专利名称：一种利普司他汀的提纯方法
技术领域：
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种利普司他汀的提纯方法。
背景技术：
利普司他汀(Lipstatin)是毒三素链霉菌(Streptomyces toxytricini )的代谢产物，能选择性抑制胃肠道中胰腺肪酶的活性，减少人体对食物中脂肪的分解和吸收，从而达到控制体重的目的。由于利普司他汀性质不稳定，在空气中容易被氧化，而它的四氢衍生物奥利司他(Orlistat)具有相对稳定的特性，已经被罗氏公司成功开发为减肥药-赛尼可，是目前唯一一个作为非中枢神经系统作用而上市的治疗肥胖症的药物。目前，奥利司他的制备主要通过两种方法，一种是全合成法，其成本较高；另一种 是半合成法，即利用毒三素链霉菌发酵产生利普司他汀，再通过加氢反应生成奥利司他。发酵法生产利普司他汀成本相对较低。对于发酵法生产利普司他汀，近年来发展了很多利普司他汀的提纯方法，一般主要包括以下步骤发酵液预处理、有机溶媒浸提、萃取、色谱纯化后得到产品。目前提纯利普司他汀的方法主要存在以下缺点1、由于毒三素链霉菌发酵液粘度大，含有一定量的油性物质，发酵液的预处理大多采用板框压滤技术，直接压滤往往容易堵塞滤布，因此在发酵液中加入大量的助滤剂如硅藻土、珍珠岩等，使其劳动强度比较大，而且在过滤过程中还容易造成利普司他汀的损失；2、浸提所用的有机溶媒大多为丙酮和乙醇，由于这两种溶剂的亲水、亲脂性，造成提取到的利普司他汀水溶性杂质较多，从而增加了后续的纯化难度，也容易引起利普司他汀的降解；3、使用的溶媒种类偏多；4、提纯得到的利普司他汀纯度和收率偏低。胡为民等在《毒三素链霉菌生产利普司他汀的发酵与提取工艺》(《中国医药工业杂志》，2007年第38卷第10期，705-708)—文中公开了利普司他汀提取工艺，该技术方案包括了丙酮萃取与超声破碎细胞、乙酸乙酯萃取、正相柱色谱粗分离及半制备柱分离纯化后，获得的利普司他汀达到94%，然而对收率及含量均没有提及，并且该方案比较繁琐，成本较高。中国发明专利申请公开说明书CN102558104A公开了一种利用超临界CO2流体萃取，并通过短程蒸馏提纯得到的利普司他汀，其纯度约为94%，收率仅约为50%。如果利普司他汀的纯度偏低，会造成氢化后的奥利司他中有很多杂质，使得现有方法很难制备符合医用标准的高纯度奥利司他。因此，这就对利普司他汀的纯度提出了较高的要求，如中国发明专利申请公开说明书CN102070568A公开了一种奥利司他的制备方法，即用一种基于动态轴向压缩柱的半制备或制备型高效液相系统进行奥利司他纯化的方法，制备出了单杂小于O. 1%，含量大于99. 0%的奥利司他，但它要求利普司他汀的纯度>85%,含量约50% 70%。
发明内容
为了克服现有工艺技术上的缺点，实现提取纯化利普司他汀过程的高效率、低成本，减轻对环境的污染，并且为后期制备高纯度的奥利司他提供方便。发明人经过大量试验研究提供了一种从毒三素链霉菌发酵液中提纯利普司他汀的工艺。本发明的技术方案概述如下①萃取含有利普司他汀的发酵液中加入乙酸乙酯，在搅拌的条件下萃取2 5小时，静置分相后，上清液浓缩至干，得黄褐色利普司他汀粗品；②溶解、过滤将①所得的黄褐色利普司他汀粗品用有机溶媒进行溶解，过滤除去不溶性杂质，将滤液减压浓缩至原体积的1/4 1/6，得浓缩液；③硅胶柱层析将硅胶填料装入层析柱，用庚烷平衡好后，将②所得的浓缩液上到硅胶柱，上样量为柱体积的10% 20%，用庚烷和乙酸乙酯的混合溶媒作为流动相进行洗杂和洗脱，流速控制在O. 5 1. 5倍柱体积/小时，收集纯度> 94%的利普司他汀洗脱液，将洗脱液减压浓缩至干，得浅黄色油状利普司他汀粗品；④结晶将③所得的浅黄色油状利普司他汀粗品用有机溶媒溶解，降温法结晶，过滤后得利普司他汀白色晶体。本发明对步骤①中乙酸乙酯的加入量与发酵液的体积比进行了优选，优选地，乙酸乙酯的加入量与发酵液体积比为2 4:1。本发明对步骤②中有机溶媒进行了优选，优选地，上述有机溶媒为环己烷、庚烷或正己烷，更优选地，上述有机溶媒为庚烷。庚烷溶解液过滤浓缩后可直接作为上柱液进行硅胶柱层析，操作更加方便，且减少了溶媒使用种类。本发明对步骤②中有机溶媒的用量进行了优选，优选地，上述有机溶媒与利普司他汀按重量体积比为20 40:1。在此条件下，溶解液粘度较小，容易过滤。本发明对步骤③中所用的硅胶填料进行了优选，优选地，上述硅胶填料为100 200目、200 300目或300 400目中的一种，更优选地，上述硅胶填料为200 300目。