带穿膜序列的人Scurfin蛋白全长及片段以及制备方法

专利名称：带穿膜序列的人Scurfin蛋白全长及片段以及制备方法
技术领域：
本发明涉及基因工程及蛋白转导的生物医学技术领域。具体的说，本发明涉及带 穿膜序列的人Scurf in全长、去除叉头结构结构域(AForkhead domain, AFKH)人Scurf in 片段和去除富含脯氨酸结构域(AProline-rich domain, APRD)人Scurf in片段的融合蛋 白PTD-hScurf in、PTD- A hFKH及PTD- A hPRD基因序列的重组构建及由此制备的融合蛋白 对Jurkat T细胞(人急性T淋巴细胞白血病细胞系)和人外周血CD4+T细胞抑制增殖、调 节细胞因子分泌和诱导免疫耐受的作用，以及应用于调节性T样细胞制备、预防和治疗治 疗炎性免疫相关性疾病(包括自身免疫病、移植排斥相关疾病)及免疫耐受诱导或肿瘤的 药物中的用途。
背景技术：
l.Treg概述 自1995年日本京都大学Sakaguchi等首次报道CD4+CD25hi调节性T细胞 (regulatory Tcells， Treg)后，Treg随即引起全世界相关学科学者的广泛关注。对Treg 的分类多种多样，目前被广泛认同的分类方式是根据Treg发育和其特异性以及作用机 制等的差异将其分为天然Treg(Natural Treg)和获得性或诱导性Treg(Adaptive or Induced Treg)。天然Treg主要表达CD4、CD25、hScurf in、CD134 (0X40) 、GITR(TNFRSF18)、 CD62L(L-selectin)和CD152 (CTLA-4)。尽管其数量很少，但具有很强的免疫抑制功能。其 通过细胞间接触抑制(活化的Treg既能够通过自身的MHC分子与效应性T细胞直接接触介 导免疫抑制，抑制CD8+T细胞的活化；也可以通过间接抑制APC表达协同剌激分子，从而抑 制效应性T细胞的增殖以及IL-2的产生。)和分泌细胞因子抑制效应免疫细胞的作用，在 自身免疫耐受的形成和维持中发挥重要作用。其功能的诱导依赖抗原，而功能的实施则无 抗原特异性，但最近有研究表明其功能也存在一定的抗原特异性。获得性Treg则主要通过 分泌细胞因子方式发挥抑制作用。随后发现Treg主要受一种叉头翼状螺旋转录因子家族 成员p3(forkhead box transcription factorclass p3，Foxp3)基因编石马的蛋白Scurfin 的调控。 一般在表示人源的基因和蛋白时用F0XP3和Scurf in表示，而鼠源性用Fo邓3和 scurf in表示，在非特指时用Foxp3表示和scurfin。也有用F0XP3/Foxp3代表蛋白的，本 专利申请书统一用hF0XP3和hScurfin分别表示人的基因和蛋白，mFoxp3和mScurfin分 别表示鼠的基因和蛋白。非特指时用Fo邓3和scurfin分别表示基因和蛋白。
2.人Scurfin基因与其编码产物 人Scurf in (human Scurfin， hScurfin)的基因为叉头翼状螺旋转录因子家族 成员p3 (humanforkhead box transcription factor class p3， hF0XP3)，位于人染色体 Xpll. 23-Xpl3. 3， GenBank登录号AF277993。属于叉头/翼状螺旋转录调节因子家族，含 有11个外显子，在人类中高度保守。 人F0XP3 (human F0XP3， hF0XP3)基因的编码产物为 一 个48_kDa的蛋白质 hScurfin，其特征性结构为蛋白C端的叉头螺旋(Forkhead/winged helix，FKH)结构，含有这一结构域的蛋白质属于DNA结合因子家族成员之一。除了叉头区，hScurfin蛋白还包括 一个N末端的富含脯氨酸的结构域(Proline-rich domain，PRD)。近年研究表明这些结构 域与hScurf in的抑制活性的发挥有着密切的联系。在FKH和PRD之间还包含一个C2H2锌 指结构以及一个亮氨酸拉链序列，但是没有磷酸化的PKB/AKT位点。hScurfin属于转录调 节子，主要作用是抑制转录，主要表达于淋巴组织的CD4+T细胞，对免疫稳态的维持作用十 分重要。 3. Scurf in是Treg相对特异性标志 对于小鼠的研究表明，缺乏mScurfin可引起一种迅速致命的淋巴细胞增生性疾 病，与缺乏CTLA-4的小鼠相似。若将mFo邓3基因转入CTLA-4敲除的小鼠，或对CTLA-4 缺陷鼠进行mScurfin过表达，可延迟淋巴系增生性疾病的产生，延长该鼠140天寿命， 证实mScurfin可替代缺失的CTLA-4功能。而hScurfin突变表现和Treg缺乏所致的 X染色体联锁的免疫失调、多内分泌腺病和肠病综合症综合征(immune dysregulation， polyendocrinopathy， enteropathy, X-liked syndrome, IPEX)，也禾尔为X_相关自身免疫 性-变应性失调综合症(X-linkedautoimm皿ity-allergic disregulation syndrome, XLAAD)情况相似。 早先对于mScurfin的研究显示，mScurfin在小鼠Treg中高表达，而在 CD4+CD25—细胞中表达非常低，过表达mScurfin蛋白的小鼠，则产生更多的Treg。多个实验 室的研究证实mScurfin参与CD4+CD25hi细胞发育，Sakaguchi等通过将mFoxp3基因通过 逆转录病毒转染，可使脾脏的初始T细胞转变为CD4+CD25hiT细胞，说明mScurfin蛋白能直 接或间接诱导Treg的相关分子表达。已证实人CD4+CD25hiT细胞部分表达hScurfin，并且 hScurfin+的这群细胞具有免疫抑制功能。但与小鼠不同的是，在TCR联合抗CD28单抗剌 激下，CD4+CD25—T细胞可转为CD4+CD25hiT细胞，同时表达hScurf in，并具有Treg样的抑制 性功能。2001年，Wildin和Bennett同时提出hF0XP3基因与sf突变小鼠的mFoxp3基因 具有同源性。在对自身免疫疾病的研究中，人们发现，Scurf in基因可能是参与自身免疫的 一个关键调节物。将Scurfin基因Fo邓3转导Scurfin—的非调节性CD4+T细胞，可使后者 获得Treg的表型，且具有无反应性(即无能)，与天然的Treg活性和表型相似，在体内、外 都可介导免疫抑制作用，说明Scurfin的表达标志着免疫调节抑制活性，其具有调控Treg 的发育及功能的作用。目前已经证实Fo邓3基因转录的mRNA以及编码蛋白Scurfin特异 性表达于Treg(尽管有少量报道在其他细胞中发现，但是大多数是非持续的表达)，而其他 CD4+T细胞亚群包括静息CD4+T细胞、活化的Thl/Th2甚至NK T细胞均极少表达Scurfin, 故认为是Treg的特异分子标记物。
4. hScurf in生物学作用 2003年，Hori S等发现，mScurfin特异性地表达于Treg，且和Treg的发生、发育 和功能密切相关，这为分子水平在体内、外研究这一特殊细胞群提供了依据和特异性标记。 此外有文献报道hScurfin与介导Treg功能的一系列细胞膜分子和细胞因子(如CTLA-4、 GITR、 IL-10和TGF-P)的表达及其功能的发挥有着十分密切的联系。体外实验表明， hScurfin以IL-2依赖的受体作为转录阻遏物，但是体内确切的靶点仍不十分清楚。
