专利名称：一种兔肝金属硫蛋白的提取方法
技术领域：
本发明涉及金属硫蛋白技术领域，具体涉及一种兔肝金属硫蛋白的提取方法。
背景技术：
金属硫蛋白(metallothionein，简称MT)是一类富含半胱氨酸和金属离子的低分子蛋白质。研究和实验表明MT在人体内具有解除重金属(镉、汞和铝)毒性和抗辐射(包括紫外线)、消除自由基、修复受损组织等功效，其清除羟基自由基(· 0H)的能力比SOD高 10000多倍，清除氧自由基(·0)的能力约是谷胱甘肽(CSH)的25倍，尤其是能为生物体提供多种微量元素(如Zn、Cu、Co等)，参与体内某些微量金属元素(如Zn、Cu、Co等)的储存、 运输和代谢。因而，被广泛用于医药、保健品及化妆品添加剂、基因工程试剂、化学、环保、动物、农业、实验用品等领域中。目前，兔肝金属硫蛋白提取工艺通常采用缓冲液提取、有机溶剂沉淀除杂、热变性除杂、乙醇沉淀MT等工艺(参考专利:92111198. 3,200440013212. χ),在这个工艺过程中，用预冷的缓冲液提取金属硫蛋白，得到的提取液呈浑浊的乳化状，需要加入大量的乙醇和氯仿混合液使溶液澄清，在随后的加热除杂过程时要求温度维持在80°C左右，致使大量的乙醇和氯仿挥发，最后需要在高浓度的乙醇溶液中沉淀金属硫蛋白，可以看出，在整个的提取工艺中，使用了大量的乙醇和有毒气体氯仿，这样不但使成本增高，污染了环境，而且氯仿对人的肝肾等器官有损害。因此，选择简便的提取工艺，降低成本，特别是减少有毒溶剂的使用，是十分有必要的。
发明内容
本发明的目的是要提供一种兔肝金属硫蛋白的提取方法，以克服现有技术存在的乙醇的大量使用，有毒溶剂氯仿的使用以及成本高的问题。本发明的目的是这样实现的，一种兔肝金属硫蛋白的提取方法，依次包括下述步骤
①诱导
采取隔日腹腔注射的方法给成体肉兔注射硫酸锌，注射次数为为7次，注射量范围 10mg/kg-250mg/kg硫酸锌，剂量呈依次递增形式，然后宰杀取肝脏，冰冻保存；
②原料的破碎
新鲜兔肝脏，生理盐水清理血迹后称重，加入2-4倍量冰箱予冷的缓冲液，并在(T4°C 下研磨，要求研磨液呈均勻状；
③热处理
将研磨液迅速加热至78、0°C，保持5-lOmin，然后置冰水浴中快速冷却至(T4°C，冷冻离心分离；
④酸调节PH沉淀杂蛋白
调上清液PH值，使其PH在4 5. 5之间，温度在(Γ4之间，保持30分钟左右，冷冻离心
3分离后，调回PH至6. 5-7. 1之间； ⑤超滤和透析袋浓缩
用0.22//过滤器过滤，除去溶液中大分子蛋白质后，将溶液装入透析袋内，浸泡在蒸馏水中除去溶液的小分子，然后侵入聚乙二醇浓溶液中，浓缩至需要的体积。本发明具有以下优点
1.本技术选用新鲜兔肝研磨后快速加热80°C，维持一定时间后冰水浴冷却至5°C以下，这样可以使肝脏中的酶等活性成分失活，大分子蛋白质及有机质充分沉淀，有利于提取液的分离，这种方法得到的提取液呈清亮的黄色，且不含脂溶性成分。2、酸调节PH沉淀杂蛋白，有利于金属硫蛋白的进一步纯化，且简化了生产工艺。 根据金属硫蛋白等电点(3. 9、. 6)比一般蛋白质等电点(5 7)低，分子量小(600(Γ7000)、 水溶液溶解度大的特点，通过控制PH除杂蛋白质，不但操作简单，而且有利于金属硫蛋白的进一步纯化。3、用水溶液直接提取金属硫蛋白，避免了乙醇、氯仿的使用。众所周知，乙醇、氯仿均属生产危险性级别甲类的易燃易爆溶剂，且氯仿是易挥发有毒溶剂，对中枢神经系统产生抑制作用、对心肌有损害的作用等。
具体实施例方式下面将通过具体实施例对本发明进行详细地说明。实施例1
(1)诱导
取家兔一只，采取隔日腹部皮下注射硫酸锌水溶液，注射次数为7次，分别为10mg/kg、 20mg/kg、50mg/kg、100mg/kg、150mg/kg、200mg/kg、250mg/kg，第七次给药 M 小时后宰杀兔子，取肝脏保存于冰箱，待用；
(2)样品的破碎
新鲜兔肝脏，用生理盐水清理血迹后称重，加入2. 5倍量冰箱预冷的0. 02M Tris-HCl, PH8. 6缓冲液，研磨6分钟；
(3)热处理
将研磨液置于预热至83°C水浴锅中，迅速加热至80°C，保持5分钟后，于冰水浴快速速冷却至0 4°C，静置30min，然后冷冻离心分离，离心条件温度3°C，速度lOOOOrpm，20min ；
(4)酸调节pH进行沉淀
