一种蛋白质工程长效多聚体药物技术的制作方法

专利名称：一种蛋白质工程长效多聚体药物技术的制作方法
技术领域：
本发明属于生物、医药一蛋白质工程药物领域，涉及一种通过基因工程改造的 长效多聚体蛋白多肽类药物的研制技术。
背景技术：
世界上第一家生物技术制药公司成立于1971年。20世纪80年代初，以干扰素、人 生长激素为代表的一大批通过重组DNA技术开发的蛋白多肽类生物工程药品给人类的一 些难治性疾病提供了有效的治疗手段。经过30多年的长足发展，蛋白多肽类药物已成为国 际医药市场上最重要的药物种类之一。蛋白多肽类药物与化学合成药物相比，具有毒副作 用小、用量少、疗效好等特点。据来自国外的报道，2005年以来，全球蛋白质类药物市场总销 售额均占当年全球医药市场10%的份额。目前已经上市的生物技术药物主要含3大类，即重组治疗蛋白质、重组疫苗和诊 断或治疗用的单克隆抗体。蛋白质类药物以抗肿瘤药物的数量最多(约占已上市蛋白质类 药物总数量的1/3)，而单克隆抗体类药物销售额则占抗肿瘤蛋白质类药物的50%。由美国 安进公司生产的AraneSp(促红素的第二代产品)则高居全球蛋白质类药品销售排行榜的 首位。随着现代生物药学的发展，人们对药物安全及毒副作用的关注，蛋白多肽类药物 的研究也越来越受到重视。但是蛋白多肽类药物存在的问题也日益突出，如给药系统的 不完善，物理化学稳定性差，在体内半衰期短，生物利用率低，生物活性低，药代动力学性质 差，需要频繁给药等，从而给患者带来了不便和经济上的巨大负担。因此长效基因工程蛋白 多肽类药物的开发已成为生物医药领域的开发热点。长效制剂采用适当的办法延缓药物在机体内吸收、分布、代谢和排泄的过程，从而 使药效延长。蛋白多肽类药物的长效性的研究通过重组融合、重组改构、化学修饰等途径使 现有产品在安全性(副作用更小)、有效性、长效性(半衰期延长，减小剂量和使用次数)等 方面优于原有制品，不但解决以上问题，而且能推动新的蛋白多肽类药物的应用开发，使一 些由于半衰期短、副作用大而无法进入实际应用的药物获得理想的临床效果(如抗肿瘤药
寸J o蛋白多肽类药物的长效性的研究基本遵循下列三种解决途径1寻找一条蛋白多肽类药物高生物利用率的给药途径；(李近等，长效载药微粒研 究进展，精细化工，2006 ；蔡波涛等，靶向长效纳米粒的研究现状及展望，数理医药学杂志， 2009 年)药物微粒指直径在微米或纳米级的载药粒子，包括微球、微囊、纳米粒、脂质体、微 乳等微型载体。长效微粒可使药物在几周或几个月内以一定速率释放，以维持有效血药浓 度，减少给药次数，提高疗效，减少不良反应。而且可以通过微粒表面和粒径的设计，实现口 服、黏膜给药、吸入等新剂型。长效微粒采用乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)、聚乳酸(PLA)等 被美国FDA批准的可用于人体的新型生物降解高分子材料为缓释辅料，其中又以PLGA更常用。此类人生长素长效制剂已进入临床，只需每月使用一次。2通过化学修饰来优化蛋白质的代谢动力学特性；(傅一鸣等，蛋白质和多肽药物 长效性研究进展，生命科学，2008年)治疗用蛋白质的长效性可以通过多种方式的化学修饰来实现。例如，通过突变一 个或者多个氨基酸(就是创造一个蛋白质类似物)或者通过糖基化、酰基化或PEG化修饰。聚乙二醇(PEG)化技术早在20世纪70年代由Frank等学者提出，即将PEG分子附 于蛋白质，既尽可能地优化了药代动力学性质，又保持了原药物活性。PEG修饰通过减少代 谢和体循环中受体介导的对蛋白质的吸收，达到降低血浆清除率，故能大大延长蛋白质类 药物在体内的作用时间。例如PEG化干扰素在体内的半衰期可延长至40小时，从而大大增 加了干扰素与体内肝炎病毒的接触时间，这样就能更有效地杀死肝炎病毒。单克隆抗体经 PEG化后，也能大大延长其与癌细胞表面接触时间，这样就能加强其杀灭癌细胞的作用力。