颗粒溶解素的表达和制备方法

专利名称：颗粒溶解素的表达和制备方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域；更具体地，本发明涉及颗粒溶解素的表达和制备方法。
背景技术：
天然的颗粒溶解素(Granulysin, GNLY) 存在两种形式，即15kDa形式和9kDa形式。目前商业化的颗粒溶解素只有15kDa形式(如ProSpec、Abnova和NovusBiologicals)，而且都含有较大的tag，可能会影响其生活学活性。ー些研究人员克服这个困难，尝试了大肠杆菌、乳酸克鲁维酵母、昆虫细胞进行表达15kDa颗粒溶解素，发现仅昆虫细胞可以表达15kDa颗粒溶解素，但是产量非常低(小于lmg/L)。目前研究中使用的9kDa颗粒溶解素大多来源于大肠杆菌表达系统，蛋白在表达过程中会易于形成包涵体，由于颗粒溶解素的蛋白序列中存在较多的ニ硫键，其在后续复性较为困难；此外，还可以通过体外转录/翻译表达系统和YT细胞脱颗粒提取获得9kDa颗粒溶解素，但是得率非常低。综上所述，目前两种形式的颗粒溶解素的来源仍然非常有限，这可能由于颗粒溶解素蛋白对于宿主具有细胞毒作用，一些真核或病毒表达系统(例如酿酒酵母，昆虫细胞)易于受其毒性制约，导致细胞生长不好，表达效率非常低。经过对各种表达系统的筛选，意外地发现采用毕赤酵母表达系统来表达颗粒溶解素蛋白，不仅表达量非常高，表达稳定，并且蛋白可以获得正确折叠加工，生物活性非常理想。同时，本发明人还优化了蛋白的重组表达エ艺以及优化了蛋白的纯化工艺。

发明内容
本发明的目的在于提供颗粒溶解素的表达和制备方法。在本发明的第一方面，提供一种重组表达颗粒溶解素的方法，所述方法包括(I)提供表达载体，所述的表达载体中含有颗粒溶解素的表达盒；(2)将(I)的表达载体转化毕赤酵母,培养转化有所述表达载体的重组毕赤酵母，从而表达颗粒溶解素。在另ー优选例中，所述的表达载体线性化后转化毕赤酵母。在另ー优选例中，所述的表达盒包括以下操作性连接的元件A0X I启动子，酿酒酵母a-Factor信号肽编码基因，颗粒溶解素，終止子。在另ー优选例中，所述的颗粒溶解素选自全长颗粒溶解素(即15kDa颗粒溶解素)，或在全长颗粒溶解素首尾两端截短的片段；较佳地，所述的首尾两端截短的片段分子量为9kDa (即9kDa颗粒溶解素)。在另ー优选例中，在酿酒酵母a-Factor信号肽编码基因与颗粒溶解素基因之间,还包括蛋白酶酶切位点；或在颗粒溶解素的基因与終止子之间，还包括蛋白纯化标签的编码基因。在另ー优选例中，所述的蛋白酶酶切位点是kex2蛋白酶酶切位点。在另ー优选例中，所述的蛋白纯化标签是HIS标签。
在另ー优选例中，所述的颗粒溶解素的基因具有SEQ ID NO: I或SEQ ID N0:2所示的核苷酸序列。在另ー优选例中，步骤(2)中，表达颗粒溶解素时，调节培养基的pH在3.0-8. 0 ;和/或调节温度为10-32で。在另ー优选例中，表达颗粒溶解素时，调节培养基(包括初始培养基以及表达过程中培养基)的PH在3. 8-5. 5 ;更佳地为4-5。在另ー优选例中，表达颗粒溶解素时，调节温度为23_31°C ;最佳地，调节温度为25-30 °C。在另ー优选例中，步骤(2)中，表达颗粒溶解素时，先以甘油为碳源进行重组毕赤酵母的培养，待重组毕赤酵母湿重超过150g/L(较佳地180g/L)时，加入甲醇进行诱导培养，整个培养过程持续60-100小时(较佳地70-90小时；更佳地80小时)。在另ー优选例中，步骤(2)中，表达颗粒溶解素时，首先使用含有4%(w/v)甘油且PH5的BSM培养基培养重组毕赤酵母菌体，培养温度30°C ;等到溶氧急剧上升时，进行甘油流加(较佳地，流加量是18±3ml/hr/升；更佳地,流加量是18. 15ml/hr/升)，待重组毕赤酵母湿重超过150g/L(较佳地180g/L)时停止流加甘油；随后加入甲醇进行诱导培养。在另ー优选例中，流加的甘油中，每升50%w/v甘油溶液含有12ml的PTM1，PTM1成分为硫酸铜-5H206. 0g，碘化钠0. 08g，硫酸锰-H2O 3. 0g，钥酸钠_2H20 0. 2g，硼酸0. 02g,氯化钴0. 5g，氯化锌20. 0g，硫酸亚铁-7H2065. Og,生物素0. 2g，硫磺酸5. Oml0在另ー优选例中，在颗粒溶解素的表达盒中，所述的颗粒溶解素的基因(5’或3’端)还连接ー纯化标签的编码基因；且，步骤(2)之后，还包括从培养基中分离颗粒溶解素的步骤，包括先采用亲和层析柱(与纯化标签相应的亲和层析柱，例如纯化标签6XHIS对应Ni柱)对培养上清进行纯化；之后采用阳离子交換柱进行纯化。在另ー优选例中，所述的纯化标签是HIS标签(如包含6-12个HIS的标签);所述的亲和层析柱是Ni柱；所述的阳离子交換柱选自(但不限干)阳离子交換柱S、SP、CM、MMC、adhere o在另ー优选例中，所述的阳离子交换柱是CM柱；更佳地，为HiTrap CM FF柱。在另ー优选例中，在亲和层析柱纯化与阳离子交换柱纯化之间，还包括除盐的步骤；较佳地，使用膜过滤系统超滤除盐(例如应用Labscale TFF system和Pellicon XL 50进行除盐)。本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。


图l、9_kD和15-kD GNLY蛋白的结构以及用于毕赤酵母(P. pastoris)表达的pPIC9K-GNLYs-His表达质粒的构建。其中，(A)9_kD和15-kD GNLY蛋白的结构示意图。(B) GNLY表达载体部分结构的示意图。图2、9_kD GNLY摇瓶培养和优化表达。(A)筛选高表达克隆，其中，1-8 :克隆编号，ctr :GS115/pPIC9K対照。、