硅胶填料太粗，吸附量较小。硅胶填料太细，虽然吸附量大，但洗脱速度较慢。本发明对步骤③中所用的流动相进行了优选，优选地，上述洗杂所用的流动相中庚烷与乙酸乙酯的体积比为95:5 88:12，洗脱所用的流动相中庚烷与乙酸乙酯的体积比为85:15 70:30，在此条件下，更有利于杂质，特别是色素类物质的去除，对利普司他汀纯度和含量的提高起到关键性作用。本发明对步骤④中的有机溶媒进行了优选，优选地，上述有机溶媒为石油醚、庚烷或正己烷，更优选地，上述有机溶媒为庚烷。本发明对步骤④中的有机溶媒进行了优选，优选地，上述有机溶媒，按重量体积比计，有机溶媒的加入量与利普司他汀的比为15 25:1。有机溶媒加入量太多，造成利普司他汀浓度偏低，结晶收率太低；有机溶媒加入量太少，会使得利普司他汀在结晶过程中出现粘稠状态，从而影响结晶效果。本发明与现有技术相比具有以下优势①本发明通过大量实验研究后，省略对发酵液进行预处理的步骤，而选用非水溶性有机溶媒乙酸乙酯直接萃取的方法，得到的利普司他汀纯度较高，而且萃取收率可达92%以上； ②本发明通过实验证明，获得了纯度≥97%，含量在75% 85%的利普司他汀，总收率达72%，为后期制备高纯度的奥利司他提供方便；在最优选的条件下，仅使用乙酸乙酯和庚烷两种溶媒，即可获得纯度> 97%，含量达84%的利普司他汀；③本发明工艺简单，操作方便，溶媒回收后可重复使用，生产成本比较低，减轻了对环境的污染。
具体实施例方式下面通过实施例对本发明作进一步说明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例中。实施例1取发酵液2. OL (发酵单位6. 6g/L)，加入乙酸乙酯8. 0L，在搅拌条件下，萃取5h。静置Ih后分相，将上层萃取液减压浓缩至干，得到黄褐色利普司他汀粗品66. 2g。用240mL庚烷将黄褐色利普司他汀粗品溶解、过滤后，将滤液减压浓缩至体积为60. OmL，得浓缩液。 硅胶柱选用100 200目的硅胶作为填料，用庚烷平衡好后，将浓缩液上柱。先用庚烷与乙酸乙酯体积比为95:5的流动相洗杂3倍柱体积，再用庚烷与乙酸乙酯体积比为70:30的流动相洗脱，流速为O. 5倍柱体积/小时，收集利普司他汀HPLC检测纯度> 94%(按峰面积归一化法计算)的洗脱液。将洗脱液合并后，减压浓缩至干，得到浅黄色利普司他汀粗品。用230mL石油醚溶解利普司他汀粗品后，通过降温法进行结晶，过滤后得到利普司他汀白色晶体12. 7g (含利普司他汀9. 6g)，HPLC检测纯度97. 1%，含量75. 6%，总收率72. 7%。实施例2取发酵液2. OL (发酵单位6. 5g/L)，加入乙酸乙酯4. 0L，在搅拌条件下，萃取4h。静置Ih后分相，将上层萃取液减压浓缩至干，得到黄褐色利普司他汀粗品64. Sg。用350mL庚烷将黄褐色利普司他汀粗品溶解、过滤后，将滤液减压浓缩至体积为64. OmL，得浓缩液。硅胶柱选用200 300目的硅胶作为填料，用庚烷平衡好后，将浓缩液上柱。先用庚烷与乙酸乙酯体积比为88:12的流动相洗杂3倍柱体积，再用庚烷与乙酸乙酯体积比为80:20的流动相洗脱，流速为O. 8倍柱体积/小时，收集利普司他汀HPLC检测纯度> 94%(按峰面积归一化法计算)的洗脱液。将洗脱液合并后，减压浓缩至干，得到浅黄色利普司他汀粗品。用160mL庚烷溶解利普司他汀粗品后，通过降温法进行结晶，过滤后得到利普司他汀白色晶体11. 5g(含利普司他汀9. 7g)，HPLC检测纯度97. 8%，含量84. 3%，总收率73. 5%。实施例3取发酵液2. OL(发酵单位6. 2g/L)，加入乙酸乙酯6. OL,在搅拌条件下，萃取2h。静置Ih后分相，将上层萃取液减压浓缩至干，得到黄褐色利普司他汀粗品63. Sg。用460mL正己烷将黄褐色利普司他汀粗品溶解、过滤后，将滤液减压浓缩至体积为76. OmL，得浓缩液。硅胶柱选用300 400目的硅胶作为填料，用庚烷平衡好后，将浓缩液上柱。先用庚烷与乙酸乙酯体积比为90:10的流动相洗杂3倍柱体积，再用庚烷与乙酸乙酯体积比为75:25的流动相洗脱，流速为1. 2倍柱体积/小时，收集利普司他汀HPLC检测纯度> 94%(按峰面积归一化法计算)的洗脱液。将洗脱液合并后，减压浓缩至干，得到浅黄色利普司他汀粗品。
