一种金属络合物用作自噬溶酶体标记物的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种金属络合物作为标记物检测自噬溶酶体的方法。此发明制得的金属化合物可用为自噬溶酶体标记物，用于检测自噬过程、药物筛选、细胞实验和组织成像等。
【专利说明】一种金属络合物用作自噬溶酶体标记物
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物检测试剂领域，是一种用于检测自噬溶酶体的标记物。
【背景技术】
[0002] 本发明涉及一种由有机化合物配体与金属离子组成的络合物及其作为自噬溶酶 体标记物。此发明制得的金属化合物可作为自噬溶酶体标记物，用于检测自噬过程，特别是 关于溶酶体疾病，例如检测和监测溶酶体累积疾病进程、监测药物效果或用于治疗疾病；此 发明也是关于毒性筛选方法，特别是对于潜在药物和可疑有毒物质的方法和高通量筛选； 也可以用于基于荧光显微镜，共聚焦显微镜的实验和组织成像。
[0003] 细胞自噬是哺乳动物细胞溶酶体降解的主要途径，对维持细胞的自我平衡、发展 和能量平衡非常重要。细胞自噬过程的中断与神经退化性紊乱、癌症、心脏病和感染等疾病 密切相关。通过研究细胞自噬及其复杂的分子诱导机制，探索自噬在细胞发生、发展中发挥 的作用，为疾病治疗提供了新的途径。通过调节细胞自噬活性的治疗已经成为当代肿瘤治 疗和帕金森等疾病治疗领域的新靶点和研究热点。无论科研单位还是制药公司对药物诱导 细胞自噬在疾病治疗中的应用表现出极大兴趣，期望通过研究自噬和死亡的关系和分子机 理，进而利用细胞自噬的调节作用，使其在疾病治疗中发挥作用。
[0004] 基于细胞的检测由于它们的高生理的相关性，在制药工业中越来越受欢迎。其它 优点包括他们预测化合物的用途的能力，评估分子相互作用，确定毒性，区分细胞类型与特 异性药物效果，并确定药物渗透。基于细胞的实验是始终相关的药物发现渠道，因为它们能 够提供从目标特性到毒理学终端阶段的数据。当前行业发展趋势要求，使用细胞实验进行 药物筛选时容易进行监测，且能够非侵入性的报道数据。对新药开发而言，其根本途径是提 高效率，降低成本，在更短的时间上市场。为早期阶段失败的化合物提供丰富的信息和准确 的数据对早期阶段的决策是必需的。这些数据可能会来自筛选化合物的结果中，即筛选相 关的生态系统，而不是经典生化分析。这些筛选系统通常整合在先进的成像平台，如高通量 筛选（HCS)工作站。产业化荧光显微镜将导致高通量HCS影像平台的发展。当加上荧光报 告技术，HCS提供了信息丰富的药物筛选，以及新类型的药物靶标。因此，开发一种快速有 效的自噬探针对于监测细胞自噬过程和诊断相关疾病是非常必要的。
[0005] 荧光标记的抗体虽然适用于分析细胞表面和透化细胞，但因为它们难以透过细 胞，所以很少用于活细胞。近年来，发展可透过细胞的小分子荧光标记物逐渐兴起。可接受 的用于细胞成像和分析的小分子荧光标记物需要最低限度的干扰，通用、稳定、易于使用、 非破坏性的成像设备检测。从组织学的角度来看传统标记物的一个问题是需要辅助因子或 需要固定或染色，仅在静态的死细胞条件下给出结果。操作所需的额外的步骤可能是耗时 和昂贵的，并且在固定和染色的情况下缺乏生物学相关性。从分析来看，标记物应该能够在 活细胞中能够实时反应实验结果。而对于药物筛选而言，简单易用是关键。