目前世界上只有少数几家制药公司解决了 PEG修饰剂和修饰工艺中的关键技 术，先灵葆雅公司首先开发上市了世界第一只聚乙二醇包埋的新型长效蛋白质类药物制 剂“聚乙二醇化干扰素”(PEG干扰素，商品名为“佩乐能”)，已上市的此类长效型制剂还有 Neulasta(rhG-CSF)和Aranesp (EP0)等，国外正在研制开发中的新型PEG化蛋白质类新药 至少有上百种之多。我国也开展了 IFN，G-CSF等蛋白质的PEG修饰研究，但目前还没有一 家上市。国内已获得专利的PEG化药物有聚乳酸-PEG化乙肝疫苗、PEG化蒿甲醚(长效 抗疟疾新药)、长效口服避孕药(内含PEG化孕酮)、长效甘露醇注射剂(即PEG化甘露醇， 可治疗中风等引起的脑水肿)、PEG化槲皮素和PEG化缓泻药等等。3应用蛋白质工程技术构建融合蛋白。随着基因工程技术的发展，很多蛋白多肽类药物能够通过基因重组技术得到 其融合蛋白，如与人血清白蛋白(HSA)(中国专利CN1405181、CN1405182、CN1405183、 CN1207131、CN101172091、CN101200503、CN1597965、CN1626554、CN1515591、CN1807646、 CN1727488、CN1831123、CN1831124、CN1884520、CN1896104、CN1896106、CN1916173、 CN101012281、CN101037477, CN101062952、CN101063123、CN101063124, CN101063125、 CN101121753、CN101280017、CN101280018、CN101280019、CN101280020)、人免疫球蛋白 Fc 片段(中国专利 CN1403483、CN1410450, CN1361793、CN1684704、CN1500811、CN1521192、 CN1760209、CN1786032、CN187288U CN1902222、CN1926237、CN1942481、CN101321870、 CN101323643)、链亲和素(中国专利 CN101148477、CN101148478、CN1651464)、转导肽(中 国专利CN101074266、CN101074267、CN101074268)等蛋白或多肽融合，或者两种蛋白多肽 类药物之间融合(中国专利 CN1144845、CN1074243、CN1076729、CN1221754、CN1225368、 CN1311332、CN1361181、CN1375500、CN1506377、CN101003812)，或者是蛋白多肽类药物的二 联体/三联体(中国专利CN1305003、CN1995064)，融合蛋白的构建可以是直接融合，也可以 使用连接肽，通常是一个或多个(Gly4-Ser)。美国马里兰州人类基因组科学(HumanGenome Sciences)公司已经进行一系列融合HSA以延长蛋白质药物半衰期的研究，其中HSA/ IFN-a融合蛋白(Albuferon-a )已进入III期临床试验，国内也有同类产品进入临床试 验。在自然界，由于亿万年进化的结果，生命中35%以上的蛋白多肽是由多个重复 性单体聚合组成的寡聚体形式存在(Goodsell, D. S. ；et al. Annu. Rev. Biophys. Biomol.Struct. 2000, 29，105-153)，寡聚体较单体发展出更长的半衰期，更大的结合表面，更高的局部生物活性，以及构象-功能变构调节等优势。同种单体或异种单体通过多种不同机 理聚合组成重复二聚体、立方四聚体及少量奇数多聚体等。寡聚体单体聚合主要利用单 体表面的局部结构域(domain)之间的范德华力、疏水键、离子键、氢键及二硫共价键和 结构域交换(domain swapping)等机理聚合组成。