一种跨膜受体的单克隆抗体的筛选方法
【专利摘要】本发明公开了一种跨膜受体的单克隆抗体的筛选方法，通过包被不表达跨膜受体的细胞膜以及表达或高表达跨膜受体的细胞膜，成对、平行地进行差异化ELISA检测，可以大规模筛选针对跨膜受体的单克隆抗体。本发明类似于常规的ELISA，可以高通量、快速、便捷地筛选针对完整跨膜受体的单克隆抗体，具有非常高的检测灵敏度；筛选出来的候选抗体经过FACS验证确认。
【专利说明】一种跨膜受体的单克隆抗体的筛选方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种单克隆抗体的筛选方法，特别涉及一种跨膜受体的单克隆抗体的筛选方法。
【背景技术】
[0002]G蛋白偶联受体(GPCR)、酪氨酸激酶受体(RTK)以及离子通道(1n channel)是细胞膜上非常重要的跨膜受体，它们将激素、神经递质、肽类等信号分子转导入细胞内，通过跨膜受体传递并放大信号。目前80%临床使用药物的靶点都集中在跨膜受体上，它们通过与跨膜受体结合而起作用，有的药物激活跨膜受体，有的药物抑制跨膜受体活性，从而影响下游信号的传导，进而改变细胞内生理生化反应。以跨膜受体为靶点的抗体药物，由于治疗性抗体具有非常好的靶标选择性和代谢稳定性，是很重要的一类药物，并日益受到制药界的青睐。
[0003]目前，以可溶性蛋白为抗原制备、筛选单克隆抗体相对容易，而制备针对跨膜受体蛋白的单克隆抗体就会非常困难。一方面是因为制备纯化的可溶性跨膜受体蛋白，需要去垢剂维持结构的稳定，但通常在纯化后都会变性，失去特定构象，这样限制了利用纯化的跨膜受体作为抗原来筛选特异性结合的抗体；另一种策略是基于跨膜受体拓扑学和结构预测，合成跨膜受体中亲水区的多肽或串联多肽，并以此作为抗原来筛选抗体，其缺点在于会大量遗漏识别结构性表位的抗体，甚至是筛选出的抗体不识别具有天然构象的跨膜受体。还有一种办法是表达跨膜受体的N’端胞外区，并以此作为抗原来筛选针对跨膜受体的抗体，这种筛选方法也很有限，比如对于某些GPCR来说，它们的N’端胞外区很短，而且具有调控作用的功能性抗体多数是结合在跨膜受体的Loop区。
[0004]以完整跨膜受体蛋白为抗原筛选特异性结合抗体的筛选方法也非常有限，通常有流式细胞术(FACS)、全细胞ELISA (酶联免疫吸附剂测定)以及荧光微体积检测技术(Fluorescent microvolume assay technology, FMAT)。其中流式细胞术很难做到高通量筛选，不容易做到超过1000个以上杂交瘤细胞上清的检测；全细胞ELISA需要将细胞固定在96孔板中，因为有内源性的过氧化物酶活性，通常使得检测背景很高，更麻烦的是整个过程需要经过很多次的洗涤，细胞很容易脱落，这样筛选的重复性很差；FMAT采用荧光标记的二抗作为检测手段，信号放大远不及化学发光，那么检测灵敏度很有限。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种简便、快速、高通量且筛选成本较低的跨膜受体的单克隆抗体的筛选方法，以克服现有技术存在的上述不足。
[0006]本发明以内皮素受体ETaR的抗体的筛选为例，介绍这种快速简便的跨膜受体抗体的筛选方法。受体内皮素受体ETaR属于七次跨膜G蛋白偶联受体(GPCR)。内皮素受体ETaR是好的药物靶点，它的抗体可用于治疗肺动脉高压或其诊断。
[0007]本发明解决其技术问题所采用的技术方案是: 一种跨膜受体的单克隆抗体的筛选方法，所述方法包括如下步骤:
