专利名称：促黄体生成素释放激素衍生物的合成方法
技术领域：
本发明涉及一种促黄体生成素释放激素衍生物的合成方法。
背景技术：
黄体生成素(LH)和卵泡刺激素(FSH)是由垂体前叶释放出来的，受控于下丘脑产生的LH-RH (促黄体生成素释放激素)或称&iRH (促性腺素释放激素)，下文统称为促黄体生成素释放激素。LH-RH及其衍生物具有促进促性腺激素分泌的活性，按序给药LH-RH及其衍生物可抑制性腺功能，因此其可以用作药物以抑制和/或治疗诸如子宫内膜异位、中枢性早熟、不育和前列腺癌等疾病。已用作药物的LH-RH及其衍生物包括戈舍瑞林、布舍瑞林、亮丙瑞林和那法瑞林。其中，戈舍瑞林(Goserelin)和布舍瑞林(Buserelin)结构可表示如下pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser (tBu) -Leu-Arg-Pro-R，当 R=Azgly-NH2 时，该结构式表示戈舍瑞林(Goserelin)，当R=NHEt时，该结构表示布舍瑞林(Buserelin)。因为结构上的极其相似，戈舍瑞林(Goserelin)和布舍瑞林(Buserelin)可以基于相同的合成工艺进行合成，目前戈舍瑞林(Goserelin)和布舍瑞林(Buserelin)的合成方法主要包括固相合成和液相合成两种。液相合成操作繁琐，每合成一步都需要纯化，合成得率很低，不适合超过5个氨基酸以上的多肽合成。液相合成的原材料的价格已大大高于大规模工业化生产的Fmoc/tBu 固相体系的原材料价格，因此，目前液相合成的方法已经被多肽合成工业体系所逐渐淘汰。对于固相合成方法来说，一般采用多肽合成中的SPPS (a Solid Phase Peptide Synthesis)进行整个片段的全合成，如专利EP2119724A1和专利US2010/0311946A1中报道的那样。但是，促黄体生成素释放激素中的戈舍瑞林(Goserelin)和布舍瑞林(Buserelin) 由于侧链D-Ser含有tBu和常规的Fmoc/tBu固相反应体系不兼容，用常规的Fmoc/tBu固相反应体系无法合成，故也有采用淘汰的液相合成或者改进的Fmoc/tBu固相反应体系来生产。例如，美国专利US5602231中报道了一种戈舍瑞林的固相合成方法，采用了侧链不保护的iTrp，Ser, Tyr固相反应体系合成戈舍瑞林，由于侧链不保护的Trp，Ser, Tyr在 Fmoc/tBu固相合成时会造成很多的副反应，导致合成的产物难以纯化，得率下降，而且采用不保护的氨基酸合成多肽对于工业化生产来说是非常难控制各种副反应的发生，故不适合工业化生产；美国专利US2010/0311946A1中报道了采用不常用侧链保护体系的Fmoc固相合成方法，采用了 His (trt)，Ser(trt)，Tyr(2-Cl-trt)等原料合成戈舍瑞林，由于工业生产中很少厂家用到kr(trt)，Tyr(2-Cl-trt)这2个原料，很难找到工业化的供应商，因此不但价格昂贵，生产成本高，给企业大规模生产带来很大的成本压力，而且在最后trt保护基团脱除的时候，很难选择性的脱除trt而不影响D-ser含有的tBu，因此会产生各种不纯物，导致得率下降；专利EP0518656B1中同样采用了侧链不保护的kr和不常用侧链保护的Tyr(BrZ)的方法，是专利US2010/0311946A1和专利US5602231的复合体，同样无法解决不保护侧链引起的副反应和应用和很难找到工业化原料的供应商，原料价格昂贵和生产成本高等问题。
发明内容
为了克服现有技术的缺陷，本发明提出一种促黄体生成素释放激素衍生物的合成方法，其通过将促黄体生成素释放激素分成两个片段分别固相合成，再拼接成整个片段的方法，从而克服了现有技术中的缺陷，使得本发明的合成方法具有适合放大生产、收率高、 纯度好的优点。为解决前述技术问题，本发明采用的技术方案如下
一种促黄体生成素释放激素衍生物的合成方法，所述促黄体生成素释放激素衍生物结构为 pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg-Pro-R，R=Azgly-NH2 或 NHEt，其包括以下步骤
(1)固相合成第一片段pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-OH，其中，His、Ser,Tyr为侧链保护氨
基酸；
(2)固相合成第二片段Dler(tBu)-Leu-Arg-Pro-R-固相支持物，其中Dler (tBu)的氨基端为保护基团Fmoc或Boc ；
(3)连接所述第一片段和第二片段，并经切肽、纯化，得到所述的促黄体生成素释放激素衍生物 pGlu-Hi s-Trp-Ser-Tyr-D-Ser (tBu) -Leu-Arg-Pro-R。本发明的促黄体生成素释放激素衍生物的合成方法，将戈舍瑞林(Goserelin) 和布舍瑞林(Buserelin)分成两个片段分别固相合成，且第一片段不受Dler (tBu)的影响，第二片段最后一步才涉及到D^er (tBu)，因而可以使得整个合成工艺克服了因 D-Ser (tBu)的影响而使得戈舍瑞林(Goserelin)和布舍瑞林(Buserelin)的固相合成与传统的固相合成不能兼容的缺陷，从而使得整体工艺具有成本低、收率高、纯度好的优点。本发明的促黄体生成素释放激素衍生物的合成方法，其中，(1)由以下步骤组成 (al)提供一树脂作为固相支持物；
