自噬溶酶体过氧化氢标记物的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种由有机化合物配体与金属离子组成的络合物及其作为自噬溶酶体过氧化氢标记物。此发明制得的化合物可作为自噬溶酶体过氧化氢的标记物，用于检测自噬过程中过氧化氢含量，特别是关于溶酶体疾病，例如检测和监测溶酶体中过氧化氢累积过程、监测与溶酶体过氧化氢相关的疾病的生理过程；此发明也是关于毒性筛选方法，特别是对于潜在药物和可疑有毒物质的方法和高通量筛选；也可以用于基于荧光显微镜，共聚焦显微镜的实验和组织成像。
【专利说明】自嗤溶酶体过氧化氢标记物 【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物检测试剂领域，是一种用于检测自噬溶酶体过氧化氢的标记物。 【背景技术】
[0002] 本发明涉及一种由有机化合物配体与金属离子组成的络合物及其作为自噬溶酶 体过氧化氢标记物。此发明制得的化合物可作为自噬溶酶体过氧化氢的标记物，用于检测 自噬过程中过氧化氢含量，特别是关于溶酶体疾病，例如检测和监测溶酶体中过氧化氢累 积过程、监测与溶酶体过氧化氢相关的疾病的生理过程；此发明也是关于毒性筛选方法，特 别是对于潜在药物和可疑有毒物质的方法和高通量筛选；也可以用于基于荧光显微镜，共 聚焦显微镜的实验和组织成像。
[0003] 细胞自噬是哺乳动物细胞溶酶体降解的主要途径，对维持细胞的自我平衡、发展 和能量平衡非常重要。细胞自噬过程的中断与神经退化性紊乱、癌症、心脏病和感染等疾病 密切相关。通过研究细胞自噬及其复杂的分子诱导机制，探索自噬在细胞发生、发展中发挥 的作用，为疾病治疗提供了新的途径。通过调节细胞自噬活性的治疗已经成为当代肿瘤治 疗和帕金森等疾病治疗领域的新靶点和研究热点。无论科研单位还是制药公司对药物诱导 细胞自噬在疾病治疗中的应用表现出极大兴趣，期望通过研究自噬和死亡的关系和分子机 理，进而利用细胞自噬的调节作用，使其在疾病治疗中发挥作用。
[0004] 基于细胞的检测由于它们的高生理的相关性，在制药工业中越来越受欢迎。其它 优点包括他们预测化合物的用途的能力，评估分子相互作用，确定毒性，区分细胞类型与特 异性药物效果，并确定药物渗透。基于细胞的实验是始终相关的药物发现渠道，因为它们能 够提供从目标特性到毒理学终端阶段的数据。当前行业发展趋势要求，使用细胞实验进行 药物筛选时容易进行监测，且能够非侵入性的报道数据。对新药开发而言，其根本途径是提 高效率，降低成本，在更短的时间上市场。为早期阶段失败的化合物提供丰富的信息和准确 的数据对早期阶段的决策是必需的。这些数据可能会来自筛选化合物的结果中，即筛选相 关的生态系统，而不是经典生化分析。这些筛选系统通常整合在先进的成像平台，如高通量 筛选（HCS)工作站。产业化荧光显微镜将导致高通量HCS影像平台的发展。当加上荧光报 告技术，HCS提供了信息丰富的药物筛选，以及新类型的药物靶标。因此，开发一种快速有 效的荧光探针对于监测细胞自噬过程和诊断相关疾病是非常必要的。
[0005] 过氧化氢（H202)是活性氧簇（ROS)的主要成员，作为有益或有害的信号标志在生 理和病理过程中扮演重要的角色。H202的有益/有害之分取决于其生产和累积的浓度及亚 细胞位置。越来越多的证据表明，不仅是ROS产生的主要环境，如线粒体，内质网和细胞膜， 还包括溶酶体参与的对过氧化氢循环的调节，最终决定了 ROS的生物结果和细胞区域间的 通讯。溶酶体中过量H202之间的交叉干扰将会导致溶酶体功能障碍，甚至破裂，这与自噬 和细胞凋亡密切相关。因此，在活细胞中使用具有高分辨率的溶酶体H202成像技术非常重 要。
[0006] 虽然由化学或遗传操作的亚细胞如线粒体，内质网（ER)，细胞膜和细胞核成像以 取得巨大进展，但用于检测溶酶体H202的方法报道很少。对于这种探针的主要挑战包括： (1)溶酶体的酸性（pH为4. 5-6)对基于亲核反应的荧光H202探针和基因编码的荧光蛋白 均不利；（2)由于过氧化氢是活性氧之中的中等的亲电剂，所以化学选择性低；（3)缺少 能够靶向溶酶体的官能团。