虽然hScurfin在Treg细胞的发育和功能发挥等方面所起的作用还有待进一步研 究，但迄今为止的研究已能够表明hScurfin是控制Treg发育及其功能效应的关键基因，同时也揭示外周Treg来源有两种可能①外周原初T细胞有可能分化为Treg ;②胸腺中可能 产生具有类似Treg功能的CD25—的细胞，这种细胞活化以后有可能转化为CD25+Treg。
Roli K等发现，mscurfin高表达的小鼠免疫系统处于抑制状态。将mFo邓3基因 导入小鼠后发现，T细胞数量明显减少，低于正常水平，并且这些T细胞的增殖能力和溶细 胞能力均较低，在TCR的剌激下分泌的IL-2水平降低。虽然这类小鼠的胸腺发育正常，但 是其外周免疫器官，尤其是淋巴结，表现出无细胞状态。这说明mScurfin蛋白影响了小鼠 外周免疫系统的发育和功能状态。
(l)维持免疫自稳 免疫自稳是机体免疫系统的基本功能之一，免疫系统通过免疫耐受和免疫调节来 达到免疫系统内环境的自身稳定。自身免疫性疾病的发生是由于对自己或非己识别的调控 机制出现紊乱， 一些自身反应性T细胞逃避克隆清除或免疫抑制，识别外周组织抗原。在正 常情况下，所有个体均存在自身反应性T细胞，但是自身免疫病仅发生在5%的人身上，这 说明一定存在能够调控那些潜在自身反应性T细胞的细胞或因子。将除去了 CD25+细胞的 CD4单阳性T细胞过继转移给T细胞缺陷小鼠，能导致宿主的各种器官特异性自身免疫病； 而将Treg和CD4单阳性T细胞共同过继转移，则能防止自身免疫病的发生。这一现象提示 Treg是维持自身免疫耐受的主要因素。出生3天切除胸腺的小鼠因外周Treg明显减少可 发生器官特异性自身免疫病。如果能利用Treg的强大免疫调节作用，去特异性抑制自身反 应性T细胞的活化，便有可能找到自身免疫疾病新的治疗方法。 2001年Brunkow等对自体免疫综合症scurfy缺陷的突变小鼠(Sf小鼠)研究时首 次发现mFo邓3基因，并证实Sf小鼠的突变基因位点是在mFo邓3基因第8内含子中插入了 两个腺苷酸残基，造成移码突变，形成FKH缺失的蛋白。研究证明，Forkhead结构域对其核 定位及其与DNA的结合等起关键作用。缺少Forkhead结构域的mScurfin蛋白不能发挥转 录因子的功能，导致CD4+T淋巴细胞过度增殖、浸润。hF0XP3基因突变可引起IPEX，其表现 为全面的免疫失调，并伴有自身免疫性内分泌疾病、早期发作的I型糖尿病和甲状腺炎；在 一部分病例中可伴有严重的异位特异反应，包括湿疹、食物变态反应和嗜酸性炎症等。IPEX 患者的hF0XP3基因有13个独立的突变点，其中有6个突变可引起氨基酸替换。通过对大 量的IPEX患者hF0XP3基因的分析发现，人类的IPEX 60%是由于hF0XP3基因编码区域突 变导致的，另外10X是mRNA表达下降导致的。 Sakaguchi等研究表明，在人类和小鼠患自身免疫性疾病时，CD4+T细胞上出现 Scurf in的表达缺失。如果将正常小鼠分离得到的Treg注入mFo邓3基因缺陷小鼠体内， 能阻止这种小鼠自身免疫疾病的发生。此外，使用逆转录病毒转化mFo邓3基因进入未激活 CD4+CD25—T细胞使之成为与自然产生的CD4+Treg具有相类似功能的细胞。
Rundensky研究表明mScurfin转录因子能被CD4+CD25hiTreg特异地表达，并在T 发挥作用时成为必须因子。在致命的自体免疫综合症sf小鼠研究中发现mFo邓3基因突变 和mFo邓3基因无效突变导致CD4+CD25hiTreg缺乏，这种缺乏有别于CD4+CD25—T细胞的自身 缺陷。把CD4+CD25hiTreg转移到新生的mFo邓3基因缺乏的小鼠中能够能优先扩大并起到
治疗疾病的作用。
(2)抑制肿瘤 肿瘤的免疫逃逸机制主要包括肿瘤的抗原性弱及抗原调变，MHC-I表达低下，分泌免疫抑制因子如TGFI3 、IL-10以及缺乏协同剌激分子等。目前肿瘤免疫治疗的研究主要集 中在打破免疫耐受和提高宿主T细胞反应。许多肿瘤抗原为自身抗原，因为Treg有利于自 身抗原耐受，通过去除组织特异性Treg可以使抗肿瘤作用得到增强，但体内应用CD25单抗 去除Treg的同时也去除了活化的CD8+CD25+T细胞，从而减弱了抗肿瘤效应。同时也发现体 内剔除CD25+细胞不足以治疗已经发生的肿瘤，因此必须与其他抗肿瘤方法相结合。对于 hF0XP3表达的hScurfin蛋白来说，还存在着另外一面的作用。最近Yang Liu和Pan Zheng 报道hScurf in能表达于乳腺上皮细胞中，在乳腺癌细胞中表达下调，过表达hScurf in抑制 癌基因ErbB2 ;此外当hF0XP3基因发生突变或RNAi干扰hF0XP3基因表达时癌基因SKP2表 达上调，而且发现抑制SKP2对hScurfin蛋白介导的肿瘤生长抑制十分关键，这些证据都证 明了 Scurf in蛋白是肿瘤抑制基因。另外众多的文献报道Fo邓3基因的表达产物Scurf in 能抑制NF-AT和NF- k B，而NF-AT和NF- k B与肿瘤的生存和增殖具有重要的作用。我们的 实验也表明hScurfin能抑制T淋巴瘤细胞系Jurkat的增殖。综上所述，因此hScurfin可 能可成为肿瘤治疗的重要手段。
(3)对移植排斥反应影响 CD4+CD25hihSCurfin+Treg在移植耐受中起着重要的作用，是诱发机体移植耐受的 主要细胞。Treg具有抑制移植排斥的作用，随着异体效应T细胞数量增加，其保护性作用减 弱。从正常小鼠体内除去Treg导致排斥反应增强，并降低移植物的存活；相反，如果给予缺 乏T细胞的移植术后小鼠接种同系Treg和未致敏T细胞，移植物存活时间可明显延长。在 体外MLR中，异基因淋巴细胞剌激下，Treg可以有效地抑制CD4+T细胞和CD8+T细胞的增殖 反应。另外，运用异基因剌激细胞和高剂量IL-2，在体外可以诱导并扩增抗原特异性Treg。 已有体外实验克隆出针对人类移植物抗原的CD4+T细胞亚群，结果表明，与Thl或Th2克隆 引起耐受相反，Treg通过过继性转移诱导耐受。在未受外来抗原致敏的Naive小鼠体内存 在天然抑制移植排斥的能力，只是在移植耐受鼠其抗移植排斥的能力有所增强，因此Treg 可以调控异基因的效应T细胞，从而有利于建立异体移植物耐受。在移植时，Treg的活化 对移植排斥反应具有一定的抑制作用。如果在移植前或在移植早期阶段能够产生足够的 Treg，将可以降低非特异性免疫抑制药物的用量，甚至可以完全代替免疫抑制性药物。
移植物抗宿主病(GVHD)是异基因造血干细胞移植后在受者体内植活的供者淋巴 细胞对宿主器官发生的免疫性损伤为主要特征的移植排斥反应，是异基因造血干细胞移植 最大障碍。随着对Treg的认识，人们开始对Treg在GVHD中的作用也进行了研究。研究发 现去除供者淋巴细胞中的Treg或在移植前对宿主鼠去除CD25+细胞都可增加GVHD发病； 而应用新鲜分离纯化的供鼠Treg进行转输可明显减轻GVHD，为临床预防GVHD提供了新的 方法，但Treg占CD4+T细胞的比例较低，临床应用Treg受到限制。近年来通过在体外扩增 培养可获得数量较多的Treg，采用扩增的Treg转输也可明显减少致死性GVHD的发生，因此 该方法在将来很有希望应用于临床。转导hF0XP3基因的透明质酸特异性转基因CD4+CD25—T 细胞能使男性皮肤移植物免受同系基因型女性排斥。
5. HIV的TAT-PTD作用特点及机制 通过细胞穿透肽进行蛋白转导是目前体外蛋白传递的一种有效方法。最常用的蛋 白转导肽就是HIV-TAT基因的第一个外显子编码的第48-56位氨基酸残基，其具有蛋白转 导结构域(protein transduction domain, PTD)，其作用特点如下
