一种熊去氧胆酸的提取方法
【专利摘要】本发明公开了一种熊去氧胆酸的提取方法，包括酯化、提取、重结晶、水解、第二次重结晶等步骤。本发明以猪胆汁作为提取原料，猪胆汁提取胆红素后，收集提取猪去氧胆酸和猪胆酸后的滤液进行分离而制得熊去氧胆酸，猪胆汁原料广泛易得，降低了熊去氧胆酸的制备成本。本发明提取工艺中选取乙酸酐为酯化试剂，确定了熊去氧胆酸水解及重结晶精制的条件，确定采用氢氧化钠作为碱催化剂，经该工艺流程，猪胆酸的总收率达到15%以上。
【专利说明】一种熊去氧胆酸的提取方法【技术领域】
[0001]本发明属于生物医药【技术领域】，具体涉及一种熊去氧胆酸的提取方法。
【背景技术】
[0002]胆汁是人体或脊椎动物肝细胞连续分泌的产物，是一种具有苦味的粘滞性有色碱性液体，其成分除水以外，主要有胆汁酸、胆盐和胆色素，此外还有少量的胆固醇、脂肪酸、卵磷脂、电解质和蛋白质等。现今较常见的动物胆汁一般为禽类胆汁、猪胆汁、牛胆汁、熊胆汁以及蛇胆汁等等。胆汁酸是胆汁的主要成分，约占胆汁总量的50%~70%，胆汁的生理作用主要就是由胆汁酸来发挥，在作为药物时，胆汁酸可以用来解热、镇痉镇咳、调节血压、强心利胆、抑菌抗炎以及调节免疫等，且活性较强、副作用又小、价格低廉，因此受到广大用药者的欢迎。[0003]在各种动物胆汁中，猪胆汁是最常见且产量最大的，自古代开始就被广泛应用于临床，如用猪胆汁治疗急性黄疸型传染性肝炎、百日咳、急性肠炎以及胃溃疡等，均能收到良好的治疗效果。猪胆汁中主要含胆汁酸类、胆色素、粘蛋白、脂类及无机物等，胆汁酸则主要包含猪去氧胆酸、猪胆酸、鹅去氧胆酸、3 α -羟基-6-氧-5 α -胆烷酸以及胆石酸等。其中猪去氧胆酸约占40%，鹅去氧胆酸约占25%。
[0004]熊去氧胆酸化学名为3 α，7 β - 二羟基_5 β -胆烷酸，分子式C24H49O4,分子量为392.58，为白色或微黄色粉末，易溶于乙醇、冰乙酸，稍溶于氯仿，几乎不溶于乙醚和水。熊去氧胆酸是1920年首先从熊胆汁中发现，1927年Shoda从熊胆汁中分离得到晶体，1937年确定其化学结构。天然熊去氧胆酸来源于熊胆汁，随着临床应用的需求量不断增加，天然熊去氧胆酸远远不能满足市场需求。杀熊取胆被国家明令禁止，因此，通过化学合成方法获得熊去氧胆酸变得越来越重要。最初，人们成功以胆酸、去氧胆酸等为原料，合成了熊去氧胆酸，但此种方法反应步骤多，工艺复杂，产率低，很难进行产业化大规模生产。
【发明内容】
[0005]本发明所要解决的技术问题是提供一种以猪胆汁为原料分离熊去氧胆酸的方法，该方法提取工艺简单，无需特殊设备，原料来源广泛易得，对环境污染小，产品纯度高。
[0006]为解决上述技术问题，本发明釆取的技术方案如下:
[0007]一种熊去氧胆酸的提取方法，包括如下步骤:
[0008](I)取提完胆红素的猪胆汁下脚料，经皂化、水解、脱色及干燥后得到棕褐色的猪总胆汁Ife粗品；
[0009](2)取猪总胆汁酸粗品，经酯化后试剂以醇提取、重结晶得到猪总胆汁酸酯粉末，再对猪总胆汁酸酯在碱性条件下水解后、第二次重结晶得到猪去氧胆酸白色晶体；
[0010](3)将步骤(1)和(2)得到的滤液、洗液以及重结晶母液合并，减压回收溶剂得到棕色粘稠状物，加入乙酸酐酯化试剂，在乙酸钠催化下进行酯化反应生成猪胆酸酯；