(bl)用一活化试剂活化氨基端为保护基团Fmoc或Boc的Tyr (tBu)-0H，并将其连接到 (al)所述的固相支持物上，接着用一脱保护试剂脱去保护基团Fmoc或Boc ；
(cl)用一活化试剂活化氨基端为保护基团Fmoc或Boc的kr (tBu) -0H,并将其连接到(bl)的固相支持物上的Tyr(tBu)上，接着用一脱保护试剂脱去保护基团Fmoc或Boc ；
(dl)用一活化试剂活化氨基端为保护基团Fmoc或Boc的Trp-OH，并将其连接到(cl) 的固相支持物上的kr(tBu)上，接着用一脱保护试剂脱去保护基团Fmoc或Boc ；
(el)用一活化试剂活化氨基端为保护基团Fmoc或Boc的His (trt)-0H，并将其连接到 (dl)的固相支持物上的Trp上，接着用一脱保护试剂脱去保护基团Fmoc或Boc ；
(fl)用一活化试剂活化pGlu-OH，并将其连接到(el)的固相支持物上的His(trt)上； (gl)将(fl)的固相支持物加入一切肽试剂中，使得其上的多肽从(al)的固相支持物上脱离，且使得Tyr (tBu)、Ser (tBu), His (trt)上的侧链保护基团被脱去，从而得到所述的第一片段 pGlu-HiS-Trp-Ser-Tyr-OH0本发明的促黄体生成素释放激素衍生物的合成方法，其中，(2)由以下步骤组成 (a2)提供匹配偶联所述末端为R基团的树脂作为固相支持物；
(b2)用一活化试剂活化氨基端为保护基团Fmoc或Boc的ftx)-0H，并将其连接到(a2)所述的固相支持物上，接着用一脱保护试剂脱去保护基团Fmoc或Boc ；
(c2)用一活化试剂活化氨基端为保护基团Fmoc或Boc的Arg -0H,并将其连接到(b2) 的固相支持物上的Pro上，接着用一脱保护试剂脱去保护基团Fmoc或Boc ；
(d2)用一活化试剂活化氨基端为保护基团Fmoc或Boc的Leu-OH，并将其连接到(c2) 的固相支持物上的Arg上，接着用一脱保护试剂脱去保护基团Fmoc或Boc ；
(e2)用一活化试剂活化氨基端为保护基团Fmoc或Boc的Dler (tBu)-0H，并将其连接到(d2)的固相支持物上的Leu上，即得到所述的第二片段D-Ser (tBu) -Leu-Arg-Pro-R-固相支持物。本发明的促黄体生成素释放激素衍生物的合成方法，其中，(3)由以下步骤组成 (a3)用一脱保护试剂脱去保护基团Fmoc或Boc，用一活化试剂活化所述第一片段，并
将其连接到脱去保护基团的第二片段固相支持物上；
(b3)将上述(a3)中的固相支持物加入一切肽试剂中，使得其上的多肽从上述(a3)得到的固相支持物上脱离，从而得到所述的促黄体生成素释放激素衍生物；
(c3)将上述(b3)的得到的促黄体生成素释放激素衍生物利用HPLC进行纯化。本发明的促黄体生成素释放激素衍生物的合成方法，其中，所述固相支持物选自 Fmoc-NH-Rink 树脂、Wang 树脂、NovaSyn TGR 树脂、Rink amide 树脂、Rink amide MBHA 树脂、Rink amide AM 树脂、Rink amide PEGA 树脂、Rink amide NovaGel 树脂、Sieber amide 树脂和 NovaSyn TG Sieber 树脂。本发明的促黄体生成素释放激素衍生物的合成方法，其中，所述树脂选自 Fmoc-NH-Rink 树脂、Wang 树脂、NovaSyn TGR 树脂、Rink amide 树脂、Rink amide MBHA 树脂、Rink amide AM 树脂、Rink amide PEGA 树脂、Rink amide NovaGel 树脂、Sieber amide 树脂和 NovaSyn TG Sieber 树脂。本发明的促黄体生成素释放激素衍生物的合成方法，其中，所述活化试剂选自 HoBt, DIC, DCC 和 DIEA。本发明的促黄体生成素释放激素衍生物的合成方法，其中，所述活化试剂选自 HoBt, DIC, DCC 和 DIEA。本发明的促黄体生成素释放激素衍生物的合成方法，其中，所述的氨基端的保护基团优选为Fmoc，所述的脱保护试剂选自piperidine、DMF、cyclohexylamine、 1, 5-diazabicyclo[5, 4, 0]undec-5-ene > ethano1 amine、pyrrolidine > 1,8-diazabicyclo[5, 4, 0]undec-7-ene> diethylamine 禾口 morpholine 中白勺一禾中或多禾中。本发明具有如下之有益效果
本发明的促黄体生成素释放激素衍生物的合成方法有如下特点简单易行，工艺稳定， 原辅材料来源方便，生产成本低，生产周期短，接肽收率高(每步接肽效率> 99 %)，可规模化生产,切肽收率60% — 65%。纯化收率35% — 45%。总收率20%_30%。