(1)免疫原稳定细胞株的构建
将带有hETaR基因的载体转染于二氢叶酸还原酶缺陷型中国仓鼠卵巢细胞，在甲氨蝶呤梯度浓度培养下加压筛选，然后用FACS检测，获得高表达hETaR的稳定细胞株；
(2)抗体的制备
用步骤(I)得到的高表达hETaR的稳定细胞株作为hETaR免疫原免疫小鼠后，用FACS方法检测血清效价直至适合抗体滴度(样品的FACS峰值与阴性对照比较，右移I个log单位以上)时，杀死小鼠，获取小鼠脾脏细胞，然后与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行融合得到杂交瘤细胞；
(3)细胞膜的制备
用PBS缓冲液洗涤步骤(I)得到的高表达hETaR的稳定细胞株，离心弃上清液后，沉淀先用缓冲液A重悬，反复吹吸重悬液50-100次后，补加缓冲液A，离心，沉淀用缓冲液A洗涤后，离心，沉淀用缓冲液B重悬，最后用蛋白浓度测定试剂盒进行膜总蛋白定量，分装，得表达hETaR的细胞膜；
用PBS缓冲液洗涤二氢叶酸还原酶缺陷型中国仓鼠卵巢细胞，离心弃上清液后，沉淀先用缓冲液A重悬，反复吹吸重悬液50-100次后，补加缓冲液A，离心，沉淀用缓冲液A洗涤后，离心，沉淀用缓冲液B重悬，最后用蛋白浓度测定试剂盒进行膜总蛋白定量，分装，得不表达hETaR的细胞膜；
(4)基于细胞膜的ELISA筛选
通过包被不表达hETaR的细胞膜作为对照，与包被表达hETaR的细胞膜成对、平行检测步骤(2)杂交瘤细胞培养后的上清液，进行差异化ELISA检测，从而大规模筛选出针对hETaR这一跨膜受体的单克隆抗体。
[0008]作为优选，步骤(I)中甲氨蝶呤梯度浓度范围为150ηΜ_10μΜ浓度。
[0009]作为优选，缓冲液A的配比为:10 mM HEPES，I mM MgCl2, pH 7.4,0.1 mM苯甲基磺酰氟，2x罗氏蛋白酶抑制剂。
[0010]作为优选，缓冲液B的配比为:10 mM HEPES，I mM MgCl2, pH 7.4，Ix罗氏蛋白酶抑制剂。
[0011]作为优选，步骤(4)具体步骤为:用PBS缓冲液将表达hETaR的细胞膜、不表达hETaR的细胞膜稀释后，分别进行ELISA筛选:以1-1OOyg /孔的量包被ELISA板，4°C过夜，吸去ELISA板孔中液体，然后用PBST洗涤，加入酪蛋白溶液封闭，加入作为第一抗体的步骤(2)杂交瘤细胞培养后的上清液孵育后，洗涤，加入第二抗体GxM-HRP-Fc孵育后，洗涤，加入TMB显色底物反应，最后用硫酸终止，用酶标仪检测对比后，从而大规模筛选出针对hETaR这一跨膜受体的单克隆抗体。
[0012]本发明主要内容为:a用高表达跨膜受体抗原的稳定细胞株，制备表达有跨膜受体抗原的细胞膜；b建立基于细胞膜的ELISA筛选方法；c筛选出的抗体得到流式细胞术的验证。
[0013]本发明的关键特征是:采用低渗溶液(缓冲液A、缓冲液B)裂解高表达有完整跨膜受体的细胞，高速离心洗涤后获取细胞膜，也即是微小细胞囊泡。完整跨膜受体镶嵌在低渗获取的微小细胞囊泡上，仍然可以保持天然的构象以及正确的朝向。然后利用细胞膜上带有大量的负电荷，包被96孔板，之后的封闭、一抗二抗孵育、洗涤、显色和终止，建立了基于细胞膜的ELISA筛选。
[0014]本发明的有益效果是:
本发明提供了一种针对跨膜受体的单克隆抗体的筛选技术，类似于常规的ELISA，可以高通量、快速、便捷地筛选针对完整跨膜受体的单克隆抗体，具有非常高的检测灵敏度；筛选出来的候选抗体经过FACS验证确认。