(B)利用BMMY培养基摇瓶培养，pH值的优化。(C)利用BMMY培养基摇瓶培养，温度的优化。(D)利用BMMY培养基摇瓶培养，甲醇诱导浓度的优化。图3、9_kD GNLY P. pastoris 的发酵过程曲线。⑷培养过程中，发酵体系中溶氧、甲醇流加量、温度、pH的变化。(B)培养过程中，菌体湿重(WCW)和0D600值的变化。(C)培养过程中，随着诱导时间增加，蛋白表达情况。图4、9_kD GNLY 的纯化。 (A)从发酵上清液中纯化9-kD GNLY。CS :澄清的上清，FT :流出液(flowthought)；E :洗脱液，M :蛋白分子量标记。(B)使用梯度缓冲液B从CM-FF中洗脱9_kD GNLY。(C)应用SDS-PAGE比较还原与非还原状态下的9_kD和15_kD GNLY。图5、15-kD GNLY的潜在的0_糖基化位点预测。(A) 5-kD GNLY的潜在的O-糖基化位点预测。87S、89S、142T :潜在0-糖基化位点。(B)利用LC-MS搜索肽段。图6、GNLY的杀伤大肠杆菌XL-10和革兰氏阳性金黄色葡萄球菌NCTC8325的生物学活性测试。(A) 9-kD GNLY 的 CFU 测试；(B) 15-kD GNLY 的 CFU 测试；(C)9-kD GNLY的上下两条电泳条带所对应蛋白的抑菌活性比较；以不同量的GNLY处理后，进行细菌克隆的计数。
具体实施例方式本发明人经过深入的研究，通过在多种宿主细胞进行表达研究，发现采用毕赤酵母来表达颗粒溶解素蛋白或蛋白片段，可实现蛋白的高表达，且良好地保留蛋白的生物活性。本发明人的新发现解决了现有技术中难以高效表达颗粒溶解素蛋白的技术难题，并为颗粒溶解素的生产提供了一种简单而稳健的发酵エ艺。在此基础上完成了本发明。由于目前研究中使用的9kDa颗粒溶解素大多以大肠杆菌表达系统进行重组表达，蛋白在表达过程中会易于形成包涵体，由于颗粒溶解素的蛋白序列中存在较多的ニ硫键，其在后续复性较为困难；由于颗粒溶解素蛋白对于细胞具有毒性，一些真核或病毒表达系统(例如酿酒酵母，昆虫细胞)易于受其毒性制约，导致细胞生长不好，表达效率非常低。经过对各种细胞的表达筛选，意外地发现采用毕赤酵母表达系统来表达颗粒溶解素蛋白，不仅表达量非常高，表达稳定，并且蛋白可以获得正确折叠加工，生物活性非常理想。同吋，本发明人还优化了蛋白的重组表达エ艺以及优化了蛋白的纯化工艺。颗粒溶解素颗粒溶解素(GNLY蛋白)是ー种毒性分子，具有广谱的抗病原微生物及杀伤肿瘤细胞作用，其作用机制涉及神经酰氨和Caspase依赖和非依赖途径,并与其ニ级结构及所带正电荷氨基酸相关。由于其广谱的抗病原微生物作用及对正常宿主细胞的低毒性，它在消除耐药性病原微生物方面是ー种很有吸引力的生物制剂。
作为本发明的优选方式，所述的颗粒溶解素或其活性片段的核苷酸序列可以与SEQ ID NO: I或SEQ ID N0:2所示的序列基本上相同。编码颗粒溶解素或其活性片段的编码序列也可以是SEQ ID NO: I (表达15kDa形式的颗粒溶解素)或SEQ ID NO: 2 (表达9kDa形式的颗粒溶解素活性片段)所示的编码区序列的简并的变异体。如本文所用，“简 并的变异体”在本发明中是指编码的蛋白质氨基酸序列与SEQ ID NO: I或SEQ ID N0:2所编码的氨基酸序列相同，但核苷酸序列与SEQ IDNO: I或SEQ ID NO:2所示序列有差别的核酸序列。例如，可以对SEQ ID NO: I或SEQ IDNO: 2进行酵母细胞偏好的密码子优化，更佳地，进行毕赤酵母细胞偏好的密码子优化。这些密码子优化的序列也被包含在本发明中。本发明的颗粒溶解素或其活性片段的核苷酸序列通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。还可用人工合成的方法来合成有关序列。目前，已经可以完全通过化学合成法来得到编码本颗粒溶解素(或其活性片段)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入表达载体和细胞中。表达系统本发明也涉及包含本发明的颗粒溶解素或其活性片段的编码基因的表达载体，以及用本发明的载体经基因工程转化产生的宿主细胞。本发明所述的表达载体是适用于毕赤酵母细胞表达的表达载体，其中含有颗粒溶解素的表达盒。如本文所用，所述的“表达盒”是指包含有表达目的多肽(本发明中为颗粒溶解素或其活性片段)所需的所有必要元件的基因表达系统，通常其包括一下元件启动子、编码多肽的基因序列，終止子；此外还可选择性包括信号肽编码序列等；这些元件是操作性相连的。作为本发明的优选方式，所述的表达盒包括以下操作性连接的元件A0X I启动子，酿酒酵母a-Factor信号肽编码基因，颗粒溶解素或其活性片段的基因，終止子。较佳地，在酿酒酵母a-Factor信号肽编码基因与颗粒溶解素或其活性片段的基因之间，还包括蛋白酶酶切位点，从而用于后续将信号肽与颗粒溶解素表达产物分离；或在颗粒溶解素或其活性片段的基因与終止子之间，还包括蛋白纯化标签的编码基因，从而有利于后续的纯化操作。多种蛋白纯化标签可应用于本发明的方法，例如，所述的蛋白酶酶切位点是kex2蛋白酶酶切位点，或所述的蛋白纯化标签是6XHIS。将所述的表达载体转化毕赤酵母，培养转化有所述表达载体的重组毕赤酵母，从而可表达颗粒溶解素。较佳地，所述的表达载体先进行线性化，之后转化毕赤酵母。用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主是真核生物如毕赤酵母时，可选用如下的DNA转染方法电转化、磷酸钙共沉淀法、显微注射、脂质体包装等；较佳地选用电转化。