具体实施例方式实施例1 戈舍瑞林的合成 (一)Goserelin第一片段的合成
(1) Fmoc-Tyr (tBu) -wang 树脂的合成
6取wang树脂(0. 8-1. 3mmol/g)用二氯甲烷浸泡，使树脂充分溶胀，之后加入DMF溶解的 Rnoc-Tyr (tBu)-OH(MW:459. 6)、HoBt (MW: 135. 1)、DIC (MW: 126. 1)的混合物，室温反应 2 小时，抽干，分别用DMF和二氯甲烷洗涤，抽干，得Fmoc-Tyr (tBu) -wang树脂；
(2)Fmoc-Ser (tBu) -Tyr (tBu) -wang 树脂的合成
在步骤(1)的树脂中，加入脱保护试剂(哌啶/DMF = 1 5体积比，树脂重量浓度为 10ml/g),室温反应0. 5小时，抽干，分别用DMF和二氯甲烷洗涤，抽干，之后加入DMF溶解的 Fmoc-Ser (tBu) -OH(MW 383. 4)、HoBt (MW 135. 1)、DIC (Mff 126. 1)的混合物，室温反应 2 小时，抽干，分别用DMF和二氯甲烷洗涤，抽干，获得Fmoc-Ser (tBu) -Tyr (tBu) -wang树脂；
其中，混合物中树脂的重量浓度为10ml/g，Fmoc- Ser (tBu)-OH、HoBt、DIC的摩尔数为树脂的3 — 5倍；
(3)Fmoc-Trp- Ser (tBu) -Tyr (tBu)-wang 树脂的合成
在步骤O)的树脂中，加入脱保护试剂(哌啶/DMF = 1 5体积比，树脂重量浓度为 10ml/g),室温反应0. 5小时，抽干，分别用DMF和二氯甲烷洗涤，抽干，之后加入DMF溶解的 Fmoc-Trp-OH(MW:426. 5)、HoBt (MW 135. 1)、DIC (MW: 126. 1)的混合物，室温反应 2 小时，抽干，分别用DMF和二氯甲烷洗涤，抽干，获得Fmoc-Trp- Ser (tBu) -Tyr (tBu) -wang树脂；
其中，混合物中树脂的重量浓度为10ml/g，Fmoc- Trp-OH, HoBt, DIC的摩尔数为树脂的3 — 5倍；
(4)Fmoc-Hi s (trt) -Trp- Ser (tBu) -Tyr (tBu)-wang 树脂的合成
在步骤(3)的树脂中，加入脱保护试剂(哌啶/DMF = 1 5体积比，树脂重量浓度为 10ml/g),室温反应0.5小时，抽干，分别用DMF和二氯甲烷洗涤，抽干，之后加入DMF溶解的 Rnoc-His (trt)-OH(MW:619. 7)、HoBt (MW: 135. 1)、DIC (MW: 126. 1)的混合物，室温反应2小时，抽干，分别用DMF和二氯甲烷洗涤，抽干，获得Fmoc-His (trt) -Trp- Ser (tBu) -Tyr (tBu) -wang 树脂；
其中，混合物中树脂的重量浓度为10ml/g，Fmoc- His (trt)-OH、HoBt、DIC的摩尔数为树脂的3 — 5倍；
(5)pGlu-His(trt)-Trp- Ser (tBu) -Tyr (tBu)-wang 树脂的合成
在步骤(3)的树脂中，加入脱保护试剂(哌啶/DMF = 1 5体积比，树脂重量浓度为 10ml/g),室温反应0. 5小时，抽干，分别用DMF和二氯甲烷洗涤，抽干，之后加入DMF溶解的 PGlu-OH(丽129. l)、HoBt (丽135. 1)、DIC (MW: 126. 1)的混合物，室温反应 2 小时，抽干，分别用 DMF 和二氯甲烷洗涤，抽干，获得 PGlu-His (trt) -Trp- Ser (tBu) -Tyr (tBu)-wang 树脂；
其中，混合物中树脂的重量浓度为10ml/g，PGlu, HoBt、DIC的摩尔数为树脂的3 — 5
倍；
(6)PGlu-His -Trp- Ser-Tyr-OH 的获得
按照本发明，切肽包括如下步骤将步骤(5)中的PGlu-His (trt) -Trp- Ser (tBu) -Tyr (tBu)-wang 树脂加入预冷至 0°C 的切肽试剂(TFA:EDT:TIS:H20=9:5:2. 5:2. 5)中，室温反应2小时，乙醚沉淀，抽滤，乙醚洗涤沉淀，真空干燥，得粗肽。
(二)Goserelin 第二片段的合成
(1) Fmoc-azagly-OSu 的(1.1) 将20ml水合胼/乙腈溶液(内含760μ1 80%水合胼溶液)滴加入100ml Fmoc-OSu乙腈溶液中(内含6. 74g Fmoc 一 OSu)，磁力搅拌反应16小时后过滤，以1 :1 (体积比) 的乙腈/乙醚溶液洗涤三遍，乙醚溶液洗涤三遍，干燥；
(1. 2) 将上步所得的8. 77g Fmoc-NH-NH2与DSC (9. 72g)溶于150ml乙腈中，搅拌反应20小时，旋转蒸发，水沉淀，过滤，固体以乙酸乙酯溶解，饱和NaHCO3洗涤2遍，饱和食盐水洗涤两遍，取乙酸乙酯层，旋转蒸发后以石油醚沉淀，洗涤，干燥，得固体11. 81g ；
(2)Fmoc-Pro-azagly- NH-Rink 树脂的制备
