专利名称：一种从蔓越橘中提取分离锦葵花素-3-o-葡萄糖苷的方法
技术领域：
本发明涉及一种从北美蔓越橘中提取分离锦葵花素-3-0-葡萄糖苷的方法，特别是一种通过大孔吸附树脂柱层析技术粗分，再过聚酰胺粉末柱进行分离纯化的方法，分离花青素单体成分等天然活性成分的方法。
背景技术：
蔓越橘是小果类果树品种之一，属杜鹃花科越橘属。果实为鲜红色，果酸而脆。原产于北美，集中于美国的马萨诸塞州。与沙棘、野蔷薇、桑椹、悬钩子等野生灌木果类并称第三代水果，其果体虽小，但维生素、氨基酸及微量元素含量很高。蔓越橘因其保健功效和医疗价值，在发达国家很受重视，在法国、美国、日本、德国、瑞士等国销量都很大，且呈上升趋势。我国也在发展这些果品，需求量也在逐年增长。花青素(Anthocyanidins)属酚类化合物中的类黄酮类，是一种水溶性色素，广泛存在于植物花瓣、果实的组织中及茎叶的表面细胞与下表皮层。其色泽随PH不同而改变，由此赋予了自然界许多植物明亮而鲜艳的颜色。在自然状态下，花青素在植物体内常与各种单糖结合形成糖苷，称为花色苷(Anthocyanin)，该命名是由Marguart (185 命名矢车菊花朵中的蓝色提取物时提出来的，现在作为同类物质的总称。现有资料表明花青素有二十余种，在植物中常见的有六种，即天竺葵色素O^g)、矢车菊色素(Cy)、飞燕草色素 (Dp)、芍药色素(Pn)、牵牛花色素(Pt)和锦葵色素(My)。有机溶剂萃取法是目前国内外最广泛使用的提取花青素素的方法。多数选择甲醇、乙酮、丙酮等混合溶剂对材料进行溶解过滤，通过调节溶液酸碱度萃取滤液中的花青素。国内吴信子等用盐酸一甲醇溶液提取。目前，有机溶剂萃取法已成功地应用于诸如葡萄皮、桑椹、蓝莓等绝大多数含花青素物质的提取分离。有机溶剂萃取法的关键是选择有效溶剂，要求既要对被提取的有效成分有较大溶解度，又要避免大量杂质的溶解。该方法原理简单，对设备求较低，不足之处是大多数有机溶剂毒副作用大且产物提取率低。近些年来，国外对于蔓越橘的研究大多集中在其果汁的药理作用研究上，研究证实蔓越橘抑制细菌黏附的活性，可以在很大程度上预防尿路感染发生，体外实验证实蔓越橘汁可以抑制LDL的氧化修饰，促进心血管健康，并能有效地清除自由基、延缓衰老，具有抗肿瘤的功效；但体外的抗氧化和抗肿瘤作用是否能在体内发挥实效还需要临床试验验证。国内方面，凡建礼等公开了一种蔓越橘果实中花色苷和原花青素类成分的提取方法，方法采用酶解提取，大孔树脂吸附醇洗脱的技术，得到花色苷和原花青素类成分的混合物并未明确其中花色苷成分的含量，更未提及其中是否含有锦葵花素-3-0-葡萄糖苷以及含量。
发明内容
本发明的目的是提供一种从北美蔓越橘中提取分离锦葵花素-3-0-葡萄糖苷的方法。本发明的技术方案概述如下
一种从北美蔓越橘中提取分离锦葵花素-3-0-葡萄糖苷的方法，包括如下步骤 (1)将蔓越橘冻果解冻，以原料重量6 8倍纯化水或乙醇水溶液，热回流提取3次， 每次1小时；
(2)三次提取液合并，真空浓缩，回收乙醇，得到蔓越橘提取药液；
(3)提取药液过吸附型大孔树脂层析柱，用去离子水冲洗，用30 95%(体积分数)乙醇水溶液洗脱，收集洗脱液，真空浓缩至无醇；
(4)上述液体过60 100目聚酰胺粉末层析柱，用去离子水冲洗，分别用30 60%(体积分数)和60 95% (体积分数)的乙醇水溶液洗脱，分别收集洗脱液，
(5)两部分洗脱液分别真空浓缩至糖度40°，浓缩膏喷雾干燥，即得本品组分III。所述蔓越橘为自原产地采摘后，立即采用速冻技术制成的冻果。所述步骤(1)提取用的乙醇水溶液中乙醇的体积分数优选为40 60%。所述步骤(3)吸附型大孔树脂优选为AB-8型、HP-20、HPD-300、XAD-6型树脂。所述步骤(3)用于洗脱的乙醇水溶液体积分数优选为50 70%，其用量优选为 2 4倍柱体积。所述步骤(4)用于洗脱组分I的乙醇水溶液的体积分数优选为30 40%，其用量优选为1 2倍柱体积。所述步骤(4)用于洗脱组分II的乙醇水溶液的体积分数优选为60 70%，其用量优选为1 3倍柱体积。本发明的优点是