表达和纯化方法由于颗粒溶解素是ー种具有毒性的蛋白，其对宿主会产生伤害，因此现有技术中还没有找到ー种适合于进行高效重组表达的较佳方案。大肠杆菌的原核表达形成包涵体，这可使得颗粒溶解素对宿主的毒性较小，但是包涵体面临后续的复性纯化问题，表达效率低、步骤复杂，且获得的蛋白活性不理想。酿酒酵母等一些真核细胞在表达颗粒溶解素的同时，受其毒性侵害，无法获得高的表达产量。因此，本发明人进行了大量的细胞筛选，最終确定采用毕赤酵母表达，其对于颗粒溶解素有一定的耐受能力，并通过优化表达、纯化方法，使得其广量大大提尚。为了提高颗粒溶解素或其活性片段的表达量，本发明人还进行了エ艺条件方面的优化。作为本发明的优选方式，表达颗粒溶解素时，调节初始培养基以及发酵过程中培养基的pH在3. 0-8. 0 ;更佳地，调节初始培养基的pH在3. 8-5. 5，更佳地为4_5。这种弱酸性的PH值环境，可获得较高的蛋白表达量。作为本发明的优选方式，表达颗粒溶解素时，调节温度为10_32°C ;较佳地，调节温度为23-31°C ;最佳地，调节温度为25-30°C。而较低的温度可影响颗粒溶解素的表达。考虑到颗粒溶解素是具有杀细胞毒性的蛋白这ー特性，本发明人采取了先进行重组毕赤酵母菌体生长培养，在菌体生长到足够多时再进行诱导表达的发酵策略，从而最大程度地降低其对宿主细胞的毒性。因此，作为本发明的优选方式，表达颗粒溶解素时，先以 甘油为碳源进行重组毕赤酵母的培养，待重组毕赤酵母湿重超过150g/L(较佳地180g/L)时，加入甲醇进行诱导培养，整个培养过程持续60-100小时；较佳地70-90小时；更佳地80小吋。更多的培养时间对于蛋白表达量的増加不显著。在发酵培养结束后，还可包括步骤从发酵培养基中分离颗粒溶解素。从培养产物中分离或纯化颗粒溶解素可采用本领域技术人员熟知的技术。例如可采用硫酸铵沉淀、离子交換、凝胶过滤法纯化；或采用亲和层析法纯化，这些方法均包含在本发明中。然而，为了提高纯化的效率，本发明人还进行了纯化工艺的优化。作为本发明的优选方式，在颗粒溶解素的表达盒中，所述的颗粒溶解素或其活性片段的基因还连接ー纯化标签的编码基因；从而，在纯化时包括先采用亲和层析柱(与纯化标签相应的亲和层析柱，例如纯化标签6 X HIS对应Ni柱)对培养上清进行纯化；之后采用阳离子交換柱进行纯化。由于颗粒溶解素的等电点比较高，因此通过阳离子交换柱纯化之后，纯度比Ni柱纯化进ー步提高。在本发明的实施例中，采用这种两步法的纯化方法，使得 9kDa GNLY56mg/L, 15kD GNLYc 纯化后可达 130mg/L。纯化标签的选择是本领域技术人员易于作出的，常用的纯化标签例如HIS-tag(如 6XHIS)，GST-Tag，FLAG-Tag，HA-Tag，Myc-Tag等。纯化标签的选择与亲和层析柱中亲和介质的选择是关联或对应的，这种关联或对应是本领域技术人员的常规知识。作为本发明的优选方式，所述的纯化标签是6XHIS ;所述的亲和层析柱是Ni柱；所述的阳离子交换柱可以是S、SP、CM、MMC, adhere等，例如，阳离子交换柱是CM柱；更佳地，为HiTrapCM FF 柱。作为本发明的优选方式，在亲和层析柱纯化与阳离子交换柱纯化之间，还包括除盐的步骤。较佳地,使用Labscale TFF system和Pellicon XL 50进行除盐。颗粒溶解素的纯化的其它步骤例如上清液的获得、样品澄清等可采用本领域技术人员熟知的常规技术进行。通过亲和层析柱纯化与阳离子交换柱纯化，本发明人分离获得了分子量略有不同的颗粒溶解素9kDa或15kDa蛋白。经分析，这种分子量的差异可能体现在其糖基化修饰的不同。但是，这种糖基化修饰的不同并不影响蛋白的抑菌活性。
利用本发明提供的方法，颗粒溶解素表达量超过100mg/L，通过两步纯化，纯度可以达到95%以上。抑菌实验表明，9kDa和15kDa两种形式的颗粒溶解素都具有抑制细菌生长的活性，并具有剂量依赖的关系，且9kDa形式的颗粒溶解素抑菌活性远高于15kDa颗粒
溶解素。本发明的主要优点在干首次提供了 ー种简単，但是稳健的发酵调控方式，利用毕赤酵母表达9kDa和15kDa两种形式的颗粒溶解素，并 进行了一系列的摇瓶表达条件优化，并且发酵条件下表达量高达100mg/L，显著高于之前文献报道的方法。酵母表达的两种形式的颗粒溶解素均具有良好的抑菌活性，呈现剂量依赖；且9kDa的抑菌活性明显高于15kDa的颗粒溶解素；而现有技术的文献报道认为15kDa的颗粒溶解素不具有抑菌活性。提供了一种纯化方法，先通过亲和层析捕获蛋白，再使用离子交换层析的方法分离两种不同修饰的颗粒溶解素。下面结合具体实施例，进ー步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等編著，分子克隆实验指南，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。I.材料菌株与质粒P. pastoris 菌株 GS115、大肠杆菌 XLlO 感受态、pPIC9K 载体购自 Invitrogen 公司；pMD18_T载体购自Takara公司。