专利名称：利用晚期胚胎发生丰富蛋白及其编码基因培育抗旱转基因棉花的制作方法
技术领域：
本发明属农作物的生物工程育种领域，具体说，涉及晚期胚胎发生丰富蛋白(LEA)及其编码基因在培育抗旱转基因棉花中的应用。
背景技术：
水资源短缺是目前公认的全球性环境焦 点问题之一。据1950-1999年统计，我国平均每年受旱面积达2173. 33万hm2，成灾面积893. 33万hm2，直接减收粮食100亿kg以上，约占各种自然灾害造成粮食损失的60 %。干旱不仅造成农业的重大损失，还加剧了生态环境的恶化及土地沙漠化和水土流失。面对我国人口不断增长、耕地和水肥资源日益减少、环境状况急剧恶化、粮食供需矛盾日益尖锐的严峻现实，如何通过提高作物的抗旱能力和水分利用效率来增加粮食产量、节约资源和改善环境，已成为我国农业持续高效发展的重大需求。基因工程的迅速发展与完善，为人类进一步改良作物的抗逆性、提高资源利用效率提供了新的策略和强有力的工具。近年来，该领域的研究已引起国内外学者广泛的兴趣和重视，在拟南芥、水稻、小麦等许多植物克隆了干旱胁迫应答基因，对其表达调控和编码蛋白的功能进行了研究，并通过基因工程技术分子改良水稻、玉米、马铃薯等农作物而取得显著进展。很多水分胁迫诱导的基因产物具有保护细胞结构免受失水造成伤害的功能(Bray, 1993) 0这种推测的依据是蛋白质的氨基酸序列及其基因表达的特性。其中，晚期胚胎发生丰富蛋白(Late Embryogenesis Abundant Protein, LEA)基因是第一个鉴定的在种子成熟和发育阶段表达的基因，这些基因也在因受到干旱、低温和盐溃等环境胁迫而脱水的营养组织中表达。目前，至少发现了 6组这样的基因，称为LEA基因。推测LEA蛋白可能有以下三方面的作用①作为脱水保护剂。由于LEA蛋白在结构上富含不带电荷的亲水氨基酸，它们既能像脯氨酸那样，通过与细胞内的其它蛋白发生相互作用，使其结构保持稳定，又可能给细胞内的束缚水提供了一个结合的衬质，从而使细胞结构在脱水中不致遭受更大的破坏；②作为一种调节蛋白而参与植物渗透调节；③通过与核酸结合而调节细胞内其它基因的表达。LEA基因及其表达产物在植物耐干旱、耐盐胁迫方面具有可观的应用前景。Xu (1996)将来自大麦的LEA基因HVAl导入水稻，在水稻启动子Actl基因的调控下，大麦HVAl基因得到高水平的表达，在胁迫条件下转基因水稻与非转基因水稻相比，明显具有较高的生长速率。这个研究表明，在水分亏缺和盐分胁迫下，LEA蛋白在植物保护中发挥重要作用。Jai等(2002)将大麦的HAVl基因转移入水稻，结果转基因的水稻叶片中积累高水平的LEA3蛋白，从而显著提高转基因品系干旱和盐胁迫耐受性。Byong等(2005)第一次将来自油菜LEA基因转移入中国卷心菜，转基因卷心菜在受胁迫时损伤症状显著延迟，而且盐胁迫和干旱胁迫条件下转基因植株具有增强的生长能力，表明转LEA基因增强了植物对盐和干旱的耐受性。Wang等(2006)从紫杆柽柳中克隆到一个新的LEA基因(DQ663481)，转基因烟草实验表明其丙二醛(MDA)含量和相对电导率在干旱胁迫条件下显著地更低，推测该基因通过保护细胞膜免受损伤从而提高了植物对干旱胁迫耐受性。棉花是我国重要的经济作物。在棉花主栽区，干旱和土壤盐溃化是影响棉花产量的主要因素。在严重干旱情况下，棉花会出现生长缓慢以及落蕾落铃等现象，从而严重影响棉花的生产。随着我国淡水资源的逐年匮乏和气候变暖，采用转基因技术培育耐旱棉花具有重要的战略意义。目前，棉花的转基因工作主要集中在抗鳞翅目昆虫方面，抗虫棉已在国内外大面积推广。而采用转基因技术创制耐旱棉花的工作在国内外尚处起步阶段。