抗体的制作方法

专利名称：抗体的制作方法
技术领域：
本发明涉及可与促甲状腺素(TSH)受体(TSHR)反应的人单克隆自身抗体(MAb)。 一种人MAb (K1-18)具有结合TSHR并刺激TSHR环AMP活性的能力。另外一种人MAb (Kl-70) 具有结合TSHR并且阻断由TSH和TSHR刺激抗体介导的对环AMP的刺激的能力。这两种人 MAb都是从表现出甲状腺机能减退临床症状的患者的外周淋巴细胞中分离得到的。
背景技术：
甲状腺的功能由垂体分泌的TSH调节(kkudlinski MW, et al，2002. Physiological Reviews 82 :473-502)。TSH与甲状腺细胞表面上的TSHR结合，并且这是引发TSHR信号级联反应的第一步。TSH与TSHR的结合导致对甲状腺激素甲状腺素(T4)和三碘甲状腺原氨酸CH)的形成和释放的刺激。涉及循环中的T4和T3和由下丘脑分泌的促甲状腺素释放激素(TRH)的水平的反馈机制控制TSH的释放，TSH转而控制甲状腺刺激作用和甲状腺激素在血清中的水平(kkudlinski MW, et al，2002，文献见上文)。TSHR是 G蛋白偶联的受体，由三个结构域组成富含亮氨酸的重复结构域(LRD)、切割结构域(CD) 和跨膜结构域(TMD) (Nunez Miguel R，et al 2004. Thyroid 14:991-1011)。本领域详尽地记载了一些自身免疫甲状腺疾病(AITD)患者出现了可与TSHR反应的自身抗体(Rees Smith B，et al 1988. Endocrine Reviews 9:106—121)。有两种主要的 TSHR自身抗体(TRAb)类型刺激型和阻断型。甲状腺刺激型自身抗体与TSHR结合并且模仿TSH的作用从而刺激甲状腺产生高水平的T4和T3 ；这些自身抗体还被描述为具有刺激活性或 TSH激动活性的 TRAb (Rees Smith B，et al 2007. Thyroid 17 :923-938)。甲状腺功能的所述反馈控制机制在甲状腺刺激自身抗体存在下不再有效，并且患者表现出亢进甲状腺临床症状，特征是在血清中有过多的甲状腺激素及其代谢产物。这种病症被称为格雷夫斯病(Graves，s disease)。具有刺激活性的TRAb还可与眶后组织中的TSHR相互作用并且促使格雷夫斯氏病眼部症状的出现。作为强力甲状腺刺激物起作用的人单克隆自身抗体 (hMAb TSHRl ；也被称作 M22)已经在 WO 2004/050708A2 中详细描述。如 W02008/025991A1 所述，已通过χ射线结晶学在2.55人分辨率下解析了与TSHR LRD结合的M22 Fab复合物的结构。对所述TSHR-M22复合物结构的分析为参与相互作用的受体残基和刺激自身抗体残基提供了详细信息。为测量TSHR 抗体，已在 ELISA 中使用 M22(Z0phel，K et al, Clinica Chimica Acta 2009 and Zophel, K et al, Clinica Chimica Acta 2008)。阻断型TRAb比刺激性自身抗体出现在AITD患者中的频率更小。阻断型自身抗体与TSHR结合，防止TSH与所述受体结合，但是不能刺激TSHR活性。结果甲状腺激素(T4 和T3)的形成和分泌大量减少，而且具有该类型TRAb的患者可表现出甲状腺活化不足的临床症状(甲状腺机能减退)。阻断型自身抗体被称为具有阻断活性或TSH拮抗活性的 TRAb (Rees Smith B, et al 1988 文献见上文，和 Rees Smith B, 2007 et al，文献见上文)。具有阻断活性的TRAb当存在于孕妇血清中时会穿过胎盘并且可阻断胎儿甲状腺中的TSHR，导致新生儿甲状腺机能减退和严重的发育后果。此外，具有阻断活性的TRAb可存在于患病母亲的乳汁中找到并且可在婴儿中引起临床甲状腺机能减退(Evans C,et al 2004 European Journal of Endocrinology 150:265-268)。具有 TSH 拮抗活性的 TSHR 人自身抗体(5C9)已在WO 2008/099185A1中详细描述。患有AITD并具有循环TRAb的患者的临床症状与自身抗体对TSHR活性的作用即TRAb是否引起刺激或阻断有关。但是，已经提出在一些患者中刺激和阻断TRAb的混合物可同时出现，总的临床表现与一种类型的TRAb的更高的浓度和/或活性相关(Rees Smith B et al 1988文献见上文；Furmaniak J et al 1993 Springer Seminars in lmmunopathology 14 :309-321 and Schott M et al 2005 Trends in Endocrinology and Metabolism 16 :243-248)。此夕卜，朿Ij激或阻断 TRAb 的浓度和/或活性在同一患者的病程中有所变化，并且已报道，随着时间的变化，在同一患者中确实有从甲状腺机能减退到甲状腺机能亢进的症状波动(Rees Smith B et al 1988文献见上文；Furmaniak J and Rees Smith B 1993 文献见上文和 Schott M et al 2005 文献见上文)。但是，使用目前可用的生物测定来分开具有不同生物学活性的TRAb或者区分血清样本中的这些TRAb的尝试是困难的。最近，W02006/016121A1中描述的发明提供了用使用在R255突变的TSHR的生物测定来区分刺激型或阻断型TRAb的方法。人重组TSH (Thyrogen )是根据cGMP规范生产的重组蛋白形式的人TSH制品，并被美国FDA批准作为一种诊断残留或复发甲状腺癌的辅助物(Dimtas LH,Cooper DS 2008 Thyroid 18:509-516)。治疗后监测甲状腺癌患者包括用重组人TSH刺激甲状腺残余物或转移灶，之后进行甲状腺扫描和/或血清甲状腺球蛋白水平测量(Dimtas LH and Cooper DS 2008文献见上文)。人绒毛膜促性腺激素是在怀孕时产生的激素，具有轻微的甲状腺刺激作用(Grossmann M et al 1997 Endocrine Reviews 18 :476-501)。对刺激型或阻断型 TRAb的表征以及它们与TSHR如何相互作用对于诊断和治疗不同形式的AITD的改良方法的开发是至关重要的。此外这些研究对于开发用于治疗与对TSHR的自身免疫应答相关的疾病的新方法至关重要。重组人TSH以外的强力甲状腺刺激物的可利用性会提供检测监测和治疗甲状腺癌患者的新选择。相关的在先专利申请W02004/050708A2中描述的发明提供了具有强刺激活性的人单克隆自身抗体 (MAb)特性及其与TSHR的相互作用的详情。如W02008/025991A1所述，该自身抗体(M22)与所述TSHR LRD之间的相互作用已从对所述两个分子的复合物的X-射线衍射分析(2. 55 A 分辨率)中在分子水平上得到解析。W02006/016121A1公开了包括至少一个点突变的突变 TSHR制品，所述TSHR制品可被用在对来自被筛查患者的体液中的患者血清刺激TSHR自身抗体、患者血清阻断TSHR自身抗体和TSH的差示筛选和鉴定中。W02004/050708A2中还描述了具有TSHR阻断活性的小鼠MAb (9D33)的产生和表征。9D33与TSHR以高亲和力O X IO10L/ mol)结合并且是TSH、hMAb TSHRl (M22)和具有刺激或阻断活性的患者血清TRAb的有效拮抗剂。W02008/099185A1公开了 TSHR的人MAb(5C9)的分离和表征，所述人MAb (5C9)是患者血清中的TSH和刺激TRAb的有效拮抗剂。已意外地发现5C9会抑制TSHR组成性活性(也被称作TSHR基础活性)，即在没有TSH或M22的测试系统中的环AMP的产生。此外，还发现5C9能够抑制与TSHR激活突变相关的TSHR环AMP活性。W02008/091981A2描述了具有抑制TSHR组成性活性能力的小鼠MAb和使用所述MAb治疗包括甲状腺机能亢进和甲状腺癌的甲状腺疾病的方法。W02008/091981A2中描述的MAb的特性也在Chen CR et al 2007 Endocrinology 148 :2375-2382 中被公开。本发明已从一名患有甲状腺机能减退并且具有高水平TSHR自身抗体的M岁女性患者的外周血淋巴细胞中分离到抗体K1-18和K1-70。所述患者有8年的AITD病史并且最初呈现甲状腺机能亢进和对持续3年的甲巯咪唑(methimazone)治疗有反应。但是，在达到甲状腺机能正常状态(即具有正常功能)大约10个月后，所述患者出现了甲状腺机能减退并且接受甲状腺素治疗。在收集血液时所述患者已出现甲状腺机能减退约4. 5年。在淋巴细胞分离时，TSH结合抑制试验测得血清TRAb水平是160单位/L。所述血清还表现出阻断TSH对 TSHR的刺激作用的能力(基于环AMP的试验)。血清甲状腺过氧化物酶自身抗体在>500
/mL (g National Institute for Standards and Control (NIBSC) Potters
Bar, UK的参照制品66/387的单位)时为阳性。通过以Epstein Barr病毒(EBV)感染使所述患者的淋巴细胞无限增殖化并且就其抑制125I-TSH与TSHR包被管结合的能力对所述感染细胞培养物的上清液进行筛选。将来自阳性细胞培养物的细胞与小鼠/人细胞系融合并且如上所述筛选。得到2个分泌TSHR自身抗体的稳定克隆。从所述克隆培养物的上清液中纯化IgG并且评估所述2个MAb (K1-18和K1-70) IgG结合TSHR并影响TSHR活性的能力。具体地，研究了 K1-18或K1-70抑制TSH与TSHR结合的能力。还研究了 K1-18刺激 TSHR的能力并且将之与各种其他甲状腺刺激物的活性比较。研究了 K1-70抑制TSH刺激 TSHR的能力并且将之与其他TSH拮抗剂比较。此外，评估了刺激或阻断患者血清TRAb抑制 K1-18和K1-70的TSHR结合以及生物活性的能力。此外，研究了 K1-18和K1-70在TSHR抗体、TSH和相关化合物的测定中的用途。对K1-18和K1-70的重链(HC)和轻链(LC)的可变区(V区)基因进行测序并且找出互补决定区(CDR)。此外，使Kl-70Fab的纯化制品结晶并用X-射线衍射法分析。这些分析提供了关于Kl-70Fab总体结构和K1-70的抗原结合位点的拓扑结构的分子水平的细节。

发明内容
本发明的一个方面提供分离的人抗体分子，所述分离的人抗体分子会与TSHR结合并且会减少配体诱导的对所述TSHR的刺激，但对所述TSHR的组成性活性没有作用。优选地，提供分离的人抗体分子或其片段，所述分离的人抗体分子或其片段会结合所述TSHR并且会减少配体诱导的对所述TSHR的刺激，但对所述TSHR的组成性活性没有作用，其中所述人抗体或其片段具有患者血清TSH受体自身抗体抑制TSH和M22结合所述 TSHR的特性。更优选地，所述分离的人抗体分子或其片段具有选自以下的至少一个另外的患者血清TSH受体自身抗体的特性对所述TSHR具有至少l(fL/m0l的结合亲和力；和具有以少于10μ g/mL的抗体浓度引起可检测的对配体诱导的TSHR刺激的阻断的能力。甚至更优选地，所述另外的患者血清TSH受体自身抗体的特性选自对TSHR具有至少IO9LAioI的结合亲和力和具有以少于1 μ g/mL、优选少于0. 1 μ g/mL的抗体浓度引起可检测的对配体诱导的TSHR刺激的阻断的能力。所述分离的人抗体可以是TSH和/或甲状腺刺激自身抗体、和/或甲状腺刺激动物抗体和/或人绒毛膜促性腺激素的拮抗剂。所述分离的抗体分子可以是会与TSH、M22或K1-18中的至少一种结合的TSH受体的抑制剂。所述分离的抗体分子可包含抗体VH区，所述抗体VH区选自图恥和5d的氨基酸序列(分别是SEQ ID No 41和51)。所述分离的抗体分子可包含抗体VH区，所述抗体VH 区优选由图恥和图5d的氨基酸序列(分别是SEQ ID No 41和51)组成。所述分离的抗体分子可包含选自分别示于图5b和5d的CDR I (SEQ ID No 42和52)、II (SEQ ID No 43 和53)和III (SEQ ID No 44和的CDR。本发明的抗体分子可包含VH区，所述VH区包含一段或多段与这些⑶R有很大同源性的氨基酸序列。本发明的抗体优选地显示出与图5d 所示的⑶R(SEQ ID No 52、53和54)有70-99. 9%的氨基酸同源性。所述分离的抗体分子优选地包含图5d的⑶R I、II*III(SEQ ID No 52、53和Μ)。在优选的实施方案中，所述分离的抗体分子的相应部分具有与这些CDR之一至少70%的同一性，更优选至少80%的同一性，高度优选至少90%的同一性，特别优选至少95%的同一性并且尤其优选99. 9%的同一性。所述分离的抗体分子可包含抗体VL区，所述抗体VL区优选地选自图6d的氨基酸序列(SEQ ID No 69)。所述分离的抗体分子可包含优选由图6d的氨基酸序列(SEQ ID No 69)构成的抗体VL区。所述分离的抗体分子可包含选自图6d的⑶R I (SEQ ID No 70)、 IKSEQ ID No 71)或III(SEQ ID No 72)的⑶R。并且/或者，本发明的分离的抗体分子可包含一段或多段与这些CDR有很大同源性的氨基酸序列。本发明的分离的抗体分子的CDR 优选地显示出与图6d显示的⑶R(SEQ ID No 70、71和72)有70-99. 9%的氨基酸同源性。 在优选的实施方案中，所述分离的抗体分子具有至少70%的同一性，更优选至少80%的同一性，高度优选至少90%的同一性，特别优选至少95%的同一性并且尤其优选至少99. 9% 的同一性。所述分离的抗体分子优选地包含图6d的CDR I、II和III (SEQ ID No 70、71和 72)。所述分离的抗体分子可具有如图9a所示的分子结构，且抗原结合位点中的带电和芳香族残基的分布如图％和9c所示。本发明的另一方面提供会与所述TSHR结合以刺激所述TSHR的分离的抗体分子，所述抗体分子包含选自图4b和4d的氨基酸序列(分别为 SEQ ID No 23和33)的抗体VL区，和/或包含选自分别示于图4b和4d的⑶R I (SEQ ID No 24 和；34)、II (SEQ ID No 25 和 35)和 III (SEQ ID No 26 和 36)的一个或多个 CDRjP /或选自图北和3d的氨基酸序列(分别为SEQ ID No 5和15)的抗体VH区，和/或包含选自分别示于图 3b 和 3d 的 CDR I (SEQ ID No 6 和 16)、II (SEQ ID No 7 和 17)和 III (SEQ ID No 8和18)的一个或者多个CDR。所述抗体分子优选包含(i)抗体VL区，所述抗体VL 区包含一个或多个选自分别示于图4b和4d的CDR I (SEQ ID No M*34)、II(SEQ ID No 25和35)和III (SEQ ID No 26和36)的CDR ；禾口 /或(ii)抗体VH区，所述抗体VH区包含一个或多个选自分别示于图3b和3d的CDR I (SEQ ID No 6和16)、II (SEQ ID No 7和17) 和 III (SEQ ID No 8 禾口 18)的 CDR。所述分离的抗体分子与所述TSHR的结合可被具有甲状腺刺激或阻断活性的患者血清TSHR抗体抑制。所述分离的抗体分子与所述TSHR的结合可被M22、K1-70、5C9、9D33和甲状腺刺激小鼠单克隆抗体中的至少一种抑制。所述分离的抗体分子可包含抗体VL区和抗体VH区，所述抗体VL区选自图4b和4d的氨基酸序列(分别为SEQ ID No 23和33)，所述抗体VH区选自图北和3d的氨基酸序歹丨J (分别为SEQ ID No 5和15)。所述分离的抗体分子优选地包含分别示于图北和3d的⑶R KSEQ ID No 6和 16) ,11 (SEQ ID No 7和17)和III (SEQ ID No 8禾口 18)。本发明的抗体可包含VH区，所述 VH区包含一段或多段与这些⑶R有很大同源性的氨基酸序列。本发明的抗体分子优选显示出与分别示于北和3d的CDR(SEQ ID No 6-8和16-18)有70-99. 9%的氨基酸同源性。在优选的实施方案中，所述分离的抗体分子具有至少70 %的同一性，更优选至少80%的同一性，高度优选至少90%的同一性，特别优选95%的同一性并且尤其优选99. 9%的同一性。所述分离的抗体分子可包含由图4b或4d的氨基酸序列(分别为SEQ ID No 23 和33)组成的抗体VL区。所述分离的抗体分子可包含由图北或3d的氨基酸序列(分别为SEQ ID No 5和15)组成的VH区。所述分离的抗体分子优选地包含分别示于图4b和4d 的 CDR I (SEQ ID No M*;34)、II(SEQ ID No 25 和 35)和 III (SEQ ID No 洸和 36)。并且/或者，本发明的抗体可包含一段或多段与这些⑶R有很大同源性的氨基酸序列。所述抗体优选地表现出与图4b和4d分别显示的CDR(SEQ ID No 2446和34-36)有70-99. 9% 的氨基酸同源性。在优选的实施方案中，所述分离的抗体分子具有至少70%的同一性，更优选至少80%的同一性，高度优选至少90%的同一性，特别优选至少95%的同一性并且尤其优选99. 9%的同一性。在大部分应用中，本发明的抗体分子的VH区与VL区会排列在一起以提供TSHR结合位点。在一些应用中，可仅提供VH区以结合TSHR。接枝抗体结构域的方法是本领域熟知的，这样使用来自不同来源的VH和VL区或其部分可构建本发明的抗体分子。本文使用的关于本发明的抗体分子的术语“抗体分子”根据上下文包括基于免疫球蛋白的结合部分，如单克隆抗体、重组抗体、合成抗体和多克隆抗体、单链抗体、多特异性抗体以及结合部分，所述结合部分可由技术人员代替所述基于免疫球蛋白的结合部分，如结构域抗体、双链抗体(diabody)以及 lgG[Delta]CH2、F(ab，)2)、Fab、scFv、VL、VH、dsFv、 微型抗体(Minibody)、三链抗体(Triabody)、四链抗体(Tetrabody)、(ScFv)2, scFv-Fc、 F(ab，)3 部分(Holliger P, et al 1993 Proc Natl Acad Sci USA 90:6444-6448·)， (Carter PJ 2006 Nat Rev Immunol 6:343-357)。所述术语还涵盖这些实体的片段，优选会结合TSHR的片段，并且更优选具有K1-18或K1-70的效应的片段。术语“促甲状腺素受体”和“TSHR”是指全长人TSHR，所述全长人TSHR具有图7a所示的氨基酸序列(SEQ ID No 74)或其与所述TSHR有高度同源性的变体或片段。这样的变体和片段优选具有与图7a所示氨基酸序列(SEQ ID No 74)70至99. 9%的同源性。在优选的实施方案中，这样的变体或片段与所述序列具有至少70%的同一性，更优选至少80%的同一性，高度优选至少90%的同一性，特别优选至少95%的同一性并且尤其优选99. 9%的同一性。本发明的分离的抗体可优选地是单克隆抗体、重组抗体或合成抗体的形式。K1-18 或K1-70的VH或VL区的CDRI、II或III可被纳入合适的构架中。K1-18和K1-70的VH 和VL区及其CDR的变体可使用本领域技术人员熟知的方法通过修饰产生。这样的变体可包含一个或多个氨基酸序列变化，包括添加、缺失、置换或插入突变。K1-18或K1-70的构架还可在本发明的抗体分子中被修饰。本发明的分离的抗体可具有人或非人构架。