试剂Yeast nitrogen base (YNB)购自 BD 公司；RPMI_1640 培养基购自 Hyclone 公司；胎牛血清购自Gibco公司；酵母抽提物和蛋白胨购自0X0ID公司；BCA蛋白检测试剂盒购自Pierce公司；d_Sorbitol、d-biotin、质粒抽提试剂盒、PCR产物回收试剂盒、胶回收试剂盒、DNA聚合酶、T4DNA链接酶、限制性内切酶、蛋白marker和PAGE配制相关试剂购自上海生エ；细胞分离液 Ficoll-Hypaque*-购自 Solarbio 公司；G418 和 EndoglycosidaseH (Endo H)购自Sigma-Aldrich公司；EZ-ECL化学发光检测试剂盒购自BiologicalIndustries 公司；in his-tag mouse mAb 购自 Abmart 公 ロ」；二手几 anti-mouse IgG-HRP 购自 BioLegend 公司；SV Total RNA Isolation System 购自 Promega 公司；Turbo 逆转录酶购自北进原平皓公司；含硅泡敌购自江苏赛欧信越消泡剂有限公司。BMMY培养基、BMGY培养基、MGY培养基、BSM培养基等配制參见Invitrogen公司毕赤酵母表达手册■，几种主要成分分别购自Yeast Nitrogen Base (YNB)购自BD公司；Yeastextract和Trypton购自0X0ID公司；其他化学试剂购自上海生エ和国药集団。仪器电子分析天平和pH计购自梅特勒-托利多公司；镟润振荡仪购自ScientificIndustries公司；电泳仪，垂直电泳槽、水平电泳槽、凝胶成像系统购自天能公司；半干转膜仪、电转仪购自Bio-Rad公司；化学发光检测仪购自UVITEC公司；高压灭菌锅购自Hirayama 公司；台式冷冻离心机(Centrifuge 5810R、Centrifuge 5415R)购自 eppendorf公司；超净工作台、摇床、恒温培养箱购自上海智诚公司；PCR仪购自德国Biometra公司；微量移液器购自法国Gilson公司；细胞培养箱购自Themo公司；AKTA explorer^LabscaleTFF System 和 Pellicon XL(5kDa)购自 Millipore 公司。BioFlo 115 Benchtop Fermentor 购自 New Brunswick Scientific 公司；FlexStand system 矛ロ 0. 45 y m microfiltration cartridge 购自 GE healthcare ；LTQ linearIT MS 购自 Thermo ；EttanTM MDLC HPLC system 购自 GE healthcare。溶液Ni 柱结合缓冲液300mM NaCl,20mM Tris-HCl, pH7. 5 ；Ni 柱洗涤缓冲液40mM 咪唑，300mM NaCl,20mM Tris-HCl, pH7. 5 ；Ni 柱洗脱缓冲液400mM 咪唑，300mM NaCl,20mM Tris-HCl, pH7. 0 ； Buffer A 20mM 憐酸，pH7. 0 ；Buffer B 1M NaCl，20mM 磷酸，pH7. 0。PTMl 液硫酸铜-5H206. Og,碘化钠 0. 08g,硫酸锰 _H203. Og,钥酸钠 _2H20 0. 2g，硼酸0. 02g,氯化钴0. 5g，氯化锌20. Og,硫酸亚铁-IW2O 65. Og,生物素0. 2g，硫磺酸5. Oml，用纯化水定容至I升，过滤后室温保存。引物GNLY的RT-PCR弓丨物如下PMD18T-GNLY-Fw CTCCTTGCAGCCATGCTCCTG(SEQ ID NO:3)；PMD18T-GNLY-Rv GAGGGGACCTGTAGAAGGTATAC(SEQ ID NO:4)。a-Factor 引物Pl-Fw ATGGATCCAAACGATGAGATTTC(SEQ ID NO:5)；P2-9-Rv GACAGGTCCTGTAGTCACGGCCTCTTTTCTCGAGAGATACCC(SEQ ID NO :6)；P2-15-Rv GTAGTACTCAGGGCTCAGACGTCTTTTCTCGAGAGATACCC(SEQ ID NO:7)。GNLY P3-9-Fw CTCGAGAAAAGAGGCCGTGACTACAGGACCTGTC(SEQ IDNO:8)；P3-15-Fw CTCGAGAAAAGACGTCTGAGCCCTGAGTACTAC(SEQ ID NO:9) P4-9-Rv CTGAATTCTCAATGGTGATGGTGATGATGCCTGAGGTCCTCACAGATCTGCTGGGCAG(SEQ IDNO:10)；P4_15_Rv :CTGAATTCTCAATGGTGATGGTGATGATGGAGGGGACCTGTAGAAGG(SEQ ID NO: 11)。II.实验方法颗粒溶解素cDNA克隆的构建I、PBMCs 总 RNA 的提取使用Promega 的 SV Total RNA Isolation System试剂盒从PBMC 细胞中(PBMC 中含有约10%的NK细胞，含有GNLY的mRNA)抽提总RNA，具体操作步骤參见试剂盒说明书。2、RT-PCR
(I)在一个 RNase-free 的 Ep 管中加入下列试剂I ii I oligo (dT) 12-18 (500 U g/ml) ；2ng-5 u g 总 RNA ;1 y IlOmM dNTP Mix(dATP, dGTP, dCTP 和 dTTP 均为 IOmM)；加入RNase-free的去离子水使总体积达到12ii I。(2)将上述混合物于65°C加热5分钟，立即放冰上，稍稍离心。(3)加入下列试剂4 u 15 XFirst-Strand Buffer ；2 U 10. IM DTT ； I u I Turbo 逆转录酶(200 单位)；lul RNase OUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor(40 单位/U I)。37°C孵育50分钟，然后70°C孵育15分钟使体系失活，得到总cDNA。3、颗粒溶解素cDNA的PCR扩增和pMD18_T克隆的构建(I)以上步cDNA为模板，使用基因特异性的引物PMD18T-GNLY-FW和PMD18T-GNLY-RV来扩增目的基因，切胶回收特异片段。