迄今 国内外仅见几例获得耐旱性提高转基因棉花的报道，包括“New protein, being a proteincomposed of amino acid sequences, useful for culturing a plant with improvedanti-drought capability”(专利申请号CN101481410_A) ,Generation of plant withimproved drought tolerance”(专利申请号US7968768B2)一种利用聚合抗逆基因提高棉花耐盐抗旱性的方法”(专利申请号CN 101624604A)等，其实用价值尚有待考证；但利用晚期胚胎发生丰富蛋白(LEA)及其编码基因培育抗旱转基因棉花尚未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供晚期胚胎发生丰富蛋白(LEA)及其编码基因在培育抗旱转基因棉花中的应用。所述晚期胚胎发生丰富蛋白(LEA)的氨基酸序列如Genebank号ABG54481所示；所述编码基因的核苷酸序列如Genebank号DQ663481所示；将LEA基因重组到一个植物表达载体中，转化入棉花细胞并让其表达，获得转基因植株，从转基因植株及其后代中筛选出稳定遗传的T3代植株，培育出棉花抗旱育种新种质，进而创建出棉花抗旱育种新材料，以用于棉花的常规品种或杂交品种培育。本发明所述的一种利用晚期胚胎发生丰富蛋白及其编码基因在培育抗旱转基因棉花中的应用，其特征在于按下列步骤进行a、将晚期胚胎发生丰富蛋白基因通过常规分子生物学方法插入到植物转基因表达载体中，并通过花粉管通道法导入到棉花受体材料中，获得转基因植株；b、通过大田卡那霉素检测和室内分子检测，经过继代培养并每代进行严格的阳性植株筛选，直至获得稳定遗传的T3代转基因植株；C、转基因抗旱材料的抗逆性鉴定和利用，根据目的基因过表达的生理作用，进行相应的生理生化指标检测，并通过盆栽试验和大田抗逆性测定试验，筛选出抗旱性能明显提高的转基因育种材料，获得的优异材料用于棉花育种或生产实践。所述晚期胚胎发生丰富蛋白的氨基酸序列如Genebank号ABG54481所示。所述晚期胚胎发生丰富蛋白编码基因的核苷酸序列如Genebank号DQ663481所
/Jn o所述用于遗传转化的棉花品种为早熟棉新陆早18号。本发明对转基因植株进行筛选，从抗性植株及其后代中筛选出转基因T3代植株的方法是通过对3-4叶期转基因棉花叶片涂抹卡那霉素(5g/L)检测转基因植株，对筛选出的阳性植株利用常规的分子检测技术进行进一步验证，获得稳定转化的转基因植株T1代；次年，将收获的T1代种子进行大田种植，重复上述步骤，直至获得稳定转化的T3代转基因植株。
所述获得的转基因T3代植株耐旱性鉴定方法是采用生理生化指标和盆栽鉴定相结合的策略，筛选出耐旱能力明显提高的株系，从中选择优异材料培育棉花耐旱新种质。本发明所述获得的转基因棉花为转LEA基因陆地棉新陆早18号棉花T3代转基因植株。本发明的实验证明与野生型和转空载体植株相比，转LEA基因棉花的抗旱性得至IJ增强。本发明获得的转基因植株可直接应用于棉花的常规品种或杂交品种培育。本发明的基本思路是依据植物抗逆生理和植物抗逆基因工程研究的新进展，利用从本土抗逆植物紫杆柽柳中克隆的、与抗逆性密切相关的晚期胚胎发生丰富蛋白(LEA)基因，采用转基因技术，将能够显著提高植物细胞中抗旱特性的LEA基因导入棉花品种中，实现该基因的过表达，从而大幅度提高植株的耐旱性。转基因棉花采用花粉管通道法，转基因植株用PCR检测、RT-PCR验证；外源基因表达研究采用实时荧光定量PCR方法。植株抗逆 性采用植物生理学和作物栽培学方法，其中转基因植株抗旱性测定采用水培试验-生理指标测定，同时结合盆栽试验进行验证。在棉花的遗传转化中，以我国新疆地区主载的陆地棉品种新陆早18号为受体材料，采用花粉管通道法进行转化。采用夏季在新疆育种，冬季到海南加代的方法，一年可继代育种2次，直至获得稳定遗传的转基因T3代植株。转基因遗传稳定性测定采用经典的遗传学方法，结合于PCR检测。本发明实施的具体步骤为将LEA基因通过常规分子生物学方法插入到植物转基因表达载体中，并通过花粉管通道法导入到棉花受体材料中，获得转基因植株。通过大田卡那霉素检测和室内分子检测，经过继代培养并每代进行严格的阳性植株筛选，直至获得稳定遗传的T3代转基因植株。转基因抗旱材料的抗逆性鉴定和利用，根据目的基因过表达的生理作用，进行相应的生理生化指标检测，并通过盆栽试验和大田抗逆性测定试验，筛选出抗旱性能明显提高的转基因育种材料，获得的优异材料用于棉花育种或生产实践。
