表位肽的制作方法

专利名称：表位肽的制作方法
技术领域：
本发明涉及医学免疫学领域，特别涉及一种B细胞表位肽及其应用。
背景技术：
糖尿病(diabetes mellitus, DM)定义:由多种病因引起的以慢性高血糖为特征的代谢紊乱，伴有因胰岛素分泌和/或作用缺陷引起的糖、脂肪和蛋白质代谢异常。该病在临床上的主要病征为“三多一少”，即多饮、多食、多尿、体重减轻。2型糖尿病:以胰岛素抵抗为主，伴胰岛素分泌不足，至以胰岛素分泌不足为主伴胰岛素抵抗(WH01999标准)。2型糖尿病的致死率的预测一直是一个难题。第47届欧洲糖尿病研究学会年会(EASD2011)上报告的荷兰一项针对2型糖尿病患者初级保健的前瞻性观察研究表明，循环过氧化物氧化还原酶4(peroxiredoxin-4,Prx4)水平的增加与2型糖尿病患者的心血管和全因死亡率独立相关。但是，目前临床上还不存在一种基于Prx4的糖尿病检测试剂。

发明内容
本发明旨在提供一种B细胞表位肽及其蛋白载体，其能过氧化物氧化还原酶4单克隆抗体的特异性抗原。实现上述目的的技术方案为:表位肽， 所述表位肽为含有的氨基酸序列为WETEERPRTREE的人工合成肽，即如SEQ ID NO: I所示。含有上述氨基酸序列的表位肽具体为:WETEERPRTREEE。优选的，所述表位肽与BSA、0VA、肌红蛋白、KLH和破伤风类毒素任一种蛋白载体连接，得含有所述表位肽的蛋白载体。本发明的目的之二在于提供一种杂交瘤细胞，其能特异性的分泌过氧化物还原酶4单克隆抗体。为实现上述目的，本发明的技术方案为:所述所述表位肽制备的杂交瘤细胞。杂交瘤细胞的制备是通过所述B细胞表位肽段与BSA或KLH交联后免疫Balb/c小鼠，取免疫后的小鼠小鼠脾细胞悬液并制备SP2/0细胞悬液(脾脏B淋巴细胞)，并与骨髓瘤细胞和融合，将融合细胞选择性培养，通过ELISA筛选后得到的杂交瘤细胞。将筛选出的阳性细胞进行克隆化培养，同时在克隆化培养的杂交瘤细胞中筛选出阳性化的杂交瘤细胞送于并送中国典型培养物保藏中心(武汉大学保藏中心)保藏，保藏号为CCTCC C2012148，其可稳定分泌所述单克隆抗体。本发明的目的之三在于提供表位肽单克隆抗体及其应用，该单克隆抗体可作为检测过氧化物还原酶4的特异性诊断试剂，其应用为类风湿关节炎的诊断及2型糖尿病的预测提供了新方法。实现上述目的的技术方案为:所述表位肽的特异性单克隆抗体。所述特异性单克隆抗体由生物保藏编号为CCTCC C2012148的杂交瘤细胞分泌。
所述的特异性单克隆抗体在制备诊断二型糖尿病或类风湿关节炎诊断试剂中的应用。所述的表位肽在制备诊断二型糖尿病诊断试剂中的应用。有益效果I)抗Prx4单克隆抗体的制备:通过生物信息学分析，综合考虑蛋白质的二级结构、抗原性、亲疏水性、可及性及柔韧性，预测HBV LHBs中preSl区段中的潜在B细胞表位，发现新的B细胞表位区域83aa_lIIaa (肽2)，人工合成上述两种B细胞表位多肽，与BSA交联后通过新型免疫程免疫Balb/c小鼠，通过杂交瘤技术经多次细胞融合，利用间接ELISA法和克隆化筛选出能稳定分泌抗Prx4单克隆抗体的杂交瘤细胞株并检测其细胞培养上清的效价。之后对杂交瘤细胞核型分析，明确染色体数目，证实杂交瘤确实是小鼠脾细胞和SP2/0融合而成，再进行抗体亚类鉴定和抗体的特异性实验，证实得到的抗体是特异性针对Prx4 的 ο2) Prx4重组蛋白的制备:从GENBANK中获得人Prx4编码序列，通过密码子偏性改造，同义置换为大肠杆菌偏爱的密码子获得编码序列，进行Prx4全长基因的合成制备；将Prx4基因与载体连接·,获得Prx4重组质粒；将Prx4重组质粒转化大肠杆菌,诱导表达获得Prx4重组蛋白；鉴定重组蛋白的可溶性后纯化重组蛋白并进行纯度、浓度和活性鉴定，得到了高纯度的Prx4重组蛋白，可以用于筛选抗Prx4杂交瘤细胞。3)制备抗Prx4特异性兔多克隆抗体:用从血清中分离纯化得到的Prx4免疫新西兰大白兔，经过多次免疫，待兔血清中的抗Prx4抗体达到较高效价后放血，经过抗原亲和层析纯化后得到了高效价、高亲和力的特异性的多克隆抗体。更多有益效果，详见具体实施方式