例如p53抑癌基因首先利用其羧基 端(residUes326-355)寡聚化结构域形成二聚体，再通过其广泛的疏水表面聚成四聚体 (Mateu, M. G.，et al. 1999，Nature Struct. Biol. 6，191-198)。目前这种寡聚化结构域 (oligomerization domain)被发现越来越多(Liu, Y. ；et al. , Protein Sci. 2002，11， 1285-1299)。而现在开发研制的蛋白多肽类药物几乎都为天然单体蛋白多肽，单体直接改 造或单体与其它大分子共价交联。学习模仿天然寡聚化结构域，经蛋白质工程改造的长效 多聚体蛋白多肽类药物将是新一代的人造重组蛋白长效高活性制剂。

发明内容
为了克服天然蛋白多肽类药物半衰期短、药代动力学差、需要频繁给药等缺点，一 般通过基因工程技术改造蛋白多肽类药物的氨基酸序列、空间结构、表面性状或者与大分 子共价交联重组，最后表达、生产长效活性重组蛋白多肽类药物。由于蛋白多肽序列结构的 改变更常发生的是降低或破坏其生物学活性，要发现找出增强活性的突变是一项极其繁琐 的小概率事件。蛋白多肽直接相互交联的多聚体或与其它大部分大分子交联，更是明显降 低其生物学活性。如此常规蛋白质工程改造限制了蛋白多肽类药物的长效高活性剂型的发 展。“一种蛋白质工程长效多聚体药物技术”，其特征在于某种活性蛋白多肽天然氨 基酸序列通过柔性(Gly4Ser)HLinker或连接短肽连接一种寡聚化结构(domain)或模体 (motif)氨基酸序列的重组蛋白质，异位表达的重组蛋白质通过寡聚化结构域的聚合形成 二聚体或四聚体结构的长效活性蛋白药物。所述活性蛋白多肽为基因工程重组蛋白多肽活 性药物，如干扰素、促红细胞生成素、集落细胞刺激因子等。所述寡聚化结构域(domain)指 天然寡聚化蛋白质单体之间相互交联的一大类短氨基酸结构域(domain)，包括单体间形成 的范德华力、疏水键、离子键、氢键及二硫共价键和结构域交换(domain swapping)等的结 构域(domain)。所述连接短肽是指从天然蛋白质内部大的功能区之间的短连接部份经突变 改造后适于更多种蛋白多肽相互柔性连接的约十至三十个氨基酸长度的人造短肽。所述蛋 白质工程是通过基因工程重组及重组拼接PCR技术来实现人为预先设计的重组蛋白质构 建表达的生物工程技术。所述异位表达指预构建的重组蛋白质基因表达载体于原核表达系 统、昆虫杆状病毒表达系统及真核表达系统表达，提取生产长效重组药物；也可以重组蛋白 质基因腺病毒载体或痘苗载体基因枪注射，人体内直接表达长效重组药物。本发明“一种蛋白质工程长效多聚体药物技术”提供一种不改变蛋白多肽类药物 天然有效结构，而通过其柔性短肽连接的寡聚化结构域(domain)或模体(motif)的寡聚化 来实现长效多聚体药物的技术途径，即生物活性部分氨基酸序列+(Gly4Ser)Mlinker+寡 聚化结构域(domain/motif)序列。原理示意图见附图。采用基因工程重组技术完成这一人 工设计的重组药物序列。首先分别设计合成蛋白多肽活性部分基因扩增引物，寡聚化结构 域(domain/motif)基因扩增引物，将柔性(Gly4Ser) "Linker等连接肽序列的反义链加在蛋白多肽下游引物的5’端/前端；将Linker连接肽有意义链加在寡聚化结构域(domain/ motif)上游引物的5’端/前端，分别扩增的两条基因片段通过重组PCR技术生成一人工重 组的活性蛋白多肽+寡聚化结构域(domain/motif)完整序列，再克隆至载体质粒并异位表 达。本发明的基本原理公式如下
