专利名称：一种通过纤维形成片段来诱导蛋白质形成淀粉样纤维的方法
技术领域：
本发明属于分子生物学和生物化学相关领域，涉及通过将含有纤维形成片段的多肽与目标蛋白融合表达来诱导目标蛋白质形成淀粉样纤维的方法。
背景技术：
蛋白质是具有多种生物学活性的生物大分子，能够执行包括催化，分子识别，抗原，抗体等功能。酶大多数由蛋白质组成。酶的催化效率非常高，如果能够在化工和医学领域广泛应用，将会给相关领域带来非常重要的突破。但是有很多因素限制了酶的广泛使用，其中一个很重要的因素就是酶制备成本高但是稳定性不够高，所以工业成本比较大。
蛋白质工程的一个非常核心的目的就是对蛋白质属性的定向改造，所使用的手段包括通过基因工程的方法改变蛋白质的氨基酸组成成分，通过共价，包埋，吸附等方法来固定化酶，通过共价修饰来改变抗体的属性等等。然而到目前为止还没有找到能够广泛使用的对蛋白质的活性没有影响的固定蛋白质的方法。我们研究发现，将不同的纤维形成片段插入到蛋白质中，蛋白质会表现出多样化的聚集属性，包括聚集的浊度，分散程度和形态。也就是说，可以通过将不同的纤维形成片段插入到蛋白质中，来控制蛋白质的聚集属性。
发明内容
本专利所要解决的技术问题在于提供一种诱导蛋白质形成淀粉样纤维的方法。该方法具体为选择可以独立生长蛋白质淀粉样纤维的多肽序列，即纤维形成片段；用分子克隆的方法将纤维形成片段插入目标蛋白质的柔性结构和溶剂可及区域，然后诱导目标蛋白质形成淀粉样纤维。所述的纤维形成片段包括但不局限于序列为SNQNNF，SSTSAA, GVATVA, SQAIIH,NHVTLS, IFQINS, DFNKFH, NNQQNY, QQQQQQ, STVITE, AAAAAA 的多聚氨基酸片段。所述目标蛋白质包括但不局限于酶，结构蛋白，抗原，抗体在内蛋白质单体。所述目标蛋白质的柔性结构和溶剂可及区域是指目标蛋白质中的折叠或α-螺旋等规则二级结构之间的环状结构区。不同的纤维形成片段具有不同的特征，这些特征包括纤维形成片段的长度，带电性，极性，疏水性，ROSETTADESIGN能量函数值，形成疏水拉链结构的方向。这些特征对蛋白质的聚集属性有非常重要的影响。例如，将来自人溶菌酶的纤维形成片段IFQINS插入到Tau蛋白中之后，蛋白质能够形成很特别的纤维，这些纤维的浊度低，但是纤维所含有的β_折叠结构比较多，纤维的形态规则，在溶液中分散得很好，难以发生沉淀。这种特性的纤维就是非常好的纳米材料。纤维形成片段插入蛋白质的位置也对融合蛋白的纤维特征有着重要的影响。将纤维形成片段插入到蛋白质中的β_折叠或α-螺旋等规则二级结构之间的环状结构区，这样纤维形成片段就可以暴露在蛋白质的外面，使得它们之间的相互作用成为可能。用多肽链将纤维形成片段 和目标蛋白偶联到一起，这种起连接作用的多肽不能具有强烈的形成β_折叠和α-螺旋结构的趋向，从而保证纤维形成片段能够暴露在溶液的外围，有比较多的相互接触，形成疏水拉链结构。蛋白质聚集诱导的方式的选择。不同的蛋白质聚集的溶液条件是不相同的。例如，Tau蛋白需要在肝素、核酸或者其他带负电的分子存在的情况下形成纤维状聚集。本发明的有益效果在于蛋白质淀粉样纤维是一种良好的纳米材料，是有序重复排列的蛋白质分子，它非常稳定，能抗酸，抗碱，抗蛋白酶消化，能稳定存在比较长的时间；淀粉样纤维能够携带其他生物大分子，使之聚集在其表面，形成超级高的局部浓度，有放大酶联反应信号等优势；蛋白质纤维通过分子生物学的方法很容易编辑和构建，也可以方便地与其他具有生物活性的蛋白质偶联在一起；蛋白质纤维的聚集是很容易控制的，如果没有添加适当的诱导剂，蛋白质纤维是不能够形成的。本发明方法是在医学，化工等领域有比较重要的应用前景。
图I为插入IFQINS后Tau蛋白形成的一种长而且弯曲的蛋白质淀粉样纤维。图2为插入GVATVA后Tau蛋白形成的一种长而且分支的蛋白质淀粉样纤维。图3为插入NNQQNY后Tau蛋白形成的一种长而且成束的蛋白质淀粉样纤维。图4为插入QQQQQQ后Tau蛋白形成的一种短的蛋白质淀粉样纤维。