①速度快——几分钟，几小时起效。 ②温度适应性广。在4t:和37t:都可以进行；其入胞过程遵循一个非受体、非能量 和非胞吞的动力学机制。 ③蛋白质进入的数量依赖于培养液中融合蛋白的浓度
④引领融合蛋白穿入培养细胞效率高。 ⑤若将融合蛋白注射入动物的腹腔，在很短时间内，可以在几乎所有的组织和器 官中看到融合蛋白。 被TAT-PTD带入细胞的分子的命运被TAT-PTD带入细胞的分子基本上保留了 它们各自原有的化学性质，且具有它们本来的活性，因此它们在细胞内会各尽其责，各显其 能。 目前推测穿膜过程与蛋白转导域中碱性氨基酸(精氨酸和赖氨酸)的存在有关， 这些氨基酸带有强的正电荷，可能是通过直接与带正电荷的细胞膜脂类相互作用而介导穿 膜过程。PTD可以与其他蛋白形成的融合蛋白导入几乎所有的细胞，包括破骨细胞、外周血 单核细胞及原代细胞等常规方法难以转染的细胞，甚至还可以穿过血脑屏障。PTD引导蛋白 和多肽入胞的主要特点是转导速度快，效率高，不损伤细胞。近来应用此转导技术可以将药 物、化合物、寡核苷酸、肽段、全长蛋白(如抗体、酶、分离的蛋白质)、金属离子、甚至200nm 的脂质体进入细胞内。操作也很简便，只需将融合的分子直接加入到组织培养介质中，15 30分钟左右胞内可达到最大浓度，并且每个细胞内的蛋白浓度近乎相同。这样，既可以控制 细胞内的蛋白浓度，又可以控制作用时间，一般胞外蛋白浓度在20-1000nmol/L，即可产生 生物学作用。 6. PTD-融合蛋白亚细胞定位 TAT蛋白真正具有转导作用的是其序列中一个富含碱性氨基酸、带有正电荷的多 肽片段与跨膜转导有关，因而被称为蛋白转导结构域(PTD，氨基酸47-57)。其核心序列为 YGRKKRRQRRR等电点12.7，为碱性。按照功能可以分为两部分GRKKR起了蛋白核定位的 信号的作用；而序列中的精氨酸对蛋白的穿膜转导作用十分重要。PTD通过核定位信号区 (NLS)将PTD-融合蛋白固定在核上，这可能也是其低免疫原性的原因。 一般而言，在与PTD 融合后的目的蛋白，能够通过PTD的核定位信号被定位于靶细胞核中，因此PTD融合蛋白可 以在细胞的胞浆和胞核中同时分布。
7.其他 Krosl等采用表达的TAT-H0XB4蛋白成功扩增了造血干细胞，Veldhoen等采用酶 缺陷的Lck-HIV-Tat即酶缺陷的Lck-PTD转导初始CD4+T细胞，结果其成功阻止了 CD4+T细 胞活化信号的内传，抑制了 T细胞活化，造成T细胞的无能。此外最近美国学者Joon-Yo皿g Kim等发现通过逆转录病毒将外源性的人 hScurfin转染至Jurkat-T细胞，可使其转变为Treg样的细胞，能够抑制与其共育的 CD4+CD25—T细胞增殖，并能够调节Treg相关基因的表达。
8. PTD穿膜序列在造血和淋巴系统的应用先例 Treg应用于移植免疫耐受的诱导在国内外已经开始，但是天然Treg数量很少，扩 增困难，因此近年来许多实验室开始采用经Fo邓3基因转染后具有调节性功能的T细胞诱 导移植免疫耐受，并取得了动物实验的成功，但转基因最大的缺点是转染效率低(除逆转录病毒载体外)，表达调控比较困难，有潜在的危险，尤其是逆转录病毒载体有诱发基因突变的可能。2005年Veldhoen等采用酶缺陷的Lck-PTD转导初始CD4+T细胞，成功诱导T细胞获得调节功能，目前国内外尚未见采用PTD与Fo邓3基因构建表达融合蛋白应用于基础和临床研究的报道。

发明内容
本发明目的在于提供带穿膜序列的人Scurfin蛋白全长及片段、及其制备方法。
本发明通过构建hScurfin全长及片段的穿膜融合蛋白原核表达载体，并对表达质粒进行
改建，获得功能性融合蛋白。 本发明提供了以下融合蛋白 PTD-hScurf in融合蛋白，具有SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列 PTD- A h FKH融合蛋白，具有SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列。 PTD- A hPRD融合蛋白，具有SEQ IDNO. 3所示的氨基酸序列。本文描述的PTD-hScurf in、PTD- A hFKH禾P PTD- A hPRD融合蛋白分别是人Scurf in
蛋白全长、缺失C端FKH及缺失N端PRD片段与HIV-TAT蛋白中PTD肽组成的融合蛋白。 本文描述的PTD-eGFP-hScurfin、 PTD-A hFKH-eGFP禾P PTD-A hPRD-eGFP融
合蛋白分别是带穿膜序列的人Scurfin全长和eGFP融合蛋白、去除叉头结构结构域
(AForkhead domain, AFKH)的人Scurf in片段和eGFP的融合蛋白和去除富含脯氨酸结
构域(AProline-rich domain, APRD)的人Scurf in片段和eGFP的融合蛋白。 本发明还提供了分别编码上述6种融合蛋白的核酸构建体，所说的核酸构
建体，它含有编码PTD-hScurfin、 PTD-AhFKH、 PTD-AhPRD、 PTD-eGFP-hScurfin、
PTD- A hFKH-eGFP或PTD- A hPRD-eGFP融合蛋白的氨基酸序列。 本发明提供了利用基因工程方法制备PTD-hScurfin、 PTD-AhFKH和PTD-AhPRD融合蛋白的方法，包括以下步骤①获得编码融合蛋白的基因序列；②将步骤①获得的序列插入到合适的载体中，得到相应的核酸构建体；③将步骤②获得的核酸构建体转化适宜的表达菌；④在适宜的培养条件下，培养步骤③的表达菌，并加入适量的异丙基_ P -D-硫代半乳糖苷(Isopropyl-P-D-thiogalactoside， IPTG)，O. 2mM-lmM终浓度诱导表达，从中分离出表达的融合蛋白。⑤若步骤④的融合蛋白为包涵体形式表达则通过镍柱在变性剂存在条件下亲和纯化。⑥纯化产物通过去盐柱后冻存备用。 经实验表明，本发明所公开的融合蛋白穿入Jurkat T细胞和外周T细胞后，抑制Jurkat T细胞和外周T细胞活化增殖及调控外周T细胞分泌Treg功能相关细胞因子的。为大量制备Treg样细胞或直接抑制T淋巴细胞增殖提供了新的方法，为体内免疫耐受的诱导奠定了基础。 上述融合蛋白作为活性成分可与其他药用的稀释剂、载体或赋形剂等制成药物组合物。 上述的融合蛋白在制备Treg样细胞、在制备预防和治疗治疗炎性免疫相关性疾病及免疫耐受诱导或肿瘤的药物中的应用。 本发明首次采用构建PTD-hScurfin方式获得融合蛋白，通过穿膜结构域直接融合目的蛋白转导入Jurkat T和外周CD4+CD25—T细胞，以大量获取Treg，突破制约Treg应用的瓶颈，以期最终应用于临床的器官移植抗排斥治疗。


图1.是带穿膜序列的载体pET28a-PTD质粒结构示意图。
图2.为融合蛋白构建模式图。 图3.是hScurfin、 AhFKH禾P AhPRD PCR产物电泳鉴定图。M :DL2000Marker ;1泳道:hScurfin PCR产物(1313bp) ;2泳道:AhFKH PCR产物