取Fmoc-NH-Rink树脂(替代度0.4-0. 8mmol/g)以二氯甲烷浸泡，充分溶胀，抽干。之后加入脱保护试剂(哌啶/DMF = 1 5体积比，树脂体积浓度为10ml/g)，室温反应0. 5小时，抽干，分别用DMF和二氯甲烷洗涤，抽干，之后加入Fmoc-Azgly-Osu的DMF溶液，(树脂体积浓度为10ml/g，Fmoc-Azgly-Osu摩尔数为树脂的2 — 4倍)，搅拌反应8 一 12小时， 抽干，DMF、二氯甲烷洗涤。加入脱保护试剂(哌啶/DMF = 1 5体积比，树脂重量浓度为 10ml/g),室温反应0. 5小时，抽干，分别用DMF和二氯甲烷洗涤，抽干，之后加入DMF溶解的 Fmoc-Pro-OH(MW 337. 4)、HoBt (MW: 135. 1)、DIC (MW: 126. 1)的混合物，室温反应 2 小时，抽干，分别用DMF和二氯甲烷洗涤，抽干，获得Fmoc-Pro- Azgly- NH-Rink树脂；
(3)Fmoc-Arg- Pro-Azgly- NH-Rink 树脂的制备
在步骤(2)的树脂中，加入脱保护试剂(哌啶/DMF = 1 5体积比，树脂重量浓度为 10ml/g),室温反应0. 5小时，抽干，分别用DMF和二氯甲烷洗涤，抽干，之后加入DMF溶解的 Fmoc-Arg-OH(MW 396. 4)、HoBt (MW 135. 1)、DIC (MW: 126. 1)的混合物，室温反应 2 小时，抽干，分别用DMF和二氯甲烷洗涤，抽干，获得Fmoc-Arg- Pro-Azgly- NH-Rink树脂；
其中，混合物中树脂的重量浓度为10ml/g，Fmoc-Arg-OH, HoBt, DIC的摩尔数为树脂的 3 — 5 倍；
(4)Fmoc-Leu- Arg- Pro-Azgly- NH-Rink 树脂的制备
在步骤(3)的树脂中，加入脱保护试剂(哌啶/DMF = 1 5体积比，树脂重量浓度为 10ml/g),室温反应0. 5小时，抽干，分别用DMF和二氯甲烷洗涤，抽干，之后加入DMF溶解的 Fmoc-Leu-OH(MW 353. 4), HoBt (MW 135. 1)、DIC (MW: 126. 1)的混合物，室温反应 2 小时，抽干，分别用DMF和二氯甲烷洗涤，抽干，获得Fmoc-Leu- Arg- Pro-Azgly- NH-Rink树脂；
其中，混合物中树脂的重量浓度为10ml/g，Fmoc-Leu-OH,HoBt,DIC的摩尔数为树脂的 3 — 5 倍；
(5)Fmoc-D-Ser (tBu) - Leu- Arg- Pro-Azgly- NH-Rink 树脂的制备
在步骤(4)的树脂中，加入脱保护试剂(哌啶/DMF = 1 5体积比，树脂重量浓度为 10ml/g),室温反应0. 5小时，抽干，分别用DMF和二氯甲烷洗涤，抽干，之后加入DMF溶解的 Fmoc-D-Ser (tBu)-OH(MW 383. 4)、HoBt (MW: 135. 1)、DIC (MW: 126. 1)的混合物，室温反应 2 小时，抽干，分别用DMF和二氯甲烷洗涤，抽干，获得Fmoc-D-Ser (tBu)- Leu- Arg- Azgly-NH-Rink 树脂；
其中，混合物中树脂的重量浓度为10ml/g，Fmoc- D-Ser (tBu)-OH、HoBt、DIC的摩尔数为树脂的3 — 5倍。
(三)Goserelin的对接、纯化
(1) Goserelin第一片段与Goserelin第二片段的对接在Goserelin第二片段的树脂中加入脱保护试剂(哌啶/DMF= 1 :5体积比，树脂重量浓度为10ml/g)，室温反应0. 5小时，抽干，分别用DMF和二氯甲烷洗涤，抽干，之后加入DMF 溶解的 Goserelin 第一片段(MW 702. 8)、HoBt (MW 135. 1)、DIC (MW: 167)的混合物，室温反应2小时，抽干，分别用DMF和二氯甲烷洗涤，抽干，得到Goserelin ；
(2)Goserelin 的获得
按照本发明，切肽包括如下步骤将Goserelin肽树脂加入预冷至0°C的切肽试剂中 (TFA: 二氯甲烷=1:99)，室温反应1小时，乙醚沉淀，抽滤，乙醚洗涤沉淀，真空干燥，得粗肽；
将Goserelin粗品溶于水中，过滤，上HPLC纯化(C18柱纯化)，流动相1%。TFA/H20: 1%。TFA/乙腈(1 :4)，流速为60ml/min，检测波长为220nm，收集所需组分，脱盐，冻干，获得成品 Goserelin(MW 1269. 1)，总收率 10-40%。
实施例2 戈舍瑞林的合成
(一)Goserelin第一片段的合成
(1)Fmoc-Tyr (tBu) -wang 树脂的合成
取50g wang树脂(1. 3mmol/g)用二氯甲烷浸泡，使树脂充分溶胀，之后加入DMF溶解的 Fmoc-Tyr (tBu)-OH(MW459. 6，59. 7g)、HoBt (MW: 135. 1，17. 6g)、DIC(MW: 126. 1， 21. 7ml)的混合物，室温反应2小时，抽干，分别用DMF和二氯甲烷洗涤，抽干，约得75g Fmoc-Tyr (tBu) -wang 树月旨；
