专利名称：一种从发酵液中提纯雷帕霉素的方法
技术领域：
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种从发酵液中提纯雷帕霉素的方法。
背景技术：
雷帕霉素(Rapamycin, RPM, RAPA)，又名西罗莫司(Sirolimus)，是31元环组成的三烯大环内酯化合物，含有特殊的α、二酮乙哌啶酸胺分子掩盖的半羧酮，其分子式为C51H79O13，分子量为991KD。它是在1975年由加拿大Ayerst研究所从吸水链霉菌 Strepomyces hygroscopicus 中分离出来的。Vezinia等于1975年发现它具有抗真菌作用，以后Tanaka等又发现它是一种极有前途的免疫抑制剂并具有抗肿瘤作用。Tanaka等研究表明，雷帕霉素具有很强的抗移植排斥反应，可与环孢素协同延长移植物存活时间，能逆转正在进行的移植排斥反应，还有预防和治疗实验性自身溶血性贫血的作用。因此雷帕霉素的市场前景非常广阔。然而如中国发明专利申请公布说明书CNlO 1486976A所述的西罗莫司为胞内产物，一般西罗莫司产生菌效价只有200 μ g/ml左右，发酵副产物较多，导致后序提取时的层析分离比较困难，工作较为复杂，发酵培养的发酵液经过滤得菌体后经甲醇萃取浓缩后，再通过一系列纯化工艺如色谱层析、萃取、结晶等获得西罗莫司纯品，产品收率低于20%。所以该公布说明书公开了一种吸水链霉菌及其应用的技术方案，提供了一种高单位的西罗莫司产生菌，效价为600 μ g/ml以上，但是产品收率只达到了 30 35%。杨国新等在《海峡药学》(2007年，第19卷第17期，2546页)一文公开了高纯度西罗莫司的制备的技术方案，该方法为a)发酵液经离心后得到菌丝体，菌丝体用两倍量体积的95%酒精分别浸泡两次，离心弃菌丝渣，合并酒精浸泡液，减压浓缩去除酒精，残留液用等体积的乙酸乙酯分别萃取两次，合并乙酯层并用饱和氯化钠溶液洗涤1次，经无水硫酸钠干燥Ih后，过滤，减压浓缩除去乙酯得上柱物，上柱物溶于适当体积的洗脱剂(乙酯-石油醚洗脱系统)，200 300目硅胶柱层析，分段收集，HPLC检测，合并含西罗莫司的洗脱液，减压浓缩，浓缩液经乙醚结晶，洗晶，干燥得西罗莫司结晶；b)经上述制备的西罗莫司结晶溶于少量的洗脱剂，硅胶O00 300目)柱层析分离，分部收集，分离过程用高效液相跟踪检测，合并含西罗莫司的洗脱液，减压浓缩，浓缩液经乙醚结晶，洗晶，重结晶得高纯度西罗莫司样品，纯度达到99. 8%以上，单杂小于0.05%。然而该方法的技术方案主要是针对发酵-16L的小试工艺，经过两步硅胶柱层析之后得到的雷帕霉素结晶品纯度达到质量标准，但是单个杂质含量没有达到特殊用途的质量要求，所以文献中提到经过两步硅胶柱层析之后需要进行两个平行试验，且在硅胶层析中采用特定的含5%水的丙酮-石油醚混合溶剂系统进行硅胶柱层析时，得到的高纯度西罗莫司样品中RRT = 1. 19杂质的含量稳定在0.05%以下(HPLC)，样品纯度可提高0.2%，高达99.8%，文献资料中RRT = 0. 79 杂质的含量虽然有所下降，但是该杂质仍然高于0.1%。美国专利公布说明书US20100029933A1 公开了 Pure form of rapamyc in and a process for recovery and purification thereof的技术方案，该方法使从发酵液中纯化得到的雷帕霉素纯品纯度达到98.8%，总的杂质含量小于1.2%，单杂低于0. 15%。提纯方案包括a)用疏水性溶剂萃取发酵液中的雷帕霉素并浓缩；b)加入亲水性的溶剂分离杂质； c)将步骤b得到的产物中吸附到惰性载体上，用碱和酸连续洗涤，然后洗脱；d)收集步骤c 得到的洗脱液或直接用步骤b中含有雷帕霉素的溶液，上样硅胶柱，收集洗脱液；e)将步骤 d得到的产物结晶；f)溶解步骤e的结晶品，进行疏水作用或反相色谱；并g)重结晶得到高纯度的雷帕霉素。但是利用该方法纯化雷帕霉素的产率不高，在一个具体的实施例中可以得知Ilkg的雷帕霉素发酵液最后的纯品只有6g，称取3g纯品进一步纯化结晶得到2. 5g。从以上几个专利文献资料的提取纯化工艺中，我们可以得知雷帕霉素的纯度提高到了 99. 8%以上，或者是单杂以及总杂的含量也降低到了 0. 15%和1. 2%以下，但是其提取纯化过程冗长繁杂，收率很低。