(1008bp) ;3泳道AhPRD PCR产物(705bp)。 图4.显示 了 PTD-hScurfin(A、 B禾口 C) 、 PTD-A hFKH、 PTD-A hPRD、 PTD-eGFP-hScurf in、 PTD- A hFKH-eGFP、 PTD- A hPRD-eGFP融合蛋白诱导表达及纯化的 SDS-PAGE电泳图结果。 A :PTD-hScurfin在BL21和Rosetta(DE3)中诱导表达，两种工程菌在0. 2mM的 IPTG分别诱导2h 8h :M :蛋白低分子量标准Fermentas SM0441。 B :PTD-hScurf in在不同菌种中诱导表达M :蛋白低分子量标准Fermentas SM0441 ;1、2泳道超声裂解产物沉淀及上清。 C :1泳道总菌体蛋白；2_7泳道PTD-hScurf in镍柱纯化洗脱产物(51kDa) ;M : 蛋白低分子量标准Fermentas SM0441。 D : 1-3泳道PTD- A hFKH镍柱纯化洗脱产物(43kDa) ;M :蛋白低分子量标准 FermentasSM0441。 E : 1-5泳道PTD- A hPRD镍柱纯化洗脱产物(33kDa) ;M :蛋白低分子量标准 FermentasSM0441。 F :1泳道PTD-hScurfin-eGFP镍柱纯化洗脱产物(80kDa) ;M :蛋白低分子量标准 Fermentas SM0441。 G :1泳道PTD-eGFP-AhPRD镍柱纯化洗脱产物(70kDa) ;M :蛋白低分子量标准 Fermentas SM0441。 H :1泳道PTD-eGFP-AhFKH镍柱纯化洗脱产物(61kDa) ;M :蛋白低分子量标准 Fermentas SM0441。 图5.显示了 PTD-hScurfin、PTD-AhFKH和PTD-AhPRD融合蛋白表达的Western blots图鉴定结果。 其中，1泳道PTD-hScurf in (51kDa) ;2禾口 4泳道Fermentas预染Marker ;3泳道 PTD-eGFP-hScurf in (80kDa) ;5泳道PTD-A hPRD (33kDa) ;6泳道PTD-A hFKH(43kDa) ;7 泳道PTD- A hPRD-eGFP (60kDa) ;8泳道PTD- A hFKH-eGFP (70kDa)。在该实验中使用的一 抗为l : 1000抗6XHis-Tag ;二抗1 : 5000HRP-羊抗小鼠IgG。 图6.显示了融合蛋白的亚细胞定位分析的激光共聚焦照片(Hoechst33342和PI 分别染细胞核，绿色荧光是为观察亚细胞定位构建表达的融合蛋白PTD-hScurfin-eGFP、 PTD-A hFKH-eGFP和PTD-A hPRD-eGFP中eGFP的荧光)及Western-blot图结果(目的蛋 白鉴定的一抗为l : 1000抗6XHis-Tag，二抗1 : 5000HRP-羊抗小鼠IgG，内参蛋白的 一抗为抗GAPDH抗体)。 A :PTD-eGFP-hScurf in、PTD_eGFP- A hPRD和PTD-eGFP- A hFKH激光共聚焦显微镜分析图(紫外激发光检测呈蓝色荧光的细胞核，绿色滤光片检测呈红色荧光的细胞核，蓝 色滤光片检测融合蛋白中eGFP绿色荧光)。 B :左图PTD-hScurfin穿膜2h和24h免疫印迹分析；右图胞浆和胞核蛋白提取
物中PTD-hScurfin、PTD-AhFKH和PTD-AhPRD的Western-blot图。 图7.显示了分别使用PHA 0. 5ug/mL、lug/mL、5ug/mL，PHA lug/mL+PMA 25ng/mL、
PHA lug/mL+PMA 50ng/mL、PHA lug/mL+PMA 100ng/mL剌激Jurkat T细胞24h，剌激条件摸
索的实验结果。 A:PHA lug/mL+PMA 50ng/mL剌激Jurkat T细胞12h显微镜下图(10X ， 20X ， 40X)细胞表面出现突起，比较容易被分散。 B:未剌激Jurkat T细胞组，12h显微镜下图(10 X ， 20 X ， 40 X)细胞保持原有容 易聚团生长特点，表面未见突起。C :PHA lug/mL+PMA 50ng/mL剌激Jurkat T细胞24h， cck_8法测定490nm吸光度
分析细胞增殖。 图8.显示了 PTD-hScurf in、PTD- A hFKH和PTD- A hPRD融合蛋白640nM分别对经 PHA+PMA联合剌激24h和48h的Jurkat T细胞增殖水平影响的CCK-8法测定的实验结果。
A:PHA lug/mL+PMA 50ng/mL剌激Jurkat T细胞24h各融合蛋白处理组(640nM， 剌激前lh加入)及各对照组cck-8法测定490nm吸光度比较细胞增殖。
B :PHA lug/mL+PMA 50ng/mL剌激Jurkat T细胞48h各融合蛋白处理组(640nM， 剌激前lh加入)及各对照组cck-8法测定490nm吸光度比较细胞增殖(*p < 0. 05)。
图9.显示了 PTD-hScurf in、PTD- A hFKH和PTD- A hPRD融合蛋白640nM分别对经 PHA+PMA联合剌激活化的外周T细胞增殖的影响。 A :不同浓度PHA+PMA或PMA+Ionomycin剌激后外周血T细胞增殖情况1 : Cells Control ;2 :PHA 0. 5 ii g/mL ;3 :PHA 1 ii g/mL ;4 :PHA 2 ii g/mL ;5 :PHA 1 ii g/ mL+PMA 50ng/mL ;6 :PHA 2 ii g/mL+PMA 30ng/mL ;7 :P廳.5 ii g/mL+PMA 100ng/mL ;8 : PMA30ng/mL+Ionomycinl. 2 u g/ml ;9 :PMA50ng/mL+Ionomycin 0. 8 u g/mL ;10 :PMA70ng/ mL+Ionomycin 0. 4iig/mL。 B :不同融合蛋白(640nm/L)和CsA (3 ii M)对经PHA 1 ii g/mL+PMA 50ng/mL后 外周血淋巴细胞增殖的影响。[96孔板每孔接种IX 105， CsA、 PTD-eGFP、 PTD-hScurfin、 PTD-AhPRD和PTD-A hFKH融合蛋白分别与细胞共育lh，每组同时做3个复孔。而后加入 上述实验得出的最适剂量的PHA/PMA(1 y g/mL/50ng/mL)剌激](*p < 0. 05)。
图10.显示了 Realtime PCR分析融合蛋白对外周T细胞经PHA+PMA剌激后产生 IL-2的影响。 A :PHA 1 ii g/mL+PMA 50ng/mL剌激外周血T细胞后，不同时间点IL-2的转录水 平。(*p < 0. 05)B :不同融合蛋白(640nm/L)和CsA (3 ii M)对经PHA 1 ii g/mL+PMA 50ng/mL后6 小时外周血T淋巴细胞产生IL-2的影响。[6孔板每孔接种1X106/ml， CsA、 PTD-eGFP、 PTD-hScurf in、 PTD-AhPRD和PTD-AhFKH融合蛋白分别与细胞共育lh。而后加入上述实 验得出的最适剂量的PHA/PMA(1 y g/mL/50ng/mL)剌激，实验重复三次](*p < 0. 05)
图11.显示了 Realtime PCR分析融合蛋白对外周T细胞经PHA+PMA剌激后产生IL-10的影响。 A :PHA 1 ii g/mL+PMA 50ng/mL剌激外周血T细胞后，不同时间点IL-10的转录水 平。(*p < 0. 05) B :不同融合蛋白(640nm/L)和CsA (3 ii M)对经PHA 1 ii g/mL+PMA 50ng/mL后2 小时外周血T淋巴细胞产生IL-10的影响。[6孔板每孔接种IX 106/ml， CsA、 PTD-eGFP、 PTD-hScurfin、 PTD-AhPRD和PTD-AhFKH融合蛋白分别与细胞共育lh。而后加入上述实 验得出的最适剂量的PHA/PMA(1 y g/mL/50ng/mL)剌激，实验重复三次](*p < 0. 05)
具体实施例方式