(2)使用Taq酶对上步得到片段进行加A反应，回收后连接到pMD18_T载体，将连接产物转化XLlO感受态；(3)挑选阳性克隆，PCR鉴定后送样测试，所得阳性克隆命名为PMD18-T-GNLY ;其插入片段序列与NCBI上NM_006433. I序列完全一致。颗粒溶解素酵母表达载体的构建I、具有Kex2单ー蛋白酶酶切位点的a -因子(a -Factor)信号肽片段编码序列的扩增以pPIC9k质粒为模板，在引物Pl-Fw和P2-9-RV的引导下进行PCR扩增，PCR反应条件为先94°C 2分钟；然后94°C 30秒，55°C 40秒，72°C 30秒，共32个循环；最后72°C 10分钟。反应结束后，对PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，得到一条大小约255bp的条带，与预期结果相符。用PCR产物回收试剂盒回收目的条带，命名为“ a-Factor-9-”。2、9kDa GNLY 基因的扩增以质粒pMD 18-T-GNLY 为模板，在引物 P3_9_Fw 和 P4_9_Rv (后续扩增 15kDa GNLY基因时，采用引物P3-15-Fw和P4-15-Rv)的引导下进行PCR扩增，PCR反应条件为先940C 2分钟；然后94°C 30秒，55°C 40秒，72°C 40秒，共30个循环；最后72°C 10分钟。反应结束后，将得到的PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，得到一条大小约240bp的条带，与预期结果相符。用PCR产物回收试剂盒回收目的条带，该片段命名为“_9kDa GNLY-”。3、含有信号肽的重组9kDa GNLY基因编码基因的扩增以获得的“a -Factor-9-”和“-9kDa GNLY-”为模板，在引物 Pl-Fw 和 P4_9_Rv (后续制备含有a-Factor信号肽的重组15kD GNLY基因时，采用引物PトFw和P4_15-Rv)的引导下进行PCR扩增，并通过引物在序列两端分别添加上限制性内切酶BamH I和EcoR I识别位点。PCR反应条件为94°C 2分钟；94°C 45秒，55°C 45秒，72°C I分钟，循环32次；最后72°C 10分钟。反应结束后，对PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，得到一条大小约为500bp的条带，与预期结果相符。用PCR产物回收试剂盒回收目的条带，将该PCR产物的基因命名为“ a -Factor-9kD GNLY-His”。4、重组9kD GNLY的毕赤酵母表达载体的构建用限制性内切酶BamH I和EcoR I对上步获得的PCR产物(a -Factor_9kDGNLY-His)进行双酶切，再将酶切片段与经相同酶双酶切的质粒pPIC9K用T4DNA连接酶进行连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5 a感受态细胞，筛选阳性重组子，提质粒，酶切鉴定，将鉴定后的阳性克隆命名为pPIC9K-9kD GNLY-His，并送上海生エ测序，测序结果显示插入PPIC9K的BamH I和EcoR I的识别位点间的DNA序列与预期结果完全一致。5、重组15kDa GNLY的毕赤酵母表达载体的构建重组15kDa GNLY的毕赤酵母表达载体的构建过程与上述9kDa GNLY完全一致，不同之处仅在于对应使用引物列表中标记“15”字样的引物替换标记“9”字样的引物即可。所得测序正确的阳性克隆命名为pPIC9K-15kDa GNLY-His。重组9kDa或15kDa GNLY摇瓶表达条件优化⑴pH优化
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配制含有不同pH值(pH4. 0、pH5. 0、pH6. 0)的0. IM磷酸钾缓冲液的BMMY培养基，诱导表达60h后,使用Western bloting检测,姆个pH值平行2份。(2)温度优化将使用BMMY培养基重悬的菌体均分成6份，置于20°C、25°C、30°C摇床各两份，诱导表达60h后，使用Western bloting检测。(3)甲醇浓度优化配制含有不同初始甲醇浓度(0. 5%(v/v)、1. 0%(v/v)、1. 5%(v/v))的BMMY培养基，诱导表达60h后,使用Western bloting检测,姆个浓度平行2份。重组9kD或15kD GNLY的发酵表达(I) 一级种从冻存的工作菌种库接种到5ml MGY培养基，30°C，250rpm培养36-48h至0D6QQ=2-6，此为发酵ー级种；(2) ニ级种从 I 级种接 Iml 到 200ml pH5. OBMGY 培养基中，30°C，250rpm 培养12-18h，至0D6QQ=2-6，此为发酵ニ级种；(3)发酵准备发酵罐组装及相关试剂准备、灭菌等工作；⑷Batch阶段将ニ级种接入含4L pH5. 0的BSM培养基(基础盐培养基)的14L发酵罐中，补充6ml/L的PTMl溶液，温度控制在30°C，初始搅拌速度400rpm，通过补加氨水将pH维持在5. 