。本发明中杂交瘤细胞株杂交瘤细胞株Prx-4送中国典型培养物保藏中心(武汉大学保藏中心)保藏，保藏编号为CCTCC C2012148，地址位于中国武汉武汉大学，保藏的培养物名称为小鼠杂交瘤细胞。
具体实施例方式实施例1多克隆抗体的制备一重组蛋白I编码Prx4基因成熟肽cDNA的克隆和验证利用Trizol Reagent提取糖尿病患者血细胞的总R N A,并反转录成cDNA。设计引物 Prx4F:5，_gctagcatgagcaacactgtccc a~3'和 Prx4R:5' -gaattcgaagtattctttgctgcc a~3'，以 cDNA 为模板进行 PCR 扩增，以获得编码该基因成熟肽的基因片段。PCR反应程序:94°C变性4min，I个循环；94°C变性50s，55°C退火50秒，72°C延伸I分钟，35个循环；72°C延伸10分钟，I个循环。PCR产物在1.2%的琼脂糖凝胶中进行电泳，经过凝胶成像系统观察照相后切下特异目的条带，用D N A凝胶回收试剂盒纯化目的片段，连入P M D18-T载体，转化ToplOF’感受态细胞，然后通过PCR筛选阳性克隆并进行测
序验证。2重组表达载体构建
构建重组表达载体:将构建好的表达载体转化大肠杆菌T0P10F’感受态细胞，涂布含有氨苄青霉素(lOOyg/mL)的L B平板，过夜培养，以基因特异性引物Prx4与载体引物 Reverse T7Promoter (5' -tagttattgctcagcggtg g-3')对转化子进行筛选。挑选阳性克隆，进行测序。3重组表达载体转化宿主菌将经过测序鉴定正确的阳性克隆转入含有氨苄青霉素(100 μ g/m L)的L B液体培养基中，200转/分钟，37°C培养过夜。利用EZ Spin Colunm Plasmid Min1-Pr印skit提取质粒，取IOng质粒转化表达宿主菌BL21(DE3)plys S感受态细胞。将转化产物接入IOmL的L B培养基中(含100 μ g/m I氨苄青霉素，34 μ g/m I氯霉素)，200转/分钟，37°C培养过夜。4重组蛋白的诱导表达取0.5m L过夜培养的菌液接入5m L新鲜的L B培养基中(含100 μ g/m L氨苄青霉素，34 μ g/m L氯霉素)，200转/分钟，37°C培养2_3小时，待其OD45tl达到0.5-0.8小时，加入终浓度为0.lmmol/L的I P T G继续培养6小时，每隔I小时取样一次，每次取500 μ L。将收集到的培养液分别于4°C，12000转/分钟条件下离心2分钟，弃上清，然后将菌泥保存于-20°C，备用。5表达产物的初步分析在每个样品中加500 μ L裂解液处理，在液氮与42°C水浴中反复冻融，离心后通过SDS-PAGE分析上清与 沉淀中的蛋白，同时对IPTG诱导不同时间目的蛋白的表达量进行分析。6分离纯化称量回收菌体的湿重，按每克菌体IOm L的比例加入Buffer (50mmol/L磷酸钠，6mol/L盐酸胍,300mmol/L氯化钠)，将菌体与Buffer混勻,超声波破碎至液体变清；然后，4°C, 12000转/分钟离心30分钟，收集上清。利用固相金属亲和层析和Co-NTA技术，对超声波破碎后的重组蛋白进行分离纯化，具体操作按照BD Talon TM Metal Afinity Resins操作手册进行。7 结果质谱鉴定的结果证明宿主菌中被诱导表达的蛋白就是重组的人Prx4蛋白，将菌体的培养体系扩大到了 300mL，选取4小时为最佳的诱导时间，对扩大培养的菌体进行诱导。