【专利附图】
【附图说明】
[0015]图1是本发明的基于细胞膜的ELISA筛选杂交瘤细胞上清。每一个杂交瘤细胞上清分别用包被有CHO-DHFR-hETaR细胞膜和对照的CHO-DHFR细胞膜进行平行筛选，标记粗体下划线和灰色背景表示针对hETaR特异性结合的抗体上清。
[0016]图2:流式细胞术检测几个筛选出的单克隆抗体7B6，38G1和18E3与CHO-DHFR细胞(虚线)、CHO-DHFR-hETaR (实线)结合图。灰色峰是CHO-DHFR细胞本身，灰色峰和虚线峰分别为阴性对照。
[0017]图3:通过与全细胞ELISA方法(表2)对比，用筛选出的单克隆抗体(7B6，38G1，54C11，54C12和80H4)验证细胞膜ELISA方法(表I)。
【具体实施方式】
[0018]下面通过具体实施例，并结合附图，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。
[0019]本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
实施例
[0020]1、免疫用抗原细胞稳定株的构建
接种CH0-DHFR_ (二氢叶酸还原酶缺陷型中国仓鼠卵巢细胞，市售)至6孔板中，24h后用带有hETaR基因的载体(市售)转染,转染前更换培养液，按照Invitrogen公司推荐Lipofectamine 2000的转染条件进行转染。48小时后，再换为含有浓度为150nM的MTX(甲氨蝶呤，市售)的完全培养基，每隔3天换液，待两周左右，出现稳定生长的克隆，逐渐提高MTX的浓度进行加压筛选，优选的MTX使用浓度范围为150ηΜ-10 μ Μ。构建的稳定细胞株分别进行FACS检测，10 μ M MTX筛选后的CHO-DHFR-hETaR细胞膜上hETaR有大量表达，经过克隆筛选获得高表达hETaR的稳定细胞株。
[0021]2、抗体的制备
将在弗氏佐剂(市售)中乳化的hETaR免疫原(高表达hETaR的稳定细胞株)以1-1OOyg的剂量皮下注射BALB/c小鼠(6_8周龄)。2周后，使用不完全弗氏佐剂乳化的hETaR免疫原，加强免疫小鼠，此后每周加强一次。通过眼球放血或剪尾的方式采血，进行FACS检测血清效价。直至适合抗体滴度时(样品的FACS峰值与阴性对照比较，右移I个log单位以上)，杀死小鼠，获取脾脏细胞，和小鼠骨髓瘤细胞SP2/0 (市售)进行融合。将所得的杂交瘤细胞在96孔板中进行培养，并进行HAT (次黄嘌呤、氨甲喋呤和胸苷)筛选，以除去非融合的细胞。7-10天后收取培养板中的杂交瘤细胞的上清液进行ELISA检测。
[0022]3、细胞膜的制备
ImM EDTA消化贴壁细胞，离心收集细胞后计数，_80°C冷冻保存，或者直接用于细胞膜抗原的制备。用4°C预冷PBS Ix洗涤细胞(高表达hETaR的稳定细胞株)，2000rpm离心5分钟后，完全移去上清。先用1ml缓冲液A (10 mM HEPES，I mM MgCl2,pH 7.4,0.1 mM苯甲基磺酰氟，2x罗氏蛋白酶抑制剂(Roche PI cocktail,市售))重悬,用4#针头反复吹吸细胞液50-100次后，补加20ml缓冲液A。lOOOOrpm，4°C离心60分钟。沉淀用缓冲液A洗涤一次，离心后去除上清，沉淀用5-10ml缓冲液B (10 mM HEPES, I mM MgCl2, pH 7.4，Ix罗氏蛋白酶抑制剂(Roche PI cocktail,市售))重悬。最后用蛋白浓度测定试剂盒(Pierce BCA Protein Assay Kit,市售)进行膜总蛋白定量,分装,得表达hETaR的细胞膜(CHO-DHFR-hETaR 细胞膜)，_20°C保存。