[0011](4)在碱性条件下以烷提取猪胆酸甲酯三醋酸酯；[0012](5)将上述重结晶母液与步骤(4)提取猪胆酸甲酯三醋酸酯的母液合并，减压除去溶剂，得到棕褐色粘稠状物，以甲醇提后，再以乙醇重结晶，得到鹅去氧胆酸甲酯二醋酸酯的白色粉末；
[0013](6)将鹅去氧胆酸甲酯二醋酸酯在碱性条件下水解后，进行重结晶，红外灯下干燥至恒重后，制得鹅去氧胆酸的白色粉末。
[0014]作为本发明的改进，上述步骤(5)中甲醇的提取时间为72~96小时。
[0015]作为本发明的改进，上述步骤(5)的重结晶试剂为甲醇或乙醇。
[0016]作为本发明的改进，上述步骤(6)使用的碱为NaOH，其与猪鹅去氧胆酸甲酯二醋酸酯的摩尔比为2.5:1。
[0017]作为本发明的改进，上述步骤(6)重结晶试剂为乙酸乙酯。
[0018]与现有技术相比，本发明的有益效果为:
[0019]本发明以猪胆汁作为提取原料，猪胆汁提取胆红素后，收集提取猪去氧胆酸和猪胆酸后的滤液进行分离而制得熊去氧胆酸，猪胆汁原料广泛易得，降低了熊去氧胆酸的制备成本。本发明提取工艺中选取乙酸酐为酯化试剂，确定了熊去氧胆酸水解及重结晶精制的条件，确定采用氢氧化钠作为碱催化剂，经该工艺流程，猪胆酸的总收率达到15%以上。
【专利附图】
【附图说明】
[0020]图1是本发明的工艺流程图。
【具体实施方式】
[0021]为便于理解本发明，本发明列举实施例如下。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅用于帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
[0022]下列实施例中，所使用的所有专业与科学用语与本领域技术熟练人员所熟悉的意义相同。
[0023]如图1所示，一种熊去氧胆酸的提取方法，包括如下步骤:
[0024](I)取提完胆红素的猪胆汁下脚料，经皂化、水解、脱色及干燥后得到棕褐色的猪总胆汁Ife粗品；
[0025](2)取猪总胆汁酸粗品，经酯化后试剂以醇提取、重结晶得到猪总胆汁酸酯粉末，再对猪总胆汁酸酯在碱性条件下水解后、第二次重结晶得到猪去氧胆酸白色晶体；
[0026](3)将步骤(1)和(2)得到的滤液、洗液以及重结晶母液合并，减压回收溶剂得到棕色粘稠状物，加入乙酸酐酯化试剂，在乙酸钠催化下进行酯化反应生成猪胆酸酯；
[0027](4)在碱性条件下以烷提取猪胆酸甲酯三醋酸酯；
[0028](5)将上述重结晶母液与步骤(4)提取猪胆酸甲酯三醋酸酯的母液合并，减压除去溶剂，得到棕褐色粘稠状物，以甲醇提后，再以乙醇重结晶，得到鹅去氧胆酸甲酯二醋酸酯的白色粉末；
[0029]( 6 )将鹅去氧胆酸甲酯二醋酸酯在碱性条件下水解后，进行重结晶，红外灯下干燥至恒重后，制得鹅去氧胆酸的白色粉末。
[0030]实施例1
[0031](I)取250ml圆底烧瓶，加入猪总胆汁酸粗品10g，无水甲醇50ml，98%浓硫酸0.7ml，于常温下搅拌反应24h，经TLC检测反应完毕，无原料残留后停止反应，向体系中加入无水NaHCO3固体调pH至中性，滤去无机盐，滤饼用甲醇洗涤，合并滤液及洗液，减压回收甲醇，得棕褐色粘稠物，加水50ml以溶解其中剩余的无机盐，再以乙醚分次提取有机物(50ml，30ml，20ml)，合并有机相，分别以饱和NaHCO3溶液及饱和食盐水洗涤I次，无水Na2SO4干燥2h，过滤，减压蒸除乙醚，得到棕色粘稠状物11.4g，向烧瓶中加入苯30ml，于油浴锅80°C下溶解完全后停止加热，待自然冷却至室温后放入冰箱约16h，析出固体，过滤，滤饼以苯洗涤2~3次，得到类白色固体4.9g，再用苯进行重结晶，得到的白色粉末于红外灯下干燥至恒重，为4.5g，即猪总胆汁酸甲酯；