用240mL庚烷溶解利普司他汀粗品后，通过降温法进行结晶，过滤后得到利普司他汀白色晶体11. lg(含利普司他汀9. 0g)，HPLC检测纯度97. 5%，含量81. 1%，总收率72. 6%。实施例4取发酵液2. OL(发酵单位6. 9g/L)，加入乙酸乙酯8. 0L,在搅拌条件下，萃取3h。静置Ih后分相，将上层萃取液减压浓缩至干，得到黄褐色利普司他汀粗品75. 5g。用380mL环己烷将黄褐色利普司他汀粗品溶解、过滤后，将滤液减压浓缩至体积为70. OmL，得浓缩液。硅胶柱选用200 300目的硅胶作为填料，用庚烷平衡好后，将浓缩液上柱。先用庚烷与乙酸乙酯体积比为90:10的流动相洗杂3倍柱体积，再用庚烷与乙酸乙酯体积比为85:15的流动相洗脱，流速为1. 5倍柱体积/小时，收集利普司他汀HPLC检测纯度> 94%(按峰面积归一化法计算)的洗脱液。将洗脱液合并后，减压浓缩至干，得到浅黄色利普司他汀粗品。
用210mL正己烷溶解利普司他汀粗品后，通过降温法进行结晶，过滤后得到利普司他汀白色晶体12. 9g (含利普司他汀10. 0g), HPLC检测纯度97. 0%，含量77. 6%，总收率72. 5%。
权利要求
1.一种利普司他汀的提纯方法，其特征在于包括如下步骤①萃取含有利普司他汀的发酵液中加入乙酸乙酯，在搅拌的条件下萃取2 5小时， 静置分相后，上清液浓缩至干，得黄褐色利普司他汀粗品；②溶解、过滤将①所得的黄褐色利普司他汀粗品用有机溶媒进行溶解，过滤除去不溶性杂质，将滤液减压浓缩至原体积的1/4 1/6，得浓缩液；③硅胶柱层析将硅胶填料装入层析柱，用庚烷平衡好后，将②所得的浓缩液上到硅胶柱，上样量为柱体积的10% 20%，用庚烷和乙酸乙酯的混合溶媒作为流动相进行洗杂和洗脱，流速控制在O. 5 1. 5倍柱体积/小时，收集纯度> 94%的利普司他汀洗脱液，将洗脱液减压浓缩至干，得浅黄色油状利普司他汀粗品；④结晶将③所得的浅黄色油状利普司他汀粗品用有机溶媒溶解，降温法结晶，过滤后得利普司他汀白色晶体。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤①所述乙酸乙酯的加入量与发酵液体积比为2 4:1。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤②所述有机溶媒为环己烷、庚烷或正己烧。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于步骤②所述有机溶媒为庚烷。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤②所述有机溶媒，按重量体积比计，有机溶媒的加入量与利普司他汀的比为20 40:1。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤③所述硅胶填料为100 200目、 200 300目或300 400目中的一种。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤③所述洗杂所用的流动相中庚烷与乙酸乙酯的体积比为95:5 88:12。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤③所述洗脱所用的流动相中庚烷与乙酸乙酯的体积比为85:15 70:30。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤④所述的有机溶媒为石油醚、庚烷或正己烷。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤④所述的有机溶媒，按重量体积比计，其加入量与利普司他汀的比为15 25:1。
全文摘要
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种利普司他汀的提纯方法。本发明的技术方案主要包括发酵液直接萃取浓缩、有机溶媒溶解过滤、硅胶柱层析以及结晶等步骤，从而得到重量含量75%-85%，HPLC检测纯度≥97%的利普司他汀，总收率达72%。本发明的提纯方法具有步骤简单、周期短、产品收率高、质量好，所用溶媒均可以回收再利用，大大降低了生产成本，减轻了对环境的污染。
文档编号C07D305/12GK102993134SQ20121059418
公开日2013年3月27日 申请日期2012年12月31日 优先权日2012年12月31日
发明者赵志全, 梁红宝 申请人:鲁南新时代生物技术有限公司