图I为本发明pROKII-LEA植物表达载体构建示意图。图2 为本发明 pROKII-LEA 质粒 PCR 电泳图。其中 M DNA marker ；Lanel,2 pROKII-Lea质粒；A为LEA基因特异引物PCR电泳图，B为载体引物PCR电泳图。图3为本发明转基因棉花的RT-PCR电泳图。其中Lane M DL2000marker ；Lane2,4，6，7 :转基因棉花阳性植株；Lane 3,5 :转基因棉花阴性植株；Lane8 :pR0KII-Lea质粒。图4为本发明12% (w/v)PEG-6000模拟干旱处理12小时后LEA基因实时荧光定量PCR图。WT :转空载体样品，即对照；L1，L2，L3 :转基因植株干旱处理前样品；dLl，dL2，dL3 :转基因植株干旱处理12小时后样品。图5为本发明12% (w/v)PEG-6000模拟干旱处理12小时后棉花生长图。从左至右分别为WT，LI，L2，L3.图6为本发明12% (w/v)PEG-6000模拟干旱处理12小时后棉花叶片丙二醛(MDA)含量。
图7为本发明12% (w/v)PEG-6000模拟干旱处理12小时后棉花叶片游离脯氨酸含量。图8为本发明12% (w/v)PEG-6000模拟干旱处理12小时后棉花叶片可溶性糖含量。图9为本发明12% (w/v)PEG-6000模拟干旱处理12小时后棉花叶片可溶性蛋白含量。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。 下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。实施例(抗旱转基因棉花创制)I、植物表达载体的构建LEA基因克隆自紫杆柽柳(Tamarix androssowii),由东北林业大学王玉成博士馈赠。紫杆柽柳LEA基因的核苷酸序列如Genebank号DQ663481所示，基因序列为lgcacgaggcc tcgtgccgaa ttcggcacga ggattcattc ttcaaagaaagtgggaatca6lgagagagaaa gagagagcgg tagtccaccc tatctgtgct cctgtattgccgacgaacag121aacctcggtt cagaaattaa ctttggaaaa ggagaaaatg gctcgctgctcttactctaa181tgctaagctc gtctctaccc tcgtcgtcga caatctctcc cttgctctctccaggaggag241ttacgcgcaa ggcatggtga tgtccaactc cagcaacgtc atgcgaagagcaggcggtag301taataatgct acatctacca ccccaaacga tgagaattca tgggtgccggatcctgttac361cggttactac aggccggcta atcatgccga tgacgtcgac gtcgctgagcttcgtgagat421gcttctgact accagcaatg cgaacaagtt caatcgatcc tctcactgaatgatttgaat481tttgattttg aggcggtggg aaaccatggc tgattgggtt ttgttccatatgtgatgccg541cgtgtttcgc cgcctcgtga tttattgctg ttgttgttgt