诱导结束后对菌体进行离心回收。纯化后目的蛋白纯度达到95%以上。二多克隆抗体的制备以所得纯化Prx4重组蛋白为抗原，采用背部皮下及四肢多点注射免疫新西兰大白兔。免疫程序:基础免疫前耳缘静脉取血5mL分离血清作为阴性对照。每只用抗原500 μ g与等体积完全弗氏佐剂充分乳化后进行注射，首次免疫后3天用等量抗原配以完全弗氏佐剂加强免疫，第28天用等量抗原配以不完全弗氏佐剂第3次免疫。第3次免疫后7天，耳缘静脉取血5ml分离血清，用间接ELISA检测抗血清的效价。效价达1: 64000时颈动脉插管收集全血，4°C放置过夜，4000rpm离心收集血清，-70°C保存。效价达不到要求可再加强免疫I次。二特异性亲和纯化抗体
将待纯化的血清用上样缓冲液(0.1M磷酸钠，0.1M柠檬酸三钠，pH7.0)适当稀释后加入到ProteinA柱中，用洗脱缓冲液(0.1M磷酸钠，0.1M柠檬酸钠，pH3.0)洗脱柱子，收集单峰。收集的纯化产物再经抗原抗体特异性亲和纯化，得到纯化的抗Prx4多克隆抗体。所述的抗原抗体特异性亲和纯化方法:Prx4抗原用buffer A (0.lmol/L碳酸氢钠,0.5mol/L 氯化钠，ρΗ8.0),按照 0.5:1 (buffer:sample)处理，将填料 NHS-activatedSepharose4FAST Flow装柱，室温下将PRX4重组蛋白偶联在柱上，经过纯化过量的抗原决定簇及大量清洗柱体后，备用。反复上样，保证特异性的抗Prx4抗体充分与柱结合,用100mol/L甘氨酸，pH2.5洗脱,特异性抗体蛋白直接被洗脱收集入lmol/L Tris,pH9.0，-20°C保存备用。本实施例1制备的多克隆抗体，应用于和实施例2制备的单克隆抗体配对。实施例2单克隆抗体的制备一 B细胞表位肽段的预测所述的化学合成的B细胞表位肽段的序列来自生物信息学分析结果，综合分析过氧化物还原酶4蛋白的二级结构、抗原性、亲疏水性、可及性及柔韧性，对各区段进行分析评分，选取得分高的区域作为B细胞表位区域。具体的,利用Chou & Fasman预测β转角、Emini法预测抗原表面可及性、Karplus&Schulz法预测蛋白柔韧性、KoIaskar&Tongaonkar蛋白质抗原性分析、Parker法蛋白质疏水分析和Bepipred线性抗原表位预测等技术参数，获得人过氧化物还原酶4蛋白中潜在的B细胞表位肽段。所述的筛选B细胞表位肽段，其中化学合成的表位肽段2段分别为:肽段1:N—WETEERPRTREE— C(后制得的单克隆抗体简称为单抗I)，肽段2:N—WETEERPRTREEE-C (后制得的单克隆抗体简称为单抗2)。在所述肽段I和肽段2化学合成中，在其N端引入半胱氨酸，以提高其与BSA的交联能力，接着与BSA交联。交联率(>60% )，得过氧化物还原酶4的B细胞表位肽段抗原。另外，肽段I和肽段2也可选择同KLH、0VA、肌红蛋白、破伤风类毒素任一种蛋白载体连接进行交联。二单克隆抗体的制备与鉴定I过氧化物还原酶4的B细胞表位肽段衍生物免疫Balb/c小鼠将上述合成的肽段I和肽段2制备的过氧化物还原酶4的B细胞表位肽段抗原从_80°C冰箱取出，分别作抗原，溶解后过滤。选取6周龄、体重约20g的雌性Balb/c小鼠免疫。抗原乳化选用双注射器互推法。首次免疫时，将肽段I和肽段2制备的过氧化物还原酶4的B细胞表位肽段抗原分别与等体积的弗氏完全佐剂乳化混合，分别得抗原混合物I和抗原混合物2，分别用于不同的小鼠:按100 μ g的量皮内多点加腹腔注射,第14和第28天分别进行第二次第三次免疫，佐剂改用不完全弗氏佐剂，抗原量、注射体积和途径不变，第3次免疫后间接ELISA法测定效价。融合前3天进行加强免疫，每只小鼠腹腔注射不加佐剂的100 yg抗原，3天后细胞融
八
口 ο