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本发明的另一个方面提供编码本发明的分离的抗体分子或其片段的分离的核苷酸，所述抗体分子或其片段包含抗体VL区、抗体VH区或CDRI、II或III、或其结合，其中所述抗体 VL 区包含图 4b (SEQ ID No 23)或 4d (SEQ ID No 33)或 6d (SEQ ID No 69)的氨基酸序列；所述抗体VH区包含图北(SEQ ID No 5)、3d (SEQ ID No 15)或釙(SEQ ID No 41)和 5d(SEQ ID No 51)的氨基酸序列；所述 CDRI、II 或 III 示于图 3b (SEQ ID No 6-8) ,3d(SEQ ID No 16-18),4b(SEQ ID No 24-26)、4d(SEQ ID No 34-36)、5b(SEQ ID No 42-44)、5d(SEQ ID No 52-54)或 6d(SEQ ID No 70-72)。所述分离的核苷酸可包含图3a (SEQ ID No 1) ,3c (SEQ ID No 10) ,4a (SEQ ID No 19) ,4c (SEQ ID No 28) ,5a (SEQ ID No 37) ,5c (SEQ ID No 46)或 6c (SEQ ID No 64)的核
苷酸序列。可在例如噬菌体展示文库中提供多种这样的核苷酸。这样的噬菌体展示文库可被用于表达多种抗体分子或其片段，如分离的结构域。本发明还提供包含本发明的分离的核苷酸的载体，或包含本发明的所述载体或核苷酸的宿主细胞。所述载体可以是质粒、病毒或其片段。很多不同类型的载体是本领域技术人员已知的。所述分离的细胞可表达本发明的抗体。所述分离的细胞优选地分泌本发明的抗体。本发明的分离的细胞优选地来自稳定的异源杂交瘤细胞系。本发明的另一方面提供生产分离的抗体分子或其片段例如本发明分离的结构域的方法，所述方法包括表达编码这样的抗体分子或其片段的核苷酸。本发明的另一方面提供生产本发明的抗体的方法，所述方法包括培养一种或多种本发明的分离的宿主细胞，藉此所述抗体由所述细胞表达。所述抗体优选地由所述细胞分泌。本发明的另一方面提供包含本发明的分离的抗体分子和载体的药物组合物。本发明的药用组合物可适于对人给药。本发明的药物组合物优选地对受试者的免疫系统没有显著不良作用。考虑到用于本发明的药物组合物的多种形式。用于治疗甲状腺相关病症的本发明的药物组合物可以是可注射形式。用于治疗眼的格雷夫斯病的本发明的药物组合物优选为滴眼剂的形式。本发明的药物组合物包含本发明的分离的抗体，以及可药用载体、辅助剂或媒介。可用在本发明的药物组合物中的可药用载体、辅助剂或媒介包括但不局限于离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白(如人血清白蛋白)、缓冲物质(如磷酸盐)、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物、水、盐或电解质(如硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、胶态二氧化硅、三硅酸镁)、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素基物质、聚乙二醇、羟甲基纤维素钠、聚丙烯酯、蜡、聚乙烯-聚氧丙烯嵌段聚合物、聚乙二醇和羊毛脂。本发明的药物组合物可经口、肠胃外、经吸入喷雾、局部、通过滴眼剂、经直肠、经鼻、经口含、经阴道或通过植入贮库给药。发明人优选口服给药或注射给药。本文使用的术语“肠胃外”包括皮下、皮内、静脉内、肌肉内、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内、病灶内(intralesional)和颅骨内注射或输注技术。所述药物组合物可以是无菌可注射制品的形式，例如，作为无菌可注射水性或油性悬浮剂。可根据本领域已知的技术使用合适的分散或润湿剂(如，吐温80)和悬浮剂来制备该悬浮剂。所述无菌可注射制品还可以是在无毒可肠胃外使用的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液剂或悬浮剂，例如，作为1，3 丁二醇中的溶液剂。在可接受的媒介和溶剂中，可使用的是甘露醇、水、林格溶液和等渗氯化钠溶液。此外，无菌不挥发性油一般被用作溶剂或悬浮介质。为此目的，可使用任何温和不挥发性油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。脂肪酸如油酸及其甘油酯衍生物可用于可注射剂的制备，天然可药用油如橄榄油或蓖麻油特别是它们的聚氧乙基化形式也可用于可注射剂的制备。这些油溶液剂或悬浮剂还可包含长链醇稀释剂或分散剂如Ph. Helv或类似的醇。 本发明的药物组合物可以任意可口服剂型经口给药，所述可口服剂型包括但不局限于胶囊剂、片剂以及水悬浮液和水溶液。对于口服用的片剂，通常使用的载体包括乳糖和玉米淀粉。通常还加入如硬脂酸镁的润滑剂。对于胶囊剂形式的口服给药，可用的稀释剂包括乳糖和干玉米淀粉。当经口给予水悬浮液时，所述活性成分与乳化剂和助悬剂结合。若需要，可加入一些甜味剂和/或调味剂和/或着色剂。本发明的药物组合物还可以用于直肠给药的栓剂的形式提供。这些组合物可通过将本发明的化合物和在室温下是固体而在直肠温度下是液体(从而在直肠内溶化以释放活性成分)的合适的无刺激性赋形剂混合来制备。这样的材料包括但不局限于可可脂、蜂蜡和聚乙二醇。本发明的药物组合物的局部给药尤其可用于当所需要的治疗涉及局部施用容易到达的部位或器官时。对于对皮肤的局部施用，所述药物组合物应该用包含悬浮或溶解在载体中的所述活性成分的合适的软膏剂制备。用于本发明的化合物的局部给药的载体包括但不局限于矿物油、液体石油、白石油、丙二醇、聚氧乙烯聚氧丙烯化合物、乳化蜡和水。或者，所述药物组合物可用含有悬浮或溶解于载体中的所述活性化合物的合适的洗剂或膏剂配制。合适的载体包括但不局限于矿物油、失水山梨糖醇单硬脂酸酯、聚山梨醇酯60、十六烷基酯蜡、鲸蜡硬脂醇(cetearyl alcohol)、2_辛基十二烷醇、苯甲醇和水。本发明的药物组合物还可通过直肠栓剂制剂或在合适的灌肠剂制剂中被局部施用于下肠道。本发明还包括局部经皮给药贴剂。本发明的药物组合物可通过鼻喷雾剂或吸入给药。这样的组合物可根据药物制剂领域熟知的技术制备并且可被制备为盐水中的溶液剂，使用苯甲醇或其他合适的防腐剂、增加生物利用度的吸收促进剂、碳氟化合物和/或其他本领域已知的增溶剂或分散剂。本发明最初提到的方面的抗体如K1-70具有治疗和控制与TSHR激活有关的病症的潜在用途，所述病症例如格雷夫斯病、TSH或hCG异常水平引起的格雷夫斯眼病 (Graves' opthalmopathy)或甲状腺机能亢进。本发明其次提到的方面的抗体如K1-18具有在不同的临床情况和治疗情况下刺激所述TSHR的用途。这些情况包括甲状腺癌及其转移灶、多结节性甲状腺肿或先天性甲状腺功能低下的诊断和治疗。本发明的另一方面提供本发明的分离的抗体分子或药物组合物用于治疗的用途。 本发明还提供用于治疗的本发明的分离的抗体分子或药物组合物。本发明的另一方面提供表征TSHR抗体、TSH或人绒毛膜促性腺激素的活性的方法，所述方法包括一个步骤，所述步骤包括本发明的分离的抗体分子的使用。本发明的另一方面提供刺激哺乳动物细胞中的TSHR的体外方法，所述方法包括使所述细胞接触本发明的分离的抗体分子。本发明的另一方面提供刺激哺乳动物细胞中的TSHR的体内方法，所述方法包括使所述细胞接触本发明的分离的抗体分子。优选地使患有甲状腺癌及其转移灶、多结节性甲状腺肿和/或先天性甲状腺功能低下的受试者的细胞与本发明的分离的抗体接触。
本发明的另一方面提供防止哺乳动物细胞中配体诱导的对TSHR的刺激的体内方法，所述方法包括使所述TSHR与本发明的分离的抗体接触。所述配体可以是甲状腺刺激自身抗体、TSH或人绒毛膜促性腺激素。所述哺乳动物细胞可以是甲状腺细胞或甲状腺外细胞(extrathyroidal cell)。哺乳动物甲状腺外细胞可以在眶后组织或胫骨前组织中。在本发明该方面的方法中，所述分离的抗体分子可与另外的TSHR结合抗体如上文提到的5C9或9D33结合使用。所述甲状腺相关病症可选自甲状腺机能亢进、格雷夫斯病、眼格雷夫斯病和新生儿甲状腺机能亢进。或者，所述甲状腺相关的病症可以是与患有AITD的患者中具有阻断活性的TRAb的存在相关的甲状腺机能减退、因母体TRAb转移(经胎盘或母乳)引起的新生儿甲状腺机能减退。在上文描述的本发明的各种方法中受治疗的受试者优选是人。本发明的另一方面提供检测TSHR的自身抗体的诊断方法，所述方法包括使样本和本发明的抗体分子与TSHR接触，所述样本从被认为含有所述自身抗体的受试者中分离。本发明的另一方面提供检测TSHR的本发明的抗体(优选人抗体)或人血清中的TSHR的抗体的诊断方法，所述方法包括使所述TSHR的任一种抗体与包含所述 TSHR(TSHR260)(图 7b ；SEQ ID No 75)的氨基酸 22-260 的 TSHR 片段接触。可用于本发明的方法的合适的可检测标签可选自酶标签、同位素标签、化学发光标签、荧光染料等。因此在使用放射性标签(如1251、14(、力或^5)的情况下，监测可包括测量依赖于本发明的抗体分子的结合的放射性。一般使用Y计数器或液体闪烁计数器来测量放射性。 本发明的另一方面提供鉴定会与TSHI^60(SEQ ID No 75)结合的小分子的方法，所述方法包括例如在ELISA中使候选小分子与TSHR260接触并且选出会与TSHI^60结合的小分子。 此外，提供鉴定有防止TSHR自身抗体与TSHR260结合的能力的小分子的方法，所述方法包括确定在候选小分子存在下对TSHR自身抗体(刺激的或阻断的)与TSHR260结合的抑制并且选出会抑制TSHR自身抗体结合的小分子。可开发以这种方法鉴定到的小分子以提供控制由TSHR自身抗体(刺激的或阻断的)引起的自身免疫甲状腺疾病的新药物。本发明提供新的和/或改善的方法，目的是1刺激甲状腺或表达所述TSHR的组织如甲状腺癌和甲状腺癌转移灶中的所述 TSHR。2防止甲状腺刺激自身抗体与甲状腺中的TSHR结合并且从而提供针对格雷夫斯病的新疗法。3防止TSHR自身抗体与甲状腺外TSHR(例如眶后组织或胫骨前组织中)结合并且从而提供治疗格雷夫斯眼病和胫骨前粘液性水肿更好的机会。4确定对结合具有刺激活性的TRAb关键的TSHR氨基酸。5确定对结合具有阻断活性的TRAb关键的TSHR氨基酸。6比较对结合具有刺激活性的TRAb关键的TSHR氨基酸和对结合具有阻断活性的 TRAb关键的TSHR氨基酸。7为TRAb开发区分阻断和刺激抗体的新测定。8为TRAb开发基于使用热稳定TSHR片段的新测定。
9确定对配体诱导的TSHR激活关键的TSHR氨基酸。10确定对配体诱导的TSHR失活关键的TSHR氨基酸。11确定对结合至所述TSHR关键的阻断自身抗体氨基酸。12确定对影响TSH或甲状腺刺激抗体介导的TSHR激活关键的阻断自身抗体氨基酸。13控制格雷夫斯病的甲状腺机能亢进、新生儿甲状腺机能亢进和格雷夫斯病的眼部症状。或者，所述甲状腺相关的病症可以是与AITD患者中具有阻断活性的TRAb的存在相关的甲状腺机能减退，或由母体阻断型TRAb转移(通过胎盘或母乳)引起的新生儿甲状腺机能减退。14开发筛选控制由结合所述TSHR的自身抗体引起的甲状腺疾病的小分子药物候选物方法。15理解由同一患者的免疫系统或由不同患者的免疫系统产生的具有甲状腺刺激或阻断活性的TSHR自身抗体之间的分子差异。16理解在刺激和阻断TSHR自身抗体的出现和产生中涉及的免疫学机制。17理解包括进化驱动力的机制，所述机制是TSH和TSHR自身抗体之间的分子模拟的基础。


现在将参考附图的图1-9——仅为了举例——来描述本发明的抗体分子和方法， 所述附图中图1显示125I-标志的K1-70或125I-标志的K1-18与所述TSHR结合的结合和解离特性(a) 125I标志的Kl-70IgG和Fab与全长TSHR结合的时间过程；(b) 125I-标志的 Kl-70IgG与TSHR260结合的时间过程；(C)125I-标志的Kl_70Fab与TSHR260结合的时间过程；(d)在各种配体存在下125I-标志的Kl-70IgG从所述TSHR(全长)上的解离；(e) 在Kl-18Fab存在下125I标志的Kl-70IgG从TSHR(全长)上的解离；(f)在各种配体存在下125I标志的Kl-70Fab从所述TSHR(全长)上的解离；(g)在各种配体存在下125I标志的 Kl-70IgG 从 TSHR260 上的解离；(h)在 Kl_18Fab 存在下 125I 标志的 Kl_70IgG 从 TSHR260 上的解离；⑴在各种配体存在下125I标志的Kl-70Fab从TSHI^eo上的解离；(j) 125I标志的 Kl-18IgG与全长TSHR和TSHR260结合的时间过程；(k)在各种配体存在下125I标志的K1-18 IgG从全长TSHR上的解离；和⑴在各种配体存在下125I标志的Kl-18IgG从TSHR260上的解离；图2显示患者血清中TSHR自身抗体的测量结果(a)在TRAb包被管测定(基于对TSH结合的抑制)中与在TSHR260-AP ELISA中测量结果的比较；(b)基于对M22与全长 TSHR结合的抑制的ELISA中和基于对M22Fab与TSHR260结合的抑制的ELISA中测量结果的比较；(c)在TRAb包被管测定中(基于对TSH结合的抑制)和基于对M22Fab与TSHI^60 包被的板结合的抑制的ELISA中测量结果的比较；和(d)在TRAb ELISA (基于对M22结合的抑制)中和在TSHI^60-AP ELISA中测量结果的比较；图3给出了 K1-18重链(HC)的可变区序列(a)以未注解形式和注解形式显示的 K1-18HC的寡核苷酸序列(SEQ ID No 1)。在注解形式中，在用于PCR引物的序列下有划线；方框框出的是各互补决定区(CDR)；粗体是恒定区；(b)以未注解和注解形式显示的由(图 3a)显示的寡核苷酸序列产生的K1-18HC的氨基酸序列(SEQ ID No 5) ； (c)以未注解和注解形式显示的优选的带有真实N-末端序列(前导序列)的K1-18HC的寡核苷酸序列(SEQ ID No 10)。在注解形式中，用于PCR引物的序列下有划线，所述前导序列以小写字母显示； 方框框出的是各个CDR;粗体是恒定区；和(d)未注解和注解形式的由图3c所示寡核苷酸序列产生的优选的具有前导序列的K1-18HC的氨基酸序列(SEQ ID No 15)；图4给出了 K1-18轻链(LC)的可变区序列(a)以未注解和注解形式显示的 K1-18LC的寡核苷酸序列(SEQ ID No 19)。在注解形式中，用于PCR引物的序列下有划线； 方框框出的是各个CDR;而粗体是恒定区；(b)未注解和注解形式的由图如显示的所述寡核苷酸序列产生的K1-18LC的氨基酸序列(SEQ ID No 23) ； (c)以未注解和注解形式显示的优选的具有实际N末端序列(前导序列)的Kl-18 LC的寡核苷酸序列(SEQ ID No 28) 0 在注解形式中，用于PCR引物的序列下有划线，所述前导序列以小写字母显示；方框框出的是各个CDR ；而粗体是恒定区；和(d)未注解和注解形式的由图如显示的寡核苷酸序列产生的优选的具有前导序列的K1-18LC的氨基酸序列(SEQ ID No 33)；图5给出了 K1-70重链(HC)的可变区序列(a)以未注解和注解形式显示的 K1-70HC的寡核苷酸序列(SEQ ID No 37)。在注解的形式中，用于PCR引物的序列下有划线；方框框出的是各个CDR;而粗体是恒定区；(b)未注解和注解形式的由图fe所示的寡核苷酸序列产生的K1-70HC的氨基酸序列(SEQ ID No 41) ； (c)以未注解和注解形式显示的优选的具有实际N-末端序列(前导序列)的K1-70HC的寡核苷酸序列(SEQ ID No 46)。 在注解的形式中，用于PCR引物的序列下有划线，所述前导序列以小写字母显示；方框框出的是各个CDR ；而粗体是恒定区；和(d)未注解和注解形式的由图5c显示的寡核苷酸序列产生的优选的具有前导序列的K1-70HC的氨基酸序列(SEQ ID No 51)；图6给出了 K1-70轻链(LC)的可变区序列(a)以未注解和注解形式显示的 K1-70L C的寡核苷酸序列(SEQ ID No 55)。在注解的形式中，用于PCR引物的序列下有划线；方框框出的是各个CDR;而粗体是恒定区；(b)未注解和注解形式的由图6a所示的寡核苷酸序列产生的K1-70LC的氨基酸序列(SEQ ID No 59) ； (c)以未注解和注解形式显示的优选的具有实际N-末端序列(前导序列)的K1-70LC的寡核苷酸序列(SEQ ID No 64)。 在注解的形式中，用于PCR引物的序列下有划线，所述前导序列以小写字母显示；方框框出的是各个CDR ；而粗体是恒定区；和(d)未注解和注解形式的由图6c显示的寡核苷酸序列产生的优选的具有前导序列的K1-70LC的氨基酸序列(SEQ ID No 69)；和(e)由Edman降解反应确定的实际N-末端氨基酸序列(氨基酸2-21) (SEQ ID No 73)；图7给出了人TSHR的氨基酸序列(a)描述了人TSHR(氨基酸1-764) (SEQ ID No 74)(登录号 P16473, http://www. ncbi. nlm. nih. gov/entrez/viewer, fcgi ？ db = protein&val = 62298994)的共有氨基酸序列；(b)描述了人TSHR氨基酸H60的共有氨基酸序列。前导序列(氨基酸1-21)以小写字母显示，而为纯化目的附加在C-末端的组氨酸序列以粗体显示(SEQ ID No 75)；和(c)描述了人TSHR LRD C-CAP的氨基酸序列。前导序列(氨基酸1-21)以小写字母显示，而为纯化目的附加在C-末端的组氨酸序列以粗体显示(SEQ ID No 76)；图8给出了在2.22人分辨率下Kl_70Fab的坐标。图9显示(a)Kl-70Fab的结构-以Joy格式表示的结构；(b)Kl_70Fab结合位点的静电势；和(c)Kl-70Fab结合位点的芳香族氨基酸。