NH2-活性蛋白多肽+柔性Linker+寡聚化结构域(domain/motif)-C00H ；或NH2-寡聚化结构域(domain/motif) +柔性Linker+活性蛋白多肽-C00H。本发明至少包括以下步骤1长效药物融合基因的构建即按上述基本公式，以寡聚化结构域位于羧基端为例。以活性多肽药物降钙素作 为活性蛋白多肽药物代表，以柔性(Gly4Ser)MLinker作为连接短肽的代表，长效药物融合 寡聚化结构域的基因构建实例。实例一降钙素融合P53寡聚化结构域其氨基酸序列如下CGNLSTCVLSATffRNLNNFH- (Gly4Ser) ^3-P PGSTKRALSN NTSSSPQP KKKPLDGEYFTL QIRGRERFEM FRELNEALEL KDAQAGKEPG GSRAHSSH LKSKKGQSTSRH KKLMFKTEGP DSD实例二 降钙素融合链亲和素(Core Streptavidin)寡聚化结构域CGNLSTCVLSATWRNLNNFH-(Gly4SerUATDGSGTAL GffTVAffKN NYRNAHSATTffS GQYVGGAEAR INTQffLLTSG TTEANAffKST LVGHDTF T KV KPSAAS实例三降钙素融合人IgG1重链绞链区(Hinge Region)的寡聚化结构域CGNLSTCVLSATWRNLNNFH-(Gly4Ser) h-AALGCLVKDYF PEPVTVS WNSGALTSGVH TFPAVLQSSG LYSLSSVVTV PSSSLGTQTY ICNVNHKPSN TKVDKRVEPKSCDKTHTCPP CPAPELLGGP SVFLFPPKPK DTLMISRTPE VTCVVVDVSH EDPEVKFNWYVDGVEVHNAK TKPREEQYNS TYRVVSVLT V LHQDffLNGKE YKCKVSNKAL PA各片段基因的扩增融合，首先分别设计合成蛋白多肽活性部分基因扩增引物 (短片段基因可采用化学合成)，寡聚化结构域(domain/motif)基因扩增引物时，将柔 性(Gly4Ser)HLinker等连接肽序列的反义链加在蛋白多肽下游引物的5’端/前端；将 Linker连接肽有意义链加在寡聚化结构域(domain/motif)上游引物的5’端/前端，分别 扩增蛋白多肽活性部分基因和寡聚化结构域基因片段并经凝胶电泳回收纯化片段。一端部 份重叠的两片段之间可以互为引物退火、延伸几个循环，再以此融合片段为模板，以蛋白多 肽上游引物和寡聚化结构域下游引物作为最终融合片段的扩增引物，PCR扩增生成一人工 重组的活性蛋白多肽+柔性Linker+寡聚化结构域(domain/motif)的完整序列。2长效药物表达质粒及相应的工程菌的构建经重组PCR制备的融合基因产物纯化后用适当的限制性内切酶处理，再与用同样 限制性内切酶处理的质粒PET等载体连接，连接产物转化(或转染)感受态细胞如BL21等， 涂布(spread) LB培养皿，经过夜培养后，挑选单菌落PCR筛选阳性克隆及核酸测序分析，选 择序列正确者。含正确重组质粒的菌种小规模培养，IPTG诱导表达后进行SDS PAGE电泳分析，挑 选表达目的条带的菌种作为工程菌菌种。3长效药物的发酵生产、分离纯化
通过发酵、IPTG诱导培养，离心收获菌体，经超声破碎、溶菌酶裂解。先采用盐析、 透析、超滤等方法粗提，进一步采用离子交换层析、疏水作用层析、亲和层析(包括生物亲 和层析，金属离子亲和层析，免疫亲和层析等)、凝胶过滤等方法制备纯品，或聚丙烯酰胺凝 胶制备电泳精制。4长效药物生物学活性的测定制备的纯品经初步的纯度、含量、pH值、热原等一般理化性能指标鉴定后，根据中 国药典的质量标准规定，采用适当的方法测定相应效价等长效药物的生物学活性。本发明“一种蛋白质工程长效多聚体药物技术”的优点主要集中表现在(1).模拟了天然蛋白进化的优势，从而具备了寡聚化蛋白多肽的半衰期长，结合 表面积大及局部生物活性高等优点；(2).没有改变天然蛋白多肽药物的结构，所以既不会破坏或降低药物活性，增加 的天然短寡聚化结构域也不会增加新的不良反应等的毒副作用；(3).活性蛋白多肽仅与小分子短寡聚化结构域交联，基因工程构建的是单基因链 及表达的是蛋白多肽单体，寡聚化后再成为大分子多聚体。易于基因工程构建及规模化生 产、纯化精制。


