微生物发酵制备广昌白莲降血压多肽的方法
【专利摘要】一种微生物发酵制备广昌白莲降血压多肽的方法，将白莲研磨成粉，发酵液培养基的配方（kg/L）为：3-6%白莲粉、1-5%碳源、水，自然pH值；取菌龄处于28-44h的活化菌株，把地衣芽孢杆菌ND稀释成1mL中含1*107CFU后，按2-6%接种量将种子液接种于发酵液培养基中，37℃，125r/min摇床培养，培养32-52h；取发酵液，10000r/min下离心20min，沉淀为菌体和未水解的白莲组分，取上清液0.45μm微孔滤膜过滤，滤液真空干燥；用蒸馏水溶解后在葡聚糖凝胶Sephadex-G25下对其进行分离纯化，根据各个收集管的OD220，发酵产物经凝胶层析后，收集第2个吸收峰真空干燥。本发明工艺简单，成本低，获得的混合多肽分子量多数小于1500D，且其降血压活性比使使用木瓜蛋白酶获得的多肽更好。
【专利说明】微生物发酵制备广昌白莲降血压多肽的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于自然资源中肽的提取，特别涉及降血压活性肽的提取。
技术背景
[0002]血管紧张素转化酶(Angiotensin Converting Enzyme, ACE)可以使血压升高。能抑制ACE活性的物质称为血管紧张素转化酶抑制剂(Angiotensin Converting Enzymeinhibitor,ACEI),研究发现许多天然蛋白水解肽可以抑制ACE的活性。这些多肽在预防和治疗高血压方面具有巨大的开发潜力。食源性蛋白降血压肽由于其无毒、无副作用、安全性高，可开发成降压药物或者降压保健品。
[0003]广昌白莲具有高蛋白、低脂肪，氨基酸含量丰富的特点，是药食共用的优良保健食品。通过对广昌干白莲莲子中蛋白的组成、溶性和品质进行研究，发现含蛋白质24.94 %，目前利用木瓜蛋白酶从广昌白莲中获得了降血压活性肽，但是植物蛋白酶(如木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶等)效率低，受外界环境因素影响大，成本高，生产工艺复杂，不适合工业化生产。[0004]微生物发酵法生产多肽不需要蛋白酶的提取过程，而是直接利用微生物生长过程中产生的各种酶类。此酶系非单一蛋白酶而是多种蛋白酶混合的复合酶系，包括酸性蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶等一系列蛋白酶。简化生产工艺，可有效的降低生产成本。
【发明内容】
[0005]本发明的目地是针对现有广昌白莲降血压多肽获取存在的两个问题，即成本高，生产工艺复杂，提供一种获得降血压活性较高的白莲多肽的方法。
[0006]本发明是通过以下技术方案实现的。
[0007]将白莲研磨成粉，发酵液培养基的配方(kg/L)为:3-6%白莲粉、1-5%碳源、水，自然pH值。取菌龄处于28-44h的活化菌株，把地衣芽孢杆菌ND稀释成ImL中含1*107CFU后，按2-6%接种量将种子液接种于发酵液培养基中，37°C，125r/min摇床培养，培养32_52h。
[0008]取发酵液，10000r/min下离心20min，沉淀为菌体和未水解的白莲组分，取上清液微孔滤膜过滤(0.45 μ m)，滤液真空干燥。用蒸馏水溶解后在葡聚糖凝胶S印hadex-G25下对其进行分离纯化，根据各个收集管的OD22tl,发酵产物经凝胶层析后出现3-5个吸收峰，收集第2个吸收峰进行真空干燥，其ACE抑制率为60-89%。
[0009]本发明所述的碳源为葡萄糖、蔗糖、淀粉、麦芽糖、麸皮或玉米粉中的一种。
[0010]本发明的最优条件:将白莲研磨成粉，发酵液培养基的配方(kg/L)为:5%白莲粉、2%葡萄糖、余为水，自然pH值。取菌龄处于36h的活化菌株，把地衣芽孢杆菌ND稀释成ImL中含1*107CFU后，按5%接种量将地衣芽孢杆菌ND种子液接种于发酵液培养基中，37 °C，125r/min摇床培养,培养46h。取发酵液，10000r/min下离心20min,沉淀为菌体和未水解的白莲组分，取上清液微孔滤膜过滤(0.45 μ m)，滤液真空干燥。用蒸馏水溶解后在葡聚糖凝胶SephadeX-G25下对其进行分离纯化，根据各个收集管的OD22tl，发酵产物经凝胶层析后出现5个吸收峰。收集第2个吸收峰进行真空干燥。其ACE抑制率为88.5%。