取离心后的黄色上清液，用稀盐酸调PH值，使其pH控制在圹5. 5之间，冰水浴中保持时间30分钟后冷冻离心分离，上清液回调pH至6. 5 ；
(5)超滤、透析袋浓缩、干燥
将上述的离心上清液用0.22//的超滤膜过滤，除去溶液中大分子蛋白质后，将溶液装入已处理过的3500透析袋中，置于预冷的蒸馏水中浸泡，保持溶液温度低于4°C，并不定时的更换蒸馏水，使浸泡液无AgCl沉淀，然后将透析袋埋入聚乙二醇中浓缩至需要体积， 冷冻干燥。实施例2 (1)诱导取家兔一只，采取隔日腹部皮下注射硫酸锌水溶液，注射次数为7次，分别为10mg/kg、 20mg/kg、50mg/kg、100mg/kg、150mg/kg、200mg/kg、250mg/kg，第七次给药 M 小时后宰杀兔子，取肝脏保存于冰箱，待用；
(2)样品的破碎
新鲜兔肝脏，用生理盐水清理血迹后称重，加入3倍量冰箱预冷的0. 02M Tris-HCl, PH8. 6缓冲液，研磨4分钟；
(3)热处理
将研磨液置于预热至80°C水浴锅中，迅速加热至78°C，保持8分钟后，于冰水浴快速速冷却至0 4°C，静置30min，冷冻离心分离，离心条件温度3°C，速度lOOOOrpm，20min ；
(4)酸调节pH进行沉淀
取离心后的黄色上清液，用稀盐酸调PH值，使其pH控制在圹5. 5之间，冰水浴中保持时间30分钟后离心分离，回调pH至6. 8 ；
(5)超滤、透析袋浓缩、干燥
将上述的离心上清液用0.22//的超滤膜过滤，除去溶液中大分子蛋白质后，将溶液装入已处理过的3500透析袋中，置于预冷的蒸馏水中浸泡，保持溶液温度低于4°C，并不定时的更换蒸馏水，使浸泡液无AgCl沉淀，然后将透析袋埋入聚乙二醇中浓缩至需要体积， 冷冻干燥。实施例3
(1)诱导同实施例1;
(2)样品的破碎
新鲜兔用生理盐水清理血迹后，用滤纸吸干水分，准确称重兔肝100g，加入4倍量冰箱预冷的0. 02M Tris-HCl, PH8. 6缓冲液300ml，充分研磨；
(3)热处理
将研磨液置于预热至83°C水浴锅中，迅速加热至80°C，保持5分钟后，于冰水浴快速速冷却至(T4°C，静置20min，然后冷冻离心分离，离心条件同上；
(4)酸调节pH进行沉淀
离心后的上清液，用稀盐酸调pH值，使其pH控制在4. 75，冰水浴中保持时间60分钟， 冷冻离心分离，回调pH7. 0 ；
(5)超滤、透析袋浓缩、干燥同实施例2。
权利要求
1. 一种兔肝金属硫蛋白的提取方法，其特征在于其依次包括下述步骤 ①诱导采取隔日腹腔注射的方法给成体肉兔注射硫酸锌，注射次数为为7次，注射量范围 10mg/kg-250mg/kg硫酸锌，剂量呈依次递增形式，然后宰杀取肝脏，冰冻保存； 原料的破碎新鲜兔肝脏，生理盐水清理血迹后称重，加入2-4倍量冰箱予冷的缓冲液，并在(T4°C 下研磨，要求研磨液呈均勻状；③热处理将研磨液迅速加热至78、0°C，保持5-lOmin，然后置冰水浴中快速冷却至(T4°C，冷冻离心分离④酸调节PH沉淀杂蛋白调上清液PH值，使其PH在4 5. 5之间，温度在(Γ4之间，保持30分钟左右，冷冻离心分离后，调回PH至6. 5-7. 1之间；⑤超滤和透析袋浓缩用0.22//过滤器过滤，除去溶液中大分子蛋白质后，将溶液装入透析袋内，浸泡在蒸馏水中除去溶液的小分子，然后侵入聚乙二醇浓溶液中，浓缩至需要的体积。
全文摘要
本发明涉及一种兔肝金属硫蛋白的提取方法。现有提取工艺中使用大量的乙醇和氯仿，成本高，污染环境，且氯仿对人的肝肾等器官有损害。本发明采用的技术方案依次包括下述步骤①诱导给成体肉兔注射硫酸锌，注射次数为为7次，剂量呈依次递增形式。②原料的破碎。③热处理将研磨液迅速加热至78~80℃，保持5-10min，然后置冰水浴中快速冷却至0~4℃，冷冻离心分离。④酸调节pH沉淀杂蛋白调上清液pH值，使其pH在4~5.5之间，温度在0~4之间，保持30分钟左右，冷冻离心分离后，调回pH至6.5-7.1之间。⑤超滤和透析袋浓缩。本发明提取工艺简单，成本低廉，特别可以减少有毒溶剂的使用。
文档编号C07K14/825GK102174103SQ20111002549
公开日2011年9月7日 申请日期2011年1月24日 优先权日2011年1月24日
发明者党芯叶, 权清转, 蒋志武, 齐凡 申请人:陕西省动物研究所