具体实施例方式实施例I :使用IFQINS来使Tau蛋白形成长而且弯曲的蛋白质淀粉样纤维。I、利用分子克隆方法将纤维形成片段IFQINS插入到Tau244_372/ Δ PHF6/ Δ PHF6*的PHF6的位置上。2、蛋白质的表达和纯化将构建好的突变的质粒，加入到200 μ I的BL21感受态细胞中去，冰浴30分钟，42°C热击90秒，加800 μ I LB培养基培养I个小时，涂平板，在37°C条件下培养过夜。次日挑单菌落于5ml含终浓度为100 μ M氨卞青霉素的LB管中在37°C、200转/分钟的震荡速率中活化过夜。接种至2L每瓶体积为250ml含终浓度为100 μ M氨卞青霉素的LB培养基中。于37°C、200转/分钟的转速的摇床中培养至OD6tltl = O. 6-1. 0，加入终浓度为O. 4mM IPTG诱导蛋白表达，同样的条件下培养3小时，12000g离心10分钟，弃上清，收集沉淀为菌体。用80ml的buffer A (含有2mM DTT的50mM磷酸缓冲液pH 6. 8)重悬后，用250W超声波处理30分钟。加入NaCl至终浓度为500mM，沸水煮10分钟。此时，由于Tau蛋白及其突变体具有耐热性，因此仍然存在于溶液中，其他的杂蛋白经过变性，沉淀下来。17000g 4°C离30min,温度为4°C,取上清过滤,装入透析袋中，用磷酸缓冲液(bufferA)在4°C环境下搅拌充分透析过夜，中途换一次透析液。15000g、4°C，离心30min，取上清，过滤，上样至阳离子交换色谱(SP sepharose)。用3 5床体积的buffe A洗去非特异蛋白以及核酸，直到紫外信号稳定在O. 01以下。之后用超过6倍体积的含NaCl梯度(O 400mM)的buffer A洗脱目的蛋白。用SDS-PAGE检测蛋白质纯化情况。收集洗脱峰，用超滤管浓缩蛋白至为5 10mg/ml。再次用缓冲液充分透析后，通过测定214nm紫外吸收来确定Tau蛋白的浓度，分装后于_80°C保存待用。3、用浊度法检测Tau蛋白的聚集过程和分散程度用50mM pH 7. 5Tris_HCl缓冲液配制DTT与heparin储存液，浓度分别为200mM和250 μ Μ。检测体系为500ml体积，Tau蛋白、DTT和heparin的终浓度分别为50 μ M、2mM和2· 5 μ Μ,缓冲液为50mM pH 7. 5Tris_HCl缓冲液。紫外波长为350nm，检测温度为37°C，检测时间为12h。4、用透射电镜法检测纤维的形态配制500 μ I体积的反应体系，其中Tau蛋白、DTT和heparin的终浓度分别为8 μ M、2mM和2. 5 μ Μ。缓冲液为50mM pH 7. 5Tris_HCl缓冲液。于37°C，220转/分钟的摇床中震荡。待纤维长出后，取10μ I滴于铜网上，吸附2分钟，用滤纸将溶液吸干，加8 μ I醋酸双氧铀，染色2分钟。置于滤纸上使其自然干燥，于透射电子显微镜下检测。
实施例2 :使用GVATVA来使Tau蛋白形成长而且分支的蛋白质淀粉样纤维。具体操作办法与方案I的区别仅在于插入的片段是GVATVA。实施例3 :使用NNQQNY来使Tau蛋白形成长而且成束的蛋白质淀粉样纤维。具体操作办法与方案I的区别仅在于插入的片段是NNQQNY。实施例4 :使用QQQQQQ来使Tau蛋白形成短的蛋白质淀粉样纤维。具体操作办法与方案I的区别仅在于插入的片段是QQQQQQ。
权利要求
1.一种诱导蛋白质形成淀粉样纤维的方法，其特征在于选择可以独立生长蛋白质淀粉样纤维的多肽序列，即纤维形成片段；用分子克隆的方法将纤维形成片段插入目标蛋白质的柔性结构和溶剂可及区域，然后诱导目标蛋白质形成淀粉样纤维。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，所述的纤维形成片段包括序列为SNQNNF，SSTSAA, GVATVA, SQAIIH, NHVTLS, IFQINS, DFNKFH, NNQQNY, QQQQQQ, STVITE 或 AAAAAA 的多聚氨基酸片段。
3.根据权利要求I或2所述的方法，其特征在于，所述目标蛋白质包括酶、结构蛋白、抗原或抗体。
4.根据权利要求I或2所述的方法，其特征在于，所述目标蛋白质的柔性结构和溶剂可及区域是目标蛋白质中的折叠或α-螺旋之间的环状结构区。
全文摘要
本专利书公开了一种通过纤维形成片段来诱导蛋白质生长淀粉样纤维的方法。选择可以独立生长蛋白质淀粉样纤维的多肽序列，即纤维形成片段；用分子克隆的方法将纤维形成片段插入目标蛋白质的柔性结构和溶剂可及区域，然后诱导目标蛋白质形成淀粉样纤维。该方法在医学，化工等领域有比较重要的应用前景。
文档编号C07K19/00GK102719468SQ20121019062
公开日2012年10月10日 申请日期2012年6月11日 优先权日2012年6月11日
发明者孟生荣, 朱应竹, 梁毅, 莫重瑛, 郭童, 陈杰 申请人:武汉大学