专利名称：鲟鱼肝金属硫蛋白的诱导提取纯方法
技术领域：
本发明属于生物制药领域，具体涉及鲟鱼肝金属硫蛋白产品的诱导、提取、纯化制 备方法。
背景技术：
1957年Marghes和Vallee在研究金属生物学作用时，从动物器官分离出一种新蛋 白质，它含有丰富的巯基，能螯合大量的金属离子，此物质称为金属硫蛋白(简称MT)。 MT是一种重要、奇异，生理功能强的活性物质，被誉为生命的守护神之一。目前，国 内外科技工作者均采用动物兔、猪、小鼠等肝脏为原料，运用Zn、 Cu、 Se、 Cd、 Pb 等金属元素的无机化合物如ZiiCl2、 ZnS04等作诱导剂，采用肌肉或腹腔注射方法诱导 刺激机体，在肝脏中产生大量MT，剖杀取肝用乙醇浸提匀浆，超速离心取上清液，再 经葡聚糖和亚氨基二乙酸及G-25凝胶过滤和离子交换桩层析分离，收集一定mn峰值 层析液，进行真空冷冻干燥，得MT结晶。此传统方法存在原料来源制约，无机诱导剂 毒、副作用大，注射操作烦锁，提取成本高、收率低、品质纯度差等弊端。
发明内容
本发明的目的提供一种新的原料来源、诱导剂毒副作用小、操作方便、提取成本低、 收率高、品质纯度高的鲟鱼肝金属硫蛋白的诱导提取纯方法。
本发明的目的是这样实现的 一种鲟鱼肝金属硫蛋白的诱导提取纯方法，利用人工 养殖鲟鱼作为供体，取其肝脏提取金属硫蛋白。
本发明采用人工饲养的鲟鱼，投喂添加诱导剂乙酸锌的词料，宰杀取其肝脏切碎； 用肝匀浆缓冲液匀浆离心，再用葡聚糖和亚氨基二乙酸混合物层析柱层析，收集层析液， 将层析液真空冷冻干燥后得到金属硫蛋白。
本发明包括以下步骤-
(1) 诱导在饲料中添加乙酸锌作为诱导剂，按鲟鱼体重20-120mg/kg混合于词 料中每日投喂；
(2) 提取取鲟鱼肝脏，将肝脏切碎，用肝重2-4倍的肝匀浆缓冲液匀浆，静置 24h转入4。C环境中离心10-20min取上清液，在上清液中加入无水乙醇混匀，在-20'C环境中静置24h，再次在4'C环境中二次离心，取沉淀物溶于.pH值为8.6的 0.01mol/LTris-Hcl的洗脱液中得到金属硫蛋白粗提液；
(3) 纯化将金属硫蛋白粗提液注入60-80%葡聚糖和20-40%亚氨基二乙酸混合 物填充的层析柱中，收集紫外分光光度计检测出的272-282nm吸收峰值层析液；
(4) 干燥将层析液进行真空冷冻干燥后得到金属硫蛋白。 诱导剂连续投喂7-15天。
所述的肝匀浆缓冲液配制方法是取pH值为8.6的0.01mol/L Tris-Hcl的洗脱液 1000ml，无水乙醇1003ml，氯仿80ml混匀得到肝匀浆缓冲液。
本发明提供的鲟鱼肝金属硫蛋白的诱导提取纯方法，利用鲟鱼肝富含MT，其含量 是兔、猪、羊、牛等动物的100倍左右，通过本发明诱导提取每公斤鲟鱼体重的肝脏中 可获得17mgMT。
本发明制备方法是养殖商品鲟鱼，投喂添加诱导剂乙酸锌的鲟鱼专用颗粒饲料饲 养，诱导刺激鲟体在肝脏中产生大量MT宰杀取肝脏。其诱导剂毒副作用小，操作方便， 工作效率高，另外，层析柱用葡聚糖和亚氨基二乙酸混合物，能有效去除与MT结构分 子量相近的e2微球蛋白。不仅降低费用，而且提高MT的纯度。据统计采用本发明提 取MT与经典方法比较可降低成本30。/。，提高收率40%，提升品质，其纯度可达99% 以上。从鲟鱼中提取MT，为开发利用MT开创了新途径，提高了养殖鲟鱼的经济价值。
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
图l是本发明的结构示意图。
具体实施方式
实施例
1、 将116kg商品鲟伺养在3.5m3的工厂化循环水池中，每天投喂2.5kg添加诱导剂 乙酸锌4-12g的鲟鱼专用颗粒词料，添加乙酸锌剂量逐日递增，连续投喂10天，宰杀 取其肝脏备用。
2、 将肝中的胆囊、脂肪去除后剪碎称重为1680g。