[0032](2)取100ml圆底烧瓶，依次加入猪去氧胆酸甲酯(4.5g)，NaOH固体(1.lg)，乙醇30ml，水Iml，于80°C下搅拌回流反应20h，TLC监测反应完毕后，减压回收溶剂至干，得淡黄色固体，加水30ml，在剧烈搅拌下加10%稀盐酸调pH至1.5，析出大量固体，继续在常温下搅拌0.5h，过滤，滤饼用10%稀盐酸洗涤3次，水洗3次，得到块状白色固体，于50°C下减压干燥8h,为4.5g。以乙酸乙酯重结晶,得到的白色晶体在红外灯下干燥至恒重后为4g, mp为200~201°C，即猪去氧胆酸。
[0033](3)将上步得到的滤液、洗液以及重结晶母液合并，减压回收苯至尽，得到棕色粘稠状物6.7g。加入乙酸酐54ml，乙酸钠8g，于110°C下回流反应5h，TLC监测反应完成后，减压蒸除约2/3体积的乙酸酐，待体系自然降至室温后加水50ml以溶解其中的无机盐，用乙醚分次提取有机物(50ml，30ml，20ml)，合并有机相，先用1%的NaOH溶液洗涤有机相至接近中性，再用饱和NaHC03溶液和饱和食盐水洗涤，无水Na2SO4干燥2h，过滤，减压除去乙醚，得棕色粘稠状物7.9g，向烧瓶中加入正己烷20ml，体系升温至65°C搅拌使其完全溶解后停止加热，自然降至室温，在室温下搅拌2h，过滤，滤饼用正己烷洗涤3次，干燥后得到棕色粉末1.7g，依次以甲醇及苯-石油醚体系重结晶，干燥后得到白色粉末0.8g，mpl84~186°C，即猪胆酸甲酯三醋酸酯。
[0034](4)取25ml圆底烧瓶，依次加入猪胆酸甲酯三醋酸酯(0.8g)，NaOH固体(0.35g)，乙醇10ml，水0.4ml，于80°C下回流反应20h，TLC监测反应完毕后，减压回收溶剂，得灰白色固体，加水10ml，剧烈搅拌下用10%稀盐酸调PH至1.52，析出固体，继续于常温下搅拌
0.5h，过滤，滤饼依次用10%稀盐酸和水各洗涤3次，得到白色固体，50°C下减压干燥后为
0.6g，以乙酸乙酯重结晶，红外灯下干燥至恒重，得白色粉末0.52g，mpl88~189°C，即为猪胆酸。
[0035](5)将提取完猪胆酸甲酯三醋酸酯的母液与重结晶母液合并，减压除去溶剂，得到棕褐色粘稠状物6.3g，此时其中主要成分为鹅去氧胆酸甲酯二醋酸酯，向烧瓶中加入甲醇50ml，升温至65°C待粘稠物全部溶解后停止加热，体系自然降至室温后于冰箱中静置72h，析出淡黄色固体，过滤，滤饼用冰冷甲醇洗涤，干燥后得淡黄色粉末2.4g，以乙醇重结晶，固体于红外灯下干燥至恒重，得白色粉末2.lg, mplll~113°C，即为鹅去氧胆酸甲酯二醋酸酯。
[0036](6)取50ml圆底烧瓶，依次加入鹅去氧胆酸甲酯二醋酸酯(2.lg), NaOH固体(0.9g)，乙醇20ml，水1ml，于80°C下回流反应20h，TLC监测反应完毕后，减压回收溶剂，得灰白色固体，加水20ml，剧烈搅拌下用10%稀盐酸调PH至1.5，析出固体，继续于常温下搅拌0.5h，过滤，滤饼依次用10%稀盐酸和水各洗涤3次，得到白色固体，50°C下减压干燥后为1.6g，以乙酸乙酯重结晶，红外灯下干燥至恒重后得白色粉末1.6g，mpl41~144°C，即为鹅去氧胆酸，总收率为16%。
