专利名称：肝障碍改善用肽及其组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新的肽以及含有该肽的组合物。另外，本发明还涉及该肽以及含有该肽的组合物用于肝障碍预防或改善的用途。更具体而言，本发明涉及，对于由非酒精性脂肪性肝疾病(Non-Alcoholic Fatty Liver Disease NAFLD);非酒精性脂肪肝炎(Non-Alcoholic Steato-Hepatitis NASH)以及肝炎病毒，酒精，压力(stress),药剂或免疫异常引起的各种肝障碍具有预防和改善効果的肽，以及含有该肽的组合物(肝障碍预防或改善用组合物)。
背景技术：
NAFLD在发达国家中为最一般的肝脏疾病。NAFLD中含有的肝疾病范围较广，其范围从单纯性脂肪肝，至脂肪肝炎，肝硬化。NASH为NAFLD的重症病型，以脂肪化，炎症，纤维化为特徴。即，由多阶段一系列的发展直至NASH。脂肪化受饮食生活影响很大，在炎症阶段，由于炎症性细胞因子TNF-α、ΜΙΡ-2的增加和抗炎症性细胞因子IL-IO的减少而更进一 步发展。目前在NAFLD的治疗中，使用了贝特类(fibrate)，抑制素类(statin)，普罗布考类(probucol)等的高脂血症治疗药，ARB, ACE阻碍剂等的降压药，吡格列酮(pioglitazone) ,二甲双胍(metformin)等的胰岛素抵抗性改善药等,但是分别具有副作用，反而具有导致肝损伤的可能性。另外，肝脏作为生物体的化学工場，在解毒，物质代谢等方面起着中心的作用，作为具有各种机能的主要脏器工作。若肝脏中发生了由NAFLD ；NASH ;或者肝炎病毒，酒精，压力，药剂或免疫异常引起的肝障碍，将对生物体产生巨大影响。因此，为了维持生物体的正常机能，急需开发一种无副作用的有効的肝障碍预防或改善用组合物，特别是具有抗NAFLD以及抗NASH作用的肝障碍预防或改善用组合物。
发明内容
发明要解决的课题本发明的目的在于提供一种可有效用于肝障碍的预防或改善的新的肽以及含有该肽的组合物。本发明的目的尤其在于提供一种对NAFLD，及较其更严重的NASH具有预防或改善効果的肽以及含有该肽的组合物(肝障碍预防或改善用组合物)。解决课题的手段本发明者们为解决上述课题进行了不断研究，发现了由序列(I)WTQR所示的氨基酸序列形成的新的肽具有预防或改善肝障碍的作用，此外，还发现包括该肽，由序列(2)ASLDK，序列(3)FAK，序列(4)TSKY，序列(5) SDGLKH所示的各氨基酸序列形成的肽，在引发肝障碍的各作用点起作用，具有综合地预防或改善肝机能的効果。本发明基于所述认识而完成，涉及对肝障碍的预防或改善有効的肽，以及含有该肽的组合物。另外，本发明还涉及这些肽或含有该肽的组合物的新用途。
具体而言，本发明包括下记的形态。项I. 一种由序列(I)WTQR所示的氨基酸序列形成的肽。项2. —种含有根据项I所述的肽的组合物。项3.根据项2所述的组合物，其还含有由选自下列中的任意至少一个氨基酸序列形成的肽序列(2)ASLDK，序列(3)FAK，序列(4)TSKY，以及序列(5)SDGLKH。项4.根据项2或3所述的组合物，其为食品或医药组合物。项5.根据项I所述的肽，在制造肝障碍的预防或治疗用组合物上的用途。项6.根据项5所述的用途，所述肝障碍为非酒精性脂肪性肝疾病(NAFLD)非酒精性脂肪肝炎(NASH);或者由肝炎病毒，酒精，压力，药剂或免疫异常引起的肝障碍。 项7.根据项5或6所述的用途，所述肝障碍的预防或治疗用组合物为食品或医药组合物。项8.根据项2-4中的任意一项所述的组合物，在肝障碍的预防或治疗用组合物的制造上的用途。