在具体实施方式
中所述的PTD-hScurfin、 PTD-AhFKH禾P PTD-AhPRD融合蛋白具 有SEQID NO. 1-3所示的氨基酸序列。 本发明提供了生产PTD-hScurf in、PTD- A hFKH禾P PTD- A hPRD融合蛋白的方法，该 方法包括下列步骤 1.获得编码PTD-hScurf in、 PTD- A hFKH和PTD- A hPRD融合蛋白的基因序列；
2.将步骤1获得的序列插入到合适的载体中，得到相应的核酸构建体；
3.用步骤2获得的核酸构建体转化合适的工程表达菌； 4.在适宜的培养条件下，诱导步骤3的转化后的工程表达菌，并从中纯化出 PTD-hScurf in 、 PTD- A hFKH和PTD- A hPRD融合蛋白。 5. PTD-hScurf in 、 PTD- A hFKH和PTD- A hPRD融合蛋白或携带eGFP作为示踪的融 合蛋白的激光共聚焦观察融合蛋白的亚细胞定位实验。 6. PTD-hScurf in、PTD- A hFKH和PTD- A hPRD融合蛋白Western-blot鉴定和亚细 胞定位实验。 7. PTD-hScurf in 、 PTD- A hFKH和PTD- A hPRD融合蛋白或携带eGFP作为示踪的融 合蛋白的流式细胞仪检测穿膜效率实验。 8. Jurkat T细胞和外周CD4+CD25—T细胞的PHA+PMA活化增殖条件摸索实验
9. PTD-hScurf in、PTD- A hFKH和PTD- A hPRD融合蛋白对Jurkat T细胞的增殖抑 制实验。 10. PTD-hScurf in、PTD- A hFKH和PTD- A hPRD融合蛋白对外周T细胞的增殖抑制 实验。 11. PTD-hScurf in、PTD- A hFKH禾P PTD- A hPRD融合蛋白抑制外周T细胞分泌IL-2 的实验。 12. PTD-hScurf in 、 PTD- A hFKH和PTD- A hPRD融合蛋白促进外周T细胞分泌 IL-10的实验。 以上实验所涉及的材料来源 pGEM T-Easy/hF0XP3质粒(Amp抗性)为日本京都大学S. Sakaguchi教授惠赠。 pET28a(带有His-Tag)质粒购自Novagen公司产品，peGFP-Nl质粒购自invitrogen公司 产品；大肠杆菌菌株DH5 a日本TAKALA公司产品；BL_21和Rosetta(DE3)均为Novagen公 司产品均由北京大学医学部免疫学系陈慰峰院士赠送。pET28a-PTD质粒(带有His-tag)， pET28a-PTD-eGFP (带有His-tag)载体本实验室自行构建。Ex TaqDNA聚合酶、T4DNA连接酶、核酸电泳分子量标准DL-2000(TaKaRa公司)；质粒小量抽提试剂盒(Axygen公司)；质 粒纯化试剂盒(上海捷瑞公司)；限制性内切酶(Sac I、Xho I、HindIII)及预染色低分子 量蛋白(Fermentas公司)；Bradford蛋白定量试剂盒(北京普利莱公司)；细胞增殖试剂盒 CCK8试剂盒(日本株式会社同仁化学研究所)。纯化树脂Profinity I MAC镍金属螯合填 料(美国Bio-Rad公司产品)，小鼠抗-6 XHis-Tag单克隆抗体(Cell Signaling公司)，小 鼠抗人F0XP3抗体(克隆号236A/E7， eBioscience公司)，HRP标记山羊抗小鼠IgG 二抗 (北京中杉金桥公司)，ECL-plus显色试剂盒、PD-10去盐预装柱(美国GE公司)，E. coli Rosetta(DE3)， pET28a(+)质粒和蛋白复性试剂盒(Novagen公司产品)，蛋白分子量标准 (Fermentas公司产品)，还原型谷胱甘肽(GSH)、氧化型谷胱甘肽(GSSG)、异丙基-P -D_硫 代半乳糖苷(IPTG Dioxane Free)(德国Merck公司产品)，PHA-P， NP_40， PMA， Hoechst 33342，青霉素，链霉素，卡那霉素，碘化丙啶(PI)和PMSF购自美国Sigma公司，透析袋(截 留分子量10， 000，美国Pierce公司)，小牛血清(杭州四季青公司)，Trizol， PMRH640, DMEM，小牛血清和胎牛血清购自美国Invitrogen公司，2XBri 11 iant SYBR Green QPCR Master Mix购自美国Stratagene公司，ReverTraAce购自日本T0Y0B0公司。其余常用的 各种盐、酸、碱等化学试剂均为进口或国产分析纯。 Jurkat T细胞株由北京大学医学部T细胞研究室陈慰峰院士赠送。
引物见表l 表l.用于构建各种表达载体的引物
Primer Pairs_Primer Sequence 5'-3'_Product Annealing (^=s
Size (bp)Temperature (。C)
Sense:AAGGATCCTATGGCAGGAAGAAGCGGAGA
CAGCGACGAAGAGAG CTCATGGTGAGCAAGG
PTD-eGFP(单划线处为BamHl酶切位点，双划线处为Sac I
(N)酶切位点，BamH I和Sac I酶切位点之间为PTD序77556°C 30sec25
(primer 1)列)； Antisense:CCOAGCICTTACTTGTACAGCTCGTC (双划线处为Sacl酶切位点)
PTD-eGFP (C) (primer 2)Sense:AGAAAGCTTATGGTGAGCAAGG (划线处为 HindHI酶切位点)73956°C 30sec25
Antisense:CCCTCGAGTTACTTGTACAGCTCGTC (划线处为Xho I酶切位点)
Sense:GCCAAGCTTATGCCCAACCCCAG (划线处为
FullFOXP3 HindIII酶切位点)129662。C30sec25
(primer 3)Antisense:GATCTCGAGTCAGGGGCCAGGTGTAG (划 线处为XhoI酶切位点)
Sense:CATGAGCTCCGATGCCCAACCCCAG (Sac I酶
△FKH切位点)100862.9。C 30sec25
(primer 4)Antisense:GCAAGCTTCATGTTGTGGAACTTGAAG (划线处为HindIII酶切位点)
Sense:CTGGAGCTCCGGGTGTCTGCAAGTGGCC
△PRD(SacI酶切位点)70562.9°C 30sec25
(primer 5)Antisense:TCAAGCTTGGGGCCAGGTGTAGGGTTG (划线处为HindIII酶切位点)
以上步骤具体描述如下 1.制备并鉴定目的融合蛋白，包括步骤(1)_(4): (l)pET28a-PTD-eGFP(N)质粒(eGFP在融合蛋白的N端)的构建以peGFP-Nl质 粒为模板，用引物对primer 1 (前向引物带有PTD序列)通过PCR扩增获得带PTD的eGFP 的序列，PCR产物使用GenClean琼脂糖DNA凝胶回收试剂盒(上海捷瑞公司)进行回收后， 然后插入经BamH I和Sac I双酶切的pET28a就完成质粒的构建。 (2)pET28a-PTD质粒的构建在pET28a-PTD-eGFP (N)质粒构建的基础上，用Sac I 单酶切切除中间的eGFP即得到的是pET28a-PTD(图1) (3) pET28a-PTD-eGFP (C)质粒(eGFP在融合蛋白的C端)的构建以peGFP-Nl质 粒为模板，用引物对primer 2扩增获得的eGFP序列，PCR产物使用GenClean琼脂糖DNA凝 胶回收后，插入经Hind III和Xho I双酶切的pET28a-PTD质粒，即完成构建。