2被免疫Balb/c小鼠血清效价测定第3次免疫后10天从小鼠尾静脉取血检测血清抗体效价。将新购酶标板用双蒸水浸泡过夜，晾干后备用；用包被液(0.05mol/L碳酸钠缓冲液:0.16g Na2CO3,0.293g NaHCO3,0.02g NaN3，加去离子水溶解定容IOOml)将所得Prx4重组蛋白抗原稀释为最佳工作浓度5 μ g/ml，每孔加100 μ I抗原稀释液，37°C温育I小时后，以胶带封口，于4°C过夜，倒尽板孔中液体，吸干孔内残余反应液，加满洗涤液过一次，再注满洗涤液缓缓晃动2min，倾去，反复五次，最后将反应板倒置在吸水纸上，使孔中洗涤液流尽。自然干燥后以胶带封口，此为Prx4重组蛋白抗原包被的酶标板，加封闭液300μ 1，37°C孵育1.5小时，洗涤5次；采血及稀释血清:捏住鼠尾，体积分数为75 %的酒精消毒后用剪刀在尾静脉剪一缺口，取血20 μ L, 2000rpm离心30min,取上清I μ I加入999 μ I抗体稀释液混勻，并进行体积倍比稀释，从1: 100至1: 3200，将稀释的被检血清每孔加入100μ 1，同时取小鼠免疫前血清I: 100稀释做阴性对照，抗体稀释液做空白对照。37°C孵育1-1.5小时，洗涤5次；将辣根过氧化物酶羊抗小鼠IgG稀释到1: 10000，每孔加100μ 1，37°C孵育1.5小时，洗涤5次；加邻苯二胺溶液100 μ L/孔，室温暗处15分钟，每孔加终止液100 μ L观察结果，OPD氧化后的产物呈橙红色，用酶联免疫检测仪记录450nm读数，以空白对照孔调零后测各孔OD值大于阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。血清效价达到1: 3200即可用于细胞融合。其中，由肽段I和肽段2制备的过氧化物还原酶4的B细胞表位肽段抗原(下面分别简称为B细胞表位肽段抗原1、B细胞表位肽段抗原2)的血清的效价均在1: 3200以上。3小鼠脾细胞悬液和SP2/0细胞悬液的制备分别取经B细胞表位肽段抗原1、B细胞表位肽段抗原2经取免疫好的Balb/c小鼠，摘除小鼠眼球放血处死，眼 血离心后收集血清作ELISA的阳性对照，无菌操作取出脾脏，放入盛有IOml不完全培养基的玻璃皿中，洗涤，小心剥去周围的结缔组织和脂肪组织，换一玻璃皿，将脾脏捞出，置于200目不锈钢网中，用注射器的内芯研磨，不时用不完全培养基冲洗，使脾细胞穿过网孔进入溶液中，将脾细胞移至IOml玻璃离心管中，800rpm水平离心lOmin，去上清。同法用不完全培养基IOml洗涤细胞I次，离心收集沉淀的细胞，将细胞用IOml不完全培养基重悬混匀，细胞计数约为I X IO8个细胞。将SP2/0细胞从液氮中取出，迅速放入37°C水浴中，不断摇晃，直至细胞溶液完全溶解，将细胞转移到IOml离心管中，800rpm水平离心lOmin，弃上清，IOml完全培养液重悬沉淀，把细胞悬液转移到50ml培养瓶中，置37°C、5% CO2培养箱中培养。待细胞生长良好后用含8-AG的选择培养基筛选细胞一周；融合前2天，将I瓶细胞传至4瓶，则融合当天细胞正处于对数生长期，活力正好，细胞大小均匀，圆而透亮，融合当天，用弯头滴管将SP2/0细胞从管壁上轻轻吹下，收集于离心管中，离心，弃上清，沉淀用不完全培养基洗涤后，IOml不完全培养基重悬，细胞计数，约为6 X 107。4滋养细胞的制备取一只未免疫的Balb/c小鼠,摘眼球放血处死,75 %乙醇浸泡消毒5min,剪开小鼠皮肤，用镊子提起腹膜，用剪刀剪一小口，弯头滴管吸取预冷的不完全培养基冲洗腹腔，将洗液吸至50ml离心管中。同法用不完全培养基冲洗腹腔3次，收集洗液，室温下IOOOrpm水平离心lOmin，去上清，IOml不完全培养基重悬细胞并计数。