项9.根据项8所述的用途，所述肝障碍为非酒精性脂肪性肝疾病(NAFLD)非酒精性脂肪肝炎(NASH);或者由肝炎病毒，酒精，压力，药剂或免疫异常引起的肝障碍。项10.根据项8或9所述的用途，所述肝障碍的预防或治疗用组合物为食品或医药组合物。项11.以序列(I)WTQR所示的肽作为有効成分的肝障碍预防或改善用组合物。项12.根据项11所述的肝障碍预防或改善用组合物，其还含有由选自下列中的任意至少一个氨基酸序列形成的肽序列(2)ASLDK，序列(3)FAK，序列(4)TSKY，以及序列(5)SDGLKH。另外，项11以及12所述的肝障碍预防或改善用组合物包含医药组合物以及食品组合物。项13.根据项11或12所述的肝障碍预防或改善用组合物，所述肝障碍为非酒精性脂肪肝炎(NASH)。项14.根据项11或12所述的肝障碍预防或改善用组合物，所述肝障碍为非酒精性脂肪性肝疾病(NAFLD)。项15.根据项11-14中的任意一项所述的肝障碍预防或改善用组合物，其为以具有肝障碍，或者具有肝障碍可能性(懸念)的人群为专门对象的医药品。项16.根据项11-14中的任意一项所述的肝障碍预防或改善用组合物，其为以具有肝障碍，或者具有肝障碍可能性(懸念)的人群为专门对象的健康食品或保健食品。项17.根据项11或12所述的肝障碍预防或改善用组合物，其为以非酒精性脂肪性肝疾病(NAFLD)或非酒精性脂肪肝炎(NASH)的预防或治疗为目的而被使用的健康食品，保健食品以及医药品。项18. —种由选自下列中的至少一个氨基酸序列形成的肽作为有效成分的组合物序列(l)WTQR，序列(2)ASLDK，序列(3)FAK，序列(4)TSKY，序列(5) SDGLKH0发明的效果本发明的特征在于由序列(I)WTQR所示的氨基酸序列形成的肽发挥显著的肝障碍预防或改善作用。另外，以上述肽作为有効成分的本发明的组合物的特征在于，基于上述肽的作用，发挥显著的肝障碍预防或改善作用。因此，根据本发明的肽以及含有该肽的组合物，通过其具有的肝障碍预防或改善作用，可预防或改善由于肝障碍而导致的肝机能低下。实施发明的形态(I)新的肽以及用途本发明提供的肽为，由序列(I)WTQR所示的氨基酸序列形成的肽。该肽具有预防或改善肝障碍的作用。因此，通过将该肽单独地，或与其他的肽组合使用，可预防或改善肝障碍。作为此处的肝障碍，没有限制，可举例为NAFLD ；NASH ；由肝炎病毒，酒精，压力，药剂或免疫异常引起的肝障碍。优选为NAFLD，以及NASH。 另外，作为与上述肽组合使用的肽，没有特别的制限，可举例为由选自下列中的至少一个氨基酸序列形成的肽序列(2)ASLDK，序列(3)FAK，序列(4)TSKY，序列(5)SDGLKH。通过将这些肽单独地，或者任意二种以上地，与由序列(I)WTQR所示的氨基酸序列形成的肽组合使用，可预防或改善肝障碍，特别是NAFLD ；NASH ；由肝炎病毒，酒精，压力，药剂或免疫异常引起的肝障碍。本发明的肽，可根据其氨基酸序列，通过一般的化学合成法进行制备。所述方法包括通常的液相法以及固相法的肽合成法。相关的肽合成法更具体而言包括，基于本发明提供的氨基酸序列信息，将各氨基酸I个I个逐次结合，使链不断延长的逐步合成法(Stepwise elongation),以及预先合成由数个氨基酸形成的片段,再使各片段进行连接反应的片段组合法(Fragment condensation)。本发明的肽的合成可由上述任意方法进行。这样得到的本发明的肽，可根据通常的方法，例如可根据离子交换树脂，分配色谱法，凝胶色谱法，亲和色谱法，高效液相色谱法(HPLC)，逆流分配法等的肽化学领域常规使用的方法，进行适宜的精制。 