tgttcggatttcggaagttt601tgtacccttg ctagcccggt cctttaattt catgcggttt gcgtgtatttttatcagatt661caacttcgag ttgaagaaaa aaaaa其中，158至469碱基序列为开放阅读框ORF ；由该基因编码的紫杆柽柳晚期胚胎发生丰富蛋白(LEA)氨基酸如Genebank号ABG54481所示，其氨基酸序列为MARCSYSNAKLVSTLVVDNLSLALSRRSYAQGMVMSNSSNVMRRAGGSNNATSTTPNDENSWVPDPVTGY YRPANHADDVDVAELREMLLTTSNANKFNRSSHo将上述LEA基因插入含有35S启动子的pROKII植物表达载体中，构建pROKII-LEA植物表达载体，Lea基因的酶切位点Sma I和Sac I。植物表达载体构建过程参见图I。将上述构建的pROKII-LEA表达载体转化大肠杆菌DH5 a，为了验证载体和质粒的可靠性，用了两对引物进行PCR检测及酶切验证。两对引物分别为LEA 基因特异引物(Lea-fj, ccggaatggctcgctgctcttactc-3 1 , Lea~r 5 1 -cccttgttcgcattgctggtagtca-3 ');载体弓丨物(prl 5 ' -gttgcagcaagcggtcc-3 ' , pr2 5' -cgcacatcccactatcc-3'),其中，载体引物跨越35S启动子及Nos终止区域序列,包含载体918bp片段部分；两种引物PCR结果一致(图2A，B)，表明Lea基因确实构建至pROKII载体上，测序表明基因准确连接并成功转化大肠杆菌。2、转基因棉花T3代植株获得用改进的碱裂解法大量提取pROKII-LEA质粒。棉花首次于2009年I月在海南三亚中国农科院棉花基地利用花粉管通道法进行遗传转化，导入量为每朵花0. I i! g质粒DNA，转化的棉花品种为新陆早18号。收获的Ttl代种子于2009年5月在新疆农科院库尔勒棉花实验基地播种，至3片叶期时经田间卡那霉素检测和室内PCR检测的阳性株于2009年10月收获种子，得到T1代种子。同样方法重复冬季在海南加代繁殖(T2代)、夏季在新疆继代繁殖(T3代)，并每代经田间卡那霉素检验，直至收获T3代种子，并于2011年5月在新疆库尔勒棉花实验基地播种，种植至2 3片叶期时，将40株卡那霉素检测阳性的T3代棉花幼苗从库尔勒棉花基地转移至乌鲁木齐中国科学院新疆生态与地理研究所植物逆境生物 学实验室，进行阳性植株检测。首先用5g/L的卡那霉素溶液涂抹叶片同一部位连续涂抹3天以进一步验证大田卡检结果，结果40株中有31株为卡那霉素检测阳性植株。7天后对31株阳性株进行室内分子检测。室内利用改良的CTAB法提取棉花基因组DNA，通过PCR法确定阳性株系。最终获得5株转化阳性苗(见图3)，然后进行Southern和Northern分析，最终选择T3代LEA基因能够转录表达、并单拷贝插入基因组的3个株系，31号、56号、63号，并选择阴性株36号做对照。将棉花重新编号，36号是转pROKII空表达载体的T3代棉花植株，用WT表示；31号、56号、63号植株分别被编号为LI、L2、L3。3、转基因植株的抗旱性检测将上述T3RLl, L2，L3转基因棉花及WT的棉花幼苗小心地从花盆土中挖出，挖取时用细水冲洗细根保证所有细根从土中剥离，使细根不受损伤，然后将从土中取出的棉花幼苗放入直径15cm高30cm的圆柱形培养瓶中液体培养，并用支持板固定植株，培养液为holgland营养液，每周更换一次，充分通气；培养瓶外周用锡箔纸包好，进行遮光处理，将水培棉花放到组培室中进行培养，组培室条件为温度28°C，湿度45%，关照时间14h (光照)/10h (黑暗)，光强 7000Lux(TES1330A Digital Lux Meter)。2周后，待棉花生长稳定，对其进行干旱处理。