以人a干扰素交联Igh寡聚化结构域为例附图是本发明的基本原理示意图，以实施例干扰素IFN a _lb+源自黄病毒柔性连 接短肽+人IgGjA寡聚化结构域为例。其中附图A为两个单体的人a干扰素分子，附图B 短方条代表柔性连接短肽，附图C示意Igh绞链区的寡聚化结构域通过两对共价二硫键形 成二聚体。
具体实施例方式以下实施例进一步说明本发明“一种蛋白质工程长效多聚体药物技术”的内容，但 不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、条件、 步骤及应用所作的修改或替换，均属于本发明的范围。实施例长效人干扰素a -lb融合二聚体干扰素是一类重要的细胞因子，它是机体受到病毒感染时，免疫细胞通过抗病毒 应答反应，而产生的一组结构类似、功能相近的低分子糖蛋白。干扰素在同种细胞上具有广 谱的抗病毒、抗细胞分裂、免疫调节等多种生物学活性，目前在临床上广泛用于抗病毒、抗 肿瘤治疗。根据人干扰素的分子结构和抗原性不同分为a、0、Y等几类，0干扰素活性 分子为二聚体，Y干扰素活性分子为四聚体，而天然a干扰素活性分子仍为单体，a干扰 素又依其结构的不同再分为a-lb、a _2a、a _2b等亚型。干扰素是我国第一个实现产业化的基因工程药物。干扰素a是治疗慢性乙型肝 炎或慢性丙型肝炎的首选治疗，可以有效地抑制或清除病毒，疗效持久，阻止肝硬化或肝癌 的发生。但普通干扰素治疗具有自身不可克服的缺点，半衰期短，只有4个小时，所以，干扰 素不得不每隔一天就注射一次，使用很不方便。美国安进公司(Amgen Inc.)开发并于1997年在美国上市的复合干扰素是一种非 天然的新型干扰素，是以生物工程DNA技术，把十多种a干扰素亚型蛋白质结构中，每一位 点最常见的氨基酸序列排列成一复合序列而产生，故名复合a干扰素，商品名为干复津。
将IFN进行PEG化的研究，经历了从线性PEG到支链PEG对IFN进行修饰，先后研 发了 PEG IFN a-2b和PEG IFN a-2a。PEG IFN a-2b为小分子直链PEG IFN，半衰期约为 40小时，可以在体内持续作用168小时，刚好满足一周一次给药。同时保留了 30%的肾脏 清除率，这样，当干扰素治疗期间发生严重不良反应时，撤药快速，便于对干扰素不易耐受 的病人调整剂量，大大提高了干扰素治疗的安全性。PEG IFN a _2a为大分子支链PEG IFN, 半衰期约为80小时。 另一种途径是干扰素的融合蛋白，如干扰素与人血清白蛋白(HSA)、人免疫球蛋白 Fc片段、脑啡肽、胸腺肽等蛋白或多肽融合，可以是直接融合或使用连接肽，通常是一个或 多个(Gly4-Ser)，或干扰素的糖基化、酰基化等，也能够改善普通干扰素半衰期短的特性。 美国马里兰州人类基因组科学(Human Genome Sciences)公司已经进行一系列融合HSA以 延长蛋白质药物半衰期的研究，其中HSA/IFN-a融合蛋白(Albuferon-a )已进入III期 临床试验。本发明“一种蛋白质工程长效多聚体药物技术”，其具体实施例是以天然a干扰 素加一柔性连接短肽与人Igh绞链区的寡聚化结构域融合，通过寡聚化结构域的链间二硫 键共价形成二聚体。一、长效人干扰素a -lb融合二聚体融合基因的构建其基本构建公式为干扰素IFN a -lb+源自黄病毒柔性连接短肽+人Igh的寡聚化结构域(1)中国人特有的IFN a-lb的氨基酸序列是(genebank AF439447)CDLPETHSLD NRRTLMLLAQ MSRISPSSCL MDRHDFGFPQ EEFDGNQFQKAPAISVLHEL IQQIFNLFTT KDSSAAWDED LLDKFCTELY QQPNDLEACVMQEERVGETP LMNADSILAV KKYFRRITLY LTEKKYSPCA WEVVRAEIVRSLSLSTNLQE RLRRKE相对应的核酸序列(有意义链)为5， -tgt gat ctc cct gag acc cac age ctg--------gaa aga tta agg agg aag