另外，本发明的肽除了可用上述化学合成法进行制备之外，还可通过将含有上述氨基酸序列的多肽或蛋白质进行酶水解或加水分解，进行制备。相关的多肽或蛋白质的由来没有特别制限，动物，鱼类以及植物均可。(2)组合物及其用途本发明提供的组合物包括如后所述的医药组合物以及食品组合物。此处作为本发明对象的医药组合物包括，对于具有肝障碍的患者，特别是NAFLD，及其严重疾病的NASH的患者或有上述可能性的患者，专门以肝障碍的预防(肝机能低下抑制)或治疗(肝机能向上)为目的而使用的医药品。另外，作为本发明对象的食品组合物包括，对于具有肝障碍的人群，特别是具有NAFLD，及其严重疾病的NASH的人群或有上述可能性的人群，专门以肝障碍的预防(肝机能低下抑制)或改善(肝机能向上)为目的而使用的健康食品以及保健食品O本发明的组合物为含有由序列(I)WTQR的氨基酸序列形成的肽的组合物。优选地，为进一步含有由选自下列中的任意至少一个氨基酸序列形成的肽的组合物序列(2)ASLDK，序列(3)FAK，序列(4)TSKY，以及序列(5)SDGLKH。另外，本发明的组合物也可为蛋白质分解物。上述蛋白质分解物为通过将蛋白质进行酶水解或加水分解等分解得到的含有本发明的肽的组合物。
(3)医药组合物作为上述本发明的肝障碍预防或改善组合物的一个形态可列举医药组合物。在本发明中，上述肝障碍预防或改善肽及其组合物可单独，或者与肝保护剂，降血糖剂，高脂血症治疗药，降压剂，抗氧化剂，抗炎症剂的至少一种组合后使用。作为本发明对象的医药组合物包括，在肝障碍中，尤其NAFLD以及其重症的NASH的预防或治疗剂。本发明的医药组合物只要含有发挥肝障碍改善作用的有效量的上述肽即可，可仅由肽组成，但通常除上述有効成分之外还与药学上可接受的载体或添加剂一起被调制。作为此处的载体，例如，根据医药组合物(制剂)的投与形态通常使用的赋形剂，稀释剂，结合剂，崩解剂，崩解抑制剂，吸收促进剂，润滑剂，溶解辅助剂，缓冲剂，乳化剂，悬池剂等。
另外，作为添加剂，例如，根据制剂的投与形态而通常使用的安定化剂，保存剂，缓冲剂，等渗剂，螯合剂，PH调整剂，表面活性剂，着色剂，香料，风味剂，甜味剂等。另外，所述医药组合物的投与单位形态(医药制剂形态)可根据投与路径进行各种适宜的选择，可大致分类为经口剂，经肺投与剂，经鼻剂，舌下剂，非经口剂(注射剂，点滴剂)等。根据这些常规方法，可进行各种投与形态。本发明的医药组合物中所配合的肽的比例没有特别限制，例如，通常可为约O. I 80重量％左右，本发明的医药组合物在相关范围内可调制成含有肽的制剂形态。这样所获得的医药组合物的投与量，可根据医药组合物的目的(肝障碍的预防或者治疗)，该组合物的投与方法，投与形态，投与患者的肝障碍的种类、症状、年龄以及体重等进行适宜地选择。一般而言，有効成分的肽的投与量以成人(60kg)每I日，约O. 5 IOOmg左右的范围，优选为2. 5 50mg左右的范围进行投与。另外，该当投与不一定为I日I次，也可分为I日2 4次进行投与。如后记实施例所示，源于由序列(l)WTQR，序列(2)ASLDK，序列(3)FAK，序列(4)TSKY，序列(5) SDGLKH所示的氨基酸序列形成的活性肽，本发明的医药组合物发挥预防或改善肝障碍的作用。此处作为对象的肝障碍尤其为被称为NAFLD，NASH的肝障碍。对于具有NAFLD或NASH的患者或具有其可能性的患者而言，本发明的医药组合物可被有效用于肝障碍的预防(肝机能低下抑制)或治疗(肝机能向上)。(4)食品组合物作为上述本发明的肝障碍预防或改善用肽及其组合物的另一形态，可列举食品组合物。本发明提供的食品组合物包括，赋予了肝障碍预防或改善作用的健康食品(包括功能性食品以及特定保健用食品)。