发明内容
为了提高雷帕霉素纯度，降低雷帕霉素中的杂质含量，同时提高雷帕霉素的收率，本发明提供了一种从发酵液中提纯雷帕霉素的方法。本发明中所用的含有雷帕霉素的发酵液，是通过发酵培养微生物菌株吸水链霉菌(Mr印omyces hygroscopicus ACCC No. 40417)得到的。本发明的技术方案包含以下步骤a.用丙酮或乙醇抽提发酵液过滤后得到的菌丝体，得到抽提液后，真空浓缩得浓缩抽提液；b.用乙酸乙酯萃取发酵液过滤后得到的上清液，控制发酵上清液的温度为 15°C 35°C和pH为5. 0 7. 0，分离乙酸乙酯相得萃取液，真空浓缩得浓缩萃取液；c.将a中的浓缩抽提液和b中的浓缩萃取液合并得浓缩液，并加入到装有大孔树脂的床层进行吸附，用丙酮和水的混合溶液作为洗涤剂洗涤大孔树脂，控制洗涤剂的温度为15 35°C和pH为5. 0 8. 0，用丙酮和水的混合溶液作为洗脱剂洗脱大孔树脂，控制洗脱剂的温度为15 35°C和pH为5. 0 8. 0，收集洗脱液并真空浓缩，得浓缩洗脱液；d.用乙酸乙酯萃取c得到的浓缩洗脱液，经无水硫酸钠或无水硫酸镁脱水后真空浓缩得浓缩液，上样硅胶柱进行层析分离，正庚烷和丙酮混合溶液作为洗涤剂洗涤硅胶柱， 正庚烷和丙酮混合溶液作为洗脱剂洗脱硅胶柱，收集洗脱液并真空浓缩得浓缩液；e.将步骤d得到的浓缩液溶于石油醚或乙醚中结晶，结晶过程控制温度为5 25°C、时间为1 M小时，干燥得到雷帕霉素粗品。f.丙酮溶解雷帕霉素粗品，真空浓缩后用乙醚重结晶，结晶过程控制温度为5 10°c、时间为10 20小时，干燥得到雷帕霉素纯品。本发明对步骤a中丙酮或乙醇的体积用量进行了优选，优选地，上述丙酮或乙醇的体积用量为菌丝体体积的5 10倍。本发明对步骤a中抽提的次数进行了优选，优选地，上述抽提次数为2 4次。本发明对步骤b中乙酸乙酯的体积用量进行了优选，优选地，上述乙酸乙酯的体积用量为上清液体积的0. 2 1倍。本发明对步骤b发酵上清液的温度进行了优选，优选地，上述发酵上清液的温度为22 28V。
本发明对步骤b发酵上清液的pH进行了优选，优选地，上述发酵上清液的pH为 5. 5 6. 5o本发明对步骤c中大孔树脂进行了优选，优选地，上述所用的大孔树脂为X-5、 DiaionHP20 或 SP825。本发明对步骤c大孔树脂的体积进行了优选，优选地，上述大孔树脂与浓缩液的体积比为1 5 1 20，更优选地，大孔树脂与浓缩液的体积比为为1 8 1 15。本发明对步骤c中洗涤剂进行了优选，优选地，上述洗涤剂中丙酮占混合溶液体积的30% 55%，更优选地，丙酮占混合溶液体积的40% 50%。本发明对步骤c中洗涤剂的温度进行了优选，优选地，上述洗涤剂的温度为22 28°C。本发明对步骤c中洗涤剂的pH进行了优选，优选地，上述洗涤剂的pH为6. 5 7. 5。本发明对步骤c洗涤剂的体积用量进行了优选，优选地，上述洗涤剂的体积用量为大孔树脂体积的1 4倍。本发明对步骤c中洗脱剂进行了优选，优选地，上述洗脱剂中丙酮占混合溶液体积的70% 85%，更优选地，丙酮占混合溶液体积的75% 80%。本发明对步骤c中洗脱剂的温度进行了优选，优选地，上述洗脱剂的温度为22 28°C。本发明对步骤c中洗脱剂的pH进行了优选，优选地，上述洗脱剂的pH为6. 5 7. 5。本发明对步骤c中洗脱剂的体积用量进行了优选，优选地，上述洗脱剂的体积用量为大孔树脂体积的1. 2 1. 8倍。本发明对步骤d中乙酸乙酯的体积用量进行了优选，优选地，上述乙酸乙酯的体积用量为浓缩洗脱液体积的1 4倍。本发明对步骤d中萃取浓缩洗脱液的次数进行了优选，优选地，上述乙酸乙酯萃取浓缩洗脱液的次数为2 3次。本发明对步骤d中硅胶进行了优选，优选地，上述所用的硅胶粒径为200-300目。本发明对步骤d中硅胶的体积装量进行了优选，优选地，上述硅胶的体积装量为脱水后真空浓缩得到的浓缩液体积的6 10倍。本发明对步骤d中洗涤剂进行了优选，优选地，上述洗涤剂中正庚烷和丙酮的体积比为6 1 4 1。本发明对步骤d中洗涤剂的体积用量进行了优选，优选地，上述洗涤剂的体积用量为硅胶体积的4 6倍。本发明对步骤d中洗脱剂进行了优选，优选地，上述洗脱剂中正庚烷和丙酮的体积比为3 1 1 1。本发明对步骤d中洗脱剂的体积用量进行了优选，优选地，上述洗脱剂的体积用量为硅胶体积的3 5倍。本发明对步骤e中结晶所用石油醚或乙醚的体积用量进行了优选，优选地，上述结晶所用的石油醚或乙醚的体积用量为浓缩液体积的2 5倍。