具体实施例方式方法淋巴细胞分离和人单克隆TSHR自身抗体的克隆。使用W02004/050708A2中描述的方法分离单克隆自身抗体K1-18和K1-70。从采自有8年AITD临床病史和高水平TRAb的患者的血液样本中分离淋巴细胞。获得患者的同意和地方伦理委员会的批准。所述患者最初被诊断为甲状腺机能亢进，在用甲巯咪唑治疗后达到甲状腺机能正常状态，然而，在血液收集前约4. 5年她出现了甲状腺机能减退。在血液收集时所述患者正在接受甲状腺素(每天50 μ g)治疗。用Epstein Barr病毒(EBV) (European Collection of Cell Cultures-ECACC ；Porton Down,SP4 0JG，UK)感染所述淋巴细胞并且在小鼠巨噬细胞饲养层上培养，如W02004/050708A2所述。将无限增殖化的分泌TSHR自身抗体的淋巴细胞与小鼠/人杂交细胞系K6H6/B5 (ECACC)融合，并且通过有限稀释克隆4次来得到单集落。通过对标志的TSH与TSHR结合的抑制来检测TSHR自身抗体在克隆的不同阶段在细胞培养物上清液中的存在(W02004/050708A》。扩大培养两个产生所述TSHR自身抗体的单克隆并且收集来自所述培养物的上清液用于自身抗体纯化。一个克隆被命名为K1-18而另一个被命名为K1-70。K1-18和K1-70的纯化、表征和标志如Sanders J et al 2004. Thyroid 2004 14 :560-570 中所述在 MabklectTM(GE Healthcare, UK)上使用蛋白A亲和色谱法从培养物上清液中纯化TSHR人MAb IgG，并且通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)评估纯度。使用辐射状扩散测定(The Binding Site ； Birmingham, B29 6AT，UK)确定重链同种型，并用抗人-κ链和抗-人λ链特异性小鼠单克隆抗体(Sigma-Aldrich Company Ltd, Poole, UK)通过蛋白质印迹确定轻链同种型。将纯化的 Kl-18IgG 在 37°C在磷酸盐缓冲盐水中(PBS ;137謹ol/L NaCl,8. lmmol/L Na2HPO4, 2. 7mmol/L KCL、1. 47mmol/L KH2PO4, pH 7. 4，含有终浓度为lmmol/L的半胱氨酸和终浓度为 2mmol/L 的 EDTA)用氧化汞合木瓜蛋白酶(mercuripapain) (Sigma Aldrich,Poole,UK)以 100 1的IgG/酶比例处理4个小时。通过在室温下加入碘乙酰胺(50mmol/L的终浓度)30 分钟停止所述反应。然后使所述反应混合物通过Mabklect柱以从所述Tab制品中除去任何完整IgG或Fc片段。将所述含有Fab的溶液用含有3. lmmol/L Ni^3WPBS透析，并且当合适时用Centripr印浓缩器(Millipore, Watford, WD18 8YH, UK)浓缩。使用类似的方法得到Kl-70Fab，但是使用的IgG/酶比例是200 1，并且酶消化是在37°C下进行1小时。 通过SDS-PAGE进行的分析表明在所述Fab制品中检测不到完整的IgG。用125I (Sanders J et al 1999. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 199984 :3797-3802) 或者用生物素酰胼(Perbio Science,Cramlington,UK) (Rees Smith et al 2004. Thyroid 14 :830-835)标志 IgG 制品。对125I-TSH或125I-标志的人MAb与所述TSHR结合的抑制如W02004/050708A2中所描述用TSHR包被管进行结合抑制测定。在所述测定中， 将100 μ L的测试样本(MAb制品、患者血清或未标志的TSH)和50 μ 1的起始缓冲液在室温下在TSHR包被管中轻微震荡孵育2小时。抽吸之后，洗涤所述管并加入100 μ L的125I-标志的蛋白质(5X 104cpm)，并且在室温下震荡孵育1小时。然后对所述管进行抽吸、洗涤并且在Y计数器中计数。对标志蛋白质结合的抑制被计算为100X [1_(在测试材料存在下结合的cpm/在对照材料存在下结合的cpm)]。这些实验中使用的MAb制品是上文描述的 K1-18、K1-70、M22、5C9 和 9D33。TSMAb 1-7 是小鼠甲状腺刺激 MAb (W0 03/01863 和 Sanders J et al 2002文献见上文)。对照材料是合并的健康血液供体血清或单名健康血液供体的血清或在各实验的结果中指出的其他材料。对人MAb IgG与所述TSHR结合的katchard分析分别将50 μ L 测定缓冲液(50mmol/L NaCl、10mmol/L Tris pH 7· 8 和 0· 1 % Triton X-100)和 50 μ L 起始缓冲液(RSR Ltd)中的未标志 K1-18 或 Kl_70IgG 与 50 μ L 125I-标志的Κ1-18或Kl-70IgG(30000cpm，在测定缓冲液中)在室温下在TSHR包被管中震荡孵育2小时(在这些条件下出现最大结合)，抽吸，用ImL测定缓冲液洗涤两次并且在、 计数器中计数。将结合的IgG浓度对结合/游离作图(katchard G 1949. Annals of the New York Academy of Sciences 51 :660-672)以得到缔合常数。通过ELISA测量的对TSH与所述TSHR结合的抑制如前所述使用基于TSH-生物素与TSHR包被的ELISA孔的结合的TRAb ELISA(Bolton J, et al 1999Clinical Chemistry 45:2285-2287)。在所述测定中，将 75 μ L测试样本加至所述板的孔中的75 μ L起始缓冲液中并且在室温下以约500转/分钟的速度震荡孵育2小时。洗涤后加入IOOyL TSH-生物素并且继续孵育25分钟，不进行震荡。再次洗涤所述孔，使用所述标准方法使反应物显色，并且在450nm读取吸光度。对TSH-生物素结合的抑制被计算为100X[l-(450nm处的测试样本吸光度 /450nm处的阴性对照样本吸光度)]。这些实验中使用的MAb制品是上文描述的K1-18、 K1-70、M22、5C9 和 9D33。TSMAb 1-7 是小鼠甲状腺刺激 MAb (W003/01863 和 Sanders J, et al 2002文献见上文)。对照样本材料是合并的健康血液供体血清或如各实验的结果中指出的其他材料。在ELISA中对M22与所述TSHR结合的抑制使用基于标志的M22 (M22 Fab-POD)与TSHR包被的ELISA孔结合的TRAb ELISA (Rees Smith B, et al 2004文献见上文)。如基于TSH-生物素的ELISA进行测定， 但是首次孵育是1小时。使用以下公式将结果表述为对M22结合的抑制100X [l-(450nm 处的测试样本吸光度/450nm处的阴性对照样本吸光度)]。这些实验中使用的MAb制品是上文描述的1(1-18、1(1-70^22、509和9033。TSMAb 1-7是小鼠甲状腺刺激MAb (申请号为 W003/01863的专利和Sanders J, 2002文献见上文)。对照材料是合并的健康血液供体血清或如各实验的结果中指出的其他材料。对TSHR刺激的分析如W02004/050708A2所述测试K1-18或Kl_70IgG以及其他制品刺激人TSHR转染的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中环AMP的产生的能力。将每个细胞表达约5X IO4或约 5X IO5TSHR的CHO细胞以每孔3X IO4个细胞接种在96孔板中，更换为没有胎牛血清的 DMEM(Invitrogen Ltd, Paisley, UK)，然后加入测试样本(TSH、IgG 或患者血清)(100 μ L, 稀释在环AMP测定缓冲液中，即含有lg/L葡萄糖、20mmol/L HEPES、222mmol/L蔗糖、15g/L 牛血清白蛋白和0. 5mmol/L 3异丁基-1-甲基黄嘌呤的无NaCl Hank' s缓冲盐溶液(pH7.4)；环AMP测定低渗缓冲液)并在37°C下孵育1小时。除去测试溶液后，裂解细胞，使用来自 Assay Designs ；Cambridge Bioscience, UK 的 Direct Cyclic AMP Correlate-EIA 试剂盒测定裂解液中的环AMP浓度。结果被表达为所述细胞裂解液QOO μ L)中环AMP的 pmol/mL。一些实验在等渗缓冲条件下进行。在这些实验中使用了 Krebs Ringer !fepes缓冲液(KRH 缓冲液)(124mmol/L NaCl、5mmol/L KCl U. 25mmol/L MgSO4U. 45mmol/L CaCl2, 1. 25mmol/L KH2PO4、25mmol/L HEPES、8mmol/葡萄糖、0. 5g/L 牛血清白蛋白、0. 5mmol/L 3 异丁基-1-甲基黄嘌呤，PH 7.4)。使细胞达到所需要的密度，除去培养基并且用ImL of KRH缓冲液洗涤所述细胞。然后加入新鲜的KRH缓冲液并且在37°C下孵育所述细胞30分钟。然后除去所述缓冲液并用含有测试样本(TSH、MAb制品、血清样本等)的新鲜KRH缓冲液代替。下一步骤是随后如上文对等渗条件下(即在环AMP测定缓冲液中)进行的实验的描述进行。在一些实验中，评估了各种Mab对如上文所述测量的各种制品(例如，TSH、人 MAb和患者血清)的TSHR刺激活性的作用。这通过比较(a)仅所述样本的刺激活性和(b) 在各种MAb存在下的刺激活性来进行。拮抗(阻断)活性的测量评估了 Kl_70IgG和其他制品在表达TSHR的CHO细胞中抑制猪(p)TSH、天然人(h) TSH和重组人(rh)TSH、MAb M22、MAb K1-18和患者血清TRAb的刺激活性的能力。这是通过比较不存在Kl-70IgG(或被测试的其他制品)或存在Kl-70IgG(或被测试的其他制品) 的情况下TSH、M22、K1-18或TRAb的刺激效应来进行的。如上文所述进行所述测定，但是将 50 μ L稀释在环AMP测定缓冲液中的Kl-70 (或被测试的其他制品)加入所述细胞孔中，随后加入50 μ L的TSH或Μ22或Κ1-18或患者血清(视需要稀释在环AMP测定缓冲液中)，并且如上文对刺激测定所述进行孵育和测试。除了 Κ1-70，在该测定中还测试了其他MAb和具有阻断型TRAb的患者血清。Κ1-18和Κ1-70与所述TSHR结合的缔合和解离使用如Nakatake N, et al Thyroid 2006，16 ;1077_1084 中所述的方法研究了 Kl-18IgG、Kl-18Fab、Kl_70IgG 和 Kl_70Fab 与全长 TSHR 和 TSHI^60 结合的缔合和解离。 将所述全长TSHR或TSHR260包被在塑料管上，所述塑料管已被合适的小鼠TSHR MAb预包被。在缔合实验中，在所述TSHR包被管中在37°C下将100 μ L的125I-标志的IgG或Fab孵育5-180分钟。然后对所述管进行抽吸、用测定缓冲液洗涤并且在Y计数器中计数。在解离实验中，将100 μ 1的125I-标志的IgG或Fab在TSHR包被管中在室温下孵育180分钟， 随后加入10 μ L的lmg/ml的各种MAb IgG或Fab制品并且在室温下孵育0-180分钟。在不同的时间点对于所述管进行抽吸、洗涤和计数。在一些实验中，加入TSH或缓冲液而不是 MAb制品。所述TSHR中的氨基酸突变用于向TSHR序列引入具体突变的方法已在专利申请W02006/016121A中描述。此外，在W02006/016121A中还描述了使用FlpHn系统将突变的TSHR构建体转染进入CHO细胞。将表达野生型或突变的TSHR的Flp-In-CHO细胞接种至96孔板并用于测试各种制品刺激表达包含氨基酸突变的TSHR的CHO细胞中的环AMP的活性的能力。将这些实验与使用表达野生型THSR的CHO细胞进行的类似实验进行了比较。还在实验中使用了表达野生型或突变的TSHR的Flp-In-CHO细胞，以研究各种制品阻断如上文所述的TSH、刺激抗体或患者血清TRAb的刺激活性的能力。TSHI^60-碱性磷酸酶(TSHR260-AP)构建体的产生将全长人TSHR用作模板扩增所述TSHR 260构建体(编码人TSHR的氨基酸H60 ； 氨基酸 1-21 是前导序列)(Oda Y，et al 1998. Journal of Molecular Endocrinology 20: 233-244)并且使用克隆载体pSEAP2-basiC (Clontech)作为模板将其与所述分泌的碱性磷酸酶的编码序列(没有17个氨基酸的碱性磷酸酶前导序列)连接。进行两个PCR反应，第一个使用全长TSHR并用特异性引物SEQ ID No 77和SEQ ID No 78引物(Sigma Genosys) 扩增，所述引物在N-末端添加了 EcoRI限制性位点，在C-末端添加了 1个氨基酸接头(天冬酰胺)和分泌的碱性磷酸酶的前8个氨基酸(不包括所述17个氨基酸的前导序列)。第二个PCR使用克隆载体pSEAP2-basic进行并用引物SEQ ID No 79和SEQ ID No 80扩增， 所述引物在所述分泌的碱性磷酸酶的N-末端添加了 TSHR的氨基酸2M-260和1个氨基酸接头(天冬酰胺)，并在所述分泌的碱性磷酸酶基因的C-末端添加了 6组氨酸标签、终止密码子和Biol限制性位点。所述PCR反应如下进行30个循环的94°C 1分钟，40°C 1分钟和 72°C 1分钟，之后是72°C7分钟。所述PCR产物在琼脂糖凝胶上电泳并且按照制造商的说明使用geneclean II试剂盒(Anachem Ltd, Luton)提取所述DNA。然后使用纯化的 PCR产物1和2进行第三个PCR以构建完整的TSHR 260-碱性磷酸酶基因。所述PCR 3反应包含200ng PCR 1产物和200ng PCR 2产物并且PCR 3如下进行-J个循环的94°C 1. 5 分钟，65°C 1. 5分钟和72°C 1. 5分钟。然后将温度再次升至94°C持续2分钟，然后加入引物 SEQ ID No 77和80，之后进行30个循环的94°C 1分钟，52°C 1分钟和72°C 2分钟。使用 EcoRI和B10I限制性位点将所述PCR 3产物克隆进入pFastBad，并且使用桑格-库森法测序方法(Sanger F et al 1997. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 74 :5463-5467)确认突变的存在。如 W02008/025991A1 所述，使用 Bac to Bac 杆状病毒表达系统(Irwitrogen，UK)制造重组DNA并将其转染至Sf_9细胞中以得到并扩增重组杆状病毒原种。如W02008/025991A1所述在昆虫细胞中表达TSHR260-AP。基于TSHR260-AP 的 ELISA基于二价TSHR抗体通过一个抗原结合位点与包被在ELISA板孔上的TSHR结合并且通过另一个抗原结合位点与液相中的TSHI^eo-AP结合即形成桥连的能力建立ELISA。如前所述((Bolton J et al 1999，文献见上文)通过C-末端抗体将CHO细胞中表达的全长的洗涤剂溶解的受体形式的TSHR包被在ELISA板孔上。在所述测定中，将75 μ L起始缓冲液 (如对TRAb ELISA所描述的；Bolton J，et al 1999文献见上文)和75 μ L测试样本(患者血清或单克隆抗体)加入至由所述全长的洗涤剂溶解的TSHR包被的ELISA板孔中并且在室温下震荡(500rpm)孵育2小时。然后除去所述孔中的内含物，用洗涤缓冲液(50mmol/ L NaCl、20mmol/L Tris pH 7. 8,1% Triton X-100)将所述孔洗涤 3 次，随后加入 100 μ L 的TSHR260-AP (稀释在含有0. 2g/L MgCl2_6H20和2g/L BSA的洗涤缓冲液中)。在室温下震荡(500rpm)孵育1小时后将所述孔清空、洗涤(3次)并且加入100 μ L对硝基苯基磷酸盐(PNpp)底物(Europa Bioproducts Ltd,Ely, Cambridge UK)，然后将所述板在黑暗中孵育45分钟。之后加入100 μ L停止溶液(lmol/L NaOH)并在ELISA酶标仪中在405nm下读取吸光度。结果以OD4tl5Iim吸光度值表示，高于以集合的健康血供体(HBD)血清观察到的吸光度的值表明，所述样本中存在TSHR自身抗体。在一些实验中，用CHO细胞中表达的包含突变R255D的重组TSHR的溶解制品来包被所述ELISA板孔。TSHR LRD C-CAP构建体的产生使用全长人TSHR作为模板扩增TSHR LRD C-CAP构建体，所述构建体编码除去了氨基酸 306-384 的人 TSHR 的氨基酸 1-409 (Oda Y, et al 1998. Journal of Molecular Endocrinology 20 :233-244)。进行两个PCR反应，第一个使用所述全长TSHR，用T7引物 (SEQ ID No 81)和特异性引物 SEQ ID No 82 (Sigma Genosys, Gillingham, Dorset, UK)扩增，所述特异性引物SEQ ID No 82在所述TSHR的氨基酸305的C末端添加所述TSHR的氨基酸385-342。使用全长TSHR进行第二个PCR，用BGH反向引物SEQ ID No 83和特异性引物(SEQ ID No 84)扩增，所述特异性引物(SEQ ID No 84)在所述TSHR的氨基酸385的N 末端添加所述TSHR的氨基酸四8-305。