此处健康食品是指，与通常食品相比，具有积极意义上的保健，维持和/或增进健康等目的的食品。另外，赋予了肝障碍预防或改善作用的特定保健用食品的特征在于，含有预防或改善肝障碍的有効量的肽，食品的包装袋或广告中，可有关于其作用効果(肝障碍预防或改善作用)的记载，在可达到与其他的食品的区别化上，在本发明中也为较适宜的形态。本发明的食品组合物只要含有发挥肝障碍预防或改善作用的有効量的上述肽即可，虽可仅由肽组成，但通常除了与该肽具有同样作用的医药品、食品素材之外，可与作为医药品或食品可使用的载体或添加剂一起被调制。所述食品组合物包括，将上述肽，根据需要与医药品或食品上可接受的载体、添加剂等一起，调制成如前关于医药组合物所述的各种制剂形态，而形成的以肝障碍的预防或改善为目的的营养补充剂。另外，本发明的食品组合物还包括，通过将上述肽添加至一般的食品中(即，通过将肽作为食品原材料的一种进行使用)而调制成的，以肝障碍的预防或改善为目的和/或功能的健康食品(饮食物)。上述食品组合物中可含有的有効成分(肽)的量，可根据食品组合物的摄取量进行适宜调整。食品组合物的摄取量随着食品组合物的种类，对象人群的肝障碍的种类、症状等的程度，以及其他的各种条件而不同，例如，对于通常体重60kg的人每I日肽的量为约
O.5 IOOmg,优选为2. 5 50mg的比例。另外，本发明的食品组合物的摄取不一定为I日I次，也可分为I日3 4次进行摄取。 本发明食品组合物，如后记实施例所示，作为有効成分含有的肽，通过各种因素发挥改善肝障碍，特别是NAFLD，NASH的作用。所以，本发明的食品组合物，对于具有NAFLD或NASH的人群或具有其可能性的人群，可专门以肝障碍的预防(肝机能低下抑制)或治疗(肝机能向上)为目的而使用。
图I为实施例2中B6N-NASH模型小鼠的肝脏病理检查写真(马松三色法染色)。
具体实施例方式以下，通过制备例和实施例对本发明进行更详细的说明。但是，这些实施例不构成对本发明的任何限定。实施例I制备例多肽的合成通过所定的液相法合成了氨基酸序列(I)WTQR(Trp-Thr-Gln-Arg)，氨基酸序列
(2)ASLDK(Ala-Ser-Leu-Asp-Lys),氛基酸序列(3)FAK(Phe-Ala-Lys),氛基酸序列(4)TSKY(Thr-Ser-Lys-Tyr),氨基酸序列(5) SDGLKH(Ser-Asp-Gly-Leu-Lys-His)所不的 5 种肽(委托Shanghai C-Strong公司(上海，中国)制备)。用液相自动Edman降解法(装置美国应用生物系统公司(7 7° 9 4 F' 才'> 7 f A文' )制Procise HT, ProteinSequencing System)对得到的肽进行了氨基酸序列分析,确认了其为由上述氨基酸序列构成的肽。实施例2 B6N-NASH小鼠中肽的肝脂肪积累以及肝纤维化的抑制効果NASH前期以脂肪化，后期以炎症及纤维化的多阶段地病情不断发展。肝纤维化的动物模型有若干报道，但是与人的病况类似的动物模型很少。采用最近作为人NASH肝纤维化模型而开发的B6N-NASH模型小鼠，研究了肽WTQR，肽ASLDK对肝脂肪积累及肝纤维化的作用。具体而言，从日本查尔斯河株式会社(日本f Y — · -J 〃'一社)购入，对出生后2日龄的B6N-NASH小鼠投与N-乙酰-β -D-氨基葡萄糖苷酶阻碍剂，并从4周龄开始供给高脂肪食物(”寸一 f夕' 4工'> 卜社制，商品名D12492)而饲养的6周龄动物，经过I周的预备饲养后用于试验(病态群)。