HPLC检测分析雷帕霉素的方法引入美国专利公布说明书US20100029933A1公开的检测方法，表1为HPLC分析的梯度洗脱方法，HPLC条件如下色谱柱安捷伦ZORBAX Eclipse XDB C8，内径-3. 5 μ m，直径_4· 6mm，长度 _150mm流速1.5ml/min检测波长287nm进样量20μ 1流动相缓冲盐A-乙腈，缓冲盐B_2mM KH2PO4溶液柱温45°C药品溶剂乙腈表IHPLC分析的梯度洗脱方法
权利要求
1.一种从发酵液中提纯雷帕霉素的方法，其特征在于它包含如下步骤a.用丙酮或乙醇抽提发酵液过滤后得到的菌丝体，得到抽提液后，真空浓缩得浓缩抽提液；b.用乙酸乙酯萃取发酵液过滤后得到的上清液，控制发酵上清液的温度为15°C 35°C和pH为5. 0 7. 0，分离乙酸乙酯相得萃取液，真空浓缩得浓缩萃取液；c.将步骤a中的浓缩抽提液和步骤b中的浓缩萃取液合并得浓缩液，并加入到装有大孔树脂的床层进行吸附，用丙酮和水的混合溶液作为洗涤剂洗涤大孔树脂，控制洗涤剂的温度为15 35°C和pH为5. 0 8. 0，用丙酮和水的混合溶液作为洗脱剂洗脱大孔树脂，控制洗脱剂的温度为15 35°C和pH为5. 0 8. 0，收集洗脱液并真空浓缩，得浓缩洗脱液；d.用乙酸乙酯萃取c得到的浓缩洗脱液，经无水硫酸钠或无水硫酸镁脱水后真空浓缩得浓缩液，上样硅胶柱进行层析分离，正庚烷和丙酮混合溶液作为洗涤剂洗涤硅胶柱，正庚烷和丙酮混合溶液作为洗脱剂洗脱硅胶柱，收集洗脱液并真空浓缩得浓缩液；e.将步骤d得到的浓缩液溶于石油醚或乙醚中结晶，结晶过程控制温度为5 25°C、 时间为1 M小时，干燥得到雷帕霉素粗品。f.丙酮溶解雷帕霉素粗品，真空浓缩后用乙醚重结晶，结晶过程控制温度为5 10°C、 时间为10 20小时，干燥得到雷帕霉素纯品。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的大孔树脂为X-5、DiaionHP20或 SP825。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的步骤积的30% 55%。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述的步骤积的40% 50%。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的步骤积的70% 85%。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述的步骤积的75% 80%。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所用的硅胶粒径为200-300目。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的步骤d洗涤剂中正庚烷与丙酮的体积比为6 1 4 1。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的步骤d洗脱剂中正庚烷与丙酮的体积比为3 1 1 1。c洗涤剂中丙酮占混合溶液体 c洗涤剂中丙酮占混合溶液体 C洗脱剂中丙酮占混合溶液体 C洗脱剂中丙酮占混合溶液体
全文摘要
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种从发酵液中提纯雷帕霉素的方法。为了提高雷帕霉素的纯度，降低雷帕霉素中的杂质含量，同时提高雷帕霉素的收率，本发明运用菌丝体抽提、发酵液萃取、大孔树脂吸附、硅胶柱层析及冷却结晶和重结晶技术从发酵液中提取纯化得到雷帕霉素纯品，纯度大于99.3％，单杂小于0.10％，收率提高到53～60％。本发明提高雷帕霉素纯度、降低杂质含量的同时提高了收率，而且操作方便、工艺简单，在工业化大生产中有很高的实用价值。
文档编号C07D498/18GK102443012SQ201010505168
公开日2012年5月9日 申请日期2010年10月13日 优先权日2010年10月13日
发明者赵丽丽, 赵志全 申请人:山东新时代药业有限公司