(2)Fmoc-Ser (tBu) -Tyr (tBu) -wang 树脂的合成
在步骤(1)的树脂中，加入脱保护试剂，室温反应0.5小时，抽干，分别用DMF和二氯甲烷洗涤，抽干，之后加入 300ml DMF 溶解的 Fmoc-Ser (tBu) -OH (MW 383. 4, 53. 5g), HoBt (MW 135. 1，18. 8g)、DIC(MW: 126. 1，23.3ml)的混合物，室温反应 2 小时，抽干；
(3)Fmoc-Trp- Ser (tBu) -Tyr (tBu)-wang 树脂的合成
在步骤(2)的树脂中，加入脱保护试剂，室温反应0.5小时，抽干，分别用DMF和二氯甲烷洗涤，抽干，之后加入300mlDMF溶解的Fmoc-Trp-OH (MW 426. 5，59. 5g)、 HoBt (MW: 135. 1，17. 6g)、DIC (MW: 126. 1,21. 7ml)的混合物，室温反应2小时，抽干，分别用 DMF和二氯甲烷洗涤，抽干；
(4)Fmoc-Hi s (trt) -Trp- Ser (tBu) -Tyr (tBu)-wang 树脂的合成
在步骤(3)的树脂中，加入脱保护试剂，室温反应0.5小时，抽干，分别用DMF和二氯甲烷洗涤，抽干，之后加入 300mlDMF 溶解的 Fmoc-His (trt) -OH(MW 619. 7，86. 4g)、 HoBt (MW: 135. 1，17. 6g)、DIC (MW: 126. 1,21. 7ml)的混合物，室温反应2小时，抽干，分别用 DMF和二氯甲烷洗涤，抽干；
(5)pGlu-His(trt)-Trp- Ser (tBu) -Tyr (tBu)-wang 树脂的合成
在步骤(3)的树脂中，加入脱保护试剂，室温反应0.5小时，抽干，分别用DMF和二氯甲烷洗涤，抽干，之后加入 300mlDMF 溶解的 PGlu-OH(MW: 129. 1，18g)、HoBt (MW: 135. 1， 17. 6g)、DIC(MW:126. 1,21. 7ml)的混合物，室温反应2小时，抽干，分别用DMF和二氯甲烷洗涤，抽干；
(6)pGlu-His -Trp- Ser-Tyr-OH 的获得
将步骤(5)中的 pGlu-His(trt) -Trp- Ser (tBu) -Tyr (tBu)-wang 树脂加入预冷至
90°C的1升切肽试剂(TFA:EDT:TIS:H20=9:5:2. 5:2. 5)中，室温反应2小时，乙醚沉淀，抽滤， 乙醚洗涤沉淀，真空干燥，得粗肽约30g (得率92%)。(二)Goserelin 第二片段的合成
(1)Fmoc-Azgly-Osu的合成
(1.1) 将120ml水合胼/乙腈溶液(内含4.6ml 80%水合胼溶液)滴加入300ml Fmoc - OSu乙腈溶液中(内含40. 4g)，磁力搅拌反应16小时后过滤，以1 :1 (体积比)的乙腈/乙醚溶液洗涤三遍，乙醚溶液洗涤三遍，干燥；
(1. 2) 将上步所得的52. 6g Fmoc-NH-NH2与DSC (58. 3g)溶于500ml乙腈中，搅拌反应20小时，旋转蒸发，水沉淀，过滤，固体以乙酸乙酯溶解，饱和NaHCO3洗涤2遍，饱和食盐水洗涤两遍，取乙酸乙酯层，旋转蒸发后以石油醚沉淀，洗涤，干燥，得固体70. 9g；
(2)Fmoc-Azgly- NH-Rink 树脂的制备
取50g Fmoc-NH-Rink树脂(替代度0. 6mmol/g,共30mmol)以二氯甲烷浸泡，充分溶胀，抽干。之后加入脱保护试剂，室温反应0. 5小时，抽干，分别用DMF和二氯甲烷洗涤，抽干，之后加入Fmoc-Azgly-Osu (MW 395. 3，59. 3g)的DMF溶液，搅拌反应8 — 12小时，抽干， DMF、二氯甲烷洗涤；
(3)Fmoc-Arg- Azgly- NH-Rink 树脂的制备
在步骤(2)的树脂中，加入脱保护试剂，室温反应0.5小时，抽干，分别用DMF和二氯甲烷洗涤，抽干，之后加入300mlDMF溶解的Fmoc-Arg-OH (MW 396. 4，35. 7g)、 HoBt (MW 135. 1，12. 15g)、DIC (MW: 126. 1，15ml)的混合物，室温反应 2 小时，抽干；
(4)Fmoc-Leu- Arg- Azgly- NH-Rink 树脂的制备
在步骤(3)的树脂中，加入脱保护试剂，室温反应0.5小时，抽干，分别用DMF和二氯甲烷洗涤，抽干，之后加入300mlDMF溶解的Fmoc-Leu-OH (MW 353. 4，31. 8g)、 HoBt (MW 135. 1，12. 15g)、DIC (MW: 126. 1，15ml)的混合物，室温反应 2 小时，抽干；
(5)Fmoc-D-Ser (tBu) - Leu- Arg- Azgly- NH-Rink 树脂的制备
在步骤(4)的树脂中，加入脱保护试剂，室温反应0.5小时，抽干，分别用DMF和二氯甲烷洗涤，抽干，之后加入 350mlDMF 溶解的 Fmoc-D-Ser (tBu) -OH (MW 383. 4, 34. 5g)、 HoBt (MW: 135. 1，12. 15g)、DIC (MW: 126. 1，15ml)的混合物，室温反应2小时，抽干，分别用 DMF和二氯甲烷洗涤，抽干。(三)Goserelin的对接、纯化