1、本发明提供了一种提取分离锦葵花素-3-0-葡萄糖苷的新的植物来源和提取分离方法；
2、本发明采用大孔树脂柱层析技术粗分花色素类物质，继而通过聚酰胺粉末柱层析技术分离其中的锦葵花素-3-0-葡萄糖苷组分，使其含量得到进一步的提高，整个工艺过程中只用到纯化水和乙醇，不使用任何有机溶剂或酸碱，制得提取物不存在有机溶剂残留问题，制备过程本身不污染环境；
3、依照本发明制备的提取物锦葵花素-3-0-葡萄糖苷含量最高可达30%。
图1为锦葵花素-3-0-葡萄糖苷标准品的HPLC图谱。图2为蔓越橘提取物组分II的HPLC图谱。
具体实施例方式本发明采用的原料选用蔓越橘为自原产地采摘后，立即采用速冻技术制成的冻果，要求原料外观光洁，色泽鲜艳，无霉变。各实施例用高效液相法分析样品中锦葵花素-3-0-葡萄糖苷的含量，步骤为采用高效液相色谱法，色谱条件为采用十八烷基化学键和固定相为填充剂，即ODS C18柱，规格为250mm 4. 6mm ；紫外检测波长为528nm，温度为30°C，流动相为A:0. 5%醋酸水溶液，B:水乙腈醋酸=50:48. 5:1.5，流速为lml/min，以梯度程序洗脱。实施例1
(1)将蔓越橘冻果解冻，以原料重量8倍纯化水热回流提取3次，每次1小时；
(2)三次提取液合并，得到蔓越橘提取药液；
(3)提取药液过AB-8型大孔树脂层析柱，用去离子水冲洗，用2.5倍柱体积50% (体积分数)乙醇水溶液洗脱，收集洗脱液，真空浓缩至无醇；
(4)上述液体过60 100目聚酰胺粉末层析柱，用去离子水冲洗，先用2倍柱体积30% (体积分数)的乙醇水溶液洗脱得到组分I洗脱液，再用3倍柱体积60% (体积分数)的乙醇水溶液洗脱得到组分II洗脱液，分别收集各自洗脱液；
(5)两部分洗脱液分别真空浓缩至糖度40°，浓缩膏喷雾干燥，即得 本品组分I锦葵花素-3-0-葡萄糖苷含量1. 34%，
本品组分II锦葵花素-3-0-葡萄糖苷含量19. 83%。实施例2
(1)将蔓越橘冻果解冻，以原料重量8倍纯化水热回流提取3次，每次1小时；
(2)三次提取液合并，得到蔓越橘提取药液；
(3)提取药液过HP-20型大孔树脂层析柱，用去离子水冲洗，用2倍柱体积60%(体积分数)乙醇水溶液洗脱，收集洗脱液，真空浓缩至无醇；
(4)上述液体过60 100目聚酰胺粉末层析柱，用去离子水冲洗，先用1倍柱体积40% (体积分数)的乙醇水溶液洗脱得到组分I洗脱液，再用2倍柱体积65% (体积分数)的乙醇水溶液洗脱得到组分II洗脱液，分别收集各自洗脱液；
(5)两部分洗脱液分别真空浓缩至糖度40°，浓缩膏喷雾干燥，即得 本品组分I锦葵花素-3-0-葡萄糖苷含量4. 93%，
本品组分II锦葵花素-3-0-葡萄糖苷含量23. 97%。实施例3
(1)将蔓越橘冻果解冻，以原料重量6倍40%乙醇热回流提取3次，每次1小时；
(2)三次提取液合并真空浓缩至无醇，得到蔓越橘提取药液；
(3)提取药液过HPD-300型大孔树脂层析柱，用去离子水冲洗，用2倍柱体积70%(体积分数)乙醇水溶液洗脱，收集洗脱液，真空浓缩至无醇；
(4)上述液体过60 100目聚酰胺粉末层析柱，用去离子水冲洗，先用2倍柱体积35% (体积分数)的乙醇水溶液洗脱得到组分I洗脱液，再用3倍柱体积70% (体积分数)的乙醇水溶液洗脱得到组分II洗脱液，分别收集各自洗脱液；
(5)两部分洗脱液分别真空浓缩至糖度40°，浓缩膏喷雾干燥，即得 本品组分I锦葵花素-3-0-葡萄糖苷含量3. 37%，
本品组分II锦葵花素-3-0-葡萄糖苷含量30. 55%。实施例4
(1)将蔓越橘冻果解冻，以原料重量6倍50%乙醇热回流提取3次，每次1小时；
(2)三次提取液合并真空浓缩至无醇，得到蔓越橘提取药液；