gaa-3，(2)源自黄病毒柔性连接短肽，其氨基酸序列为GAGARLVVLATATPPGSVTGG相对应的核酸序列(有意义链)为+ggc get gga gcg cgt ctc gtc gtg ctc gcc acc get act cct ccg gga teg gtc acc ggc ggc+(3)人Igh重链绞链区包括部份CH「CH2的寡聚化结构域TAALGCLVKD YFPEPVTVSff NSGALTSGVH TFPAVLQSSG LYSLSSVV TVPSSSLGTQTY ICNVNHKPSN TKVDKRVEPK SCDKTHTCPP CPAPELLGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPE VTCVVVDVSH EDPEVKFNWY VDGVEVHNAK TKPREEQYNSTYRVVSVLT V LHQDWLNGKE YKCKVSNKAL PA相对应的核酸序列(有意义链)为5，-aca gcg gcc ctg ggc tgc ctg---------gtc tcc aac aaa gcc ctc cca
gcc_3， 引物设计根据融合基因序列和pET32a质粒多克隆位点，选择BamH I和EcoR I酶切位点，并在BamH I酶切位点后加入rTEV蛋白酶特异性识别序列 (Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Gly)以方便下游生产目的蛋白的纯化。HjIFNF :5，-eg ggatcc RaR aat ctR tac ttt caR rrc tgt gat ctc_3，IFNF1 :5，_c ttt caR rrc tgt gat ctc cct gag acc cac age ctg_3，IFNR1 :5，-gag acg cgc tcc age gcc ttc ctt cct cct taa tct ttc_3，IFNR :5，-agt age ggt ggc gag cac gac gag acg cgc tcc age gcc_3，IgGF :5，-g ctc gcc acc get act cct ccg ggatcg gtc acc ggc gg+_3，IgGFl :5，-gga teg gtc acc ggc ggc+aca gcg gcc ctg ggc tgc ctg_3，RjIgGR :5，-eg gaattc tta ggc tgg gag ggc ttt gtt gga gac_3，融合基因的构建首先分别从含有ifna -lb和人igg:重链基因的重组质粒中pcr 扩增出相应的基因片段，反应体系为重组质粒0. 5u 1
上游引物1 u 1
下游引物1 u 1
10mM dNTP1 u 1
10Xpfu buffer5u 1
Pfu酶0. 5u 1