3、 配制洗脱液pH为8.6的0.01mol/L Tris-Hcl.溶液10kg。 Tris即三羟甲基氨基 甲垸。
4、 配制肝匀桨缓冲液取洗脱液5000ml，无水乙醇5015ml，氯仿400ml计10415ml混匀。
5、 将1680ml肝匀浆缓冲液倒入剪碎的肝组织中混匀后装入电动匀桨器内匀浆。
46、 在肝浆中加入5000ml肝匀浆缓沖液，充分混合后转入低温超速离心机内，4°C 20000g离心10-20min，得上清液6800ml。
7、 在上清液中加入2万ml-20。C预冷的AR级无水乙醇，混匀后置于-2(TC冰箱中 静置24h。
8、 24小时后转入低温超速离心机，4°C 2000 0g离心10-15min，弃上清液，沉淀 物溶于100ml洗脱液中，此液名为MT粗提液。
9、 将MT粗提液转入葡聚糖和亚氨基二乙酸混合物，两者比为2-3: 1的层析柱内， 进行层析分离，用洗脱液洗脱，收集MT组分溶液。
层析柱内的填充物是以重量比计的60-80%葡聚糖和20-40%亚氨基二乙酸混合物。
10、 将MT组分溶液转入葡聚糖和亚氨基二乙酸混合物层析柱内，进行层析分离。 用UV-2401PC紫外分光光度计，波长272-282mn检测，收集含MT组分段的层析溶液。 此溶液名为精提液。
11、 将精提液真空冷冻干燥，得到白色金属硫蛋白结晶1985mg，其MT纯度达到 分析纯级。
权利要求
1、一种鲟鱼肝金属硫蛋白的诱导提取纯方法，其特征在于利用人工养殖鲟鱼作为供体，取其肝脏提取金属硫蛋白。
2、 根据权利要求l所述的鲟鱼肝金属硫蛋白的诱导提取纯方法，其特征在于采 用人工饲养的鲟鱼，投喂添加诱导剂乙酸锌的饲料，宰杀取其肝脏切碎；用肝匀浆缓冲 液匀浆离心，再用葡聚糖和亚氨基二乙酸混合物层析柱层析，收集层析液，将层析液真 空冷冻干燥后得到金属硫蛋白。
3、 根据权利要求2所述的鲟鱼肝金属硫蛋白的诱导提取纯方法，其特征在于(1) 诱导在词料中添加乙酸锌作为诱导剂，按鲟鱼体重20-120mg/kg混合于饲 料中每日投喂；(2) 提取取鲟鱼肝脏，将肝脏切碎，用肝重2-4倍的肝匀浆缓冲液匀浆，静置 24h转入4'C环境中离心10-20min取上清液，在上清液中加入无水乙醇混匀，在-20。C 环境中静置24h，再次在4'C环境中二次离心，取沉淀物溶于pH值为8.6的 0.01mol/LTris-Hcl的洗脱液中得到金属硫蛋白粗提液；(3) 纯化将金属硫蛋白粗提液注入60-80%葡聚糖和20-40%亚氨基二乙酸混合 物填充的层析柱中，收集紫外分光光度计检测出的272-282mn吸收峰值层析液；(4) 干燥将层析液进行真空冷冻干燥后得到金属硫蛋白。
4、 根据权利要求3所述的鲟鱼肝金属硫蛋白的诱导提取纯方法，其特征在于诱 导剂连续投喂7-15天。
5、 根据权利要求3所述的鲟鱼肝金属硫蛋白的诱导提取纯方法，其特征在于所 述的肝匀浆缓冲液配制方法是取pH值为8.6的0.01mol/LTris-Hcl的洗脱液1000ml， 无水乙醇1003ml，氯仿80ml混匀得到肝匀浆缓冲液。
全文摘要
本发明属于生物制药领域，具体涉及一种以鲟鱼肝为主要原料制备金属硫蛋白的方法，主要步骤是采用人工饲养的鲟鱼，投喂添加诱导剂乙酸锌的饲料，宰杀取其肝脏；用肝匀浆缓冲液匀浆离心，葡聚糖和亚氨基二乙酸混合物层析柱层析，收集层析液，再真空冷冻干燥得到金属硫蛋白。鲟肝中富含金属硫蛋白，为其它动物肝含量的100倍左右，采用本发明提取金属硫蛋白可降低成本30％，提升收率40％，提高品质，其纯度达99％以上。金属硫蛋白价格昂贵、生理功能显著、用途广泛，利用鲟鱼肝提取金属硫蛋白，其市场前景广阔。
文档编号C07K14/825GK101525383SQ200910061460
公开日2009年9月9日 申请日期2009年4月7日 优先权日2009年4月7日
发明者兰泽桥, 刘艾平, 曹玉广, 李义勇, 钱名全 申请人:湖北天峡鲟业有限公司