(3)提取药液过XAD-6型大孔树脂层析柱，用去离子水冲洗，用2倍柱体积50%(体积分数)乙醇水溶液洗脱，收集洗脱液，真空浓缩至无醇；(4)上述液体过60 100目聚酰胺粉末层析柱，用去离子水冲洗，先用2倍柱体积40% (体积分数)的乙醇水溶液洗脱得到组分I洗脱液，再用3倍柱体积60% (体积分数)的乙醇水溶液洗脱得到组分II洗脱液，分别收集各自洗脱液；
(5)两部分洗脱液分别真空浓缩至糖度40°，浓缩膏喷雾干燥，即得
本品组分I锦葵花素-3-0-葡萄糖苷含量10. 12%，
本品组分II锦葵花素-3-0-葡萄糖苷含量33. 07%。
实施例5
(1)将蔓越橘冻果解冻，以原料重量6倍60%乙醇热回流提取3次，每次1小时；
(2)三次提取液合并真空浓缩至无醇，得到蔓越橘提取药液；
(3)提取药液过AB-8型大孔树脂层析柱，用去离子水冲洗，用3倍柱体积60%(体积分数)乙醇水溶液洗脱，收集洗脱液，真空浓缩至无醇；
(4)上述液体过60 100目聚酰胺粉末层析柱，用去离子水冲洗，先用2倍柱体积40% (体积分数)的乙醇水溶液洗脱得到组分I洗脱液，再用3倍柱体积70% (体积分数)的乙醇水溶液洗脱得到组分II洗脱液，分别收集各自洗脱液；
(5)两部分洗脱液分别真空浓缩至糖度40°，浓缩膏喷雾干燥，即得
本品组分I锦葵花素-3-0-葡萄糖苷含量9. 84%，
本品组分II锦葵花素-3-0-葡萄糖苷含量28. 37%。
权利要求
1.一种从北美蔓越橘中提取分离锦葵花素-3-0-葡萄糖苷的方法，其特征是包括如下步骤(1)将蔓越橘冻果解冻，以原料重量6 8倍纯化水或乙醇水溶液，热回流提取3次， 每次1小时；(2)三次提取液合并，真空浓缩，回收乙醇，得到蔓越橘提取药液；(3)提取药液过吸附型大孔树脂层析柱，用去离子水冲洗，用30 95%(体积分数)乙醇水溶液洗脱，收集洗脱液，真空浓缩至无醇；(4)上述液体过60 100目聚酰胺粉末层析柱，用去离子水冲洗，分别用30 60%(体积分数)和60 95% (体积分数)的乙醇水溶液洗脱，分别收集洗脱液；(5)两部分洗脱液分别真空浓缩至糖度40°，浓缩膏喷雾干燥，即得本品组分III。
2.根据权利要求1所述的一种从北美蔓越橘中提取分离锦葵花素-3-0-葡萄糖苷的方法，其特征是所述蔓越橘为自原产地采摘后，立即采用速冻技术制成的冻果。
3.根据权利要求1所述的一种从北美蔓越橘中提取分离锦葵花素-3-0-葡萄糖苷的方法，其特征是所述步骤(1)提取用的乙醇水溶液中乙醇的体积分数为40 60%。
4.根据权利要求1所述的一种从北美蔓越橘中提取分离锦葵花素-3-0-葡萄糖苷的方法，其特征是所述步骤(3)吸附型大孔树脂为AB-8型、HP-20、HPD-300、XAD-6型树脂。
5.根据权利要求1所述的一种从北美蔓越橘中提取分离锦葵花素-3-0-葡萄糖苷的方法，其特征是所述步骤(3)用于洗脱的乙醇水溶液体积分数为50 70%，其用量为2 4 倍柱体积。
6.根据权利要求1所述的一种从北美蔓越橘中提取分离锦葵花素-3-0-葡萄糖苷的方法，其特征是所述步骤(4)用于洗脱组分I的乙醇水溶液的体积分数为30 40%，其用量为 1 2倍柱体积。
7.根据权利要求1所述的一种从北美蔓越橘中提取分离锦葵花素-3-0-葡萄糖苷的方法，其特征是所述步骤(4)用于洗脱组分II的乙醇水溶液的体积分数为60 70%，其用量为 1 3倍柱体积。
全文摘要
本发明公开了一种从北美蔓越橘中提取分离锦葵花素-3-O-葡萄糖苷的方法，步骤为将蔓越橘冻果解冻,以纯化水或乙醇水溶液热回流提取3次，每次1小时。提取液回收乙醇后,过吸附型大孔树脂层析柱进行富集；再过聚酰胺粉末柱进行纯化分离，获得的组分喷雾干燥即得本品。本发明采用树脂层析法,利用可以吸附酚类化合物的吸附材料,分离提纯蔓越橘果实中的锦葵花素-3-O-葡萄糖苷,同时也得到了其中所包含的多酚和原花青素等成分。
文档编号C07H17/065GK102336794SQ201110285559
公开日2012年2月1日 申请日期2011年9月23日 优先权日2011年9月23日
发明者孙华庚 申请人:天津市尖峰天然产物研究开发有限公司