ddH2041 u 1_50 u 1其中扩增IFNa -lb基因的上游引物为HJFNF(lOuM)和IFNF1 (10uM)9 1的混 合物，下游引物为IFNR(lOuM)和IFNRl(10uM)9 1的混合物；扩增人IgG:重链基因的上 游引物为IgGF(lOuM)和IgGFl (10uM)9 1的混合物，下游引物为RJgGRdOuM)。PCR 扩增条件为94°C 4min ；94°C 30S、55°C 40S、72°C lmin，25 个循环，最后 72°C 延伸9min。PCR产物进行1. 5%琼脂糖凝胶电泳后用QI AGEN试剂盒回收。再进行两个基因片段的融合，反应体系为上述pcr反应的回收产物43. 5 ill10mM dNTP1 u 1lOXpfu buffer5 u 1Pfu 酶0. 5u 1_50 u 1PCR 扩增条件为94°C 2min ；94°C 30S、52°C 40S、72°C lmin, 10 个循环，最后 72°C 延伸9min。最后进行融合基因的pcr扩增，反应体系为上述融合反应产物5 ill上游引物HJFNFdOuM)lu 1下游引物队1801 (10碰)lu 110mM dNTP1 u 1
IOXpfu buffer5μ 1Pfu 酶0. 5μ 1ddH2036. 5 μ 1_ 50 μ 1PCR 扩增条件为94°C 4min -MV 30S、54°C 40S、72°C 2min，25 个循环，最后 72°C 延伸9min。PCR产物进行1. 2%琼脂糖凝胶电泳后用QIAGEN试剂盒回收。二、表达质粒及相应的工程菌的构建重组PCR产物经凝胶电泳回收纯化后，常规用BamH I和EcoR I双酶切处理、灭活， 再与用BamH I和EcoR I双酶切处理并胶回收纯化的pET32a质粒经T4连接酶连接，连接 产物常规转化(CaCl2法)感受态细胞BL21，于含氨苄青霉素(50mg/L)的LB平板中37°C 培养过夜，PCR筛选阳性克隆及核酸序列分析，将测序正确者命名为pET32a/IFNa -lb。含重组质粒pET32a/IFNa-lb的BL21菌种接种于LB培养基中，37°C培养过夜，次 日清晨按1 100的比例接种于上述同样条件的LB培养基中，37°C培养至怂㈨》=。.‘ 0. 6时加入IPTG至终浓度为0. 2-lmmol/L诱导表达，37°C振荡培养6hr，离心收集菌体，行 12% SDSPAGE鉴定，挑选表达目的条带的菌种作为工程菌菌种。三、新型长效人干扰素a -Ib的发酵生产、分离纯化通过常规方法发酵培养工程菌，离心收集菌体。1.粗提重组蛋白是以半包涵体的形式存在，取5g表达湿菌，加微量的溶菌酶，将 其悬浮于 35mL STE(1 OOmmo 1/L NaCl, 50mmol/L Tris. Cl, PH 8. 0, lmmol/L EDTA)中，在冰 浴中300W超声裂菌，超声5s，间歇10s，全程20min，4°C，IOOOOg离心20min，并分别辅以脱 氧胆酸(DOC 4mg/g湿菌)和低浓度尿素(l-2mol/L)超声漂洗，再IOOOOg离心20min。沉 淀用较高浓度的尿素(4-6mol/L)融解，4°C，IOOOOg离心20min，取上清初步透析后，再在冰 浴中进行硫酸铵沉淀，硫酸铵的终浓度为400g/L，4°C，IOOOOg离心20min，沉淀重溶于STE 中，即为粗提液。2.长效INFa-Ib的纯化粗提液过Ni-NTA亲和层析柱结合后，洗脱收集蛋白主 峰，收集液经rTEV蛋白酶4°C处理过夜，酶切产物再过分子筛葡聚糖凝胶S-300层析柱，收 集干扰素洗脱峰的液体，即为长效INFa-Ib半成品，过滤除菌后分装，-20°C保存。3.长效INF α -Ib的理化鉴定3. 1蛋白浓度测定采用BCA法，按照试剂盒的说明书进行操作；3. 2电泳纯度用非还原型SDS PAGE法，加样量不低于1 μ g，经扫描仪扫描，纯度 应在95%以上；3. 3分子量测定用还原型SDS PAGE法，加样量不低于1 μ g，制品的分子量与理论 值比较，误差不超过10%。四、抗病毒活性测定WISH细胞法将WISH细胞在含抗生素、谷氨酰胺和10% FCS(pH 7.4)的Eagle，s培养液中 37°C、5%C02培养箱中培养过夜。