所述PCR反应如下进行30个循环的94°C 1分钟， 400C 1分钟和72°C 2分钟，之后是72°C 7分钟。将所述PCR产物在琼脂糖凝胶上电泳并且按照制造商的说明使用Geneclean II试剂盒(Anachem Ltd, Luton, UK)提取所述DNA。 然后使用纯化的PCR产物1和2进行第三个PCR以构建将kr305连接至Tyr385 (除去了氨基酸306-384)的连续的TSHR序列。所述PCR 3反应包含200ng PCR 1产物和200ng PCR 2产物并且PCR 3如下进行7个循环的94°C 1. 5分钟，65°C 1. 5分钟和72°C 1. 5分钟。然后将温度再次升至94°C持续2分钟，然后加入T7引物(SEQ ID No 81)和BGHR引物(SEQ ID No 83)，之后进行30个循环的94°C 1分钟，52°C 1分钟和72°C 2分钟。然后将包含除去了氨基酸306-384的TSHR序列的PCR3产物在1 %琼脂糖凝胶上电泳并且按照制造商的说明使用Geneclean II试剂盒(Anachem Ltd)提取所述DNA。使用纯化的PCR3产物作为模板以在PCR4中构建所述TSHR LRD C-CAP基因。所述PCR 4反应包含200ng的PCR 3作为模板DNA，并且使用T7引物(SEQ ID No 81)和特异性引物(SEQ ID No 85)扩增，所述特异性引物(SEQ ID No 85)在所述TSHR序列(1_409，其中氨基酸306-384被删除)的氨基酸409的C-末端添加6组氨酸标签、终止密码子和Biol限制性位点。PCR 4如下进行 30个循环的94°C 1分钟，40°C 1分钟和72°C 2分钟，之后是72°C 10分钟。使用BamHI和 XhoI限制性位点将所述PCR 4产物克隆进入pFastBad，并且使用桑格-库森法测序方法 (Sanger F et al 1997. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 74 :5463-5467)确认突变的存在。如W02008/025991A1所述，使用Bac to Bac杆状病毒表达系统(InvitrogenJaisleyjK)制造重组DNA，并将其转染至Sf_9细胞中以得到并扩增重组杆状病毒原种。使用W02008/025991A1所述方法在昆虫细胞中表达TSHR LRD C-CAP (图 7c ； SEQ ID No 76)。不同TSHR制品稳定性的比较比较了重组TSHR的不同制品的温度稳定性。测试了 CHO细胞中表达的全长的溶解的TSHR、在昆虫细胞中表达的TSHI^60、在昆虫细胞中表达的TSHR260-AP和在昆虫细胞中表达的TSHR LRD C-CAP。从_80°C的保存取出上文所列的每种制品的等分试样，在冰上融化，将一份样本放回到_80°C作为对照，而主要部分在室温下O0-25°C)保存对或48小时。室温下保存对或48小时后将所述TSHR制品保存在-80°C，随后如下述进行测试。用包被缓冲液中的 1 μ g/mL 的小鼠 TSHR MAb 14C4 的 F(ab，)2 制品(Jeffreys J et al 2002， Thyroid 12:1051-1061 and Sanders J et a/2007 Thyroid 17:395-410)包被 ELISA 板孔(Bolton J et al 1999 文献见上文)。被研究的 TSHR 制品在 20mmol/L NaClUOmmol/
20L Tris pH7. 8,1% v/v Triton X_100、lg/L BSA、200mg/L NaN3 中稀释，并将 150 μ L 加入 ELISA板孔中(一式四份)。在4°C过夜孵育以使所述TSHR制品与所述抗体(14C4F(ab’)2) 包被的孔结合之后，洗涤所述孔并用75yL的测定缓冲液(50mmol/L NaCl, 20mmol/L Tris ρΗ7· 8,1% v/v Triton Χ-100，lg/L BSA)和75 μ L的健康供体血清在室温下在ELISA板震荡器上以每分钟500次震动的速度孵育1小时。之后清空所述孔的内容物，洗涤所述孔并向每孔加入100 μ L的M22Fab-过氧化物酶缀合物(参加上文)。在室温下不震荡条件下孵育25分钟后，再次洗涤所述孔，之后加入100 μ L的四甲基联苯胺，并且在室温下不震荡条件下再孵育25分钟。通过加入50yL的0. 5mol/L 终止反应并且在ELISA酶标仪中在450nm下读出每孔的吸光度。可变区基因分析如W02004/050708A2所述确定K1-18或K1-70重链和轻链的可变(V)区基因， 其中使用从IXio7个异源杂交瘤细胞(分泌Kl-18IgG或Kl-70IgG)制备的总RNA来生产用于RT-PCR (逆转录酶PCR)反应的mRNA。将使用Medical Research Council' s V~base (http: //vbase. mrc-cpe. cam, ac. uk/)设计并由 Invitrogen (Paisley, PA4 9RF, UK)合成的特异性IgGl HC和κ LC有义和反义链寡核苷酸引物与Kl-ISmRNA —起用在 RT-PCR反应中。如上所述制备的特异性IgGlHC和λ LC引物与Kl_70mRNA —起用在RT-PCR 反应中。在50°C下进行RT反应15分钟，之后进行PCR，所述PCR如下进行40个循环的 940C 15秒，50°C 30秒和72°C 30秒。将DNA产物克隆进入pUC18并用桑格-库森法(Sanger F，et al 1977 文献见上文)测序。用 Ig blast (http //www, ncbi. nlm. nih. gov/igblast/) 将V区序列与可用的人Ig基因序列比较。通过Kabat法(Kabat E et al 1991 Sequences of proteins of immunological interest(US Public Health service, Bethesda, MD) Fifth edition)禾口 Ig blast (http: //www, ncbi. nlm. nih. gov/igblast/)找出 CDR。从已通过有限稀释进一步再克隆的K1-70和K1-18杂交瘤细胞系两者中进行第二轮mRNA分离。 通过 RT-PCR 从 mRNA 得到 V-区序列(K1-18HC、K1-18LC、K1_70HC 和 K1-70LC)，然后如上所述进行克隆和测序。此外，使用与每个V区各自的前导序列的5’末端相对应的特地设计的 PCR引物进行所述RT-PCR反应。这使得可鉴定K1-18和K1-70的HC和LC V区的N-末端实际寡核苷酸序列(和所来源的氨基酸序列)。此外，通过Alta Bioscience (Birmingham, UK)由Edman降解反应分析了 K1-70LC蛋白的N-末端氨基酸序列。这在用焦谷氨酰氨肽酶将所述K1-70LC蛋白制品的N-末端“去封闭”后是可行的。将纯化的Kl-70Fab(10y g) 在75°C下用2. 5mU的焦谷氨酰氨肽酶(在50mmol/L Na2HPO4 pH 7. 0中；10mmol/L 二硫苏糖醇和lmmol/L EDTA)处理6小时。加入等体积的SDS-PAGE样本缓冲液，并且在100°C加热5分钟后，将Kl-70Fab在15 % SDA-PAGE上解析为HC (Fd部分)和LC。小心地将所述LC 条带从凝胶上切下并且确定所述N-末端蛋白质序列。重复进行的对K1-18HC、K1-18LC和 K1-70HC的RT-PCR和测序证实V区序列与之前得到的是相同的，而K1-70LC V区则不同。 在重复的实验中得到的K1-70LC序列与通过Edman反应得到的2_21连续N-末端氨基酸的蛋白质序列(图6e ；SEQ ID No 73)和Kl_70Fab的晶体结构中的LC氨基酸的电子密度 (图8) —致，并且因此被认为是优选的K1-70LC序列(图6c和6d ；分别是SEQ ID No 64 和 69)。Kl-70Fab的X-射线衍射分析
使用具有9000Da 截留值的 iCON 浓缩器(ThermoFisher Scientific, Loughborough,UK)将如上文所述制备的Kl_70Fab溶液浓缩至15. 5mg/mL并分成小份储存在-20°C。使用蒸汽扩散悬滴法(使用 Molecular Dimensions (Newmarket, UK) &Mructure Screen 1稀释矩阵筛)来生长Kl_70Fab的晶体。一些晶体可在许多条件下得到，并且全部进行筛选以鉴定最适于Biofocus DPI (Saffron Walden, UK)上的X_射线衍射分析的晶体。选择在30% PEG 400,0. IM !fepes钠pH 7. 5、0. 2M氯化镁中生长的晶体。将它用孔溶液清洗并通过放入液氮中迅速冷冻。在Rigaku R-Axis IV图像板检测器上收集所述数据集并用 MOSFLM 和 SCALA(来自 CCP4 程序组(Collaborative computational project, number 4.1994. " The CCP4 Suite Programs for Protein Crystallography" . Acta Cryst.D50, 760-763)对其建立索引、整合以及估算。基于序列对比选择来自蛋白质数据库(http //www. rcsb. ora/pdb/home/home. do)的三个结构 ILIL (VL 禾口 CL 区)、2B0S (VH 区)和2EH7(VL区)用于分子置换。在不对称单元中有两个完整的Fab K1-70分子，并且使用REFMAC5 (CCP4)以严格的几何重量(tight geometric weight)对得到的模型进行10 轮原子精修(atomici refinement)。在模型创建程序 COOT (Emsley P, Cowtan K 2004. Nature 355 =472-475)中检查分子置换和初始精修之后计算出的电子密度图，并且使用 BUCCANEER(CCP4)进行自动化模型重建。重新检查所述模型并手动建立任何剩余的不明特点，并使用REFMAC5 (CCP4)精修所述模型。然后使用C00T中的水放置(water placement) 选项加入水分子并使用REFMAC5 (CCP4)精修。使用PR0CHECK (CCP4)和RAMPAGE (CCP4)检查Fab K1-70的结构几何形状。最后，根据Kabat编号系统(Kabat E et al 1991文献见上文)对所述模型中的残基重新编号。在大肠杆菌中重组Kl_70Fab的克隆和表达用Xhol和Spel限制性内切酶切所述K1-70HC RT-PCR产物，用&icl和Xbal限制性内切酶切所述K1-70LC PCR产物，并且将HC和LC cDNA都克隆进入IacZ启动子控制下的 Immunozap H/L 载体(Stratagene Europe ；Amsterdam, Netherlands) (Matthews I，et al 2002 Laboratory Investigation 82:1-11)。使用 Qiagen midi 质粒纯化试剂盒(Qiagen Ltd, Crawley, UK)制备质粒DNA并且通过桑格-库森法(Sanger F，et al 1977文献见上文)测序确认K1-70HC和LC cDNA的存在。将质粒DNA转化进入大肠杆菌菌株HB2151 (GE Life Sciences,Little Chalfont,UK)并在 37°C下在 LB 氨苄青霉素(胰蛋白胨 10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 10g/L、100 μ g/mL终浓度的氨苄青霉素)琼脂平板上(15g/L琼脂) 培养过夜。在30°C下震荡过夜培养预培养物(3mL LB氨苄青霉素培养基+1%葡萄糖中的一个菌落)。在葡萄糖存在下所述重组Fab的产生被抑制。将过夜培养后的预培养物以1/100 稀释(0. 5mL稀释于50mL LB氨苄青霉素)并且在30°C培养直到0D_达到1. 2，之后加入蔗糖(终浓度为0. 3mol/L)，在30°C培养培养物直到OD600回到1. 2。之后加入异丙基- β -D 硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为lmmol/L，在23°C下继续震荡培养培养物对小时。然后将培养物在4°C在3000rpm下离心30分钟并回收培养物上清液。将所述培养物上清液通过 0. 45 μ m 的过滤器过滤并且用 PBS (8. lmmol/L Na2HPO4U. 5mmol/L KH2PO4,2. 7mmol/L KCl、 137mmol/L NaCl pH 7.4)中透析过夜。使用在无IPTG下用葡萄糖培养的即未诱导的被 K1-70质粒(HB2151/K1-70)转化的HB2151细胞的培养物上清液作为阴性对照。对所述培养物上清液测定(a)它们抑制THS与所述THSR结合的能力和(b)它们抑制表达TSHR的CHO细胞中TSH介导的对环AMP产生的刺激的能力。结果分泌K1-18或K1-70的稳定细胞系的分离和克隆用EBV感染从20mL患者血液中得到的淋巴细胞Q6X106)并且以每孔IX IO6个细胞铺在48孔板中的小鼠巨噬细胞饲养层上。EBV感染后第13天监测所述板孔上清液的 125I-TSH结合抑制。对阳性克隆进一步测试它们对所述TSHR的作用(刺激或阻断)。扩增来自阳性孔(在任何所使用的测定中都是阳性)的细胞并且与K6H6/B5杂交瘤细胞系融合并且铺在96孔板上。得到了稳定产生具有125I-TSH结合抑制活性抗体的两个克隆并且再克隆4次。分泌人MAb的克隆之一被命名为K1-18，所述K1-18具有TSHR刺激活性。从异源杂交瘤培养物上清液中纯化的K1-18抗体是具有κ轻链的亚类IgGl。分泌人MAb的另一个稳定克隆被命名为K1-70，所述K1-70具有阻断TSHR转染的CHO细胞中TSH刺激的环 AMP产生的能力。从异源杂交瘤培养物上清液中纯化的K1-70抗体是具有λ轻链的亚类 IgGl0125I-TSH与TSHR包被管的结合的抑制不同浓度的Κ1-18或Kl_70IgG抑制标志的TSH与TSHR包被管的结合的能力在表 Ia和Ib中示出。如表Ia所示，稀释在健康血液供体(HBD)血清中的Kl_18IgG在1 μ g/mL 的浓度表现出约95%的对125I-TSH结合的最大程度抑制。在1-0. 001 μ g/mL之间的浓度下 Kl-ISIgG的抑制效应是剂量依赖的。在相同浓度下K1-18的抑制效应与M22IgG的效应相当。与 5C9IgG、TSMAb l_7IgG 或 9D33IgG 相比，1 μ g/mL 下的 Kl_18IgG 是 125I-TSH 结合的更强的抑制剂(表la)。Kl-70IgG或Fab对125I-TSH结合的抑制效应在表Ib中显示。稀释在HBD血清中的Kl-70IgG显示出剂量依赖的抑制，范围从0. 03 μ g/mL下的13. 5士2. 3%至 100 μ g/mL下的95. 9士0. 8%。Kl_70Fab的抑制效应与Kl_70IgG的效应在相同浓度下相当 (表lb)。表Ia和Ib还显示出稀释在所述包被管测定缓冲液中的K1-18和K1-70和不同的 MAb IgG对125I-TSH与TSHR结合的效应；对于除了 5C9的所有MAb，这些效应与当MAb稀释在 HBD血清中时观察到的结果相当。表加显示出K1-18、K1供体血清和Kl-供体血清IgG的不同制品对125I-TSH与TSHR包被管的结合的抑制。在该实验中，用少到0. 01 μ g/mL的稀释在HBD血清中的Kl-ISIgG观察到约12%的抑制，并且所述抑制以剂量依赖的方式升高到在 10 μ g/mL的Kl-18IgG下的95%的最大抑制。HBD血清中0. 01 μ g/mL的Kl_18Fab显示出 5. 6 士 7. 3%的抑制并且所述抑制以剂量依赖的方式升高到在10 μ g/mL下的82. 2 士0. 9% 的最大抑制。这可以与稀释在HBD血清中的供体血清IgG对125I-TSH结合的抑制相比；在 0. 125mg/mL下的13. 7士 1. 3%抑制以剂量依赖的方式升高到lmg/mL下76. 5士 1. 5%的抑制。不同稀释度下的供体血清还显示出对125I-TSH结合的剂量依赖的抑制从1/160稀释度下的9. 1 士0.8%的抑制到1/10稀释度下的81. 1 士0.4%的抑制。表加中的数据显示从对TSH结合的抑制方面来说纯化的Kl-18IgG的活性比Kl供体血清IgG的高6600倍。当 Kl-ISIgG和供体血清IgG被稀释在测定缓冲液中时，Kl-ISIgG抑制TSH结合的能力比所述供体血清IgG的大4700倍(表加)。表2b显示不同的K1-18制品对125I-TSH与包被管中的 TSHR 结合的抑制，所述抑制与来自 National Institute for Biological Standards and Control (NIBSC ；Potters Bar, UK)的甲状腺刺激自身抗体参考制品90/672的效应相比。稀释在HBD血清中的Kl-18IgG显示出69NIBSC 90/672单位/mg(以Kl_18IgG的三种浓度计算的活性平均值，所述浓度为30ng/mL、100ng/mL和300ng/mL)的125I-TSH结合抑制活性(表2b)。在相同实验中计算的Kl-ISFab (稀释在血清中)的125I-TSH结合抑制活性是 46NIBSC 90/672 单位 /mg (Kl_18Fab 在 30ng/mL、100ng/mL 和 300ng/mL 下的活性被用于所述计算)(表2b)。这可与131NIBSC单位/mg的M22IgG125I_TSH结合抑制活性相比。 供体血清和供体血清IgG的稀释物的125I-TSH结合抑制活性在表2c中显示，所述活性与 NIBSC 90/672的活性相比。所述供体血清的125I-TSH结合抑制活性是0. 075NIBSC90/672 单位/mL(40X和20 X稀释物的平均值)，而稀释在HBD血清中的供体血清IgG的125I-TSH 结合抑制活性是0.011单位/mg (在0. 1、0. 3和1. Omg/mL下的平均值)(表2c)。这可与在相同试验中测量的为63. 3NIBSC 90/672单位/mg (在30、100和300ng/mL下的平均值)的 Kl-18IgG(稀释在HBD血清中)的活性和为114单位/mg(在10,30和100ng/mL下的平均值)的Kl-70IgG(稀释在HBD血清中)的活性相比(表2c)。