【发明内容】
[0007] 本发明提供一种荧光探针，它具有良好的生物活性和选择性，可以在很宽的pH范 围内作用。该探针是细胞渗透性的，并可以被用于可视化的外源或内源性的溶酶体内过氧 化氢。
[0008] 本发明还提供一种基于此标记物的自噬溶酶体过氧化氢检测的方法，包括以下步 骤：1)获得样品细胞；2)标记物进入到细胞的自噬溶酶体内；3)通过检测标记物监测溶酶 体内过氧化氢量。此方法可以运用在如下领域：1)实时监测细胞自噬溶酶体内过氧化氢的 量；2)检测与自噬溶酶体过氧化氢相关的药物的作用效果；3)药物筛选。
[0009] 本发明适合的应用涉及：荧光扫描显微镜、流式细胞仪、共聚焦显微镜、荧光分析 仪、基于微孔板的细胞技术、细胞微阵列分析、组织成像等。
[0010] 发明涉及荧光标记物的制备和应用，例如SN-2的制备方法和在细胞自噬溶酶体 检测中的应用。这些标记物是一类小分子有机化合物，通常呈中性。它们的分子结构中包 含特定的元素，如N、0、S、P等非金属元素以及Fe、Cu、Pt、Au、Zn、Ru、Os等过渡金属和镧系 金属元素。在一定的条件下，这些非金属元素会同金属元素作用，形成特定的化学结构，即 通常所称的金属络合物。特别是对于一些特定结构的有机化合物，其本生并无任何生物学 活性；只有与特定的金属络合后才表现出对自噬溶酶体过氧化氢的特异性作用，例如实施 实例中的化合物SN-2。这类包含特定金属元素的化合物能够选择性的标记自噬溶酶体过氧 化氢，并且发光强度随着过氧化氢量的增加而增强。
[0011] 本发明提供的标记物包含以下结构： 其特征是：
【权利要求】
1. 一种由有机化合物配体与金属离子组成的络合物及其作为自噬溶酶体过氧化氢标 记物，以及用此标记物检测自噬溶酶体过氧化氢的方法；该方法包括如下步骤：a.获得样 品实验所需的细胞；b.荧光标记物进入到细胞器；c.通过检测荧光标记物以确定自噬溶酶 体过氧化氢。
2. 根据权利要求1所述的荧光标记物，其结构式如下：
其中札，R2，R3，R4，R5，R6，R7，R8，各自独立的选自氢、卤素、取代的芳香族集团、 取代的杂芳香族基团、取代的芳基、取代的杂芳基或式（II)结构的取代基，&，R2，R3，R4， R5，R6，R7，R8，中至少一个为式（III)结构的取代基：
式（III)中Q为含有氮原子的基团为连接金属化合物与Q的连接基团； 环A具有式（IV)、式（V)、式（VI)结构：
其中Rla，R2a，R3a，R4a，各自独立的选自氢、卤素、取代的芳香族集团、取代的杂芳香族 基团、取代的芳基、取代的杂芳基； 式（IV)中n为1?3的正整数； Y不存在，或Y为卤素、-N03、CH3C00-、CC13C00-、CF3C00-、C104-、BF4-、BPh4-、-CN、-N3、 对甲基苯甲酸根、对甲基苯磺酸根、邻硝基苯酚氧、对硝基苯酚氧、2, 4-二硝基苯酚氧、 3, 5_二硝基苯酌?氧、2, 4, 6_二硝基苯酌?氧、3, 5_二氣苯酌?氧、3, 5_二氣苯酌?氧、3, 5_二-二 氟甲基苯酚或五氟酚氧负离子； M为过渡金属和镧系金属。
3. 根据权利要求1所述的细胞器，包括溶酶体、吞噬泡、自噬体、自噬溶酶体或它们的 组合。
4. 根据权利要求1所述的溶酶体过氧化氢，包括溶酶体内以分子、离子形式或其他型 态存在的H202以及由其他的过氧化物经由生物或化学途径在溶酶体内形成的H202分子、离 子形式或其他型态。
5. 根据权利要求1所述的方法，其特征是作为药物筛选的方法。
6. 根据权利要求1所述的方法，其特征是作为检测试剂用于细胞实验、荧光共聚焦实 验、组织学实验。
7. 根据权利要求1所述的方法，其特征是制备检测试剂盒。
【文档编号】C07F5/00GK104402933SQ201410534274
【公开日】2015年3月11日 申请日期:2014年10月12日 优先权日:2014年10月12日
【发明者】武鹏 申请人:成都鑫诺医药科技有限公司