(3) pET28a-PTD-hF0XP3禾口 pET28a-PTD-hF0XP3-eGFP表达质粒的构建以 pGEMT-Easy/hF0XP3质粒为模板，采用引物对primer 3通过PCR扩增获得h F0XP3的基因 序列，PCR产物使用GenClean琼脂糖DNA凝胶回收后，分别插入经Hind III和Xho I双酶 切的pET28a-PTD质粒和pET28a-PTD_eGFP (N)质粒，即完成构建。 (4) pET28a-PTD-A hFKH禾P pET28a-PTD_eGFP-A hFKH表达质粒的构建以 pGEMT-Easy/hF0XP3质粒为模板，采用引物对primer 4通过PCR扩增获得A hFKH的序列， PCR产物使用GenClean琼脂糖DNA凝胶回收后，分别插入经Sac I和Hind III双酶切的 pET28a-PTD质粒和pET28a-PTD_eGFP (C)质粒，即完成构建。 (5) pET28a-PTD-A hPRD和pET28a-PTD_eGFP-A hPRD表达质粒的构建以 pGEMT-Easy/hF0XP3质粒为模板，采用引物对primer 5，通过PCR扩增获得A hPRD的序列， PCR产物使用GenClean琼脂糖DNA凝胶回收后，分别插入经Sac I和Hind III双酶切的 pET28a-PTD质粒和pET28a-PTD_eGFP (C)质粒，即完成构建。 (6)构建的质粒分别转化细菌，提取质粒，采用T7通用引物，经上海英骏生物 技术有限公司测序，证实PCR产物已经准确克隆到表达载体中。结果成功构建了融合蛋 白的原核表达载体pET28a-PTD-hScurfin、 pET28a_PTD-A hFKH、 pET28a_PTD-A hPRD、 pET28a-PTD-eGFP-hScurfin、 pET28a_PTD-A hFKH-eGFP、 pET28a_PTD-A hPRD-eGFP (附图 2)。将鉴定正确的克隆后的表达载体通过热击法转化到工程表达菌Rosetta(DE3)大肠埃 希菌中，并通过抗生素Kana+(终浓度为50iig/ml)筛选阳性菌落。将阳性菌落抽提质粒， 进行PCR和酶切鉴定。(附图3) 将鉴定正确的阳性菌落在ra7.0的LB管(Kana浓度为50iig/ml)中进行增菌 培养，当OD值二 0. 4 0. 6时，加入IPTG(Sigma公司)进行诱导。经过对诱导过程中 的时间梯度、温度梯度、IPTG浓度梯度的实验，最终确定IPTG诱导条件，PTD-hScurfin 和PTD-hScurfin-eGFP以30 。C、0. 2mmol/L诱导8h为最适诱导条件；PTD-AhFKH、 PTD- A hPRD、 PTD- A hFKH-eGFP和PTD- A hPRD-eGFP以30°C 、0. 5mmol/L诱导8h为最适诱 导条件。通过SDS-PAGE电泳分析确定目的蛋白的表达量最大(附图4)。
收集在上述条件下诱导的部分菌体，加入适量的PBS，冰浴中超声破碎，12000rpm/ min离心10分钟，分别取上清和沉淀经SDS-PAGE电泳分析，证实6种融合蛋白主要为包 涵体形式表达。然后取上清经NitlMAC柱(Bio-Red公司)进行亲和层析纯化。上样前Ni+-IMAC柱先经过10倍体积的上样缓冲液洗柱。将超声裂解完全的包涵体用结合缓冲 液(50mMNaH2P04 2H20、300mM NaCl、5mM咪唑、8M尿素，调整pH至8. 0)溶解后过滤，收 集滤液，按照Bio-Rad公司操作说明书在离心管中将滤液和Prof inity IMAC Ni-Charged Resin结合，4t:轻摇lh，然后装柱，将流出液反复冲洗离心管，再上柱，以免蛋白丢失。将 流出液反复过柱3-4次。加洗涤缓冲液(50mM NaH2P04 2H20、300mM NaCl、 100mM咪唑、 8M尿素，调整pH至8. 0)，测定流出液的A280值，待A280趋近于0时，准备加洗脱缓冲液 (50mMNaH2P04 2H20、300mM NaCl、300mM咪唑、8M尿素，调整pH至8. 0)。待洗涤缓冲液全 部流出后，加洗脱缓冲液。EP管收集流出液，并测定A280值。以上均在pH二8.0环境下进 行，取收集的各组分样品进行SDS-PAGE电泳，分析目的蛋白的纯化效果和效率(附图3)。 Ni"-IMAC纯化后的蛋白过GE公司PD-10预装柱脱盐及尿素，而后-2(TC保存于10%甘油 溶液中备用，用时Bradford法定量融合蛋白。通过以上步骤成功诱导表达和分离纯化了融 合蛋白PTD-hScurf in、PTD- A hFKH、PTD- A hPRD和PTD-eGFP-hScurf in、PTD- A hFKH-eGFP、 PTD-AhPRD-eGFP(附图4)。纯化的蛋白随后进行Western-blot鉴定( 一抗1 : 1000抗 6XHis-Tag，二抗:1 : 5000HRP-羊抗小鼠IgG)确认为我们制备的目的蛋白(附图5)。
2.融合蛋白进行以下穿膜功能实验
(1)细胞培养及穿膜效应的流式细胞仪检测 Jurkat T细胞，常规培养于含10 %小牛血清、100U/mL青霉素、100g/L链霉素的 RPMI-1640培养液。以2X 105/孔细胞浓度种于24孔板，与不同浓度(40nM， 160nM，640nM， 1280nM)的PTD-eGFP-目的蛋白共育2h， 4h， 12h， 24h。 1000 X g离心10min分别收集各孔细 胞用PBS洗3次，FASCaliber流式细胞仪收集以及CellQuest软件分析显示融合蛋白最 佳穿膜浓度为640nM，穿膜的高峰在第2h，随后随着时间的延长穿膜效率逐渐下降。
(2)激光共聚焦显微镜观测穿膜蛋白在细胞内的定位 收集分别与640nM的PTD-eGFP-hScurf in、PTD- A hFKH-eGFP和PTD- A hPRD-eGFP 融合蛋白共育2h的细胞，1000Xg离心10min。预冷PBS洗2遍，1000 X g离心，5min。加 入O. 5mL 4%多聚甲醛固定液，缓缓悬起细胞，固定30分钟。离心去固定液，用PBS洗2遍， 洗涤期间手动晃动。加入PI染色液(终浓度50i!g/mL)缓缓悬起细胞，4t:避光染色30分 钟，PBS洗涤。加25yL PBS重悬细胞并滴加至载玻片上，盖上洁净的盖玻片，指甲油封片。 共聚焦显微镜下使用绿色滤光片检测呈红色荧光的细胞核，使用蓝色滤光片检测融合蛋白 中eGFP绿色荧光。另外加入Hoechst33342(终浓度2ug/mL)到与640nM蛋白共育2h的 活细胞体系中(24孔板中，2X107孔)37t:孵箱中染色10min，共聚焦显微镜下使用紫外激 发光检测呈蓝色荧光的细胞核，使用蓝色滤光片检测融合蛋白中eGFP绿色荧光。结果从影 像上确认无论活细胞还是细胞固定后对细胞核进行染色后经激光共聚焦断层三维定位分 析均见大部分细胞胞内含带有eGFP绿色荧光的目的融合蛋白，并且该融合蛋白能够穿入 细胞核内。(附图6A) (3)胞浆和胞核蛋白提取及免疫印迹检测 1000 Xg离心10min收集分另U与640nM的PTD-hScurf in、 PTD-AhFKH和 PTD-AhPRD融合蛋白共育2h禾口24h的Jurkat T细胞，用4。C预冷的PBS洗3遍，加400 yl冷 Buffer A(10mMHEPEs、10mM KC1、0. lmM EDTA、0. lmM EGTA、0. 5mM PMSF，pH7. 