因此在该测定系统中Kl-ISIgG 的比活度是所述供体血清IgG的比活度的5755X。类似地，Kl-70IgG的比活度是所述供体血清IgG的比活度的10364X。K1-18 和 K1-70 与 TSHR 包被管的结合的 katchard 分析 Kl_18IgG 对 TSHR(全长)的结合亲和力是6. 7士 1.0X109L/mol(平均值士SD ；η = 3)而Kl_18Fab的结合亲和力是1. 8士 1. 0X109L/mol(平均值士SD ;n = 3)。Kl_18IgG对所述TSHI^60的结合亲和力是5.9士1.0\1091711101(平均士50;11 = 3)。Kl_70IgG 对 TSHR(全长)的结合亲和力是 3. 9 士 0. 8X 10lclL/mol (平均值士 SD ;n = 3)，而 Kl_70Fab 的结合亲和力是 2. 3 士 0. 3 X IO10L/ mol(平均值+SD ；η = 3)。Kl_70IgG对与所述TSHI^60的结合亲和力是3. 1 士0. 4X IO10L/ mol (平均值士SD ;n = 3)而Kl_70Fab对所述TSHI^60的结合亲和力是9. 3士0. 4X IO9L/ mol(平均值士 SD ;n =幻。这可与6. 0 士0. 9X 109L/mol (平均值士 SD ;n = 5)的猪TSH对所述TSHR(全长)的结合亲和力相比(Nakatake et al 2006文献见上文)。通过ELISA测量的对TSH-生物素与所述TSHR结合的抑制对Kl-18IgG对TSH-生物素与TSHR包被的ELISA板孔结合的效应进行了研究并与各种其他MAb的效应进行了比较。如表3a所示，稀释在HBD血清中的Kl-ISIgG具有对TSH-生物素结合剂量依赖的抑制，在0. 01 μ g/mL下为10. 0士0. 8%抑制，在1 μ g/mL下是96. 2士0. 2%的基本最大抑制并且在3 μ g/mL及以上浓度达到最大抑制平台。这可与 0. 01 μ g/mL 下 17. 5士2. 0%和 1 μ g/mL 下 98. 3士0. 0%的 M22IgG(稀释在 HBD 血清中)的抑制效应相比(表3a)。如表3a所述的实例所述，Kl-ISIgG (稀释在HBD血清中)在lyg/ mL下的TSH-生物素结合抑制活性比5C9IgG、TSMAb l_7IgG和9D33IgG的大。当对稀释在 ELISA 测定缓冲液(50mmol/L NaCl、10mmol/L Tris pH 7. 8,0. 1% v/v Triton Χ-100 和lmg/mL BSA)中的Kl_18IgG进行测试时，所述抑制效应与在HBD血清中制造稀释物时的效应基本相同(表3a)。如表北的实例所示，稀释在HBD血清或ELISA测定缓冲液中的 Kl-18Fab在所述ELISA中也是TSH-生物素结合的有效抑制剂。稀释在加入了 100 μ g/mL 的对照MAb IgG (谷氨酸脱羧酶的人MAb——5B3)的ELISA测定缓冲液中的K1-18的抑制效应在表3c中显示。当稀释在含有对照MAb的缓冲液中时，Kl-18IgG显示出与稀释在含有BSA的缓冲液或稀释在HBD血清中相似的TSH-生物素结合抑制活性(表3c)。因此，高浓度(100 μ g/mL)无关人MAb IgG的存在不会影响Kl_18IgG和M22IgG以及5C9IgG的抑制活性。表3d显示出K1-70对TSH-生物素与所述TSHR的结合的效应，并且这些与K1-18或M22的效应是相当的(表3a和3b)。稀释在HBD血清中的Kl_70IgG对TSH-生物素结合有剂量依赖的抑制效应，在0.011^/1^、0.11^/1^和11^/1^下分别为13.6 士 1.4%、 74. 1 士0. 4%禾口 97. 4士0. 2% 的抑制。Kl_70Fab 有相似的活性，在 0. 01 μ g/mL、0. 1 μ g/mL 和 1 μ g/mL 下分别为 18. 2+0. 6%,88. 3士0. 3%和 96. 9士0. 的抑制。当 Kl_70IgG 或Fab 制品被稀释在ELISA缓冲液中时，抑制活性与用HBD血清制备的稀释物基本相同(表3d)。 Kl-18IgG对M22Fab-P0D与TSHR包被的ELISA板孔结合的抑制能力在表如中显示。稀释在HBD血清中的Kl-18IgG以剂量依赖的方式抑制M22Fab_P0D结合；具体地，观察到在 0. 03 μ g/mL、0. 3 μ g/mL 禾口 3 μ g/mL 下分另Ij为 21. 0士 1. 3%,81. 6士0. 5%和 97. 2士0. 的抑制。该效应与M22IgG(稀释在HBD血清中)的抑制效应(在0. 03 μ g/mL、0. 3 μ g/mL和 3 μ g/mL 下分别为 51. 0士2. 4%,93. 2士0. 3%禾口 98. 0士0. 2% )相当。Kl_18Fab 显示出与 Kl-18IgG相似的抑制M22Fab-P0D结合的能力(表4b)。如表如所示，K1-18和M22抑制标志的M22与TSHR结合的能力比5C9、TSMAb 1-7和9D33的抑制活性更大。研究的所有MAb 当稀释在ELISA测定缓冲液中时的抑制效应与当稀释在HBD血清中时观察到的相似(表 4a和b)。可比较K1-18对M22Fab-P0D与所述TSHR结合的抑制效应和K1-70的效应(表 4c)。稀释在HBD血清中的Kl-70IgG表现出在0. 03 μ g/mL、0. 3 μ g/mL和3 μ g/mL下分别为 34. 5士3. 8%、91. 1 士0.3%和 97. 6士0. 的抑制。当 Kl_70IgG 稀释在 ELISA 测定缓冲液中时观察到相似的抑制百分比(表4c)。如表如所示，稀释在HBD血清或ELISA测定缓冲液中的Kl-70Fab显示出与Kl-70IgG相似的M22-P0D结合抑制活性。125I-标志的Kl_18IgG或Fab与TSHR包被管结合的抑制在浓度为0.01-100 μ g/mL(稀释在HBD血清)的对照人MAb 4B4IgG存在下， 125I-Kl-18IgG的结合基本上未受影响(表fe)。这可与不同浓度的未标志的Kl-18IgG(稀释在HBD血清)的效应相比较；增加的剂量——0.001、0.01、0. 1和1.0 μ g/mL分别引起对 125I-标志的 K1-18 结合的 11. 1 士4. 4%,22. 9士2. 4%,69. 0士0. 5%和 91. 7士0. 8%的抑制。在0. 001-100μ g/mL浓度下测试的未标志的Kl-18Fab显示出10. 3 士 2. 2% (0. 03 μ g/ mL 下)至 84. 8 士 0.9% (100 μ g/mL 下)的抑制范围(表 5b)。Kl_70IgG 和 Fab (都在 0. 001-100 μ g/mL的浓度范围内测试)也以剂量依赖方式抑制125I-Kl-ISIgG结合，并在 10 μ g/mL的Kl-70IgG下有95. 1 士0. 3 %的基本完全抑制和3 μ g/mL的Kl_70Fab下有 92. 8士 1. 的基本完全抑制(表5b)。此外，125I-Kl-18IgG的结合被M22IgG、M22Fab、 5C9IgG、TSMAb l_7IgG和9D33IgG以剂量依赖的方式抑制(表fe和恥)。当使用稀释在包被管测定缓冲液中的各种MAb制品进行相同的实验时，各个制品(除了 5C9IgG)的抑制效应与当稀释在HBD血清中时观察到的效应相当(表fe)。对于稀释在测定缓冲液中的5C9，100 μ g/mL下的最大抑制是91. 3士0. 4 %，相比之下，稀释在HBD血清中的抑制为 57.7 士 2.4%，在 0.01yg/mL 下抑制分别为 11. 7 士 1. 8 % 和-1. 8 士 2. 7 % (图 fe)。 125I-Kl-ISIgG与TSHR包被管的结合被淋巴细胞供体血清抑制，在1 20和1 10的血清稀释度下分别导致35. 2%和59. 3%的抑制(图5c)。来自20位格雷夫斯病患者的血清抑制125I-Kl-ISIgG的结合并且所述抑制效应与对125I-TSH结合的抑制效应相当(图5c)。 表5c还显示来自具有阻断TRAb的两位患者的血清稀释物(Bi和B》和来自具有刺激TRAb 的两位患者的血清稀释物(Si和S2)对125I-Kl-ISIgG结合和125I-TSH结合的效应。各种 MAb对25I-Kl-18Fab与所述TSHR包被管结合的效应在表5d中示出。未标志的Kl_18IgG和Kl-18Fab都对125I-Kl-18Fab结合有剂量依赖的抑制效应并且这些效应与M22IgG、M22Fab 和 Kl-70IgG 的效应相当(图 5d)。5C9IgG、TSMAb l_7IgG 和 9D33IgG 也抑制 125I_Kl_18Fab 结合，但是，与M22、K1-18和K1-70制品相比，它们的效应较小(图5d)。对表达所述TSHR的CHO细胞中环AMP产生的刺激如表6a所示，Kl-18IgG以剂量依赖的方式刺激表达所述TSHR的CHO细胞中的环AMP的生产。在低渗缓冲液中，在0. Ing/mL Kl_18IgG存在下环AMP的水平是 1. 56士0. 32pmol/L，在 1. Ong/mL 下为 4. 08士0. ^pmol/L，在 10ng/mL 下是 31. 66士5. 06pmol/L，在 100ng/mL 下是 64. 95士9. 61pmol/L 而在 1000ng/mL 下是67. 90士 10. 44pmol/L。在低渗缓冲液中不同浓度的Kl_18Fab下的环AMP水平在 Ing/mL、10ng/mL、100ng/mL 和 1000ng/mL 的 Kl_18Fab 下分别是 1. 72士0. 82pmol/L、 9. 99士3. 52pmol/L、53. 22pmol/L和 66. 94士6. 93pmol/L。在低渗缓冲液中 Ing/mL 的M22Fab 刺激产生 29. 80士0. 97pmol/L 的环 AMP，而在 10ng/mL 下产生 57. 41 士5. 05pmol/L 的环 AMP (表6a)。表6a还显示在等渗条件下测试的Kl_18IgG或Fab对表达所述TSHR的CHO 细胞中环AMP刺激的效应。如表6a中的实例所示，K1-18和K1-70在等渗条件下都引起环AMP产生的升高，但是产生的环AMP的水平比使用低渗条件的实验低。在低渗缓冲液中测试的M22IgG和Kl-18IgG刺激活性的比较在表6b中显示。在3ng/mL浓度下，M22IgG刺激 24. 3士2. 3pmol/mL 的环 AMP，而 Kl_18IgG 刺激 8. 3士0. 5pmol/mL 的环 AMP。在 10ng/mL 下，M22IgG和Kl-18IgG分别引起环AMP的50. 3士 1. 6和25. O士 1. Opmol/mL的刺激，而在 100ng/mL下分别引起环AMP的64. 6士 1. 9和62. 6士2. 7pmol/mL的刺激。还相对于NIBSC参考制品90/672的活性评估了 Kl-ISIgG和Fab的刺激活性(表6c)。计算到的Kl-ISIgG的
环 AMP 刺激活性是 155NIBSC 90/672 单位 /mg (在 3 个浓度-Ing/mL、3ng/mL 和 10ng/mL
下计算的平均活性)(图6c)。在相同实验中计算的Kl-ISFab的环AMP刺激活性是22NIBSC 90/672 单位 /mg (使用 1 Ong/mL、30ng/mL 和 100ng/mL 的 Kl_18Fab 的活性进行计算)(图 6c)。这可与286NIBSC单位/mg的M22IgG环AMP刺激活性相比较(表6c)。为了比较的目的，猪TSH、天然人TSH和重组人TSH在等渗缓冲液和低渗缓冲液中的刺激活性在表6d中显
7J\ ο表6e显示的其他实例涉及Kl_18IgG、M22IgG或pTSH以不同的组合混合在一起时的刺激效应。当两个刺激物混合在一起时，pTSH、M22或K1-18的刺激效应看来比仅相同浓度的所述刺激物的效应增强了。具体地，在仅0. Ing/mL的pTSH下环AMP产生为 11. 01 士0. 99pmol/mL(平均值士SD)，Ing/mL 的 M22IgG 为 35. 17士6. 38pmol/mL(平均值 士SD)，而当 0. Ing/mL pTSH 和 Ing/mL M22IgG 混合在一起时增加至 47. 22士3. 89pmol/ mL (平均值士SD)。同样，0. Ing/mL的pTSH和10ng/mL的Kl_18IgG混合物比仅这些刺激物时的刺激效应大(表6e)。此外，混合在一起的两种刺激抗体比同样浓度的单种抗体更有效。例如,应答5ng/mL的Kl-18IgG产生四.95士 1. 18pmol/mL (平均值士SD)的环AMP，应答0. 5ng/mL的M22IgG产生20. 20 士 2. 48pmol/mL (平均值士 SD)的环AMP，而应答混合在一起的 5ng/mL K1-18 和 0. 5ng/mL M22 产生 44. 01 士7. 19pmol/mL (平均值士SD)的环 AMP (表 6e) ο比较K1-18和K1-70供体血清和供体血清IgG刺激环AMP的能力与NIBSC 90/672 的刺激活性的两个实验的结果在表6f和6g中显示。在实验1中，在30倍稀释度下供体血
26清的刺激活性是4. 7士0. lpmol/mL的环AMP，相比之下，在相同稀释度下HBD血清的效应为 1. 7 士0. 4pmol/mL的环AMP，而供体血清IgG在30 μ g/mL下的刺激活性是7. 7 士 1. Opmol/ mL(代表相对于0.013单位/mg的NIBSC 90/672的活性)(表6f)。在实验2中，30倍稀释的供体血清引起9. 5 士0. 7pmol/mL的环AMP刺激，而30 μ g/mL的供体血清IgG引起 15. 6 士 0. 7pmol/mL的刺激(代表相对于0. 014单位/mg的NIBSC 90/672的活性)(表6g)。 如表Mi所示的实例所述，Kl-18IgG的TSHR刺激活性被具有TSH拮抗活性的人MAb (K1-70 和5C9)抑制。具体地，10ng/mL的Kl_18IgG引起50. 0士3. 3pmol/mL的环AMP刺激，并且这在 0. 1 μ g/mL Kl-701gG 存在下被降低至 3. 8士 1. Opmol/mL (92 %抑制)。在 10ng/mL 的 Kl-18IgG 和 0. 1 μ g/mL 的 5C9IgG 存在下环 AMP 水平是 4. 4士 1. 5pmol/mL (91 %抑制)。在更高浓度的Kl-70IgG或5C9IgG下，抑制效应是完全的(100%抑制)(表他)。在另外的实验中，研究了与5C9IgG混合在一起的Kl-70IgG对Kl_18IgG刺激活性的效应(表6i)。如表 6i 所示，10ng/mL 的 Kl_18IgG 刺激被 0. 1 μ g/mL 的 5C9IgG 或 0· 1 μ g/mL 的 Kl_70IgG 有效地抑制。当混合Kl-70IgG和5C9IgG得到0. 1 μ g/mL的总最终浓度时，Kl_18IgG的刺激活性也被有效地抑制(97. 3%抑制)。但是在较低浓度下，与仅一种抗体相比，Kl-70IgG和 5C9IgG在混合在一起时是Kl-18IgG刺激活性的更有效抑制物。例如，在0. 001 μ g/mL下， Kl-70IgG和5C9IgG单独地不引起抑制(分别为0%和1 % )，而当一起混合为相同的总IgG 终浓度(即0.001 μ g/mL)时抑制是25. 5%。表6i还显示在Kl_70IgG(100 μ g/mL)存在下环AMP浓度与在测定缓冲液存在下观察到的环AMP浓度相似，而在5C9IgG(100 μ g/mL)存在下环AMP的浓度较低(分别为0. 89士0. 13,0. 89士0. 15和0. 55士0. 14)( 一式三份测定的平均值士SD)。当Kl-70IgG和5C9IgG混合在一起时(100 μ g/mL的总IgG终浓度)，环 AMP浓度没有降到低于在缓冲液存在下观察到的水平(即不低于基础或组成性活性水平)。 为进行比较，在1 μ g/mL的5C9IgG或1 μ g/mL的Kl_70IgG下观察到对M22IgG (3ng/mL)刺激活性的基本完全的抑制(分别为97. 1 %和96. 6%抑制)，并且在0. 1 μ g/mL的5C9IgG或 0. 1 μ g/mL的Kl-70IgG下的抑制分别为92. 8%和75. 5% (表6j)。但是，当5C9和K1-70 混合在一起达到0. 1 μ g/mL的总IgG终浓度时观察到了 91. 9%的抑制(表6j)。Kl_70IgG 和9D33IgG的混合物对Kl-18IgG刺激活性的效应在表故中显示。对于9D33IgG，在1 μ g/mL 下观察到了 95%抑制，而对于Kl-70IgG，在0. lyg/mL下显示出相同的抑制(95%抑制)。 当所述两种阻断MAb (9D33和K1-70)混合在一起达到0. 1 μ g/mL的总IgG终浓度时也观察到了 95%的抑制(表。10 μ g/mL的9D33IgG能够基本完全抑制M22IgG的环AMP刺激 (94%抑制)而较低浓度的Kl-70IgG(l μ g/mL)具有相似的效应(96%抑制)(表61)。对 M22活性基本完全的抑制(96%抑制)在1 μ g/mL的9D33和K1-70混合物下是明显的(表 61)。这与9D33和K1-70混合物(1 μ g/mL)对TSH刺激活性的抑制效应(97%抑制)是相当的(表6m)。但是，应注意TSH刺激活性被仅Kl-70IgG抑制(1 μ g/mL下98%抑制)比被仅9D33IgG抑制(100 μ g/mL下95%抑制)更有效(图6m)。表6η显示淋巴细胞供体血清和包含具有阻断活性的TRAb (Β1-Β3)的3位患者的血清对TSH、M22IgG和Kl_18IgG的TSHR 刺激活性的效应。所述供体血清抑制TSH、M22IgG和Kl-ISIgG刺激活性(分别为63. 8%, 80. 1 %和79. 5%抑制)。含有对TSH和M22IgG刺激具有强烈抑制效应的阻断TRAb的3种不同血清还抑制Kl-18IgG的刺激活性(表6n)。不同患者血清对TSH、M22IgG或Kl_18IgG 刺激活性的抑制效应是相当的。