[0023]不表达hETaR的细胞膜(CH0-DHFR细胞膜)来源为二氢叶酸还原酶缺陷型中国仓鼠卵巢细胞，制备方法同上。
[0024]4、基于细胞膜的ELISA筛选
用PBS将CHO-DHFR-ETaR或CH0-DHFR细胞膜稀释成10 μ g/ml,以100 μ I/孔包被于高亲和力的96孔板中，4°C过夜。第二天吸去孔中液体，用0.05% PBST洗涤3次。200μ1/孔加入1%酪蛋白的PBST溶液作为封闭液，置于37°C封闭2小时。经过酪蛋白封闭后，力口入步骤(2)杂交瘤细胞的上清液(一抗)4°C孵育90 min。多次洗涤后，每孔加入100 μ I稀释的(1:5000 稀释于 PBST 溶液)GxM-HRP-Fc (与 HRP (Horseradish Peroxidase，辣根过氧化物酶)偶联的羊抗鼠的第二抗体，市售)二抗，37°C孵育0.5h。洗涤5次后，每孔加Λ 100 μ I TMB (3，3’，5，5’-四甲基联苯胺，市售)显色底物，371:反应151^11，等体积的2皿H2SO4终止，读取0D450值，如图1。
[0025]在筛选实验中，阳性对照为免疫小鼠的血清；阴性对照为细胞培养基上清。选取分泌抗hETaR抗体的杂交瘤株，进行克隆化以获得能稳定分泌针对hETaR的细胞株。再选取杂交瘤细胞分泌的抗体上清进行FACS验证。
[0026]5、阳性杂交瘤细胞上清流式分析鉴定(FACS)
用含1mM EDTA的PBS收集15个感兴趣的细胞，分别加入1.5ml EP管，离心后弃上清，阴性对照样本用流式上样缓冲液(PBS，2% FBS)重悬。阳性处理组细胞每管加适量抗体上清，室温孵育；离心，弃上清，用流式上样缓冲液洗一次，再离心，重悬，加入1:100稀释的FITC标记的羊抗鼠荧光二抗(BD，200 μ I/孔，市售)，室温避光孵育30 min ;离心，弃上清，再用流式上样缓冲液洗一次，离心，最后用流式上样缓冲液重悬，上机检测。杂交瘤细胞上清和表达有hETaR的CHO-DHFR细胞有特异性结合，灰色峰和虚线峰分别为阴性对照，杂交瘤细胞上清对应的实线峰有明显右移(图2)。
[0027]6、细胞膜的ELISA筛选与全细胞的ELISA筛选的对比实验
用DMEM将CHO-DHFR-hETaR或CHO-DHFR细胞稀释成15细胞/ml，以20000细胞/孔包(到第二天大约是40000细胞/孔包)被于96孔板中，37°C，5% CO2过夜。第二天吸去孔中液体，用0.05% PBST洗涤3次。200μ1/孔加入1%酪蛋白封闭液，置于37°C封闭2小时。经过酪蛋白封闭后，加入杂交瘤细胞上清4°C孵育90 min。多次洗涤后，每孔加入100 μ I稀释的GxM-HRP-Fc 二抗，37°C孵育0.5h。洗涤5次后，每孔加入100 μ I TMB显色底物，37°C反应15min，等体积的2M H2SO4终止，读取0D450值，阳性对照为免疫小鼠的血清；阴性对照为细胞培养基上清。同时，相应的基于细胞膜的ELISA筛选法与其对照如图3。
[0028]同现有的全细胞ELISA筛选方法比较:本发明基于细胞膜的ELISA抗体筛选方法更便捷，消除了细胞的无菌操作；此方法更准确，可以消除因洗板而细胞脱落引起的筛选误差。因此，我们这里描述了一个新的并优于先前全细胞ELISA的抗体筛选方法。