0左右，初始DO 90%以上，随着菌体的生长DO会逐渐下降并维持平衡，将平衡控制在30-40%之间；(5)转化期当DO开始急速上升时意味着原有培养基中甘油耗尽，需要持续补充含有12ml/L PTMl的50%甘油溶液，流速为12ml/h/L，这个过程维持2_3h至DO达到40或湿重在180g/L附近；(6)甲醇诱导阶段当湿重达到180g/L附近时，停止甘油流加，溶解氧会迅速上升，随后开始按“Invitoogen发酵(毕赤酵母发酵)手册三步法”流加含有12ml/L PTMl的甲醇溶液(三步法包括三个流加速度，由先到后甲醇流加量分别是3. 6ml/hr/L、7. 3ml/hr/L、10. 9ml/hr/L)。温度控制在25°C;搅拌速度IOOOrpm左右，DO控制在20-40%之间(平均约30%)，到发酵后期需要通纯氧维持DO稳定。发酵持续60h左右終止。重组9kD或15kD GNLY的纯化(I)固液分离发酵结束之后，使用NaOH缓缓地将发酵液pH调节到7.5，IOOOOg, 20min离心，收集上清液；(2)样品的澄清使用 Flex Stand system 和 0. 45 U m microfiltrationcartridge将上步获得上清液进ー步过滤；
(3)蛋白的捕获使用XK26/20column和Ni-agarose组装Ni-柱(亲和层析柱)，结合缓冲液平衡后，直接上样上步澄清样品，流速700ml/h ;上样结束之后先用结合缓冲液冲洗5个柱体积，再用洗涤缓冲液冲洗5个柱体积，最后用洗脱缓冲液洗脱目的蛋白；(4)除盐使用Labscale TFF system和Pellicon XL50对上步洗脱下来的蛋白进行Buffer置换,置换两个样品体积的Buffer A ;置换之后0. 45 y m滤膜过滤备用；(5)精细纯化使用 AKTA Explorer System,将 Buffer A 平衡 HiTrap CM FF_5ml柱，直接上样上步除盐并过滤后的样品，上样完成之后，先用Buffer A冲洗，再分别用30%Buffer B、60% Buffer B、80% Buffer B 洗脱样品，最 后用 100% Buffer B 再生柱子，并用ddH20和20%乙醇冲洗并保存柱子；(6)保存将上步各浓度Buffer B洗脱下来的蛋白，用PBS置换缓冲液之后冻存备用。重组9kD或15kD GNLY的鉴定I、LC-MS 鉴定(I) SDS-PAGE在还原条件下分离上述60%B洗脱下来的GNLY，分别切胶回收上下两条带，还原并烧基化之后用trypsin酶切消化；(2)消化后的肽段使用 Thermo LTQ linear IT MS 和 Ettan MDLC HPLC system联用分析；(3)相关参数LC 分离方式C18 Reversed Phase Capillary Column流动相溶液A 0. l%(v/v)甲酸溶于ddH20 ；B :100%乙腈离子类型正离子质谱方法Data_DependentMS/MS蛋白修饰extra57Da on Cys,及 extra 16Da on Met检索方法SEQUEST;P印tide filter 1+, I. 9 ；2+,2. 50 ；3+,3. 752、数据库预测N/0-糖基化位点使用ExPASy SIB Bioinformatics Resource Portal 数据库相关软件预测N/0-糖基化位点，其中N-糖基化位点预测链接http://www. cbs. dtu. dk/services/NetNGlyc/ ;0_ 糖基化位点预测链接http://www. cbs. dtu. dk/services/YinOYang/。重组9kDa或15kDa GNLY的活性检测(l)5ml LB培养基大肠杆菌菌株XL-10或金黄色葡萄球菌NCTC-8325单菌落，250rpm，37°C培养至OD600=O. 6 0. 8 (约2_3h)，此时E. coli处于对数生长期；(2)取步骤I)中的Iml菌液,于室温1500g离心5min ；(3)弃上清，用 Iml (含 0. 03%LB 的 IOmM PPB)的重悬；(4)测量重悬菌液的0D_值，用(含0. 03%LB的IOmM PPB)调整菌液浓度至2 XlOVml (以OD600=I时，菌液浓度为5 XlOVml计算)；(5)对于每个检测的蛋白质浓度n，准备100 U I浓度为2n的颗粒溶解素的溶液与IOOu I的稀释后(步骤(4))的菌液混合；颗粒溶解素储液浓度为270uM(2. 7mg/ml，BCA定
量)；(6) 37 °C 100_160rpm 摇菌鮮育 3h ；
(7)取30 ill孵育后的菌液用(含0. 03%LB的IOmM PPB)稀释至300 U I,涂LB板；(8)置37°C培养箱中培养18 24h，待克隆清晰可见；(9)统计各板上克隆的数目并计算CFU。III.实施例 实施例I、GNLY表达载体的构建GNLY全长145个氨基酸，其中包括预测的信号肽，位于氨基酸第1_22位。在杀伤性T细胞和NK细胞中，GNLY以15kDa的形式合成，然后首位剪切后形成9kDa的形式(如图 1A)。