另外，从同一公司购入未投予N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶阻碍剂的6周龄B6N-NASH小鼠作为正常群，经过I周的预备饲养后用于试验。将病态群分为3群(病态对照群，WTQR投与群,ASLDK投与群)，向WTQR投与群以50mg/kg体重的肽WTQR投与量，向ASLDK投与群以50mg/kg体重的肽ASLDK投与量，每日10点和16点进行2次反复强制经口投与(投与液量10mL/kg体重)。在正常群和病态对照群中将被验物质替换为水，与上述被验物质投与群进行相同地投与。投与期间，供给高脂肪食物('J寸一 ★夕' 4卜社制，商品名D12492)饲料，饲料和水为自由摄取。投与期间为从7周龄到13周龄的6周间，6周间投与后，在戊巴比妥麻醉下，从下大静脉采血，并摘出肝脏。对于得到的血清，测定了转氨酶活性(AST，ALT)(商品名卜9 > ^ 7 S f —七 CII-r ^卜7 ，和光纯药工业株式会社制)。另外，还测定了肝脏的重量，中性脂肪(商品名卜U 七9 4 F E- f 7卜7 ，和光纯药工业株式会社制)，总胆固醇(商品名口一卜7 ，和光纯药工业株式会社制)，游离脂肪酸(商品名NEFAC- f ^卜7 ，和光纯药工业株式会社制)，过氧化脂质(TBARS)(商品名0ΧΙ_ΤΕΚTBARS Assay Kit，ALEXIS 制)，以及还原型谷胱甘肽(GSH)(商品名BI0XYTECH GSH-400，Oxis Res制)。作为病理检查，将摘出的肝脏经福尔马林固定后，根据常规方法，通过马松三色法进行染色观察了纤维化程度(图I)。另外，通过实时(real time)PCR法测定了肝中的纤维化亢进基因Tgfbl的表达量。表I
~JE常群病态对照群 _ jvyTQRia^^Onig/kglASLDK投与群(50mg/kg)
mean ± SEM % mean 土 SEM % mean 土 SEM % mean 土 SEM %
65" 45~
"1 (g)~27.7 土 0.6 135 20.5 土 U 100" 20.3 士 0.7 99 21.3 土 1.1 104
血清 |AST(IU/L)18 db 0 * 34 ~53 =fc 7 100 43 士 iO 81 35 ± 3 66
_ALT(IU/L·)6 土 0 *24 土 3 100 ~21 土 5 ~88 16 ± 2 * 67
肝重量(mg)~0.93 ± 0,02 * 59 1.5S ± 0.03 100 ■ 1.41 士 0,02 * 89 1.4 ± 0.05 89
中性脂肪(mg/head)32 士 2* ~ 175 土 9100 Π8 士 12 * 67 110 士 8 * 63
总胆固醇(mg/hcad) 一 4A 土 0,1 * 47 9.4 士 0.5 100" 7.1 土 0.4 76 6.6 士 0.2 * 70
—龠脂肪酸(mg^icad)2.1 土 0.1 * 30 7Λ ± 0:4100—" 08T76 ~ 4.8 土 0.3 *"~68
TBARS_(nmoles/head) 133 士 3 * 59 225 ^ 10 100 216 ± 18 96 205 ± 12 91
GSH(mg/head)84 土 6 * H "~204~ ± f lOQ~6 士 10 76 167 ± 9 * 82
纤维化(病理检查)(grade)—0.00 士 0,000,60 士 0,24 0.25 士 0.25 0.20 ± 0.20