拮抗(阻断)活性的测量表达所述TSHR的CHO细胞与3ng/mL的猪TSH的孵育引起62. 6士3. 9pmol/mL的环 AMP产生刺激(表7a)。在渐增量的Kl-70IgG存在下，猪TSH的刺激活性被以剂量依赖的方式抑制。具体地，在0. 01,0. 05,0. 1和1 μ g/mL的Kl_70IgG存在下，环AMP的水平分别为 60. 1 士 1. 6,31. 4士 1. 9,5. 8士2. 8 和 2. 0+0. 2pmol/mL，分别代表相对于对照 MAb IgG (5B3) 的4. 0%,49. 8%,90. 7%和96. 8%的抑制(表7a)。表7a还显示出用于比较的5C9IgG的抑制效应。在两种不同实验条件下Kl-70Fab对猪TSH的刺激活性的效应在表7b中显示。在两种条件下(即在等渗介质和在低渗介质中)在1 μ g/mL Kl-70Fab存在下，猪TSH刺激活性都基本被完全抑制。Kl-70Fab的效应在所研究的浓度范围内(0. 003 μ g/mL至3 μ g/mL) 是剂量依赖的，低至0. 05 μ g/mL的Fab显示出在1 μ g/mL对照MAb存在下将猪TSH刺激的环 AMP 从 39. 5 士 1. 9pmol/mL 降低至沘· 9 士 1. lpmol/mL (在等渗条件下)(表 7b)。Kl_70Fab 在低渗条件下的效能与在等渗条件下的效能相似(表7b)。如表7c所示的实例所显示，浓度渐增的Kl-70IgG(范围为0. 001-100 μ g/mL)没有显示出抑制TSHR组成性(基础)活性的任何能力。这与在表7c中显示的用于比较的5C9IgG的效应不同。在同一实验中测试的阻断小鼠抗体9D33没有影响TSHR组成性活性的能力(表7c)并且在高浓度的9D33情况下观察到一些微弱的刺激活性(约2X基础活性)。如表7d所示Kl_70IgG的阻断活性与所述淋巴细胞供体血清的阻断活性进行比较。环AMP水平在与Ing/mL猪TSH孵育后为61. 7士4. 3pmol/mL，并且所述水平在供体血清 (10 X稀释)存在下下降到14. 9士 1. 2pmol/mL(75. 9%抑制)，而当血清稀释20倍时下降到 51. 6+2. 6pmol/mL(16. 4%抑制)。较高稀释度的供体血清没有可检测的对TSH刺激活性的效应。可比较供体血清的效应与Kl-70IgG的效应(在0. 1 μ g/mL下与稀释10倍的血清有相似的效应)(分别为67. 6%和75. 9%抑制)(表7d)。如表7e中的实例所示，Kl_70IgG 具有阻断猪TSH、人TSH和人重组TSH的环AMP刺激活性的能力。0. 1 μ g/mL的Kl_70IgG 是在低渗介质条件下测试的所有三种TSH制品的刺激活性的有效阻断物。Kl-70IgG的阻断活性在等渗介质条件下有效性较低(表7e)。Kl-70IgG对表达所述TSHR的CHO细胞中 M22IgG介导的环AMP产生的刺激的效应在表7f中显示。在3ng/mL的M22IgG下观察到的环AMP水平为33. 1 士 1. 8pmol/mL并且这些在Kl_70IgG存在下下降，例如在0. 1 μ g/mL下为4. 3士2. 4pmol/mL(87%抑制)(表7f)。Kl_70IgG的效应与在相同实验中测试的5C9IgG 的效应相当(表7f)。此外，Kl-70IgG显示出阻断来自格雷夫斯病患者的血清中的TRAb的环AMP刺激活性的能力，并且表7g1k中的实例示出了浓度为100 μ g/mL的Kl_70IgG引起所研究的全部15种血清中刺激活性的完全抑制(T1-T15的抑制范围为90. 8%至98. 7% )。 除一种血清即Tll以外，Kl-70IgG对血清T1-T15刺激活性的效应与相同实验中测试的 5C9IgG和9D33IgG的效应相当(表7j)。血清Tll的刺激活性仅被100 μ g/ml的5C9IgG微弱地抑制(8. 5%抑制)，而在100 μ g/mL的K1-70存在下所述抑制基本是完全的(95. 1 %抑制)(表7j)。在100 μ g/mL 9D33下也观察到了对Tll的有效抑制(87. )(表7j)。不同阻断MAb在不同浓度(0.01-100 μ g/mL)下对三种格雷夫斯血清(包括血清Tll)的刺激活性的效应在表71-7n中更详细地展示。这些实验显示Kl-70IgG、5C9IgG和9D33IgG在低至0. 1 μ g/mL的浓度下都是有效的抑制物，但是在血清Tll的情况下，5C9IgG对它有很少或没有效应(表7n)。表7o显示在一个实验中Kl-70IgG和5C9IgG当这两种阻断Mab混合在一起时对猪TSH刺激的抑制。这些实验显示所述两种阻断Mab在结合时能够有效抑制 TSH刺激的环AMP产生。此外，测试了混合在一起的Kl-70IgG和5C9IgG对所述TSHR的组成性活性的效应。如表7c和7p所示，与5C9IgG不同，Kl_70IgG对TSHR基础活性没有影响。当K1-70和5C9IgG混合在一起得到2 μ g/mL的IgG终浓度时，环AMP水平在缓冲液存在下从58. 04士8. 52pmol/mL(平均值士SD，n = 3)仅略微下降至55.沘士6. 17pmol/mL(平均值士SD，n = 3)，即4. 8%抑制(表7p)。但是，当5C9IgG与5B3IgG (谷氨酸脱羧酶的对照抗体)混合得到2 μ g/mL的IgG终浓度时，所述TSHR的组成性活性被抑制至基础值的 52. 1% (环AMP水平27. 78 士 2. 96pmol/mL ；平均值士 SD，n = 3)(表7p)。这些实验显示在 Kl-70IgG存在下，5C9IgG不能够作为TSHR组成性活性的有效抑制剂起作用。TSHR突变对K1-18刺激活性的效应使用表达具有以下氨基酸突变的TSHR的CHO细胞测试Kl_18IgG对环AMP产生的刺激的效应Lys58Ala、Arg80Ala、Tyr82Ala、Glul07Ala、Argl09Ala、Lysl29Ala、 Phel30Ala、Phel34Ala、Lysl83Ala、Asp203Ala 和 Arg255Asp (表 8a_k 并且在表 10 中做了总结)。TSHR 氨基酸 Lys58、Arg80、Tyr82、Glul07、Argl09、Lysl29、Phel30、Phel34 和 Asp203突变为丙氨酸对Kl-18IgG刺激环AMP产生的能力没有影响。K_18IgG刺激环AMP 产生的能力在表达包含突变Lysl83Ala和Arg255Asp的TSHR的CHO细胞中完全丧失，并且响应Kl-ISIgG的环AMP浓度与在仅有环AMP缓冲液存在下观察到的浓度相似(表8i 和8k)。但是，对TSH的响应性对于突变Lysl83Ala和Arg255Asp得以保留。在另外的一系列实验中进一步测试了 TSHR的多个氨基酸突变对Kl-18IgG的环AMP刺激活性的效应 (表 14a-14v 并且在表 16 中做了总结)。TSHR 残基 Asp43、Ile60、Glu61、Thrl04、Hisl05、 Lys250、Arg255、Thr257、Asp276和kr281的突变(突变为丙氨酸)对Kl_18IgG的刺激环 AMP产生的能力没有影响。TSHR的Aspl51、Glul78、Lys209、Gln235和Glu251突变为丙氨酸引起Kl-ISIgG刺激活性的较小的下降，但是这些突变也会影响TSH刺激活性，因此认为与这些TSHR残基的相互作用对K1-18不是特异的。相反地，TSHR Glul57Ala、Lysl83Asp、 Tyrl85Ala和Asp232Ala的突变致使Kl_18IgG刺激环AMP的能力的丧失(少于野生型活性的 20% ；表 14g、14i、14j 和 14m)。此外，Kl_18IgG 刺激 Tyr206、1"印258 和 Arg274 突变为丙氨酸的TSHR的能力下降至野生型活性的约40-60% (表14k、Hs和14t)。TSHR突变对K1-70阻断活性的效应在表达包含以下氨基酸突变为丙氨酸的TSHR的CHO细胞中测试Kl_70IgG对TSH 刺激的环 AMP 产生的效应Lys58、Arg80、Tyr82、Glul07、Argl09、Lysl29、Phel30、Phel34、 Lysl83和Asp203。此外，测试了 TSHR突变Arg255Asp的效应(表9a_k并且在表10中做了总结)。TSHR 氨基酸 Arg80、Glul07、Lysl29、Phel30、Phel34 和 Asp203 突变为丙氨酸对Kl-70IgG抑制TSH刺激的环AMP生产的能力没有影响。TSHR Lys58、Tyr82、Argl09和 Lysl83突变为丙氨酸使K1-70抑制TSH刺激的环AMP产生的能力下降。突变Lys58Ala有最大的效应(表9a)，之后是Argl09Ala、Lysl83Ala和具有最小效应的Tyr82Ala(分别示于表9e、9i和9c以及表10)。但是，研究的突变没有一个引起Kl_70IgG阻断TSH刺激的环AMP生产的能力完全丧失。在其他系列的实验中，进一步测试了 TSHR的多个氨基酸突变对Kl-70IgG阻断活性的效应(表15a-15v并在表16中做了总结)。在TSHR转染的CHO细胞中K1-70抑制TSH刺激的环AMP产生的能力未受TSHR Asp43、Thrl04、Hisl05、Aspl51、Tyrl85、Tyr206、Lys209、Asp232、Gln235、Glu251、Arg255、Thr257、Trp258 和 Arg274 突变为丙氨酸或Aspl60Lys和Lysl83Asp突变的影响。TSHR Glul78和kr281 (突变为丙氨酸) 的突变对Kl-70IgG阻断TSH的刺激活性的能力有较小影响(野生型活性的80-100%，表 15h和15v)。TSHR Glu61、Lys250和Asp276突变为丙氨酸引起对Kl_70IgG阻断活性的一些效应(野生型的60-80% )(表15c、15ο和15u)，而TSHR突变Ile60Ala引起Kl_70IgG 的阻断活性下降至野生型活性的40-60% (表15b)。125I-标志的Kl_70IgG或Fab结合TSHR的抑制125I-Kl-70IgG与TSHR包被管的结合被未标志的Kl_70IgG以剂量依赖的形式抑制，并且在0. 003 μ g/mL、0. 03 μ g/mL、0. 3 μ g/mL和3 μ g/mL(稀释在HBD血清中)的浓度下，所述抑制分别是 10. 2士2. 4%、36. 5士 1. 9%、84. 4士0. 8%和 92. 0士0. 5% (表 Ila)。 如表Ila所示，125I-Kl-70IgG的结合被M22IgG(稀释在HBD血清中)以非常类似的方式抑制在 0. 003 μ g/mL、0. 03 μ g/mL、0. 3 μ g/mL 和 3 μ g/mL 浓度下分别为 6. 2% ( —式两份测定的平均值)>33. 8士0. 9%、84· 6士 1. 禾口 91. 6士0. 5%抑制。M22Fab显示出在较低浓度下抑制 125I-Kl-70IgG 结合的较大效能，在 0. 003 μ g/mL、0. 03 μ g/mL、0. 3 μ g/mL 和 3 μ g/ mL(稀释在HBD血清中)浓度下的抑制分别为16. 7士6. 0%、60. 2士 1.8%、89. 9士01%和 92. 0士0.3% (表11a)。同样，Kl_18IgG和Fab以剂量依赖的方式抑制125I_Kl_70IgG与 TSHR 结合(表 lib)。0. 03 μ g/mL、0. 3 μ g/mL 和 3 μ g/mL 的 Kl_18IgG 稀释物(在 HBD 血清中)分别显示出 20. 0 士 1. 9%,73. 9 士 0. 6% 禾口 91. 0 士 0. 3% 的抑制，而 0. 03 μ g/mL、0. 3 μ g/
(在 HBD血清中)分别显示出 10. 2士2· 1%,60. 9士 1. 和80. 5士0. 6%的抑制(表lib)。相反地，需要较高浓度的5C9IgG来抑制125I-Kl_70IgG结合15. 4士3. 4%抑制需要 1μ g/mL，而 100 μ g/mL 显示出 68. 5士0. 7%抑制(表 Ila)。表 Ila和lib还显示出多种人MAb在测定缓冲液中对125Ι-Κ1-70结合的效应。当稀释物在测定缓冲液中制备时比用HBD制备的效应更强。所述TSHR具有TSHR刺激活性(TSMAb 1-7) 和具有TSHR阻断活性(9D33)的不同小鼠单克隆抗体对125I_Kl-70IgG与TSHR结合的效应在表Ilc中显示。测试的全部TSMAb均具有抑制125I-Kl-70IgG结合的能力并且100 μ g/ ml的浓度(在HBD血清中)引起的抑制范围为33. 5士3. 7% (TSMAb 3)至59. 6士0.6% (TSMAb 5)(表 11c)。100yg/ml 的 9D33IgG(在 HBD 血清中)显示出 51. 1 士 1.7%的抑制 (表lie)。当这些MAb稀释在测定缓冲液中时，在一些情况下，与使用HBD稀释相比，抑制％ 略高，而在另一些情况下则抑制％略低(表11c)。其他实验显示125Ι-Κ1-70与TSHR的结合还被 Kl-18IgG、Kl-18Fab、M22IgG、M22Fab、Kl_70IgG、Kl_70Fab 和小鼠 TSMAb 以剂量依赖方式有效地抑制(表lid)。含有TSHR自身抗体(125I-TSH结合抑制活性的范围为15.9% 至80.0% (在所述TSHR包被管测定中))的格雷夫斯病患者血清(n = 20)还显示出抑制 125I-Kl-7OIgG 或 Fab 与 TSHR 结合的能力(分别为 19. 2%至 77. 6%和 15. 9%至 72.8% ) (表lie)。测试的所述三种标志的配体的抑制％对于每种血清是相当的(表lie)。所述 HBD血清(n = 10)全都对125I-标志的TSH、Kl_70IgG或Fab结合没有影响(表lie)。表 lie示出了使用具有TSHR刺激活性的两种血清(Si和S》和具有TSHR阻断活性的两种血清(Bi和B2)的实验的实例。有任一类型活性的血清以剂量依赖的方式抑制125I-标志的 TSH、Kl-70IgG或Fab结合，并且每种血清对不同配体结合的抑制程度是相当的(表lie)。K1-18和K1-70与TSHR结合的动力学
室温下125I-标志的Kl_70IgG和Fab与TSHR(全长)包被管的结合在180分钟后达到最大(分别为45.5%和37.1%结合)。50%最大结合出现在约35分钟后(图la)。 25I-标志的Kl-70IgG与TSHR260包被管的结合在180分钟达到36. 2%而在孵育60分钟后观察到50%最大结合(图lb)。125I-标志的Kl-70Fab与TSHR260结合的时间过程与对 Kl-70IgG观察到的时间过程相似，60分钟孵育后的最大结合为37. 3%而50%最大结合出现在约60分钟后(图Ic)。向与TSHR (全长)包被管结合的125I-Kl-70IgG或125I-Kl-70Fab 中加入未标志的 Kl-70IgG 或 Fab、Kl-18IgG 或 Fab、M22IgG(都是 lmg/mL)，猪 TSH(100mU/ mL)或测定缓冲液，即使在孵育180分钟后也不会导致可检测的解离(图ld，Ie和If)。但是，向与TSHR包被管结合的125I-Kl-70IgG或125I-Kl-70Fab中加入未标志的M22Fab (lmg/ mL)之后分别41. 2%和27. 9%的结合总数在孵育180分钟后解离(图Id和If)。各种未标志的配体对与TSHI^60结合的125I-标志的Kl-70IgG的解离效应在图Ig中示出。猪TSH、 M22IgG和Kl-18IgG没有作用而M22Fab和Kl_70Fab在30分钟的孵育后引起约30%的结合的125I-标志的Kl-70IgG从TSHR260上解离，并且之后直至180分钟解离不再增加(图 lg)。Kl-18Fab具有类似效应，如图Ih所示。125I-Kl_70Fab与TSHR260包被管的结合不会通过用未标志的 Kl-70IgG、Kl-18IgG、M22IgG(都是 lmg/mL)、猪 TSH(100mU/mL)或测定缓冲液的孵育而解离。用未标志的M22Fab或Kl-70Fab(lmg/mL)孵育引起125I-Kl_70Fab与 TSHR260结合的解离(分别为58. 9%和62% )(图li)。125I-标志的Kl_18IgG与TSHR包被管在室温下的结合在180分钟后在全长TSHR包被管的情况下达到最大值32. 7%，而在 TSHR260包被管的情况下达到23. 3% (图Ij)。在全长TSHR情况下在约45分钟后观察到 50%最大结合而在TSHR260的情况下在约50分钟后观察到50%最大结合(图Ij)。与全长 TSHR包被管结合的125I-标志的Kl-ISIgG不会在用未标志的猪TSH孵育时几近不解离(not dissociated to a smau extent)，而用未标志的 Kl_18IgG、M22IgG、Kl_70IgG、Kl_18Fab 和Kl-70Fab孵育有略大的效应(180分钟后约25%解离)(图Ik)。相反地，M22Fab导致 60分钟孵育后与全长TSHR结合的125I-Kl-18IgG的解离，在180分钟孵育后增加至 43%解离(不存在M22Fab时有34. 5%结合的125I_Kl_18IgG，相比之下，用M22Fab孵育60 和180分钟后分别有24. 5%和19. 8%结合的125I_Kl_18IgG)(图lk)。对于与TSHR260包被管结合的125I-标志的Kl-18IgG，用猪TSH孵育没有解离效应(图11)。相反，用未标志的 M22Fab 孵育，Kl_70Fab 和 Kl_18Fab 引起结合的 125I_Kl_18IgG 从 TSHR260 上解离。在 M22Fab和Kl-70Fab存在下解离很快(30分钟孵育后约50% )，而用Kl_18Fab孵育90分钟后引起 50%解离(图 11)。完整 M22IgG、Kl-70IgG 和 Kl-18IgG 使 125I-K1-18 从 TSHR260 上解离的能力较小，180分钟孵育后观察到约30%的解离(图11)。另一系列实验显示125I-标志的猪TSH不能够与TSHR260包被管结合。以前描述过125I-TSH与全长TSHR包被管的结合(Nakatake et al 2006 文献见上文)。在基于TSHR260-AP 的 ELISA 中 K1-18 或 Kl_70IgG 的效应Kl-18IgG在固定在ELISA板孔上的全长TSHR与液相中的TSHR260-AP之间形成 “桥连”的能力由表12a中的实例描述。0D405nm值以剂量依赖的方式随着Kl-ISIgG(稀释在HBD血清中)浓度的上升而上升。具体地，与仅存在HBD血清情况下-0. 002的0D405nm 相比，0D405nm 值在 0. 005,0. 05,0. 5、10 禾口 100 μ g/mL 的 Kl_18IgG 下分别为 0. 013,0. 191、 0. 511、0. 660 和 0. 706。Kl_70IgG(稀释在 HBD 血清中)也在所述桥连 ELISA(bridging