5骨髓瘤细胞和脾脏B淋巴细胞融合融合前将PEG1500置于37 °C培养箱中预温，吸取I X IO7个骨髓瘤细胞悬液和I X IO8个脾脏B淋巴细胞悬液(细胞数1: 10)至一个50ml离心管中，补加30ml不完全培养基，充分混匀，IOOOrpm离心lOmin，弃上清，轻弹管底，使细胞团松散成糊状，将离心管37°C水浴，用滴管吸取0.8ml预温的50 % PEG1500溶液，在离管底约2cm处沿管壁慢慢加入细胞中，边加边转动离心管，在Imin左右加完，然后静置90s，逐滴加入37°C预温的不完全培养基30ml终止融合，3min之内加完，速度先慢后快，动作轻柔，将离心管在37°C培养箱中静置5min，取出离心管，IOOOrpm离心5min，弃去上清，加入IOml HAT培养基重悬细胞，轻轻吹打，混匀，将融合细胞接种至已铺有滋养细胞的96孔细胞培养板，按100 μ I/孔，每块培养板留6孔接种SP2/0细胞，作为HAT选择的阴性对照，置37°C ,5% CO2培养箱中培养。6融合细胞的选择性培养及杂交瘤细胞的筛选融合后第5天即可在倒置显微镜下观察细胞的生长情况，并补加HAT培养基100 μ 1，第14天换HT培养基培养。融合后10-14天，待细胞长到满培养孔的1/2孔底时，采用间接ELISA法检测培养上清，筛选阳性克隆；以实施例1制备的纯化后Prx4重组蛋白包被酶标板(0.5 μ g/孔)，4°C过夜，洗涤缓冲液洗涤5次，每次5分钟，拍干液体，每孔加入封闭液300μ 1，37°C孵育2h，加入100 μ I细胞培养上清，阳性对照选小鼠的免疫血清，阴性对照选SP2/0培上清，空白对照用洗涤液，37°C孵育2h ;洗涤酶标板:每孔加入100μ I ; I: 10000体积稀释的HRP标记的羊抗小鼠IG抗体，37°C孵育2h ;洗涤，拍干液体，加新鲜配制的邻苯二胺溶液100 μ I/孔，室温暗处反应10-15分钟，加终止液每孔100 μ I终止反应，酶标仪检测450nm吸光度值。结果为B细胞表位肽段抗原I和B细胞表位肽段抗原2，免疫BALB/C小鼠，融合成功后，经克隆化和ELISA筛选后，分别得到分泌过氧化物还原酶4的单克隆抗体的杂交瘤细胞株(由表位肽I制备的简称杂交瘤细胞1，由表位肽2制备的简称杂交瘤细胞2)，它们细胞培养上清效价达到1: 6400。杂交瘤细胞I和杂交瘤细胞2经数次冻存，体外传代培养3个月以上仍能稳定分泌抗体。7阳性杂交瘤细胞的克隆化筛选出阳性克隆后，立即采用有限稀释法将阳性杂交瘤细胞进行克隆化培养，制备饲养细胞，用IOml不完全培养基重悬，收集阳性克隆细胞并计数，用不完全培养基将阳性克隆细胞稀释到100个/20ml，取一块预先已加有滋养细胞的96孔细胞培养板，加入200 μ I细胞悬液，将剩下的阳性克隆细胞转移到24孔板中扩大培养，收集细胞液氮冻存，同时将培养板在37°C，5% CO2培养箱培养，第3天后显微镜下观察细胞生长情况，10天后用ELISA法(方法参照现代免疫学实验技术沈关心周汝麟主编)，并将强的阳性克隆再次克隆化，直至细胞阳性率达100%，即可定株。其中，从所述杂交瘤细胞I筛选并在此克隆后定株的杂交瘤细胞株培养上清的效价后再将定株的杂交瘤细胞扩大培养，送往中国典型培养物保藏中心(武汉大学)保藏，所得保藏编号为CCTCC C2012148，其可稳定分泌所述单克隆抗体。8小鼠腹水制备、抗体纯化及效价测定选用健康雌性Balb/c小鼠2组，每组10只，腹腔注射0.5ml灭菌石蜡油/鼠，1-2周后每只小鼠腹腔注射I X IO6个杂交瘤细胞I或杂交瘤细胞2，同时注射0.25ml等量混合的液体石蜡与不完全弗氏佐剂的混合物。小鼠明显产生腹水后拉颈处死，用吸管从腹腔取出腹水，4 离心15min,分离收集中段的澄清腹水液。选用HiTrap rProtein A HP柱接入AKTA Explorer纯化抗体，经SDS-PAGE检测纯度大于97%。纯化的抗体用间接ELISA法检测效价，杂交瘤细胞I组和杂交瘤细胞2组效价在达1: 10000以上，初步说明获得的单克隆抗体对Prx4有较高结合能力，分装冷冻保存。