flWMS因表达量(相对表达量)丨 0.31 ± 0.13 * j 1.00 土 CUf ° 0.26 丨 0,55 士 0.14 *+ρ < O. I，*ρ < O. 05 (相对于病态对照群)如表I所示，肽WTQR，肽ASLDK抑制了血清转氨酶活性的上升。另外，这些肽还抑制了肝脂质的中性脂肪，总胆固醇，游离脂肪酸的积累。此外，肝TBARS，GSH等被抑制表明肝脏中氧化被抑制，进而，与氧化应急导致的炎症得到抑制相关。在纤维化上，纤维化亢进基因Tgfbl的表达量被抑制，病理检查也证明了纤维化被抑制。从以上可知，肽WTQR，肽ASLDK具有抑制NASH前期产生的肝脂肪积累的作用，同时还具有防止后期发生的纤维化的作用。实施例3 RAW264细胞的LPS诱发的炎症性细胞因子产生的抑制効果
以为细胞内毒素的脂多糖(LPS)刺激小鼠由来的巨噬细胞RAW264细胞，使其引发炎症，研究了所产生的各种炎症性细胞因子的产生量。具体而言，将悬浊于10% FBS-DMEM培养基中的小鼠由来巨噬细胞RAW264细胞以5X IO4个/孔接种于24孔板中。接种24小时后作为被验物质添加表2所记载的各单独的肽(最终浓度O. 5mg/mL) ,Peptide mix I (所含各肽的最终浓度均为O. 3mg/mL),或者Peptide mix II (所含各肽的最终浓度均为O. 12mg/mL)，接种48小时后添加LPS (最终浓度 100ng/mL)。前述的 Peptide mix I 为肽 WTQR 以及 ASLDK 混合而成,Peptide mix II 为肽 WTQR，ASLDK, FAK, TSKY,以及 SDGLKH 混合而成。添加LPS的24小时后采取培养上清，通过ELISA法测定了上清中的TNF- α，MIP-2，IL-6以及IL-IO (表2)。使用的试剂盒为，商品名为> O TNF-α - 々7的ELISA试剂盒(日本W <公司制)，商品名=Mouse MIP-2ELISA kit (Ray Bio制)，商品名Murine IL-6 ELISA KIT (GEN-PROBE 制)，商品名Murine IL-10ELISA KIT (GEN-PROBE制)。表权利要求
1.一种由序列(I)WTQR所示的氨基酸序列形成的肽。
2.一种含有根据权利要求I所述的肽的组合物。
3.根据权利要求2所述的组合物，其还含有由选自下列中的任意至少一个氨基酸序列形成的肽序列(2)ASLDK，序列(3)FAK，序列(4)TSKY，以及序列(5)SDGLKH。
4.根据权利要求2或3所述的组合物，其为食品或医药组合物。
5.根据权利要求I所述的肽在制造肝障碍的预防或治疗用组合物上的用途。
6.根据权利要求5所述的用途，所述肝障碍为非酒精性脂肪性肝疾病；非酒精性脂肪肝炎；或者由肝炎病毒，酒精，压力，药剂或免疫异常引起的肝障碍。
7.根据权利要求5或6所述的用途，所述肝障碍的预防或治疗用组合物为食品或医药组合物。
8.根据权利要求2-4中的任意一项权利要求所述的组合物，在肝障碍的预防或治疗用组合物的制造上的用途。
9.根据权利要求8所述的用途，所述肝障碍为非酒精性脂肪性肝疾病；非酒精性脂肪肝炎；或者由肝炎病毒，酒精，压力，药剂或免疫异常引起的肝障碍。
10.根据权利要求8或9所述的用途，所述肝障碍的预防或治疗用组合物为食品或医药组合物。
全文摘要
本发明提供一种对肝障碍可发挥预防效果或治疗效果的包括医药品和食品的肝障碍改善用肽及其组合物，所述肝障碍尤其为非酒精性脂肪性肝疾病(NAFLD)；非酒精性脂肪肝炎(NASH)；或者由肝炎病毒，酒精，压力，药剂或免疫异常引起的肝障碍。
文档编号C07K5/117GK102807602SQ20111019366
公开日2012年12月5日 申请日期2011年7月6日 优先权日2011年6月3日
发明者香川恭一, 福滨千津子, 笹川由香 申请人:香川恭一