9)，冰浴10min ; 加25ii 1 10% NP-40， Vortex 10s，冰浴10min， 12000Xg离心15s，收集上清，即为胞桨蛋白；力口50ii l冷Buffer B(20mM HEPEs、0. 4M NaCl、lmM EDTA、lmM EGTA、lmM PMSF、lmMDTT， pH7.9)至沉淀，置冰上30min;12000Xg离心10min，收集上清，即为胞核蛋白；加等量的 2XSDS上样缓冲液，煮沸5min，-8(TC冻存备用。提取的胞浆胞核蛋白用12% SDS-PAGE胶 分离；350mA 2h将蛋白转印至PVDF膜；用5%脱脂牛奶(溶解于TBS/T液)封闭lh ;加抗 6XHis-Tag(1 : 1000)，4。C过夜，用TBS/T洗涤3次；加HRP-羊抗小鼠IgG(l : 5000)，室 温lh， TBS/T洗涤3次；加ECL-Plus化学发光剂，作用5min，扫膜，拍照；一抗二抗剥脱液 洗膜5-10min，封闭lh，4。C过夜孵育抗GAPDH抗体(1 : 1000) ， TBS/T洗涤，HRP-羊抗小鼠 IgG(l : 5000)室温静置lh，TBS/T洗涤后ECL-Plus显色，扫描检测GAPDH内参蛋白，结果 从另一方面进一步确认了激光共聚焦分析的结果制备的融合蛋白均能在2h-24h内穿透 细胞膜进入胞内并定位于核内，且截至穿膜第24h细胞核内仍存在目的融合蛋白，而此时 细胞质提取物中已无法用Western-blot检测出靶蛋白(附图6B)。
3.细胞增殖抑制实验 (1) Jurkat T细胞和外周血T细胞剌激条件的摸索 分别使用PHA 0. 5ug/mL、lug/mL、5ug/mL， PHA lug/mL+PMA 25ng/mL、 PHAlug/ mL+PMA 50ng/mL、 PHA lug/mL+PMA 100ng/mL剌激Jurkat T细胞观察6h， 12h， 24h剌激效 果，经实验最终选取的最适剌激剂量为PHA lug/mL+PMA 50ng/mL，剌激时间选取24h(附 图7)。 (2) CCK-8法检测细胞增殖 Jurkat T细胞增殖抑制试验将细胞用含10%小牛血清的1640培养液调整适量 的浓度。将Jurkat T细胞分别以2 X 104每孔种于96孔板。以环孢霉素A (CsA) ， PTD-eGFP 融合蛋白及hScurfin蛋白做对照组，实验组分别加入640nM的各融合蛋白与细胞共育lh， 每组同时做3个复孔。而后加入最适剂量的PHA(l y g/mL)+PMA(50ng/mL)剌激，将细胞置于 37°C ， 5% C02培养箱中培养，分别于PHA+PMA剌激第18h和第42h加入CCK-8试剂10 y 1/ 孔(总体积100uL/孔)，继续培养6小时，用酶标仪检测490nm时的吸光度，分析数据显示 PHA+PMA联合剌激24h和48h后PTD-hScurf in、PTD- A hPRD (终浓度640nM)与对照组相比 对JurkatT细胞的增殖具有明显的抑制作用，而在剌激48h后PTD-AhFKH(终浓度640nM) 也呈现出明显抑制作用，其中PTD-hScurfin的抑制效果与CsA阳性对照组相当(附图8)。
外周T细胞增殖抑制试验将外周T细胞用含10%小牛血清的1640培养液调整适 量的浓度。将外周血T细胞分别以1 X 105每孔种于96孔板。以CsA (终浓度为3 ii M)为阳性 对照，以PTD-eGFP及hScurfin融合蛋白(640nM)作为阴性对照组，实验组PTD-hScurfin、 PTD- A hPRD和PTD- A hFKH融合蛋白浓度分别以640nM分别与细胞共育lh，每组同时做3个 复孔。而后加入上述实验得出的最适剂量的PHA(ly g/mL)+PMA(50ng/mL)剌激，将细胞置 于37°C ， 5% C02培养箱中培养，于PHA+PMA剌激第20h加入CCK-8试剂10 y1/孑L (总体积 100 y L/孔)，继续培养4h，用酶标仪检测490nm时的吸光度，分析数据。结果发现不加蛋 白剌激的空白组PBMC增殖明显；不带穿膜序列的hF0XP3蛋白，对PBMC的增殖无明显影响； 而带穿膜序列的全长PTD-hScurfin显著抑制PBMC的增殖；带穿膜序列的PTD- A hPRD片段 的抑制能力高于PTD-AhFKH片段，但均低于全长的PTD-hScurfin，说明FKH区域在Fo邓3 的抑制功能中起重要的作用，而PRD片段(N末端富含脯氨酸区域)也有一定的抑制功能。 试验说明，我们所构建的PTD-hScurf in、PTD- A hPRD和PTD- A hFKH融合蛋白具有抑制外周T细胞的增殖的生物学功能。(*P<0.05)。(附图9)。
3.调控Treg功能相关细胞因子的表达实验 细胞因子IL-2和IL-10的RT-PCR检测采集健康人肝素抗凝外周血，经淋巴细胞
分离液分离获得外周单个核细胞，经贴壁去除巨噬细胞和单核细胞，然后采用CD19和CDS
单抗和补体杀伤去除B细胞和CD8+T细胞，洗涤后将细胞接种于6孔板，每孔2 X 106，分别与
CsA (3 ii M) 、PTD-eGFP、PTD-hScurf in、PTD- A hPRD和PTD- A hFKH等融合蛋白(640nM)共育
lh，而后加入PHA(ly g/mL)+PMA(50ng/mL)剌激活化细胞0h， 2h， 4h， 6h， 8h，收集细胞。收集
每个样本2X 106个细胞，按常规Trizol裂解法提取总RNA。 按照下列体现进行逆转录 Reagent volume 5 X reaction buffer 4. 0 li 1 d證mix (10mM each) l.Oyl Recombinant RNase inhibitor 0. 5 li 1 M-MLV reverse transcriptase l.Oul Total 6. 5ul 混匀后42"反应20分钟，94t:加热5分钟灭活以终止cDNA合成，4" 5分钟。再 按照下列体系进行梯度PCR扩增在0. 2ml PCR管中建立10 y 1PCR反应体系，加入的各成
分分别为10XPCR buffer1 ii 1d證s(10mM each)1 ii 1Forward primer0. 2ii 1Reverse primer0. 2ii 1cDNA0. 2ii 1Taq DNA聚合酶0. 06ii 1无菌水7. 34ii 1总体积10 ii 1混匀后94t:预变性2分钟，进行梯度PCR扩增。
各基因扩增所用引物和PCR反应所选择的温度为
1. P —actin Forwardprimer :CAC GAA ACT ACC TTC AAC TCC ;
Reverse primer :CATACTCCTGCT TGC TGA TC ;2.IL-2Forward primer :CAA AGA AAA CAC AGC TAC AACT ;
Reverse primer :TCTCATCAGCAT ATT CAC ACAT ;3.IL-lOForward primer :AGG GCA CCC AGT CTG AGAACA ;
Reverse primer :CGGCCTTGCTCT TGT TTT CAC4.所选温度为53. 3 °C ， 54. 2 °C ， 55. 2 °C ， 56. 4 °C ， 57. 5 °C ， 58. 5 °C ， 59. 4 °C ，60. 0°C，60. 4t:，摸索合适的退火温度，最后确定采用56t:作为退火温度。
将上述扩增的PCR产物回收，连接T载体，构建标准质粒，并测序鉴定。采 用realtimeRT-PCR测定细胞因子IL-2和IL-10的表达水平。以上述cDNA为模板， 2XSYBRGreen QPCRMaster MIX,在置于冰上的0. 2ml PCR管中依次加入下列成分