应用商品化的Prx4蛋白作为抗原标准品，通过免疫印迹方法鉴定所制备单抗的有效性，结果显示抗Prx4单抗结合Prx4蛋白处可见清洗条带。本实施例的实验步骤详见《现代免疫学实验技术》(沈关心周汝麟主编)。9所述单克隆抗体的亲和力测定为检验抗过氧化物还原酶4的单克隆抗体(单抗I和单抗2)对过氧化物还原酶4的抗原的结合能力，运用基于抗原/抗体竞争结合原理的单抗亲和力常数(Kd)检测方法对所获单抗进行亲和力测定。将实施例1制备的纯化好的过氧化物还原酶4的重组抗原溶解在0.05mol/l的碳酸缓冲液(pH9.5)中，调整过氧化物还原酶4的终浓度为I μ g/ml,于ELISA板孔中每孔加100 μ 1，胶带封闭条板4°C过夜。次日拍干孔中液体，以含1% BSA的PBS溶液对各孔封闭2h，洗板并干燥后4°C保存备用。根据测定原理及方法建立抗原抗体反应系统，分别将单抗I和单抗2初始反应浓度稀释至40ng/ml,过氧化物还原酶4的抗原初始浓度稀释至360mg/ml。抗原浓度倍比稀释按30、15、7.5、3.75、1.875,0.938,0.469、
0.235 (单位为10_12mOl/l)进行，计算单抗I和单抗2亲和力常数。结果显示其具有高亲和力，单抗 I 和单抗 2 分别为 Kd = 5.3Xl(T8mol/L、Kd = 5.8 X l(T8mol/L。人Prx4的氨基酸序列为:MEALPLLAATTPDHGRHRRLLLLPLLLFLLPAGAVQGWETEERPRTREEECHFYAGGQVYPGEASRVSVADHSLHLSKAKISKPAPYWEGTAVIDGEFKELKLTDYRGKYLVFFFYPLDFTFVCPTEIIAFGDRLEEFRSINTEVVACSVDSQFTHLAWINTPRRQGGLGPIRIPLLSDLTHQISKDYGVYLEDSGHTLRGLFIIDDKGILRQITLNDLPVGRSVDETLRLVQAFQYTDKHGEVCPAGWKPGSETIIPDPAGKLKYFDKLN ；其中，氨基酸的中文、英文缩写，英文简写分别为:丙氨酸，Ala, A ;亮氨酸，Leu, L ;精氨酸，Arg, R ;赖氨酸，Lys, K ;天冬酰胺，Asn, N ；甲硫氨酸，Met, M ;天冬氨酸，Asp, D ;笨丙氨酸，Phe, F ;半胱氨酸，Cys, C ;脯氨酸，Pro, P ；谷氨酰胺，Gin, Q ;丝胺酸，Ser, S ;谷氨酸，Glu, E ;苏氨酸，Thr, T ;甘氨酸，Gly, G ;色氨酸，Trp, W ;组氨酸，His, H ;酪氨酸，Tyr, Y ;异亮氨酸，He, I ;颉氨酸，Val, V。通过实施2可以得出:氨基酸序列“WETEERPRTREE”，位于人Prx4序列的38-49位，含有单位氨基酸序列WETEERPRTREE，如“N—WETEERPRTREEE—C”或“N—VQGWETEERPRTREE—C”，在包含“WETEERPRTREE”肽单位时，只要其设计符合B细胞表位肽设计的其它规则参见《梁谨.B细胞构想表位预测方法的建立及初步应用》，可以制备出具有特异性抗体的单克隆抗体，含有单位肽单位后，其它差别仅会在效价上存在差异。另外，肽段I和肽段2分别制备的单克隆抗体，具有特异性，其可用于作为检测Prx4抗原含量的检测试剂。实施例3用于检测Prx4抗原的胶体金试纸的制备I纳米金试纸的制备方法(I)硝酸纤维素膜和结合垫的预处理将浓度等于lmg/mL的实施例2制备所得的单抗体I (保藏编号为CCTCC C2012148的杂交瘤细胞分泌)用XYZ-3000三维喷点仪喷点于硝酸纤维素膜上形成检测线，将浓度等于1.5mg/mL的实施例1制备的多克隆抗体用XYZ-3000三维喷点仪喷点于硝酸纤维素膜上形成质控线，喷涂了抗体的硝酸纤维素膜在37°C封闭、洗涤并干燥lh，得复合硝酸纤维素膜；将玻璃纤维素膜浸于纳米金标记浓度大于或等于6 μ g/mL的所述单体I中，在37°C干燥4小室后得复合结合垫。