[0037]实施例2
[0038]与实施例1相比较，第(I)、第(2)第(3)、第(4步相同，第(5)和第(6)步如下:
[0039](5)将提取完猪胆酸甲酯三醋酸酯的母液与重结晶母液合并，减压除去溶剂，得到棕褐色粘稠状物6.3g，此时其中主要成分为鹅去氧胆酸甲酯二醋酸酯，向烧瓶中加入甲醇50ml，升温至65°C待粘稠物全部溶解后停止加热，体系自然降至室温后于冰箱中静置96h，析出淡黄色固体，过滤，滤饼用冰冷甲醇洗涤，干燥后得淡黄色粉末2.4g，以甲醇重结晶，固体于红外灯下干燥至恒重，得白色粉末2.lg, mplll~113°C，即为鹅去氧胆酸甲酯二醋酸酯。
[0040](6)取50ml圆底烧瓶，依次加入鹅去氧胆酸甲酯二醋酸酯(2.lg), NaOH固体(0.9g)，乙醇20ml，水1ml，于80°C下回流反应20h，TLC监测反应完毕后，减压回收溶剂，得灰白色固体，加水20ml，剧烈搅拌下用10%稀盐酸调PH至1.5，析出固体，继续于常温下搅拌0.5h，过滤，滤饼依次用10%稀盐酸和水各洗涤3次，得到白色固体，50°C下减压干燥后为
1.6g，以乙酸乙酯重结晶，红外灯下干燥至恒重后得白色粉末1.5g，mpl41~144°C，即为鹅去氧胆酸，总收率为15%。
[0041] 申请人:声明，所属【技术领域】的技术人员在上述实施例的基础上，将上述实施例某组分的具体含量点值，与
【发明内容】
部分的技术方案相组合，从而产生的新的数值范围，也是本发明的记载范围之一，本申请为使说明书简明，不再罗列这些数值范围。
【权利要求】
1.一种熊去氧胆酸的提取方法，其特征在于，包括如下步骤: (1)取提完胆红素的猪胆汁下脚料，经皂化、水解、脱色及干燥后得到棕褐色的猪总胆汁酸粗品； (2)取猪总胆汁酸粗品，经酯化后试剂以醇提取、重结晶得到猪总胆汁酸酯粉末，再对猪总胆汁酸酯在碱性条件下水解后、第二次重结晶得到猪去氧胆酸白色晶体； (3)将步骤(1)和(2)得到的滤液、洗液以及重结晶母液合并，减压回收溶剂得到棕色粘稠状物，加入乙酸酐酯化试剂，在乙酸钠催化下进行酯化反应生成猪胆酸酯； (4)在碱性条件下以烷提取猪胆酸甲酯三醋酸酯； (5)将上述重结晶母液与步骤(4)提取猪胆酸甲酯三醋酸酯的母液合并，减压除去溶剂，得到棕褐色粘稠状物，以甲醇提后，再以醇重结晶，得到鹅去氧胆酸甲酯二醋酸酯的白色粉末； (6)将鹅去氧胆酸甲酯二醋酸酯在碱性条件下水解后，进行重结晶，红外灯下干燥至恒重后，制得鹅去氧胆酸的白色粉末。
2.如权利要求1所述的一种熊去氧胆酸的提取方法，其特征在于:所述步骤(5)中甲醇的提取时间为72~96小时。
3.如权利要求1所述的一种熊去氧胆酸的提取方法，其特征在于:所述步骤(5)的重结晶试剂为甲醇或乙醇。
4.如权利要求1所述的一种熊去氧胆酸的提取方法，其特征在于:所述步骤(6)使用的碱为NaOH，其与猪鹅去氧胆酸甲酯二醋酸酯的摩尔比为2.5:1。
5.如权利要求1所述的一种熊去氧胆酸的提取方法，其特征在于:所述步骤(6)重结晶试剂为乙酸乙酯。
【文档编号】C07J9/00GK103539829SQ201310451578
【公开日】2014年1月29日 申请日期:2013年9月27日 优先权日:2013年9月27日
【发明者】黄长乐 申请人:安徽华印机电股份有限公司