(1)Goserelin第一片段与Goserelin第二片段的对接
在Goserelin第二片段的树脂中加入脱保护试剂，室温反应0. 5小时，抽干，分别用 DMF和二氯甲烷洗涤，抽干，之后加入DMF溶解的Goserelin第一片段(MW: 702. 8，25. 3g)、 HoBt (MW: 135. 1，4. 9g)、DIC (MW: 126. 1,6ml)的混合物，室温反应2小时，抽干，分别用DMF 和二氯甲烷洗涤，抽干，得到Goserelin树脂；
(2)Goserelin的获得
将Goserelin肽树脂加入预冷至1升0°C的切肽试剂中(TFA: 二氯甲烷=1 :99)，室温反应1小时，乙醚沉淀，抽滤，乙醚洗涤沉淀，真空干燥，得粗肽16克；
将Goserelin粗品溶于水中，过滤，上HPLC纯化(C18柱纯化)，流动相10Z00 TFA/ H2O: 1%oTFA/乙腈(1 :4)，，检测波长为220nm，收集所需组分，脱盐，冻干，获得成品
10Goserelin(MW 1269. 1)8 克。实施例3 布舍瑞林的合成
(一)Buserelin第一片段的合成
Buserelin第一片段与Goserelin第一片段相同，具体实施内容见实施例1和实施例
2 ；
(二)Buserelin第二片段的合成
(1)Fmoc-Pro-wang 树脂的制备
取wang树脂(替代度0.4-0.8mmol/g)以二氯甲烷浸泡，充分溶胀，抽干。分别用DMF 和二氯甲烷洗涤，抽干，之后加入Fmoc-Pro-OH，DIC, HOBT的DMF溶液，搅拌反应8 — 12小时，抽干，DMF、二氯甲烷洗涤抽干，获得Fmoc-Pro- Wang树脂；
(2)Fmoc-Arg- Pro-wang 树脂的制备
在步骤⑴的树脂中，加入脱保护试剂(哌啶/DMF = 1 5体积比，树脂重量浓度为 10ml/g),室温反应0. 5小时，抽干，分别用DMF和二氯甲烷洗涤，抽干，之后加入DMF溶解的 Fmoc-Arg-OH(MW 396. 4)、HoBt (MW 135. 1)、DIC (MW: 126. 1)的混合物，室温反应 2 小时，抽干，分别用DMF和二氯甲烷洗涤，抽干，获得Fmoc-Arg- Pro-wang树脂；
其中，混合物中树脂的重量浓度为10ml/g，Fmoc-Arg-OH, HoBt, DIC的摩尔数为树脂的 3 — 5 倍；
(3)Fmoc-Leu- Arg- Pro-wang 树脂的制备
在步骤(2)的树脂中，加入脱保护试剂(哌啶/DMF = 1 5体积比，树脂重量浓度为 10ml/g),室温反应0. 5小时，抽干，分别用DMF和二氯甲烷洗涤，抽干，之后加入DMF溶解的 Fmoc-Leu-OH(MW 353. 4), HoBt (MW 135. 1)、DIC (MW: 126. 1)的混合物，室温反应 2 小时，抽干，分别用DMF和二氯甲烷洗涤，抽干，获得Fmoc-Leu- Arg- Pro-wang树脂；
其中，混合物中树脂的重量浓度为10ml/g，Fmoc-Leu-OH,HoBt,DIC的摩尔数为树脂的 3 — 5 倍；
(4)Fmoc-D-Ser (tBu) - Leu- Arg- Pro-Wang 树月旨的制备
在步骤(4)的树脂中，加入脱保护试剂(哌啶/DMF = 1 5体积比，树脂重量浓度为 10ml/g)，室温反应0. 5小时，抽干，分别用DMF和二氯甲烷洗涤，抽干，之后加入DMF溶解的 Fmoc-D-Ser (tBu)-OH(MW 383. 4)、HoBt (MW 135. 1)、DIC (MW: 126. 1)的混合物，室温反应 2小时，抽干，分别用DMF和二氯甲烷洗涤，抽干，获得Fmoc-D-Ser (tBu)- Leu- Arg- wang 树脂；
其中，混合物中树脂的重量浓度为10ml/g，Fmoc- D-Ser (tBu)-OH、HoBt、DIC的摩尔数为树脂的3 — 5倍。(三)Buserelin的对接、纯化
(1)Buserelin第一片段与Buserelin第二片段的对接
在Buserelin第二片段的树脂中加入脱保护试剂(哌啶/DMF = 1 5体积比，树脂重量浓度为10ml/g)，室温反应0.5小时，抽干，分别用DMF和二氯甲烷洗涤，抽干，之后加入 DMF 溶解的 Goserelin 第一片段(MW 702. 8)、HoBt (MW 135. 1)、DIC (MW: 167)的混合物，室温反应2小时，抽干，分别用DMF和二氯甲烷洗涤，抽干，得到Buserelin ；
(2)Buserelin的切肽、纯化按照本发明，切肽包括如下步骤将Buserelin肽树脂加入预冷至0°C的切肽试剂中 (乙胺二氯甲烷=1 :99)，室温反应24小时，抽滤，旋蒸，乙醚洗涤沉淀，真空干燥，得粗肽。将Buserelin粗品溶于水中，过滤，上HPLC纯化(C18柱纯化)，流动相1%。TFA/ H2O: 1%。TFA/乙腈(1 :4)，流速为60ml/min ，检测波长为220nm，收集所需组分，脱盐， 冻干，获得成品 Buserelin (MW =1239. 4)，总收率 10-40%。实施例4 =Buserelin的合成