待细胞呈单层生长后弃培养液，并用胰酶消化细胞。将 消化的WISH细胞按1000个细胞/孔接种于96孔板，37°C,5% CO2培养箱中培养过夜。换 为含5% FCS的Eagle’ s液稀释的不同浓度的待测样品，100 μ L/孔，每个稀释度做3个孔，继续培养，次日换用含5% FCS的Eagle's培养液按1 10 30稀释的VSV病毒培养液， 37°C培养24hr，观察结果，以50%细胞保护的待测样品稀释度为其效价。五、体内药代动力学初步检测给3只SD大鼠以lOOii g/kg单次皮下注射样品，于给药后的0. 5hr、2hr、4hr、8hr、 24hr、48hr尾静脉采血，分离血浆，夹心ELISA检测血浆中样品的含量，采用3p97软件进行 数据处理，计算相关药代动力学参数。初步结果表明样品纯度可达95%以上，比活达到1.2X108IU/mg以上，大鼠体内半 衰期达到10hr以上。
权利要求
“一种蛋白质工程长效多聚体药物技术”，其特征在于某种活性蛋白多肽天然氨基酸序列通过柔性连接短肽连接一种寡聚化结构域(Oligomerization domain)氨基酸序列的重组蛋白质，异位表达的重组蛋白质通过寡聚化结构域的聚合形成二聚体、四聚体结构的长效活性蛋白药物。
2.根据权利要求1“一种蛋白质工程长效多聚体药物技术”，其特征在于所述活性蛋 白多肽为天然结构的、具有生物学活性并基因工程重组表达的蛋白多肽类活性药物。
3.根据权利要求1“一种蛋白质工程长效多聚体药物技术”，其特征在于所述寡聚化 结构域(Oligomerization domain)是指形成天然寡聚化蛋白质单体之间相互交联的一大 类短氨基酸结构域(domain)，包括单体间形成的范德华力、疏水键、离子键、氢键及二硫共 价键和结构域交换(domain swapping)等的结构域(domain)。
4.根据权利要求1“一种蛋白质工程长效多聚体药物技术”，其特征在于所述连接短 肽是指柔性的小分子中性氨基酸组成的短肽(Glyjer)"。也包括从天然蛋白质内部大的 功能区之间的短连接部份经突变改造后适于更多种蛋白多肽相互柔性连接的约十至三十 个氨基酸长度的人造短肽。
5.根据权利要求1“一种蛋白质工程长效多聚体药物技术”，其特征在于所述蛋白质 工程是通过基因工程重组及重组拼接PCR技术来实现人为预先设计的重组蛋白质构建表 达的生物工程技术。
6.根据权利要求1“一种蛋白质工程长效多聚体药物技术”，其特征在于所述异位表 达指预构建的重组蛋白质基因表达载体于原核表达系统、昆虫杆状病毒表达系统及真核表 达系统表达，提取生产长效重组药物；也可以重组蛋白质基因腺病毒载体或痘苗载体基因 枪注射，人体内直接表达单体重组药物，再在体内自动进行寡聚合。
全文摘要
本发明“一种蛋白质工程长效多聚体药物技术”涉及活性蛋白多肽药物寡聚化，药物单体形成寡聚体大分子进而提高药效的技术。其特征在于活性蛋白多肽天然氨基酸序列通过柔性连接短肽连接寡聚化结构域(Oligomerization domain)氨基酸序列的重组蛋白质，异位表达的重组蛋白质通过寡聚化结构域的聚合形成二聚体或四聚体结构的长效蛋白药物。所述寡聚化结构域是指在天然寡聚化蛋白质单体之间相互交联的一大类短氨基酸结构域(domain)，包括单体间形成的范德华力、疏水键、离子键、氢键及二硫共价键和结构域交换(domainswapping)等的寡聚化结构域。使用拼接重组PCR技术构建蛋白多肽与寡聚化结构域联接的重组基因，原核或真核表达蛋白多肽单体再通过其寡聚化结构域交联成寡聚体；腺病毒或痘苗载体系统体内直接表达长效重组药物。
文档编号C07K1/10GK101875698SQ20091008326
公开日2010年11月3日 申请日期2009年4月30日 优先权日2009年4月30日
发明者江洪 申请人:北京万达因生物医学技术有限责任公司