专利名称：土壤蛋白质提取及胞内蛋白质的分离方法
技术领域：
本发明涉及一种生物技术领域土壤蛋白质提取与胞内蛋白分离的方法。
背景技术：
宏蛋白质组学是近年来新出现的一种概念和研究技术，该技术除可环境中的微生物种 群进行研究，还可对微生物群落进行深入分析通过宏蛋白质组研究能够把微生物群落组 成与其功能联系起来，从而更好的了解微生物群落。虽然现在已经开展的宏蛋白质组学的 研究很少，但是在特殊极端环境中功能基因表达、特殊功能蛋白质的开发、生态元素循环 等研究领域，宏蛋白质组学已经初步展示了其强大的功能。
Wilmes等人首次以具有生物除磷功能的活性污泥为研究对象，研究了一个完整的废水 除磷处理过程中活性污泥蛋白质组的变化，展现了宏蛋白质组学技术在探索环境微生物的 特殊功能方面的巨大作用。Schulze等人研究了分离于森林湖泊及土壤中溶解态有机物 (Dissolved organic matter, DOM)的各种蛋白质，希望找到与生态碳循环有关的细胞外 蛋白质。他们的工作是首次将宏蛋白质组学运用于生态元素的循环研究上，得到了很多有 趣的结果，显示了宏蛋白质组学研究在揭示生态环境功能上的作用。美国加州大学伯利克 分校的Banfield等人成功地将宏蛋白质组学和宏基因组学的研究结合起来对极端环境微 生物进行了研究，成功地利用其研究成果构建了在这种极端环境下能量和物质的代谢循环 模式图，充分显示了宏基因组学和宏蛋白质组学结合研究的强大力量。然而现在还有没有 通用的应用于环境样品蛋白质提取方法，特别是从海水、土壤等复杂环境样品中提取还有 很大困难。已有的研究如AMD生物膜和活性污泥，这些样品来自于极端环境，微生物多样 性较低，对于海水，土壤等这类环境复杂、微生物多样性高的样品，传统的平板法只能提 供不到1%的微生物信息，而现被宏蛋白质组研究者广泛使用的1993年(O. A. Ogunseitan， 1993)建立的方法，我们经过重复，没有获得理想的效果，表明该方法缺乏较好的通用性， 因此发展高效、通用的蛋白质提取方法对宏蛋白质组学研究与应用至关重要。
发明内容
本发明的目的是提供一种高效的土壤蛋白质提取方法，对蛋白质组分得率可提高到 37.5%。
一种高效的土壤蛋白质提取方法包括样品前处理、蛋白的提取，具体方法如下
样品前处理称取样品土壤65g于锥形瓶，加入预冷的土壤蛋白质提取缓冲液150ml，混匀后置4°C,摇床振荡过夜。振荡液用滤纸于布氏漏斗真空抽滤，取抽滤液过大孔树脂 (DIOI)，取过柱液过0.22ym微孔滤膜，滤液为胞外蛋白质母液，滤膜上做进一步胞内 蛋白质提取。
土壤蛋白质提取缓冲液配比0.82g磷酸二氢钾+0. 16g磷酸氢二钾，定容至100ml， 向其中加入8ml 0. 5M， pH8.0 EDTA。
胞外蛋白质的提取取胞外蛋白质母液，加入等体积的预冷的丙酮溶液，混匀后静置 沉淀4一5h， 30000rpm， 4。C离心30min，弃上清，沉淀用预冷的丙酮洗涤，13000rpm， 4 。C离心10min，弃上清，沉淀用预冷的无水乙醇于4'C超声波下洗涤10min, 13000rpm， 4 。C离心10min，弃上清，沉淀用预冷的乙醚洗涤，13000rpm， 4。C离心10min，弃上清，沉 淀用真空干燥机干燥，干粉即为胞外土壤蛋白质沉淀物。
胞内蛋白质的提取取上述已过滤的滤膜于烧杯中，加入20ml的预冷的土壤蛋白质 提取缓冲液，于超声波仪器4'C超声洗涤IO分钟，弃滤膜，溶液倒入50ml离心管中，离 心管于细胞破碎仪中细胞破碎(功率15%，时间600s， 槽温4'C，超声间隔5s)，细胞破 碎完成后，向离心管中加入等体积的预冷的丙酮溶液，混匀后静置沉淀4一5h， 30000rpm, 4。C离心30min，弃上清，沉淀用预冷的丙酮洗涤，13000rpm， 4。C离心10min，弃上清， 沉淀用预冷的无水乙醇于4'C超声波下洗涤10min， 13000rpm， 4。C离心10min，弃上清， 沉淀用预冷的乙醚洗涤，13000rpm， 4'C离心10min,弃上清，沉淀用真空干燥机干燥，干 粉即为胞内土壤蛋白质沉淀物。