[0011]本方法工艺简单，成本低，HPLC-MS分析结果表明多肽分子量集中在500-1900D之间。降血压肽的活性除与其氨基酸的组成及结构有关外，还与分子量有关。一般认为分子量小于1500D的组分降血压活性最强，目前已经分离和纯化得到的降血压肽多为2-12肽。本研究获得的混合多肽分子量多数小于1500D。且其降血压活性比使使用木瓜蛋白酶获得的多肽更好。
【专利附图】
【附图说明】
[0012]图1为本发明发酵液多肽经葡聚糖凝胶S印hadex-G25分离后的降血压混合多肽HPLC-MS 图谱。
【具体实施方式】
[0013]本发明将通过以下实施例作进一步说明。
[0014]实施例1。
[0015]将白莲研磨成粉，发酵液培养基的配方(kg/L)为:4%白莲粉、3%葡萄糖、余为水，自然PH值。取菌龄处于36h的活化菌株，按5%接种量将地衣芽孢杆菌ND种子液接种于发酵液培养基中，37°C，125r/min摇床培养，培养46h。取发酵液，10000r/min下离心20min，沉淀为菌体和未水解的白莲组分，取上清液微孔滤膜过滤(0.45 μ m)，滤液真空干燥。用蒸馏水溶解后在葡聚糖凝胶SephadeX-G25下对其进行分离纯化，根据各个收集管的OD22tl，发酵产物经凝胶层析后出现4个吸收峰。收集第2个吸收峰进行真空干燥。其ACE抑制率为为 64.13%。
[0016]实施例2。
[0017]将白莲研磨成粉，发酵液培养基的配方(kg/L)为:5%白莲粉、2%葡萄糖、余为水，自然PH值。取菌龄处于38h的活化菌株，按4%接种量将地衣芽孢杆菌ND种子液接种于发酵液培养基中，37°C，125r/min摇床培养，培养42h。取发酵液，10000r/min下离心20min，沉淀为菌体和未水解的白莲组分，取上清液微孔滤膜过滤(0.45 μ m)，滤液真空干燥。用蒸馏水溶解后在葡聚糖凝胶SephadeX-G25下对其进行分离纯化，根据各个收集管的OD22tl，发酵产物经凝胶层析后出现3个吸收峰。收集第2个吸收峰进行真空干燥。其ACE抑制率为为 75.44%ο
【权利要求】
1.一种微生物发酵制备广昌白莲降血压多肽的方法，其特征是将白莲研磨成粉，发酵液培养基的配方(kg/L)为:3-6%白莲粉、1-5%碳源、水，自然pH值；取菌龄处于28_44h的活化菌株，把地衣芽孢杆菌ND稀释成ImL中含1*107CFU后，按2_6%接种量将种子液接种于发酵液培养基中，37°C，125r/min摇床培养，培养32_52h ； 取发酵液，10000r/min下离心20min，沉淀为菌体和未水解的白莲组分，取上清液0.45 μ m微孔滤膜过滤，滤液真空干燥；用蒸馏水溶解后在葡聚糖凝胶S印hadeX-G25下对其进行分离纯化，根据各个收集管的OD22tl，发酵产物经凝胶层析后，收集第2个吸收峰进行真空干燥。
2.根据权利要求1所述的微生物发酵制备广昌白莲降血压多肽的方法，其特征是所述的碳源为葡萄糖、蔗糖、淀粉、麦芽糖、麸皮或玉米粉中的一种。
3.根据权利要求1所述的微生物发酵制备广昌白莲降血压多肽的方法，其特征是将白莲研磨成粉，发酵液培养基的配方(kg/L)为:5%白莲粉、2%葡萄糖、余为水，自然pH值；取菌龄处于36h的活化菌株，把地衣芽孢杆菌ND稀释成ImL中含1*107CFU后，按5%接种量将地衣芽孢杆菌ND种子液接种于发酵液培养基中，37°C，125r/min摇床培养，培养46h ;取发酵液，10000r/min下离心20min，沉淀为菌体和未水解的白莲组分，取上清液0.45 μ m微孔滤膜过滤，滤液真空干燥；用蒸馏水溶解后在葡聚糖凝胶SephadeX-G25下对其进行分离纯化，根据各个收集管 的OD22tl,发酵产物经凝胶层析后，收集第2个吸收峰进行真空干燥。
【文档编号】C07K1/36GK103911417SQ201410145355
【公开日】2014年7月9日 申请日期:2014年4月14日 优先权日:2014年4月14日
【发明者】吴丽萍, 段元丹, 李恒, 袁建赣, 李曼 申请人:南昌大学