本发明人将9kDa和15kDa GNLY的编码序列连接到酿酒酵母a -Factor信号肽3’末端，并仅保留kex2蛋白酶的酶切位点，最后通过BamH I和EcoR I酶切位点克隆到pPIC9K酵母表达载体中。这样通过甲醇诱导AOX I启动子驱动其下游蛋白的表达。GNLY表达载体结构示意图如图IB所示。实施例2、GNLY表达菌株的筛选和摇瓶表达条件优化使用Sal I将pPIC9K-GNLYs_His线性化之后，电转入毕赤酵母GS115菌株。分别从培养9kDa和15kDa GNLY表达菌株的YPDG平板上各挑选9个克隆进行诱导表达。使用Western blotting检测这些克隆培养上清中GNLY表达的情况。以9kDa GNLY克隆表达为例，大多数的克隆均有效地表达出9_kD GNLY(如图2A)，表达量最高的克隆命名为GS115/9kDa GNLY-His。Western blotting显示酵母表达出来的9kDa GNLY分子量介于10_15kDa之间，且为分子量非常相近的两条带(15%gel)(为不同程度的糖基化修饰形式)。15kDa GNLY的表达量明显比9kDa GNLY要高，且各表达克隆之间的差异并不明显。为了给发酵表达提供一些基本的发酵参数指导，本发明人先在摇瓶水平对GNLY表达条件进行了初步优化，首先选用不同pH值BMMY对GS115/9kDaGNLY-His进行诱导表达。由图2B可知，在弱酸性环境下(pH4.0或pH5.0)，9kDa GNLY表达量较高。本发明人也检测了温度对9-kD GNLY诱导表达的影响，发现低温会影响9kDa GNLY的表达，温度适宜在25-30°C，如图2C。最后，还检测了诱导的甲醇浓度对9kDa GNLY表达的影响，提高诱导的甲醇浓度，有利于9kDa GNLY的表达，甲醇浓度适宜在l_2%(v/v)如图2D。实施例3、GNLY中试规模的发酵表达本发明人采用分批补料培养(fed-batch cultivation)法培养表达菌GS115/9_kDGNLY-His，并进行了方法流程的优化。本发明人首先使用含有4%(v/v)甘油的基础盐培养基(pH5. 0)在batch阶段扩增菌体(后续调节pH使之维持pH5. 0)，培养温度30°C。等到DO急剧上升时(约培养22小时)，batch阶段结束，菌体湿重达到118. 7g/L。随后进入转换期即甘油流加期(流加量是18. 15ml/hr/升，流加的甘油中，每升50%w/v甘油溶液含有12ml的PTMl，PTMl是一种酵母生长需要的微量元素盐溶液，成分为硫酸铜_5H20 6. OgJft化钠0. 08g,硫酸锰-H2O 3. Og,钥酸钠-2H20 0. 2g，硼酸0. 02g,氯化钴0. 5g，氯化锌20. Og,硫酸亚铁_7H20 65. Og,生物素0. 2g，硫磺酸5. Oml)，经过约4个小时的生长菌体湿重进一步增加，达到186.6g/L。此时停止流加甘油，菌体呼吸活力下降，DO迅速上升；随后开始进行甲醇诱导，菌体呼吸活力恢复，DO开始逐渐下降。在甲醇诱导阶段，因为菌体对甲醇有一个适应阶段(3-4小时)，因此需要逐步提高甲醇浓度，避免甲醇过量积累对菌体产生毒性。发酵结束之后，菌体湿重达到512. 4g/L。尽管菌体湿重在诱导过程中一直在增加，但是蛋白的表达量在培养80小时基本达到平衡，不再累计。因此，在此时结束发酵比较适合。表达菌GS115/9kDa GNLY-His整个发酵过程中，各参数的变化情况如图3A-C。表达菌GS115/15kDa GNLY-His 的发酵过程基本同表达菌 GSll5/9kDaGNLY_HiS。实施例4、GNLY纯化与鉴定以9-kD GNLY纯化为例，发酵结束之后，经过离心和澄清，用BCA测定发酵液中总蛋白含量为I. 6g/L，并通过SDS-PAGE估算9kDa GNLY的浓度超过100mg/L。

经过两步纯化(Ni柱纯化和HiTrap CM FF柱纯化)实际获得9kDa GNLY56mg/L，15kDa GNLYc纯化后可达130mg/L，且内毒素含量低于0. lEU/iig蛋白。由于GNLY带有his-tag，因此，将发酵液直接上样Ni柱。洗脱之后经SDS-PAGE，为紧密两连的两条带。同时由于9kDa和15kDa GNLY的等电点比较高(>9. 3)，因此通过阳离子交换柱CM-FF纯化之后，纯度进一步提高，但是依然为两条分子量很接近的条带，如图4A。本发明人在用CM-FF做进一步纯化时发现，这两条带可以通过不同浓度的高盐缓冲液进行分离，如图4B。通过比较还原与非还原状态下的9kDa和15kDa GNLY发现，这两条带并非因为分子内二硫键错配产生的，如图4C。经过ExPASy数据库N-糖基化预测软件分析，9kDa和15kDa GNLY均没有N-糖基化位点。经过该数据库0-glycosylation预测软件YinOYangl. 2预测，15-kD GNLY有三个0-糖基化位点，如图5A。因此提示上下两条带是不同程度的0-糖基化造成的。为了排除上下两条带可能是由于蛋白降解造成的这一因素，本发明人从SDS-PAGE中将这两条带分别切下，酶切消化后用LC-MS检测。质谱结果显示，上下两条带均是GNLY。搜索到的肽段对应15kDa GNLY全长蛋白的位置如图5B所示。幸运的是，本发明人从上下两条带中均检测到了重组GNLY首位的肽段，提示上下两条带并非由于蛋白降解造成的。同时，本发明人还发现，两次质谱均未检测到由87位-117位之间的氨基酸组成的肽段，而这一段正是潜在的0-糖基化位点存在的地方。这一结果进一步支持了了上下两条带是不同程度的0-糖基化造成的这一结论。实施例5、GNLY活性检测为了检测酵母表达的GNLY具有生物学活性，特别是9kDa GNLY具有广谱的杀菌活性，本发明人分别选用了革兰氏阴性的大肠杆菌XL-10和革兰氏阳性金黄色葡萄球菌NCTC-8325作为靶细胞，通过CFU法检测GNLY的抑菌活性。实验结果显示，9kDa GNLY在较低的浓度下就对于XL-10和NCTC-8325的生长显示出很强抑制效果，并具有剂量依赖的关系(如图6A),15kDa GNLY也显示出了一定的抑菌能力。但是9kDa GNLY抑菌能力明显强于15kDaGNLY，如图6A和6B。进一步分析表明，9kDa GNLY的上下两条条带，即9kDa GNLY-上肽段和9kDa GNLY-下肽段这两条带所对应的蛋白在抑菌活性上无明显区别(如图6C)。讨论重组9kDa GNLY有广谱的抗菌活性，能够杀死革兰氏阴性菌、革兰氏阳性、甚至可以在体外直接杀死结核分支杆菌。