31ELISA)中结合良好并且在0. 005,0. 05,0. 5、10和100 μ g/mL的Kl_70IgG浓度下分别显示出 0. 045,0. 290,0. 661,0. 738 和 0. 794 的 0D405nm 值(表 12a)。如表 12a 所示，K1-18 和 Kl-70IgG的效应可与M22IgG结合TSHI^eO-AP制品的能力相比较。在所述测定中，剂量增加的M22IgG (稀释在HBD血清中，0. 005 μ g/mL至10 μ g/mL)结合增加量的所述TSHR，0D405nm 值范围为0. 045至0. 796。当MAb稀释物在ELISA测定缓冲液中制备而不是在HBD血清中制备时，450nm处的吸光度较高，尤其是对于5C9 (表12a)。二价IgG与TSHR的两个分子结合的“桥式” ELISA原理已被表12b中所示的实验结果进一步证实。TSHR的人Mab的完整 IgG(M22、5C9、Kl-18和K1-70)在所述ELISA中显示出剂量依赖的结合，而相同MAb的单价 Fab片段显示出很小的反应或没有反应(表12b)。如表12c中的实例所示，小鼠TSMAb 1-7 也在所述TSHR260-AP ELISA中结合良好。OD 405nm信号在10 μ g/mL的TSMAb 1_7浓度下为0. 103至0. 561(表12c)。小鼠TSHR阻断MAb 9D33也在该测定系统中结合，在10 μ g/ mL下OD 405nm信号为0. 481 (表12d)。含有具有刺激活性的TRAb的患者血清，即显示出在表达所述TSHR的CHO细胞中刺激环AMP活性的能力的血清，在所述TSffi^60_AP ELISA 中反应良好。表1 示出了在不同稀释度下测试的6种不同血清的实例，并且在HBD血清中的1/5稀释物中，所述0D405nm信号在HBD血清中为0.407至0.924。此外，如表12f的实例所描述，来自具有阻断型TSHR自身抗体的患者的血清在TSHI^eO-AP ELISA中结合良好，在HBD血清中的1/10稀释物中，OD 405nm信号为0. 323至0. 896。表12g示出了在 TSHR260-AP ELISA中患者血清结合的更多实例。TSHR260-AP ELISA中TRAb浓度由校准曲线(由NIBSC参考制品90/672得到)计算并与在相同血清中使用TSHR包被管测定测量的 TRAb浓度(表示为NIBSC U/L)相比较。使用所述TSHR260-AP ELISA和通过对TSH与全长 TSHR结合的抑制(包被管测定)得到的TRAb测量结果有良好的总体一致性(r = 0.913， η = 57)(图加)。表1 显示出患者血清TRAb具有抑制过氧化物酶标志的M22Fab与包被在ELISA板孔上的TSHR260结合的能力。基于对M22Fab与全长TSHR结合的抑制的测定中 TRAb测量结果的比较与基于对M22Fab与TSHR260结合的抑制的测定中的结果非常相关(r =0. 761 ；η = 56)(图沘)。其他比较数据在图2c和2d中显示。测试了 TSHR R255突变对 TSHR260-AP ELISA中的抗体结合的效应。在这些实验中，含有突变R255D的全长TSHR制品被包被在所述板孔上并且使用上文所述的标准方法进行ELISA。如表12i所示，Kl-70IgG 或9D33IgG的结合仅被TSHR R255D突变略微影响。相反地，M22IgG结合被TSHR R255D突变显著地影响，在所有研究浓度下OD信号都降低(表12i)。TSHR R255D突变对较高浓度的Kl-ISIgG几乎没有影响，但是较低的浓度(0. lyg/mL及以下)在使用所述突变受体的测定中有效性低得多(表12i)。表12j还显示当使用TSHR R255D包被的板时，与野生型 TSHR比较，10种格雷夫斯血清(没有就TSHR刺激或阻断活性而进行选择)的OD 405nm信号都降低。所述信号降低的程度随不同血清而变化(图12j)。患者TSHR阻断血清在所述 TSHR260-AP ELISA中结合良好(表12f)，并且相同血清与TSHRR255D的结合在表12k中显示。在使用野生型TSHR和R255D突变的TSHR的实验中，所述OD 405nm信号值相似，因此TSHR R255D突变对阻断血清的结合的效应在该测定系统中似乎不明显。在TSHI^60-AP ELISA中R255D突变对患者阻断血清的结合的效应可与所述相同突变对具有甲状腺刺激活性的患者血清的结合的效应进行比较。表121显示6种刺激血清(S1-S6血清与表12e中所示的相同)与TSHR R255D的结合。对于全部6种血清，OD 405nm值在使用TSHR R255D的测定中均比使用野生型TSHR的测定中低。信号降低的程度是变化的对于血清S4、S5和 S6(以1 5稀释在HBD合并血清中)，所述信号从使用所述野生型TSHR的实验中的0.646、
0.407和0. 531分别降低至使用TSHR R255D的实验中的0. 193,0. 133和0. 342 (表121)。 对于具有高水平TRAb的血清(表1 和121中的血清S1-S3)，OD 405nm值的下降在较高血清稀释度下非常明显。例如，对于血清S1、S2和S3(以1 20稀释在HBD合并物中)，OD 405nm信号在使用野生型TSHR的实验中为0. 583,0. 407和0. 453，它们在使用TSHR R255D 的实验中分别明显地下降至0. 193,0. 117和0.210。表1 和121中所示的实例表明具有 TSHR刺激活性的血清在一些情况下至少基于与含有R255D突变的TSHR的结合的差异而与具有TSHR阻断活性的血清不同。具有刺激活性的患者血清的结合倾向于被所述突变影响， 而具有阻断活性的患者血清的结合倾向于不被影响。不同TSHR制品的温度稳定性在温度稳定性实验中，在所述ELISA中M22Fab_过氧化物酶与全长TSHR结合的 OD45tlIim值对于以下三种处理的制品分别为1. 748,0. 268和0. 126 (a)储存在_80°C下的制品(未处理)；(b)在室温下孵育M小时，之后放回-80°C的制品；以及(c)在室温下孵育 48小时，之后放回_80°C的制品。因此在室温下保存48和M小时的全长TSHR制品分别显示出相对于未处理的制品的仅和15%的活性。M22Fab-过氧化物酶结合OD45tlIim值对于未处理的TSHR260是2. 293,对于在室温下保存M和48小时的TSHR260分别是1. 836和
1.676。在室温下保存M和48小时的TSHI^60的活性相对于未处理的制品分别为80%和 73%。对于TSHI^60-AP观察到了类似的结果，在室温下保存M和48小时的样本的0D45(1nm 分别为2. 106和1. 983，相比之下，未处理样本的OD45tlIim是2. 395。这代表在室温保存M小时和48小时之后相对未处理TSHR260-AP有88%和83%的结合活性。在使用未处理TSHR LRD C-CAP的实验中，0D45(1nm为1. 826，而在对和48小时室温保存后分别为1. 158和1. 155。 TSHR LRD 00々？在对和48小时室温保存后显示出相对于未处理制品的63%的活性。以上描述的实验显示室温处理后TSHI^60、TSHR260-AP和TSHR LRD C-CAP的结合M22的能力比全长TSHR制品的强。这表明TSHI^60、TSHR260-AP和TSHR LRD C-CAP在室温下与全长 TSHR相比更稳定。可变区序列对为K1-18编码的基因的序列分析表明HC V区基因来自VH5-51*01家族，D基因来自D3-16*02(或D3-16*01)家族而JH基因来自J3*02家族。对于LC，V区基因来自V3_20*01 家族而J区基因来自JK-f01种系。HC核苷酸和氨基酸序列在图3中显示(SEQ ID No 1-18) 而LC核苷酸和氨基酸序列在图4中显示(SEQ ID No 19-36)。与种系序列相比，在HC基因序列中有体细胞突变；具体地，在CDRl中有1个沉默突变和1个替换突变，在CDR2中有1 个沉默突变和3个替换突变，在FRW3中有3个替换突变而在CDR3中有1个沉默突变和1个替换突变。对于所述CDR的替换/沉默突变(R/幻率为2. 7，但是，除了所述突变以外，在所述⑶R3中还有8个碱基对长的插入。所述HC⑶Rl (SEQ ID No 6和16)是5个氨基酸长， CDR 2 (SEQ ID No 7禾口 17)是17个氨基酸长而所述CDR 3 (SEQ ID No 8禾口 18)是13个氨基酸长(分别示于图北和3d)。在所述LC序列中有在CDRl中的2个替换突变，FWR2中的1个沉默突变和在⑶R 3中的3个替换突变，总R/S突变率为5. 0 (FffR和OTR)。所述LC CDR 1(SEQ ID No 24和34)由12个氨基酸组成，CDR 2 (SEQ ID No 25和35)由7个氨基酸组成而CDR 3 (SEQ ID No沈和36)由9个氨基酸组成(分别示于图4b和4d)。K1-70HC V区来自VH5-51*01种系，D基因来自Dl-7*01家族而所述JH基因来自J4*02家族。LC基因来自于所述LVl-5f01种系，与来自LJ7*01的几基因结合。所述HC核苷酸和氨基酸序列在图5中显示(SEQ ID No 37-M)，优选的LC核苷酸和氨基酸序列在图6c和6d中显示 (SEQ ID No 63-72)。在所述K1-70HC序列中在FWRl中有3个替换突变，在CDRl中有3个替换突变，在FWR2中有1个替换突变，在CDR2中有2个沉默突变，在FWR3中有4个替换突变而在FWR4中有1个替换突变。总(FWR和OTR) R/S突变率为6. 0。此外，在所述⑶R3中有2个插入在ν和D基因的联结处有5个碱基对的插入以及在D和J基因的联结处有12 个碱基对的插入(图5b和5d ； SEQ ID No 41和51)。所述HC CDR 1 (SEQ ID No 42和52) 是5个氨基酸长，CDR 2 (SEQ ID No 43和53)是17个氨基酸长而CDR 3 (SEQ ID No 44和 54)是10个氨基酸长(分别示于图恥和5(1)。K1-70LC基因在FWRl中有1个沉默突变，在 FWR2中有1个沉默突变和1个替换突变而在FWR3中有1个替换突变。在所述CDRl中有1 个沉默突变和2个替换突变而在所述CDR3中有2个替换突变。总(FWR和CDR) R/S突变率为2.0。此外，在所述LC V和J基因之间有2个碱基对的插入。所述LC⑶Rl (SEQ ID No 70)由13个氨基酸组成，CDR2 (SEQ ID No 71)由7个氨基酸组成而CDR 3 (SEQ ID No 72) 由11个氨基酸组成(图6d)。Kl_70Fab 结构Fab K1-70的结构已在2.22人分辨率下确定(图8)。Ramachandran作图参数和精修统计数据在正确结构精修的可接受范围内。不对称的单元包含两个完整Fab K1-70分子，Fab A和Fab B。Fab A包含重链A和轻链B，而Fab B包含重链C和轻链D。所述两个 Fab 分子由于弯角(elbow angle)的不同(Fab A = 145. 5°，!^ab B = 163. 1° )而未通过非晶体学对称性关联起来。在所述结构中在主链电子密度没有断裂，但是在末端有一些残基失去。在Fab A中重链A和轻链B分别由1至227残基和4至211残基组成，而在Fab B 中重链C和轻链D分别由残基1至227和2至212组成。根据Kabat系统(Kabat E et al 1991文献见上文)对Fab A和Fab B中的残基编号。细节参见图8和9a。对于重链A的残基1、58、129和213的侧链，轻链B的残基18、94、110、126、156、163和166的侧链，重链C 的残基1、58和218的侧链以及轻链D的残基17、18、94、108、156、172、184、187和190的侧链观察不到电子密度。这些侧链在电子密度图中不存在表明它们是高度可移动的，主要是因为它们位于所述晶体结构的溶剂可达区域。使用LSQKAB (CCP4)计算所述两个Fab分子的均方根偏差(r.m. s. d)，对于VH区(117个Ca原子)是0.20人、对于VL区(106个Ca 原子)是0.23 A、对于CH区(％个C α原子)是0.22人而对于CL区(97个C α原子) 是0.29人。这证明即使所述两个Fab分子之间的弯角不同，但是该结构域本身却显示出最少的差异。Kl-70Fab的结构是标准的(图9a)所述6个⑶R采用的正则结构(canonical structure)对于LC CDRULC CDR2和 LC CDR3 分别是 1、1 和 2，而对于HC CDRl 禾PHC CDR21 分别为1和2A。所述HC CDR3由于在序列和构象方面更大的差异而未被分派为任何正则类。 二硫键出现在半胱氨酸残基LC23-LC88、LCi;34-LC194、HC22-HC92和HC142-HC208之间。在 Kl-70Fab的晶体结构中，LC CDRl是13个残基长，LC CDR2是7个残基长而LC CDR3是11 个残基长。HC⑶Rl由5个残基组成，HC⑶R2由17个残基组成而HC⑶R3由12个残基组成。为了进一步分析所述结构，加入了 LC CDR3Arg94和HC CDR2Arg58的侧链(在所述衍射数据组中没有其电子密度)。在以下对所述结构的描述中，括号中的值是指包括这些侧链得到的值。在所述LC中有158个氢键，在所述HC中有177个氢键。来自所述LC的52 (52)个残基参与与来自所述HC的44 个残基的界面接触。有7个氢键和2个盐桥使所述两条链保持在它们的相对位置上。溶剂可达表面区域(ASA)对于所述LC⑶Ri是525(485)人2, 对于 LC CDR2 是508(508) A2，对于 LC CDR3 是257(442) A2，对于 HC CDRl 是 120ΑΛ 对于 HC CDR2 是759 (842) A 2而对于 HC CDR3 是557(528) Λ2。已经分析了在 Kl-70Fab
的抗原结合位点表面上带电氨基酸的分布并在图9b中示出。结合位点表面的一侧主要是带负电的残基，另一侧主要是带正电的残基。抗原结合表面的酸性小块区域由来自LC的残基 Asp27B (CDRl)、Asp50 (CDR2)、Asp92 (CDR3)和来自 HC 的残基 Asp31 (CDRl)、Asp54 和 Asp56(CDR2)以及Asp96 (CDR3)形成。碱性小块区域由来自LC的残基Lys53和Arg54 (CDRl) 和Arg94(CDR3)与来自所述HC的残基Arg58 (CDR2)和ArglOl (CDR3)形成。此外，所述CDR 区域外的LC Lys 66还形成所述表面上的碱性小块区域。总的来说，K1-70的抗原结合表面上的带正电的区域主要由LC残基组成，而带负电的区域主要由HC残基组成。K1-70的抗原结合表面还富含芳香族残基，有来自所述HC和LC CDR的5个酪氨酸、1个苯丙氨酸和 3个色氨酸(图9c)。此外，来自所述FRW区域的4个酪氨酸和1个苯丙氨酸形成了所述表面区域。K1-70抗原结合区域的整个表面是高度不规则的，在靠近中央处有空腔。所述空腔主要被芳香族残基和LC Asp50围绕(图9b和9c)。此外，所述空腔的内部也主要为芳香族残基。这表明芳香族接触对于K1-70和所述TSHR之间的相互作用是重要的，所述TSHR表面上的凸出的芳香族残基“契合”进入所述K1-70表面的空腔中。重组Kl_70Fab表17a显示大肠杆菌培养物上清液中的重组Kl_70Fab有抑制125I-TSH与所述 TSHR结合的能力。所述抑制效应在所述培养物上清液的较低程度的稀释下是完全的(在 1 2稀释度下为91.9%)，而渐增的所述上清液稀释度导致剂量依赖的抑制效应(在 1 256稀释度下为27. 9%抑制)(表17a)。重组Kl_70Fab对在表达所述TSHR的CHO细胞中TSH介导的对环AMP产生的刺激的效应在表17b中显示。培养物上清液的不同稀释度显示出对环AMP刺激的剂量依赖抑制从1 5稀释度下的89. 3%抑制至1 40稀释度下的39. 7%抑制(表17b)。来自未诱导大肠杆菌培养物的对照培养物上清液没有产生可检测的对TSH结合的抑制或对TSH介导的环AMP刺激的抑制(表17a和b)。总结和结论上文描述的实验显示两种具有非常不同的生物活性的所述TSHR的单克隆自身抗体(K1-18刺激而K1-70阻断)可从一位患者的淋巴细胞的单一制品中分离出来。因此，所述患者的免疫系统在同时产生两种类型的TSHR自身抗体，即刺激型和阻断型。一旦以单克隆自身抗体的形式被分离(如上文所述)，所述两种类型的TSHR自身抗体的特性可以相互不受干扰地被研究。所述具有TSHR刺激活性的新的人MAb(Kl-IS)已经被描述并且与一些其他已知的TSHR MAb进行了比较。具体为刺激人MAb (M22)、阻断人MAb (5C9)、阻断人 MAb (K1-70)、阻断小鼠MAb (9D33)和小鼠刺激MAb (TSMAb 1-7)。还描述了具有TSH拮抗活性的新的人MAb(Kl-70)的特征并与已知MAb的特性进行了比较。特别是阻断人MAb (5C9)、 阻断小鼠MAb (9D33)、刺激人MAb (M22)、刺激人MAb (K1-18)和小鼠刺激MAb (TSMAb 1-7)。已经证明新的人刺激TSHR MAb K1-18在以下方面具有与M22相似的特性对标志的TSH与所述TSHR结合的抑制、对相互与所述TSHR结合的抑制、对阻断人MAb (5C9和K1-70)与所述 TSHR结合的抑制以及对小鼠阻断和刺激MAb (9D33和TSMAb 1-7)结合的抑制。所述患者血清TARb还抑制K1-18与所述TSHR的结合。此外，M22和K1-18都与所述TSHR以高亲和力结合并且都能够与同碱性磷酸酶连接的由氨基酸22-260组成的TSHR片段结合。如M22和 K1-18的抗体具有刺激TSHR环AMP活性的能力，但是所述两种抗体的效能有约1. 5倍的差异。所述研究显示TSHR刺激自身抗体的特性在不同的患者中是相似的并且到目前为止它们是所有格雷夫斯病患者中TSHR刺激自身抗体的代表性特性。K1-18性质的总结在表13a 中显示。发明人的实验还显示所述新的阻断型人Mab Kl-70(与刺激MAb Κ1-18从相同的淋巴细胞样本中得到)具有以下能力抑制标志的TSH与所述TSHR的结合、抑制人MAb (Μ22、 Κ1-18和5C9)与所述TSHR的结合以及抑制小鼠阻断和刺激MAb (9D33和TSMAb 1-7)与所述TSHR的结合。此外，Κ1-70与所述TSHR的结合被患者血清TRAb抑制。