胞内蛋白质的分离方法
样品裂解称取胞内蛋白质干粉按15H 1/mg的比例用CHAPS提取液于超声波清洗器 中2(TC超声处理10X1. 5min,每次超声处理间隔期间震荡30S, 25°C12000rpm离心20min， 取上清备用。CHAPS提取液配比9M尿素，1%二硫苏糖醇(DTT), 4%CHAPS, 2WA即holine (pH5-8)。
SDS-PAGE电泳凝胶规格为102X84X2. 4歷，分离胶为10%聚丙烯酰胺凝胶，用 1%琼脂糖(电泳缓冲液配置)封闭；电泳槽加入电极缓沖液；IOOV恒压进行电泳，室温， 待溴酚蓝离底部lcm即可停止电泳，电泳2. 5小时；电泳槽电极缓冲液配比25mmol/L Tris， 192mmol/L甘氨酸，0. 1%SDS。
反复实验证明10%聚丙烯酰胺凝胶对土壤蛋白的分辨效果更好，达到能清楚分辨的程度。
上述方法中上壤蛋白质提取缓冲液及各类试剂的量可以根据土壤的量按比例放大，但配比、方法及工艺条件不变。
采用本发明所提供的方法具有突出的特点
1、 采用大孔树酯.过滤可截留土壤样品中的有机质，而微生物和胞外蛋O不能和树酯 中的共价键结合，因向不能被大孔树酯吸附，而被洗脱于缓冲液中。该方法不仅能提高土 壤微生物的提取得率，同时也能提高蛋白质电泳的电泳、分离效率。
2、 所提取的土壤蛋白质得率约为37. 5%.与通过吖啶橙染色细胞计数所得微生物的得 率相似。
3、 10%聚丙烯酰胺凝胶对土壤蛋白的分辨效果更好，达到能清楚分辨的程度。 具体实施例
称取样品土壤65g于锥形瓶，加入预冷的土壤蛋白质提取缓冲液150ml，混匀后置4 'C，摇床振荡过夜。振荡液用滤纸于布氏漏斗真空抽滤，取抽滤液过大孔树脂(DIOI)， 取过柱液过0.22ym微孔滤膜，滤液为胞外蛋白质母液，滤膜上做进一步胞内蛋白质提取。
土壤蛋白质提取缓冲液配制0. 82g磷酸二氢钾+O. 16g磷酸氢二钾，定容至100ml， 向其中加入8ml 0. 5M， pH8. 0 EDTA。
胞外蛋白质的提取取胞外蛋白质母液，加入等体积的预冷的丙酮溶液，混匀后静置 沉淀4一5h， 30000rpm， 4'C离心30min，弃上清，沉淀用预冷的丙酮洗涤，13000rpm， 4 。C离心10min，弃上清，沉淀用预冷的无水乙醇于4'C超声波下洗涤10min, 13000rpm， 4 。C离心10min，弃上清，沉淀用预冷的乙醚洗涤，13000rpm， 4'C离心10min，弃上清，沉 淀用真空干燥机干燥，干粉即为胞外土壤蛋白质沉淀物。
胞外土壤蛋白质干粉置-20'C冰箱中短期保藏，长期保藏于-8(TC冰箱中。
胞内蛋白质的提取取上述已过滤的滤膜于烧杯中，加入20ml的预冷的土壤蛋白质 提取缓冲液，于超声波仪器4'C超声洗涤10分钟，弃滤膜，溶液倒入50ml离心管中，离 心管于细胞破碎仪中细胞破碎，细胞破碎的条件1000s，间隔5s，功率输出15%，温度4 'C。细胞破碎完成后，向离心管中加入等体积的预冷的丙酮溶液，混匀后静置沉淀4一5h， 30000rpm， 4'C离心30min，弃上清，沉淀用预冷的丙酮洗涤，13000rpm， 4。C离心10min, 弃上清，沉淀用预冷的无水乙醇于4'C超声波下洗涤10min, 13000rpm， 4。C离心10min， 弃上清，沉淀用预冷的乙醚洗涤，13000rpm， 4'C离心10min，弃上清，沉淀用真空干燥机 干燥，干粉即为胞内土壤蛋白质沉淀物。
胞内土壤蛋白质干粉置-2(TC冰箱中短期保藏，长期保藏于-8(TC冰箱中。
胞内蛋白质的分离胞内蛋白质裂解称取上述的胞内蛋白质干粉按15n l/mg的比例加CHAPS提取液，
于超声波清洗器中2(TC超声处理10X1.5min，每次超声处理间隔期间震荡30S， 25°C
12000rpm离心20min，取上清备用。
CHAPS提取液配比:9M尿素，1%二硫苏糖醇(DTT)， 4%CHAPS， 2Mmpholine (pH5-8)。 SDS-PAGE电泳凝胶规格为102X84X2.4mm，分离胶为10%聚丙烯酰胺凝胶，用