(2)纳米金免疫层析试纸的组装分别将样品垫、复合结合垫、复合硝酸纤维素膜和吸收垫依次粘在所述底板上，得用于检测Prx4抗原的纳米金试纸，所述复合硝酸纤维素膜上所述质控线靠近吸收垫端，所述检测线靠近结合垫端。用LN-5000切割机切割成0.4cm宽的试纸条，将其装入塑料盒中，密封包装，内置干燥剂，4°C保存。

用上述同样的方法制备含有单抗体2的纳米金免疫层析试纸，除单抗2的浓度为2mg/mL,其余参数和制备工艺不变。3纳米金试纸的原理和结果判定(I)纳米金试纸的原理和测试方法将抗体(所述单抗)包被于检测线，多克隆抗体包被于质控线；玻璃纤维素膜浸于抗体中，得结合垫。使用时，将检测试纸的样品垫端放入待检标本中，标本被样品垫吸收并通过毛细作用向检测试纸的吸收垫端层析，当上移到结合垫时，如果标本溶液中含有Prx4抗原，其可与纳米金标记的抗体发生特异性结合，形成抗原-抗体复合物，该复合物继续上移，当到达检测垫上的检测线时，Prx4抗原的另一结合位点可与单抗发生特异性结合，形成“抗体-抗原-抗体”双抗体夹心结构，从而使纳米金聚集在检测线上，使检测线显红色，多余的未与Prx4抗原结合的抗体则继续上移，到达质控线时，与多克隆抗体结合，形成抗原-抗体复合物，从而使纳米金聚集在质控线上，使质控线显红色，因此，当检测试纸上的检测线与质控线均显红色时，判为阳性结果；反之，如果标本溶液中不含有Prx4抗原，则在检测线处，不能形成“抗体-抗原-抗体”双抗体夹心结构，检测线不显红色，而纳米金标记的抗Prx4的单克隆抗体上移到质控线处，可形成抗原-抗体复合物，使质控线显红色，因此，当检测试纸上的检测线不显红色而质控线显红色时，判为阴性结果；当检测试纸的质控线不显红色时，不管检测线是否显红色，结果都判为操作失误或检测试纸失效，需重新检测。使用200位类风湿关节炎病人的血清和100位健康人的血清借助实施例3制备的2中胶体金试纸进行检测，其中，200位类风湿关节炎病人均为阳性，即检测试纸的检测线和质控线均显示红色。其中，100位健康人血清标本均为阴性，即检测试纸上的检测线不显红色而质控线显红色时。从实施例3可以证实，所述单抗I和单抗2均可用于检测类风湿关节炎，为检测类方式关节炎的诊断试剂。表位肽I和表位肽2为类风湿关节炎的特异性抗原。实施例4所述单克隆抗体在制备预测二型糖尿病诊断试剂中的应用一 ELISA实验原理本试剂盒应用双抗体夹心酶标免疫分析法测定标本中Prx4水平。用实施例2制备的单抗I (保藏编号为CCTCC C2012148的杂交瘤细胞分泌)作检测溶液A，包被微孔板(单抗I包被的体积稀释比依次为1: 500、1: IOOOU: 2000,1: 4000及1: 8000)，制成固相抗体，往包被有固相抗体的微孔中依次待测血浆、实施例1制备的多克隆抗体(检测溶液B)(包被的体积稀释比依次为I: 500,1: IOOOU: 2000、1:4000及I: 8000)及HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的Prx4呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值)，计算样品浓度。其中，单抗I优选的稀释体积为I: 2000，多克隆抗体的优选的稀释体积为1: 2000。