(一)Buserelin第一片段的合成
Buserelin第一片段与Goserelin第一片段相同，具体实施内容见实施例1和实施例
2 ；
(二)Buserelin第二片段的合成
(1)Fmoc-Pro-Wang 树脂的制备
取50g Wang树脂(替代度0.6mmol/g，共30mmol)以二氯甲烷浸泡，充分溶胀，抽干。 之后加入脱保护试剂，室温反应0. 5小时，抽干，分别用DMF和二氯甲烷洗涤，抽干，之后加 Λ Fmoc-Pro-OH 50. 6g，DIC 25 克，H0BT20 克的 DMF 溶液，搅拌反应 8 — 12 小时，抽干，DMF、 二氯甲烷洗涤；
(2)Fmoc-Arg- Pro-wang 树脂的制备
在步骤(2)的树脂中，加入脱保护试剂，室温反应0. 5小时，抽干，分别用DMF和二氯甲烷洗涤，抽干，之后加入300mlDMF溶解的Fmoc-Arg-OH (MW 396. 4，35. 7g)、 HoBt (MW 135. 1，12. 15g)、DIC (MW: 126. 1，15ml)的混合物，室温反应 2 小时，抽干；
(3)Fmoc-Leu- Arg- Pro-wang 树脂的制备
在步骤(3)的树脂中，加入脱保护试剂，室温反应0.5小时，抽干，分别用DMF和二氯甲烷洗涤，抽干，之后加入300mlDMF溶解的Fmoc-Leu-OH (MW 353. 4，31. 8g)、 HoBt (MW 135. 1，12. 15g)、DIC (MW: 126. 1，15ml)的混合物，室温反应 2 小时，抽干；
(4)Fmoc-D-Ser (tBu) - Leu- Arg- Pro-wang 树月旨的制备
在步骤(4)的树脂中，加入脱保护试剂，室温反应0.5小时，抽干，分别用DMF和二氯甲烷洗涤，抽干，之后加入 350mlDMF 溶解的 Fmoc-D-Ser (tBu) -OH (MW 383. 4, 34. 5g)、 HoBt (MW 135. 1，12. 15g)、DIC (MW: 126. 1，15ml)的混合物，室温反应2小时，抽干，分别用 DMF和二氯甲烷洗涤，抽干。(三)Buserelin的对接、纯化
(1)Buserelin第一片段与Buserelin第二片段的对接
在Buserelin第二片段的树脂中加入脱保护试剂，室温反应0. 5小时，抽干，分别用 DMF和二氯甲烷洗涤，抽干，之后加入DMF溶解的Goserelin第一片段(MW: 702. 8，25. 3g)、 HoBt (MW: 135. 1，4. 9g)、DIC (MW: 126. 1,6ml)的混合物，室温反应2小时，抽干，分别用DMF 和二氯甲烷洗涤，抽干，得到Buserelin树脂；
(2)Buserelin的切肽、纯化
将Buserelin肽树脂加入预冷至1升0°C的切肽试剂中(TFA: 二氯甲烷=1 :99)，室温反应24小时，乙醚沉淀，抽滤，乙醚洗涤沉淀，真空干燥，得粗肽16克；
将Buserelin粗品溶于水中，过滤，上HPLC纯化(C18柱纯化)，流动相1% TFA/H20: 1%。TFA/乙腈(1 :4)，，检测波长为220nm，收集所需组分，脱盐，冻干，获得成品Buserelin7. 5 克 O 在本发明的实施例中，合成过程中，脱保护试剂为哌啶/DMF = 1 5 (体积比) 以下是本发明实施例中的原料列表
权利要求
1.促黄体生成素释放激素衍生物的合成方法，所述促黄体生成素释放激素衍生物结构为 pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg-Pro-R，R=Azgly-NH2 或 NHEt，其特征在于包括(1)固相合成第一片段pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-OH，其中，His、Ser,Tyr为侧链保护氨基酸；(2)固相合成第二片段Dler(tBu)-Leu-Arg-Pro-R-固相支持物，其中Dler (tBu)的氨基端为保护基团Fmoc或Boc ；(3)连接所述第一片段和第二片段，并经切肽、纯化，得到所述的促黄体生成素释放激素衍生物 pGlu-Hi s-Trp-Ser-Tyr-D-Ser (tBu) -Leu-Arg-Pro-R。