1%琼脂糖封闭；电泳槽加入电极缓冲液，IOOV恒压进行电泳，室温，待溴酚蓝离底部lcm
即可停止电泳，电泳2.5小时。
电泳槽的电极缓冲液配比25mmol/L Tris， 192隱ol/L甘氨酸，0. 1%SDS。 然后将样品送至上海蛋白质组学测试中心进行LC-MS-MS分析以鉴定蛋白质种类和来
权利要求
1、一种高效的土壤蛋白质提取方法，包括样品前处理、蛋白的提取，其特征是样品前处理称取样品土壤65g于锥形瓶，加入预冷的土壤蛋白质提取缓冲液150ml，混匀后置4℃，摇床振荡过夜；振荡液用滤纸于布氏漏斗真空抽滤，取抽滤液过大孔树脂(D101)，取过柱液过0.22μm微孔滤膜，滤液为胞外蛋白质母液，滤膜上做进一步胞内蛋白质提取；土壤蛋白质提取缓冲液配制0.82g磷酸二氢钾+0.16g磷酸氢二钾，定容至100ml，向其中加入8ml0.5M，pH8.0EDTA；胞外蛋白质的提取取胞外蛋白质母液，加入等体积的预冷的丙酮溶液，混匀后静置沉淀4—5h，30000rpm，4℃离心30min，弃上清，沉淀用预冷的丙酮洗涤，13000rpm，4℃离心10min，弃上清，沉淀用预冷的无水乙醇于4℃超声波下洗涤10min，13000rpm，4℃离心10min，弃上清，沉淀用预冷的乙醚洗涤，13000rpm，4℃离心10min，弃上清，沉淀用真空干燥机干燥，干粉即为胞外土壤蛋白质；胞内蛋白质的提取取上述0.22μm微孔滤膜于烧杯中，加入20ml的预冷的上壤蛋白质提取缓冲液，于超声波仪器4℃超声洗涤10分钟，弃滤膜，溶液倒入50ml离心管中，离心管于细胞破碎仪中细胞破碎，细胞破碎完成后，向离心管中加入等体积的预冷的丙酮溶液，混匀后静置沉淀4—5h，30000rpm，4℃离心30min，弃上清，沉淀用预冷的丙酮洗涤，13000rpm，4℃离心10min，弃上清，沉淀用预冷的无水乙醇于4℃超声波下洗涤10min，13000rpm，4℃离心10min，弃上清，沉淀用预冷的乙醚洗涤，13000rpm，4℃离心10min，弃上清，沉淀用真空干燥机干燥，干粉即为胞内土壤蛋白质沉淀物。
2、 一种高效的土壤胞内蛋白质的分离方法，包括土壤胞内蛋白质裂解和SDS-PAGE电泳， 其特征是-胞内蛋白质裂解称取权利要求1方法获得的胞内蛋白质干粉按15ul/mg的比例加 CHAPS提取液，于超声波清洗器中2(TC超声处理10X1.5min，每次超声处理间隔期间震荡 30S; 25。C12000rpm离心20min,取上清备用；CHAPS提取液配比为9M尿素，1%二硫苏 糖醇(DTT)， 4%CHAPS， 2%Ampholine (pH5-8);SDS-PAGE电泳凝胶规格为102X84X2.4mm，分离胶为9_12%聚丙烯酰胺凝胶， 用1%琼脂糖(电泳缓冲液配置)封闭；电泳槽加入电极缓冲液为25mmol/LTris， 192ramol/L 甘氨酸，0. P/6SDS; 100V恒压进行电泳，室温，待溴酚蓝离底部lcm即可停止电泳，电泳 2.5小时。
3、 根据权利要求2所述的一种高效的土壤胞内蛋白质的分离方法，其特征是SDS-PAGE电泳时，采用1oy。聚丙烯酰胺凝胶为分离胶。
全文摘要
一种高效的土壤蛋白质提取方法是把土壤加入预冷的土壤蛋白质提取缓冲液混匀后置4℃，摇床振荡过夜。振荡液用粗滤纸于布氏漏斗真空抽滤，取抽滤液过大孔树脂(D101)，取过柱液过0.22μm微孔滤膜，滤液为胞外蛋白质母液；滤膜上细胞经洗涤、破碎、离心分离和真空干燥获得干粉，干粉即为胞内土壤蛋白质沉淀物。胞外蛋白质母液经离心、分离和真空干燥获胞外土壤蛋白质干粉；胞内蛋白质干粉经裂解在10％聚丙烯酰胺凝胶SDS-PAGE电泳即可清楚分离，该方法具有高分离效率，所提微生物的得率为37.5％，高于传统方法0.1-1％的得率，建立了一种简易的操作流程，提高了得率，SDS-PAGE分辨率和质谱鉴定效果好。
文档编号C07K1/00GK101531708SQ20091011146
公开日2009年9月16日 申请日期2009年4月14日 优先权日2009年4月14日
发明者林文雄, 林辉锋, 君 熊 申请人:福建农林大学