将棉花放入12% (w/v)的PEG-6000holgland营养液中处理12个小时，分别选取干旱处理前、干旱处理12小时后生长状态一致的同一部位叶片进行如下(I)、(2)的研究(I)转基因植株LEA基因转录水平表达量分析分别提取12% (w/v)PEG-6000处理前、后的棉花叶片总RNA。利用实时荧光定量RT-PCR分析LEA基因转录水平表达量，以检测LEA基因对干旱的响应情况，以18srRNA和UBQ7为实时荧光定量RT-PCR的内参基因；结果如图4所示结果表明，相比较干旱处理前，转基因棉花在模拟干旱处理12小时后LEA基因表达量显著增加3-5倍，说明干旱胁迫诱导LEA基因的表达及积累。(2)转基因植株抗旱性生理指标测定
实验重复3次。①丙二醛(MDA)含量变化丙二醛(MDA)含量变化结果见图6，结果表明干旱胁迫前，WT和转基因棉花MDA含量差别不显著；模拟干旱胁迫12小时后，WT和转基因棉花的丙二醛含量都呈现上升趋势，但WT的丙二醛含量极显著高于转基因棉花；结果表明在干旱胁迫发生的情况下，转LEA基因棉花植株可以显著减少丙二醛的生成量。丙二醛(MDA)是膜脂过氧化的主要产物之一，具有很强的毒性。膜脂过氧化会引起膜中蛋白质聚合、交联以及类脂的变化，使膜上的孔隙变大，通透性增加，离子大量外泄引起细胞代谢紊乱，严重时导致植物受伤或死亡，因此丙二醛含量高低可用以衡量植物在逆境胁迫下生物膜受活性氧伤害的程度，在模拟干旱胁迫试验中，转LEA基因棉花植株可 以有效减少丙二醛的生成量，降低膜脂的氧化程度，保护膜脂的稳定性。因此，转LEA基因棉花有助于在干旱胁迫时保护膜脂稳定，进而保护细胞膜的完整性与稳定性，对于植株正常生命活动的维持发挥重要作用。②游离脯氨酸含量变化结果游离脯氨酸含量变化结果见图7，结果表明干旱胁迫前，WT和转基因棉花游离脯氨酸含量差别不显著；模拟干旱胁迫12小时后，WT和转基因棉花的游离脯氨酸含量都呈现上升趋势，并且转基因植株的增幅为WT的4-7倍，LI的游离脯氨酸含量极显著高于WT，L2的游离脯氨酸含量显著高于WT，L3的游离脯氨酸含量与WT虽然无显著性差异，但是从图中仍可以看出L3的值高于WT，总体结果显示在干旱胁迫发生的情况下，转LEA基因棉花植株可以提高游离脯氨酸的含量。游离脯氨酸是重要的渗透调节物质，植物内脯氨酸含量在一定程度上反映了植物的抗逆性，抗旱性强的品种积累的脯氨酸多。因此测定脯氨酸含量可以作为抗旱性的生理指标。另外，由于脯氨酸亲水性极强，能稳定原生质体及组织内的代谢过程，因而能有效防止细胞脱水的作用。本研究创制的转LEA基因棉花植株在干旱胁迫发生的情况下，可显著提高游离脯氨酸的含量，对于增加棉花的抗旱性能有贡献。这可能与LEA基因可作为一种调节蛋白而参与植物渗透调节的功能有关。③可溶性糖含量变化可溶性糖含量变化结果见图8，结果表明干旱胁迫前，WT和转基因棉花可溶性糖含量差别不显著；模拟干旱胁迫12小时后，WT和转基因棉花的可溶性糖含量都呈现上升趋势，并且转基因植株的增幅为非转基因植株的3倍左右，LI、L2的可溶性糖含量显著高于WT，L3的可溶性糖含量极显著高于WT。总体结果表明在干旱胁迫发生的情况下，转LEA基因棉花植株可以提可溶性糖的含量。在干旱胁迫下，植物通过渗透调节保持细胞内溶质积累，保证组织水势下降时细胞膨压得以维持，细胞内可溶性糖浓度的提高可增强细胞的渗透吸水能力从而增强植物的抗旱性。本研究创制的转LEA基因棉花植株在干旱胁迫发生的情况下，可显著提高可溶性糖含量和生成量，提高植株的抗旱性。④可溶性蛋白含量变化可溶性蛋白含量变化结果见图9，结果表明干旱胁迫前，WT和转基因棉花可溶性蛋白含量差别不显著；模拟干旱胁迫12小时后，WT和转基因棉花的可溶性蛋白含量都呈现上升趋势，并且转基因植株的增幅为非转基因植株的5倍左右，LI、L2、L3的可溶性蛋白含量均显著高于WT。结果表明在干旱胁迫发生的情况下，转LEA基因棉花植株可以提可溶性蛋白的含量。