[0029]以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。
【权利要求】
1.一种跨膜受体的单克隆抗体的筛选方法，其特征在于:所述方法包括如下步骤: (1)免疫原稳定细胞株的构建 将带有hETaR基因的载体转染于二氢叶酸还原酶缺陷型中国仓鼠卵巢细胞，在甲氨蝶呤梯度浓度培养下加压筛选，然后用FACS检测，获得高表达hETaR的稳定细胞株； (2)抗体的制备 用步骤(I)得到的高表达hETaR的稳定细胞株作为hETaR免疫原免疫小鼠后，用FACS方法检测血清效价直至适合抗体滴度时，杀死小鼠，获取小鼠脾脏细胞，然后与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行融合得到杂交瘤细胞； (3)细胞膜的制备 用PBS缓冲液洗涤步骤(I)得到的高表达hETaR的稳定细胞株，离心弃上清液后，沉淀先用缓冲液A重悬，反复吹吸重悬液50-100次后，补加缓冲液A，离心，沉淀用缓冲液A洗涤后，离心，沉淀用缓冲液B重悬，最后用蛋白浓度测定试剂盒进行膜总蛋白定量，分装，得表达hETaR的细胞膜； 用PBS缓冲液洗涤二氢叶酸还原酶缺陷型中国仓鼠卵巢细胞，离心弃上清液后，沉淀先用缓冲液A重悬，反复吹吸重悬液50-100次后，补加缓冲液A，离心，沉淀用缓冲液A洗涤后，离心，沉淀用缓冲液B重悬，最后用蛋白浓度测定试剂盒进行膜总蛋白定量，分装，得不表达hETaR的细胞膜； (4)基于细胞膜的ELISA筛选 通过包被不表达hETaR的细胞膜作为对照，与包被表达hETaR的细胞膜成对、平行检测步骤(2)杂交瘤细胞培养后的上清液，进行差异化ELISA检测，从而大规模筛选出针对hETaR这一跨膜受体的单克隆抗体。
2.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于:步骤(I)中甲氨蝶呤梯度浓度范围为150ηΜ-10μΜ 浓度。
3.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于:缓冲液A的配比为:10mM HEPES，ImM MgCl2, pH 7.4,0.1 mM苯甲基磺酰氟，2x罗氏蛋白酶抑制剂。
4.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于:缓冲液B的配比为:10mM HEPES，ImM MgCl2, pH 7.4，Ix罗氏蛋白酶抑制剂。
5.根据权利要求1或2或3或4所述的筛选方法，其特征在于:步骤(4)具体步骤为:用PBS缓冲液将表达hETaR的细胞膜、不表达hETaR的细胞膜稀释后，分别进行ELISA筛选:以1-1OOyg /孔的量包被ELISA板，4°C过夜，吸去ELISA板孔中液体，然后用PBST洗涤，加入酪蛋白溶液封闭，加入作为第一抗体的步骤(2 )杂交瘤细胞培养后的上清液孵育后，洗涤，加入第二抗体GxM-HRP-Fc孵育后，洗涤，加入TMB显色底物反应，最后用硫酸终止，用酶标仪检测对比后，从而大规模筛选出针对hETaR这一跨膜受体的单克隆抗体。
【文档编号】C07K16/28GK104513313SQ201310445524
【公开日】2015年4月15日 申请日期:2013年9月27日 优先权日:2013年9月27日
【发明者】张 成, 汪笑峰, 盖顺, 景书谦 申请人:杭州鸿运华宁生物医药工程有限公司