此外，GNLY还与肿瘤、疟疾、麻风、移植、皮肤病和生殖并发症等有广泛的临床相关性。最近，还有一些研究使用GNLY作为佐剂经行疫苗研究和开发。越来越多的证据表明，GNLY是一个具有临床应用潜力和开发价值的蛋白分子。本发明首次利用毕赤酵母表达系统成功地表达出了 9kDa GNLY和15kDa GNLY,并利用a-因子分泌肽，将GNLY分泌到培养上清中，便于后续的纯化工作。摇瓶水平的表达条件优化显示，GNLY在偏酸性培养基中表达量较高，可能与其在酸性环境下细菌裂解活性较低或酸性环境下中性蛋白酶活性较低有关。在发酵研究中，本发明人首先尝试了一种简单的发酵策略，即甘油培养阶段和甲醇的恒定流速的诱导阶段。整个发酵过程总体比较稳定，菌体湿重稳步增加，目的蛋白也在持续累积。由于本发明人手头没有抗GNLY的抗体， 因此为了方便前期筛选和鉴定工作，本发明人在蛋白的C端添加了 his-tag，也方便了纯化工作。同时本发明人还利用GNLY等电点比较高的特点，在亲和层析之后，通过阳离子交换柱进一步纯化，纯度可到95%以上(不区分上下两条带)，即使区分上下两条带也可达到90%以上纯度。然而有文章报道，带有his-tag可能会影响蛋白的活性，因此在某些的特殊情况下，本发明人完全可利用毕赤酵母表达系统制备不带任何tag的重组GNLY,纯化也比较简单。活性实验证实9kDa GNLY具有良好的抑菌活性，其对于革兰氏阴性菌的杀伤能力强于革兰氏阳性菌，可能与革兰氏阳性菌具有荚膜有关，荚膜能一定程度上阻碍GNLY与细菌细胞膜接触，降低GNLY对菌体的伤害。15kDa GNLY也显示出一定的抑菌能力，但是明显比9kDa GNLY要弱。这个结果与之前报道15kDa GNLY在体外没有抑菌能力并不完全一致。已经证实，GNLY通过电荷作用结合到细菌细胞膜上，通过改变膜的通透性杀死细菌。因此，本发明人认为9kDa GNLY和15kDa GNLY都具有杀菌活性，只是15kDa GNLY杀菌活性明显低于 9kDa GNLY。综上所述，本发明人利用毕赤酵母表达系统，成功表达出了具有生物活性的GNLY。同时利用简单稳健的发酵策略，可大量制备高纯度、低内毒素的GNLY。为GNLY的科学研究和临床应用奠定了坚实的基础。在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
权利要求
1.一种重组表达颗粒溶解素的方法，其特征在于，所述方法包括 (1)提供表达载体，所述的表达载体中含有颗粒溶解素的表达盒； (2)将(I)的表达载体转化毕赤酵母，培养转化有所述表达载体的重组毕赤酵母，从而表达颗粒溶解素。
2.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述的表达盒包括以下操作性连接的元件AOX I启动子，酿酒酵母a-Factor信号肽编码基因，颗粒溶解素，终止子。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，在酿酒酵母a-Factor信号肽编码基因与颗粒溶解素基因之间，还包括蛋白酶酶切位点；或 在颗粒溶解素的基因与终止子之间，还包括蛋白纯化标签的编码基因。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的颗粒溶解素的基因具有SEQID NO: I或SEQ ID N0:2所示的核苷酸序列。
5.如权利要求I所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，表达颗粒溶解素时，调节培养基的pH在3. 0-8.0 ;和/或 调节温度为10-32 °C。
6.如权利要求I所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，表达颗粒溶解素时，先以甘油为碳源进行重组毕赤酵母的培养，待重组毕赤酵母湿重超过150g/L时，加入甲醇进行诱导培养，整个培养过程持续60-100小时。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，表达颗粒溶解素时，首先使用含有按照质量体积比4%的甘油且pH5. 0的BSM培养基培养重组毕赤酵母菌体，培养温度30°C;等到溶氧急剧上升时，进行甘油流加，待重组毕赤酵母湿重超过150g/L时停止流加甘油；随后加入甲醇进行诱导培养。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，甘油的流加量是18±3ml/hr/升。
9.如权利要求I所述的方法，其特征在于，在颗粒溶解素的表达盒中，所述的颗粒溶解素的基因还连接一纯化标签的编码基因；且，步骤(2)之后，还包括从培养基中分离颗粒溶解素的步骤，包括先采用亲和层析柱对培养上清进行纯化；之后采用阳离子交换柱进行纯化。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的纯化标签是HIS标签；所述的亲和层析柱是Ni柱；所述的阳离子交换柱选自阳离子交换柱3、5 、011、丽(、&(11^1^。
全文摘要
本发明涉及颗粒溶解素的表达和制备方法。本发明人首次采用毕赤酵母来表达颗粒溶解素蛋白或蛋白片段，可实现蛋白的高表达，且良好地保留蛋白的生物活性。本发明解决了现有技术中难以高效表达颗粒溶解素蛋白的技术难题，为颗粒溶解素的生产提供了一种简单而稳健的发酵工艺。
文档编号C07K1/18GK102757977SQ20121025050
公开日2012年10月31日 申请日期2012年7月19日 优先权日2012年7月19日
发明者孙洁, 李光伟, 栾淦, 肖卫华, 郭雨刚, 钟永军 申请人:中国科学技术大学