如细胞内可溶性糖一样，在干旱胁迫下，可溶性蛋白浓度的提高可增强细胞的渗透吸水能力从而增强植物的抗旱性。本研究创制的转LEA基因棉花植株在干旱胁迫发生的情况下，可显著提高可溶性蛋白含量和生成量，提高植株的抗旱性。(3)转基因植株生物量及抗旱 性形态指标测定当用12% (w/v)PEG-6000模拟干旱处理水培棉花时，4小时后，WT出现萎蔫现象，6小时后，转基因棉花开始出呈现萎蔫状态。处理12小时后，WT叶片枯萎，有3片叶子卷叶严重，且顶端叶片边缘也出现枯萎迹象。相比较而言，转基因棉花受干旱胁迫影响较小，只有最基部2个叶片表现出枯萎迹象，虽然L3个体比WT小，但它的叶片枯萎程度明显好于WT，顶端叶片边缘也无枯萎迹象(如图5)。可见，在水分胁迫实验中转LEA基因棉花植株表现出更强的抗旱性。12% (w/v)PEG-6000模拟干旱处理12小时后，继续水培棉花45天，holgland营养液每周更换一次，充分通气。至棉花开花前测定它们的生物量指标，如表I所示；测定它们的抗旱性形态指标，如表2所示。表I棉花生物量数据表
植株编号叶干重(g)茎干重(g)根干重(g)总生物量(g)
WT 1.483 0.9740.3542.811LI 2.697 1.8850.7965.378 L2 3.203 2.1550.966.318 L3 1.69 0.990.5863.266表2棉花形态指标数据表
植株编
叶片数株高(cm) 茎直径(cm)主根长(cm)
号
WT13430.74511.9
LI16480.76625.1
L215500.86417.4
L314440.71321.6结果表明转LEA基因棉花与WT相比，其叶片数增多，植株高大，茎直径变大，主根长度增加；烘干后发现，无论是根、茎、叶分营养器官组分还是总生物量，转基因植株的生物量均高于WT。结果表明植物在受到水分胁迫时，转LEA基因棉花的植株生长，地上及地下干物质积累程度都明显优于非转基因棉花。
权利要求
1.一种利用晚期胚胎发生丰富蛋白及其编码基因在培育抗旱转基因棉花中的应用，其特征在于按下列步骤进行 a、将晚期胚胎发生丰富蛋白基因通过常规分子生物学方法插入到植物转基因表达载体中，并通过花粉管通道法导入到棉花受体材料中，获得转基因植株； b、通过大田卡那霉素检测和室内分子检测，经过继代培养并每代进行严格的阳性植株筛选，直至获得稳定遗传的T3代转基因植株； C、转基因抗旱材料的抗逆性鉴定和利用，根据目的基因过表达的生理作用，进行相应的生理生化指标检测，并通过盆栽试验和大田抗逆性测定试验，筛选出抗旱性能明显提高的转基因育种材料，获得的优异材料用于棉花育种或生产实践。
2.根据权利要求I所述的应用，其特征在于所述晚期胚胎发生丰富蛋白的氨基酸序列如 Genebank 号 ABG54481 所不。
3.根据权利要求I所述的应用，其特征在于所述晚期胚胎发生丰富蛋白编码基因的核苷酸序列如Genebank号DQ663481所不。
4.根据权利要求书I所述的应用，其特征在于所述用于遗传转化的棉花品种为早熟棉新陆早18号。
全文摘要
本发明涉及一种晚期胚胎发生丰富蛋白及其编码基因在培育抗旱转基因棉花中的应用。所述晚期胚胎发生丰富蛋白(LEA)的氨基酸序列如Genebank号ABG54481所示；所述编码基因的核苷酸序列如Genebank号DQ663481所示；将LEA基因重组到一个植物表达载体中，转化入棉花细胞并让其表达，获得转基因植株，从转基因植株及其后代中筛选出稳定遗传的T3代植株，培育出棉花抗旱育种新种质，进而创建出棉花抗旱育种新材料，以用于棉花的常规品种或杂交品种培育。
文档编号C07K14/415GK102732552SQ20111039321
公开日2012年10月17日 申请日期2011年12月2日 优先权日2011年12月2日
发明者张道远, 李小双, 杨红兰, 蔡明 , 裴金玲 申请人:中国科学院新疆生态与地理研究所