2.根据权利要求1所述的促黄体生成素释放激素衍生物的合成方法，其特征在于(1) 由以下步骤组成(al)提供一树脂作为固相支持物；(bl)用一活化试剂活化氨基端为保护基团Fmoc或Boc的Tyr (tBu)-0H，并将其连接到 (al)所述的固相支持物上，接着用一脱保护试剂脱去保护基团Fmoc或Boc ；(cl)用一活化试剂活化氨基端为保护基团Fmoc或Boc的kr (tBu) -0H,并将其连接到(bl)的固相支持物上的Tyr(tBu)上，接着用一脱保护试剂脱去保护基团Fmoc或Boc ；(dl)用一活化试剂活化氨基端为保护基团Fmoc或Boc的Trp-OH，并将其连接到(cl) 的固相支持物上的kr(tBu)上，接着用一脱保护试剂脱去保护基团Fmoc或Boc ；(el)用一活化试剂活化氨基端为保护基团Fmoc或Boc的His (trt)-0H，并将其连接到 (dl)的固相支持物上的Trp上，接着用一脱保护试剂脱去保护基团Fmoc或Boc ；(fl)用一活化试剂活化pGlu-OH，并将其连接到(el)的固相支持物上的His(trt)上； (gl)将(fl)的固相支持物加入一切肽试剂中，使得其上的多肽从(al)的固相支持物上脱离，且使得Tyr (tBu)、Ser (tBu), His (trt)上的侧链保护基团被脱去，从而得到所述的第一片段 pGlu-HiS-Trp-Ser-Tyr-OH0
3.根据权利要求2所述的促黄体生成素释放激素衍生物的合成方法，其特征在于(2) 由以下步骤组成(a2)提供匹配偶联所述末端为R基团的树脂作为固相支持物； (b2)用一活化试剂活化氨基端为保护基团Fmoc或Boc的ftx)-0H，并将其连接到(a2) 所述的固相支持物上，接着用一脱保护试剂脱去保护基团Fmoc或Boc ；(c2)用一活化试剂活化氨基端为保护基团Fmoc或Boc的Arg -0H，并将其连接到(b2) 的固相支持物上的Pro上，接着用一脱保护试剂脱去保护基团Fmoc或Boc ；(d2)用一活化试剂活化氨基端为保护基团Fmoc或Boc的Leu-OH，并将其连接到(c2) 的固相支持物上的Arg上，接着用一脱保护试剂脱去保护基团Fmoc或Boc ；(e2)用一活化试剂活化氨基端为保护基团Fmoc或Boc的D-Ser (tBu) -0H,并将其连接到(d2)的固相支持物上的Leu上，即得到所述的第二片段D-Ser (tBu) -Leu-Arg-Pro-R-固相支持物。
4.根据权利要求1或2或3所述的促黄体生成素释放激素衍生物的合成方法，其特征在于(3)由以下步骤组成(a3)用一脱保护试剂脱去保护基团Fmoc或Boc，用一活化试剂活化所述第一片段，并将其连接到脱去保护基团的第二片段固相支持物上；(b3)将上述(a3)中的固相支持物加入一切肽试剂中，使得其上的多肽从上述(a3)得到的固相支持物上脱离，从而得到所述的促黄体生成素释放激素衍生物；(c3)将上述(b3)的得到的促黄体生成素释放激素衍生物利用HPLC进行纯化。
5.根据权利要求1所述的促黄体生成素释放激素衍生物的合成方法，其特征在于所述固相支持物选自Rnoc-NH-Rink树脂、Wang树脂、NovaSyn TGR树脂、Rink amide树脂、 Rink amide MBHA 树脂、Rink amide AM 树脂、Rink amide PEGA 树脂、Rink amide NovaGel 树脂、Sieber amide 树脂和 NovaSyn TG Sieber 树脂。
6.根据权利要求2或3所述的促黄体生成素释放激素衍生物的合成方法，其特征在于 所述树脂选自 Rnoc-NH-Rink 树脂、Wang 树脂、NovaSyn TGR 树脂、Rink amide 树脂、Rink amide MBHA 树脂、Rink amide AM 树脂、Rink amide PEGA 树脂、Rink amide NovaGel 树脂、 Sieber amide 树脂和 NovaSyn TG Sieber 树脂。
7.根据权利要求2或3所述的促黄体生成素释放激素衍生物的合成方法，其特征在于 所述活化试剂选自HoBt、DIC、DCC和DIEA。
8.根据权利要求4所述的促黄体生成素释放激素衍生物的合成方法，其特征在于所述活化试剂选自HoBt、DIC、DCC和DIEA。
9.根据权利要求3所述的促黄体生成素释放激素衍生物的合成方法，其特征在于 所述的氨基端的保护基团为Fmoc，所述的脱保护试剂选自哌啶、DMF、cyclohexylamine, 1，5-diazabicyclo[5, 4，0]undec-5_ene、ethanolamine、pyrrolidine、1，8_ diazabicyclo [5, 4，0]undec-7_ene、diethylamine 禾口 morpholine 中的一禾中或多禾中。
全文摘要
本发明涉及一种促黄体生成素释放激素衍生物的合成方法，所述促黄体生成素释放激素衍生物结构为pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg-Pro-R，R=Azgly-NH2或NHEt，本发明将戈舍瑞林和布舍瑞林分成两个片段分别固相合成，且第一片段不受D-Ser(tBu)的影响，第二片段最后一步才涉及到D-Ser(tBu)，使得整个合成工艺克服了因D-Ser(tBu)的影响而使得戈舍瑞林和布舍瑞林的固相合成与传统的固相合成不能兼容的缺陷，从而使得整体工艺具有成本低、收率高、纯度好的优点。
文档编号C07K1/06GK102190709SQ20111008017
公开日2011年9月21日 申请日期2011年3月31日 优先权日2011年3月31日
发明者杨祺, 王宇 申请人:厦门博欣生物技术有限公司