Κ1-70显示出很强的TSH拮抗活性和阻断被测试的全部患者血清TRAb刺激所述TSHR的能力。Κ1-70被证明是比5C9更有效的TSH与所述TSHR结合的抑制剂。Κ1-70与所述TSHR以高亲和力结合并且能够与同碱性磷酸酶连接的由氨基酸22-260组成的TSHR片段结合。因此，Κ1-70具有含有阻断TRAb的患者血清的性质，包括对所述TSHR的高结合亲和力、抑制TSH和Μ22与所述TSHR结合的能力和在低浓度的抗体下阻断配体诱导的TSHR刺激的能力。但是，Κ1-70对 TSHR组成性活性没有影响而5C9有影响。Κ1-70性质的总结在表13b中显示。当TSHR发生 Glul57Ala、Lysl83Ala、TyM85Ala、Asp232Ala 或 Arg255Asp 突变时 K1-18 刺激表达 TSHR 的CHO细胞中的环AMP活性的能力丧失。K1-70阻断表达TSHR的CHO细胞中TSH介导的环 AMP 活性的能力对于 TSHR 突变 Lys58Ala, Ile60Ala, Argl09Ala, Lysl83Ala, Lys250Ala 降低，对于TSHR突变Tyr82Ala略微降低。在基于TSHR260-AP的ELISA中，K1-18和K1-70 以及M22与22-260的TSHR片段反应良好。此外，在相同测定中，集合的患者血清TSHR自身抗体与TSHR氨基酸22-260反应良好。在所述ELISA中，含有任一类型TRAb活性(刺激和阻断)的患者血清均与所述TSHR260结合。此外，被氨基酸22-260的TSHR片段包被的 ELISA板孔与M22-过氧化物酶(RSR Ltd)结合良好并且该M22-过氧化物酶结合被集合的患者血清TSHR自身抗体抑制。这种所述患者血清TSHR自身抗体对M22-过氧化物酶结合的抑制与对M22-过氧化物酶与全长TSHR结合的抑制相似。因此，令人意外的是，氨基酸 22-260的TSHR片段(或者更小的片段)对于TSHR自身抗体常规测定来说似乎足矣。此外，M22还与所述TSHR的更长片段(TSHR LRD C-CAP)结合良好。在稳定性研究中，M22与在室温下预孵育后的TSHR260、TSHR260-AP和TSHR LRD C-CAP结合的能力比与在同样条件下预孵育后的全长TSHR制品结合的能力更强。这表明TSHR260、TSHR260-AP和TSHR LRD C-CAP与全长TSHR相比在室温下更稳定。所述TSHR突变Arg255Asp对Kl_70IgG的结合没有影响而Kl-ISIgG (在较低浓度下，即0. 1 μ g/mL及以下)与所述突变受体的结合有效性降低。所述使用不同患者血清TRAb的实验表明，基于与含有R255D突变的TSHR结合的差异，具有TSHR刺激活性的血清可与具有TSHR阻断活性的血清区分开。具有刺激活性的患者血清的结合受所述突变的影响，而具有阻断活性的患者血清的结合受影响的程度较低或者根本不受影响。所述实验提供K1-18和K1-70的核苷酸和氨基酸序列。尽管K1-18、 K1-70的重链V基因来自于与其他刺激人MAb M22重链V基因属于同一家族的同一种系，然而它们都与来自不同家族的D和J基因结合；此外K1-18使用κ链，而M22和K1-70使用λ轻链。5C9(另一种阻断型人MAb)种系基因与Μ22、Κ1-18和Κ1-70不同，但是5C9和 Κ1-70均使用J4重链基因。刺激MAb (Μ22和Κ1-18)和阻断MAb (5C9和Κ1-70)的CDR的氨基酸序列有很大不同，特别是在重链和轻链CDR3内。这些观察结果表明所述4种人自身抗体的每一种都来自不同的种系。不同的CDR序列也可以显示相似的对所述TSHR的生物学活性。所述X-射线衍射数据提供Kl-70Fab结构的分子详情，包括抗原结合位点的拓扑结构。通过在大肠杆菌中克隆和表达所述K1-70HC(SEQ ID No 46)和K1-70LC (SEQ ID No 63与SEQ ID No 64)产生的重组Kl_70Fab显示出抑制125I标志的TSH与所述TSHR结合的能力和抑制TSH介导的对TSHR环AMP活性刺激的能力。总之，所述结果表明本发明的抗体如K1-18和K1-70显示出与之前描述的TSHR MAb (M22和5C9)和在自身免疫甲状腺疾病患者的不同血清中发现的TSHR自身抗体相似的TSHR结合活性和相似的对TSHR功能的生物效应。表la Kl-18IgG和不同的TSHR单克隆抗体对125I-TSH与TSHR包被管的结合的
抑制测试样本测定缓冲液中的稀释物结合抑制<%) (乎均值± SD)HBD中的稀释物结合抑制 (平均值± SD)K1-18 IgG100 Mg/mL91.4 ±0.795.9 ± 0.230 gg/mL89.5 ± 1.096.0 ±0.310 pg/mL91.1 ± 1.196.0 ± 0.53 pg/mL89.1 ± 0.495.3 ± 0.51 pg/mL89.3 ±1.394.0 ± 0.70.3 μ /πτι 89.7 ± 0.782.6 ±1.00.1 pg/mL78.5 ± 0.662.0 ±1.60.03 pg/mL45.2 ± 2.326.6 ±1.20.01 pg/mL21.1 ±2.39.3 ± 2.10.003 pg/mL0.5*11.4 ±3.00.001 μοι/mL-4.6*1.6 ±3.2M22 IgG100 pg/mL91.4 ± 1.896.5 ± 0.130 pg/mL89.2 ± 0.596.1 ± 0.510 gg/mL89.3 ± 0.696.1 ± 0.53 pg/mL89.6 士 0.496.0 ± 0.61 pg/mL89.9 ±1.795.5 ± 0.30.3 pg/mL88.6 ±1.289.9 ±0.20.1 pg/mL·87.2 ±1.276.1 ± 2.20.03 μQlmL·58.3 ±1.541.6 ±3.50.01 pg/mL23.4 ± 3.418.0 ± 0.80.003 ng/mL7.1*11.1 ±2.90.001 pg/mL1.5*10.6 ± 8.75C9lgG100 pg/mL82.9 ± 1.035.3 ± 2.810 “g/mL40.5 ±0.340.9 ±1.11 pg/mL23.5 ±2.919.7 ±1.20.1 pg/mL21.3*16.2 ± 4.30.01 pg/mL15.9*4.1 ± 2.2TSMAb 11gG100 pg/mL61.1 ±4.154.1 ±4.110pg/mL48.1 ±1.743.4 ± 1.11 pg/mL29.3 ±1.526.5 ± 0.50.1 pg/mL11.0±1.76.8 ±1.70.01 pg/mL2.6 土 2.12.4*TSMAb 2 IgG100 μ^πΑ.77.6 ±7.748.0 ± 4.410 μρ/π 37.7 ± 2.639.0 ± 0.51 pg/mL29.1 ±2.533.6*0.1 pg/mL23.4 ±2.715.9 ± 0.80.01 pg/mL1.6 ±1.50.7 ±1.7TSMAb 3 IgG100 pg/mL81.1 ±2.954.3 ± 3.310 pg/mL58.1 ±1.144.7 ± 2.8
权利要求
1.分离的人抗体分子，所述分离的人抗体分子会与TSHR结合并且会减少配体诱导的对所述TSHR的刺激，但对TSHR组成性活性没有作用，其中所述分离的人抗体分子具有患者血清TSHR自身抗体抑制TSH和M22与所述TSHR结合的特性。
2.权利要求1的分离的人抗体分子，所述分离的人抗体分子具有选自以下的至少一个另外的患者血清TSHR自身抗体的特性对所述TSHR具有至少l(fL/mol、优选至少109L/mol 的结合亲和力；和具有以少于1 μ g/mL、优选少于0. 1 μ g/mL的抗体浓度阻断配体诱导的 TSHR刺激的能力。
3.权利要求1或2的分离的人抗体分子，所述分离的人抗体分子是TSH、甲状腺刺激自身抗体或人绒毛膜促性腺激素的拮抗剂。
4.前述权利要求任一项的分离的人抗体分子，所述分离的人抗体分子是会与TSH、M22 或K1-18中的至少一种结合的TSH受体的抑制剂。
5.前述权利要求任一项的分离的人抗体分子，所述分离的人抗体分子是单克隆抗体、 重组抗体或合成抗体，或者它们的片段。
6.前述权利要求任一项的分离的抗体分子，所述分离的抗体分子包含抗体VH区，所述抗体VH区选自图恥和5(1的氨基酸序列(分别是SEQ ID No 41和51)，优选地所述分离的抗体分子包含由图恥和5d的氨基酸序列(分别是SEQ ID No 41和51)组成的抗体VH 区。
7.前述权利要求任一项的分离的抗体分子，所述分离的抗体分子包含选自图恥和5d 的CDR I、II和III (分别为SEQ ID No 42-44和52-54)的CDR，优选地所述分离的抗体分子包含图 5b 禾口 5d 的 CDR I、II 和 III (分别为 SEQ ID No 42-44 和 52-54)。
8.前述权利要求任一项的分离的抗体分子，所述分离的抗体分子包含抗体VL区，所述抗体VL区选自图6d的氨基酸序列(SEQ ID No 69)，优选地所述分离的抗体分子包含由图 6d的氨基酸序列(SEQ ID No 69)组成的抗体VL区。
9.前述权利要求任一项的分离的抗体分子，所述分离的抗体分子包含选自图6d的CDR I、II和III (SEQ ID No 70-72)的CDR，优选地所述分离的抗体分子包含图6d的CDR I、II 和 III(SEQ ID No 70-72)。
10.权利要求1-9任一项的分离的抗体分子或其片段，所述分离的抗体分子或其片段具有人或非人的构架。
11.会与TSHR结合以刺激所述TSHR的分离的抗体分子，所述抗体分子包含选自图4b 和4d的氨基酸序列(分别为SEQ ID No 23和33)的抗体VL区，和/或包含选自图4b (SEQ ID No 24-26)和 4d(SEQ ID No 34-36)的 CDR I、II 和 III 的一个或多个 CDR，和 / 或选自图!3b(SEQ ID No 5)和3d(SEQ ID No 15)的氨基酸序列的抗体VH区，和/或包含选自图 3b (SEQ ID No 6-8)和 3d(SEQ ID No 16-18)的 CDR I、II 和 III 的一个或者多个 CDR。
12.权利要求11的分离的抗体分子，其中所述分离的抗体分子与所述TSHR的结合被具有甲状腺刺激或阻断活性的患者血清TSHR抗体抑制。
13.权利要求11或12的分离的抗体分子，其中所述分离的抗体分子与所述TSHR的结合被M22、K1-70、5C9、9D33和甲状腺刺激小鼠单克隆抗体中的至少一种抑制。
14.权利要求11至13任一项的分离的抗体分子，所述分离的抗体分子包含抗体VL区和抗体VH区，所述抗体VL区选自图4b (SEQ ID No 23)和4d(SEQ ID No 33)的氨基酸序列，所述抗体VH区选自图3b (SEQ ID No 5)和3d (SEQ ID No 15)的氨基酸序列。
15.权利要求11至14任一项的分离的抗体分子，所述分离的抗体分子包含图!3b(SEQ ID No 6-8)或 3d(SEQ ID No 16-18)的 CDR I、II 和 III。
16.权利要求14或15的分离的抗体分子，所述分离的抗体分子包含由图4b(SEQID No 23)或4d(SEQ ID No 33)的氨基酸序列组成的抗体VL区。
17.权利要求14、15或16的分离的抗体分子，所述分离的抗体分子包含由图!3b(SEQID No 5)或3d (SEQ ID No 15)的氨基酸序列组成的抗体VH区。
18.权利要求16或17任一项的分离的抗体分子，所述分离的抗体分子包含图4b(SEQ ID No 24-26)或 4d(SEQ ID No 34-36)的 CDR I、II 和 III。
19.权利要求11至18任一项的分离的抗体分子，所述分离的抗体分子是单克隆抗体、 重组抗体或合成抗体。
20.权利要求11至19任一项的分离的抗体分子，所述分离的抗体分子具有人或非人的构架。
21.分离的核苷酸，所述分离的核苷酸编码a.权利要求1至20任一项的分离的抗体分子；或b.包含图4b (SEQ ID No 23)、4d(SEQ ID No 33)或 6d(SEQ ID No 69)的氨基酸序列的抗体VL区；或c.包含图3b(SEQ ID No 5) ,3d (SEQ ID No 15) ,5b (SEQ ID No 41)或 5d(SEQ ID No 51)的氨基酸序列的抗体VH区；或d.图3b(SEQID No 6-8)、3d(SEQ ID No 16-18)、4b(SEQ ID No 24-26)、4d(SEQ ID No 34-36)、5b(SEQ ID No 42-44)、5d(SEQ ID No 52-54)或6d(SEQ ID No 70-72)的 CDR I、 II或ΠΙ ；或e.它们的组合。
22.权利要求21的分离的核苷酸，所述分离的核苷酸包含图3a(SEQID No 1), 3c (SEQ ID No 10),4a(SEQ ID No 19),4c (SEQ ID No 28),5a(SEQ ID No 37),5c (SEQ ID No 46) 或6c (SEQ ID No 64)的核苷酸序列。
23.包含权利要求21或22的分离的核苷酸的载体。
24.包含权利要求21或22的分离的核苷酸或权利要求23的载体的宿主细胞。
25.包含权利要求1-20任一项的分离的抗体分子的药物组合物。
26.权利要求1-20任一项的分离的抗体分子或权利要求25的药物组合物用于治疗的用途。
27.用于治疗的权利要求1-20任一项的分离的抗体分子或权利要求25的药物组合物。
28.表征TSHR抗体、TSH或人绒毛膜促性腺激素活性的方法，所述方法包括一个步骤， 所述步骤包括权利要求1-20任一项的分离的抗体分子的使用。
29.刺激哺乳动物细胞中的TSHR的体外方法，所述方法包括使所述细胞接触权利要求 11-20任一项的分离的抗体分子或权利要求25的药物组合物。
30.刺激哺乳动物细胞中的TSHR的体内方法，所述方法包括使所述细胞接触权利要求 11-20任一项的分离的抗体分子或权利要求25的药物组合物。
31.权利要求30的方法，其中使患有甲状腺癌和其转移灶、多结节性甲状腺肿和/或先天性甲状腺功能低下的受试者的细胞与权利要求1-10任一项的分离的抗体或权利要求25 的药物组合物接触。
32.防止哺乳动物细胞中配体诱导的对TSHR的刺激的体内方法，所述方法包括使所述 TSHR与权利要求1-20任一项的分离的抗体分子或权利要求25的药物组合物接触。
33.权利要求32的方法，其中所述配体是甲状腺刺激自身抗体、TSH或人绒毛膜促性腺激素。
34.权利要求32或33的方法，其中所述哺乳动物细胞是甲状腺细胞或甲状腺外细胞。
35.权利要求34的方法，其中所述哺乳动物甲状腺外细胞在眶后组织或胫骨前组织中。
36.权利要求32-35的方法，其中所述分离的抗体分子与另外的TSHR结合抗体结合使用。
37.权利要求36的方法，其中所述另外的TSHR结合抗体是5C9和/或9D33。
38.检测分析物TSHR的自身抗体的诊断方法，所述方法包括使样本和权利要求1-20任一项的抗体分子与TSHR或其片段接触，所述样本从被认为含有所述分析物自身抗体的受试者中分离。
39.检测分析物TSHR的抗体的诊断方法，所述方法包括使包含所述分析物抗体的样本与包含所述TSHR (SEQ ID No 75)的氨基酸22-260的TSHR片段接触。
40.权利要求38或39的检测分析物TSHR的抗体的诊断方法，其中所述TSHR或其片段在精氨酸255处突变，从而在所述诊断方法中，与分析物刺激型TSHR抗体相比，所述突变的 TSHR或其片段优先与分析物阻断型TSHR抗体相互作用。
41.权利要求39或40的诊断方法，包括a.提供来自动物受试者的体液样本；b.提供一种或多种第一来源的TSHR；c.提供一种或多种第二来源的TSHR，其中所述第二来源的TSHR是TSHR260或在精氨酸255处突变的TSHI^60 ；d.使所述第一和第二来源的TSHR同时或相继与所述体液样本接触，由此所述TSHR的抗体形成包含[第一来源的TSHR]-[TSHR抗体]-[第二来源的TSHR]的一种或多种复合物；e.在步骤(d)之前、同时或之后，提供固定化方式，由此在步骤(d)中形成的复合物中存在的所述第一来源的TSHR在步骤(d)之前、同时或之后被固定至固体支持物上；f.在步骤(d)之前、同时或之后，提供直接或间接的可检测标志手段，由此使得在步骤 (d)中形成的复合物中存在的所述第二来源的TSHR在步骤(d)之前、同时或之后被提供以所述直接或间接的标志手段；和g.根据(e)检测在(d)中形成的复合物的存在以提供TSHR抗体在所述体液样本中存在的指示。
42.权利要求41的诊断方法，其中在(b)中提供的所述第一来源的TSHR是全长TSHR， 包括TSH受体的一个或多个表位或包含TSH受体的一个或多个表位的多肽。
43.权利要求41或42的诊断方法，其中在(b)中提供的所述第一来源的TSHR是全长 TSHR，包括TSH受体的一个或多个表位或包含TSH受体的一个或多个表位的多肽，其中所述第一来源的TSHR在精氨酸255处突变。
44.权利要求39或40的诊断方法，其中通过对直接或间接标志的TSHR抗体或其片段与TSHR260或在精氨酸255处突变的TSHR260结合的抑制来检测与所述TSHR260或在精氨酸255处突变的TSHR260结合的分析物TSHR抗体。
45.权利要求44的诊断方法，其中所述标志的TSHR抗体是单克隆抗体、重组抗体或合成抗体，或它们的片段。
46.鉴定防止TSHR自身抗体与TSHR260结合的小分子的方法，所述方法包含在包含至少一种候选小分子的样本存在下确定对TSHR自身抗体与TSHR260结合的抑制，并且从所述样本中选出那些抑制TSHR自身抗体结合的候选小分子。
47.权利要求46的方法，其中所述TSHR自身抗体是单克隆抗体、重组抗体、合成抗体， 或它们的片段。
48.权利要求46的方法，其中所述TSHR自身抗体与所述TSHR的结合是通过权利要求 41,42或43任一项的方法检测的。
全文摘要
本文一方面提供了会与TSHR结合并且会减少配体诱导的对所述TSHR的刺激、但对TSHR组成性活性没有作用的分离的人抗体分子，其中所述分离的人抗体分子具有抑制TSH和M22与所述TSHR结合的患者血清TSHR自身抗体的特性。
文档编号C07K16/28GK102264764SQ200980152452
公开日2011年11月30日 申请日期2009年12月23日 优先权日2008年12月24日
发明者B·瑞斯史密斯, J·桑德斯, J·福尔曼克 申请人:Rsr有限公司