2XMIX7. 5ii 1腿(i : 500)0. 3ii 1Forward primer0. 2ii 1Reverse primer0. 2ii 1cDNA1. Oil 1ddH205. 8ii 1总体积15ii 1混匀，瞬时离心5秒，使各反应成分集中于PCR管底。反应条件如下95。C lOmin，
95°C 30sec，56。C 30sec，72。C lmin(acquire fluorescence) ，40循环。
外周血T细胞经过剌激PHA+PMA剌激后，在6 8h时IL_2转录水平最高，因此 采用剌激6h作为最合适的时间点进行试验。结果发现PTD-hScurfin、 PTD-AhPRD和 PTD- A hFKH能够抑制外周血T细胞分泌IL-2、其中PTD-hScurf in、PTD- A hPRD具有显著性 意义，而PTD-AhFKH未见统计学意义(图10)。外周血T细胞剌激后IL-10的分泌水平逐 步上升，在2h时水平比较低，因此比较适合观察融合蛋白提高其产生IL-10的作用，因此选 择2h剌激作为实验时间点。结果发现PTD-hScurf in、PTD- A hPRD和PTD- A hFKH能够促进 外周血T细胞分泌IL-10、其中PTD-hScurf in、PTD- A hPRD具有显著性意义，而PTD- A hFKH 未见统计学意义(图ll)。
0169]SEQUENCE LISTING
0170]〈110>江苏大学
0171]〈120〉带穿膜序列的人Scurfin蛋白全长及片段以及制备方法
0172]〈130〉
0173]〈160>3
0174]〈170>PatentIn version 3.3
0175]〈210>1
0176]〈211>482
0177]〈212>PRT
0178]〈213〉人
0179]〈400>1
0180]Met Gly Ser SerHisHisHisHisHisHisSerSerGlyLeuValPro
0181]151015
0182]Arg Gly Ser HisMetAlaSerMetThrGlyGlyGinGinMetGlyArg
0183]202530
0184]Gly Ser Tyr GlyArgLysLysArgArgGinArgArgArgGluLeuArg
0185]354045
0186]Arg Gin Ala LeuProAsnProArgProGlyLysProSerAlaProSer
0187]505560
0188]Leu Ala Leu GlyProSerProGlyAlaSerProSerTrpArgAlaAla
0189]65707580
0190]Pro Lys Ala SerAspLeuLeuGlyAlaArgGlyProGlyGlyThrPhe0191]859095
0192]GinGlyArgAspLeuArgGlyGlyAlaHisAlaSerSerSerSerLeu
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505560GluGluProGluAspPheLeuLysHisCysGinAlaAspHisLeuLeu65707580AspGluLysGlyArgAlaGinCysLeuLeuGinArgGluMetValGin859095SerLeuGluGinGinLeuValLeuGluLysGluLysLeuSerAlaMet100105110GinAlaHisLeuAlaGlyLysMetAlaLeuThrLysAlaSerSerVal115120125AlaSerSerAspLysGlySerCysCyslieValAlaAlaGlySerGin130135140GlyProValValProAlaTrpSerGlyProArgGluAlaProAspSer145150155160LeuPheAlaValArgArgHisLeuTrpGlySerHisGlyAsnSerThr165170175PheProGluPheLeuHisAsnMetAspTyrPheLysPheHisAsnMet180185190ArgProProPheThrTyrAlaThrLeulieArgTrpAlalieLeuGlu195200205AlaProGluLysGinArgThrLeuAsnGlulieTyrHisTrpPheThr210215220ArgMetPheAlaPhePheArgAsnHisProAlaThrTrpLysAsnAla225230235240lieArgHisAsnLeuSerLeuHisLysCysPheValArgValGluSer245250255GluLysGlyAlaValTrpThrValAspGluLeuGluPheArgLysLys260265270ArgSerGinArgProSerArgCysSerAsnProThrProGlyPro27528028权利要求
一种PTD-hScurfin融合蛋白，其特征在于，具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列
2. —种PTD-Ah FKH融合蛋白，其特征在于，具有SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列。
3. —种PTD-Ah PRD融合蛋白，其特征在于，具有SEQ ID NO. 3所示的氨基酸序列。
4. 一种核酸构建体，其特征在于，它含有编码权利要求1-3中任何一项所述的融合蛋 白的氨基酸序列。
5. —种制备权利要求1-3中任一项所述的融合蛋白的方法，其特征在于，该方法包括 下列步骤(l)获得编码融合蛋白的基因序列；(2)将步骤(1)获得的序列插入到合适的载 体中，得到相应的核酸构建体；(3)将步骤(2)获得的核酸构建体转化适宜的表达菌；(4) 在适宜的培养条件下，培养步骤(3)的表达菌，并加入适量的异丙基-e-D-硫代半乳糖苷， 0. 2mM-lmM终浓度诱导表达，从中分离出表达的融合蛋白。
6. 根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，当步骤(4)的融合蛋白为包涵体形式 表达的，在步骤(4)后还有将包涵体通过镍柱在变性剂存在条件下亲和纯化，纯化产物通 过去盐柱后冻存备用。
全文摘要
本发明涉及基因工程及蛋白转导的生物医学技术领域。具体涉及带穿膜序列的人Scurfin全长、去除叉头结构结构域人Scurfin片段和去除富含脯氨酸结构域人Scurfin片段的融合蛋白及制备方法。所说的带穿膜序列的人Scurfin全长、去除叉头结构结构域人Scurfin片段和去除富含脯氨酸结构域人Scurfin片段的融合蛋白分别具有SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ IDNO.3所示的氨基酸序列。本发明首次采用构建PTD-hScurfin方式获得融合蛋白，通过蛋白穿膜结构域直接介导融合目的蛋白转导入Jurkat T和外周CD4+CD25-T细胞，以大量获取Treg，突破制约Treg应用的瓶颈，以期最终应用于临床的器官移植抗排斥治疗。
文档编号C07K19/00GK101704893SQ200910221169
公开日2010年5月12日 申请日期2009年11月2日 优先权日2009年11月2日
发明者徐三荣, 田雨香, 蔺欣, 许逊, 邵启祥 申请人:江苏大学