同时，用实施例2制备的单抗2 (检测溶液A)包被微孔板(单抗2包被的体积稀释比依次为1: 10、1: 25、1: 50,1: 100及1: 200)，制成固相抗体，往包被有固相抗体的微孔中依次待测血浆、实施例1制备的多克隆抗体(检测溶液B)(包被的体积稀释比依次为1: 10、1: 25、1: 50,1: 100及1: 200)及HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的Prx4呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(0D值)，计算样品含量。耳、操作步骤各试剂在使用前平衡至室温。1.加样:分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。除空白孔外，余孔分别加标准溶液或待测样品lOOul，注意不要有气泡，轻轻混匀，酶标板加上盖，37°C反应120分钟。2.弃去液体，甩干，不用洗涤。3.每孔加检测溶液A工作液100ul，37°C，60分钟。洗板3次，350ul/每孔，甩干。4.每孔加检测溶液B工作液lOOul，37°C，60分钟，洗板5次，甩干。5.依序每孔加底物溶液90ul，37°C避光显色30分钟(此时肉眼可见标准品的前3-4孔有明显的梯度兰色，后3-4孔梯度不明显)。 6.依序每孔加终止溶液50ul，终止反应(此时兰色立转黄色)。用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度(0D值)。注意:每次实验留一孔作为空白调零孔，该孔不加任何试剂，只是最后加底物溶液及2NH2S04。测量时先用此孔调OD值至零。为防止样品蒸发，试验时将反应板放于铺有湿布的密闭盒内。三糖尿病人的检测取1000例二型糖尿病患者血清及200例正常人血清，用上述Elisa试剂盒对病人进行检测。取上述1200例人血清OD值的上限值和下限值以从小到大的顺序设定OD值区间，OD值的上限值和下限值设定为1，其中，当OD值位于O 34%区间内(不包含34% )，命名为区间1，判定为正常人；当OD值位于34% -100%区间(包含34% )，命名为区间2，判定为二型糖尿病患者。用上述方法判定的结果为:200例正常人血清位于区间I内，996例二型糖尿病患者位于区间2内。且二型糖尿病患者的严重程度，随Prx4含量的增高而增高，且和性氧簇(ROS)和活性氮簇(RNS)的含量呈正相关。
权利要求
1.表位肽，其特征在于:所述表位肽为含有的氨基酸序列为WETEERPRTREE的人工合成肽，即如SEQ ID NO: I所示。
2.根据权利要求1所述的表位肽，其特征在于:所述表位肽的氨基酸序列具体为:WETEERPRTREEE，即如 SEQ ID NO: 2 所示。
3.含有权利要求1或2所述表位肽的蛋白载体，其特征在于:所述表位肽与BSA、OVA、肌红蛋白、KLH和破伤风类毒素任一种蛋白载体连接，得含有所述表位肽的蛋白载体。
4.权利要求1或2所述表位肽制备的杂交瘤细胞。
5.根据权利要求4所述的杂交瘤细胞，其特征在于，所述杂交瘤细胞的生物保藏编号为 CCTCC C2012148。
6.权利要求1或2所述表位肽的特异性单克隆抗体。
7.根据权利要求6所述的特异性单克隆抗体，其特征在于，所述特异性单克隆抗体由生物保藏编号为CCTCC C2012148的杂交瘤细胞分泌。
8.权利要求6所述的特异性单克隆抗体在制备诊断二型糖尿病或类风湿关节炎诊断试剂中的应用。
9.权利要求1 或2所述的表位肽在制备诊断二型糖尿病诊断试剂中的应用。
全文摘要
本发明涉及蛋白质领域，特别涉及表位肽及其运用，所述表位肽为含有的氨基酸序列为WETEERPRTREE的人工合成肽，运用该肽制备的特异性单克隆抗体效价高，可用于制备检测糖尿病的特异性诊断试剂。
文档编号C07K7/08GK103232529SQ20121037849
公开日2013年8月7日 申请日期2012年10月9日 优先权日2011年10月10日
发明者陈志新, 熊新 申请人:张华