[0006] 虽然过往已有各种荧光标记物被报道用于活细胞分析，例如JC-1染料可以动态 的监控线粒体膜电位的变化，但对于自噬溶酶体还缺乏满意的标记物用于跟踪细胞内细胞 器的动态变化以及相关的药物筛选。目前广泛使用的自噬标记物是GFP-LC3,它是一种GFP 蛋白和LC3标记物的融合物。GFP-LC3作为自噬溶酶体荧光标记物，在自噬作用初期是非常 有效的。但由于其信号会随着降解和酸度影响而逐渐减弱，所以无法用于自噬作用后期和 较长的时间段。而且，GFP-LC3存在聚合的问题，容易给出错误的信号。尽管目前也有一些 关于监测自噬作用后期的荧光标记物的报道，但都不禁理想。
[0007] 对研究细胞内的靶向分子与作用区域的相互作用，荧光合作局域化成像是一个功 能强大的方法。在这些实验中，不同的荧光物和发光蛋白在特定的检测通道成像。从每个 发光物给出的空间和浓度信息在每个通道中都可自由控制。现有的很多用于亚细胞分析的 标记物都无法满足这类要求。
【发明内容】
[0008] 本发明提供一种高效的荧光标记物，专用于检测自噬作用后期和阳离子诱导的自 噬作用。这种标记物是一种小分子化合物，它不同于LC3这种大分子蛋白，不存在聚合问 题。它不受酸度影响，在检测活体细胞和固定细胞时均能给出高灵敏的信号。而且，此标记 物可以被高穿透性的近红外和长波长激发，对于监测细胞非常重要。
[0009] 本发明还提供一种基于此标记物的自噬溶酶体检测的方法，包括以下步骤：1)获 得样品细胞；2)连接标记物到细胞的自噬溶酶体；3)通过检测标记物以监测细胞自噬。此 方法可以运用在如下领域：1)实时监测细胞自噬过程；2)检测与自噬溶酶体相关的药物的 作用效果；3)药物筛选。
[0010] 本发明适合的应用涉及：荧光扫描显微镜、流式细胞仪、共聚焦显微镜、荧光分析 仪、基于微孔板的细胞技术、细胞微阵列分析、组织成像等。
[0011] 发明涉及荧光标记物的制备和应用，例如SN-1的制备方法和在细胞自噬溶酶体 检测中的应用。这些标记物是一类小分子有机化合物，通常呈中性。它们的分子结构中包 含特定的元素，如N、0、S、P等非金属元素以及Fe、Cu、Pt、Au、Zn、Ru、Os等过渡金属和镧系 金属元素。在一定的条件下，这些非金属元素会同金属元素作用，形成特定的化学结构，即 通常所称的金属络合物。特别是对于一些特定结构的有机化合物，其本身并无任何生物学 活性；只有与特定的金属络合后才表现出与自噬溶酶体的特异性作用，例如实施实例中的 化合物SN-1。这类包含特定金属元素的化合物能够选择性的标记无论是固定细胞还是活细 胞中的自噬溶酶体，并且随着时间和自噬溶酶体量的增加在细胞器内逐渐累积。
[0012] 本发明提供的标记物包含以下结构：
【权利要求】
1. 一种使用金属络合物作为荧光标记物检测自噬溶酶体的方法，该方法包括如下步 骤： 第一步、获得样品实验所需的细胞； 第二步、连接荧光标记物到细胞器； 第三步、通过检测荧光标记物以确定自噬溶酶体。
2. 根据权利要求1所述的荧光标记物，其结构式为：
其中札，R2，R3，R4，R5，R6，R 7，R8，各自独立的选自氢、卤素、取代的芳香族集团、取 代的杂芳香族基团、取代的芳基、取代的杂芳基或式（III)结构的取代基，凡，R2，R3，R 4， R5，R6，R7，R8，中至少一个为式（III)结构的取代基 ：
式（III)中Q为含有氮原子的基团，_为连接金属化合物与Q的连接基团； 环A具有式（IV)、式（V)、式（VI)结构：
其中Rla，R2a，R3a，R4a，各自独立的选自氢、卤素、取代的芳香族集团、取代的杂芳香族 基团、取代的芳基、取代的杂芳基； 式（IV)中η为1?3的正整数； Υ 不存在，或 Υ 为卤素、-N03、CH3C00-、CC13C00-、CF3C00-、C10 4-、BF4-、BPh4-、-CN、-ν3、 对甲基苯甲酸根、对甲基苯磺酸根、邻硝基苯酚氧、对硝基苯酚氧、2, 4-二硝基苯酚氧、 3, 5_二硝基苯酌·氧、2, 4, 6_二硝基苯酌·氧、3, 5_二氣苯酌·氧、3, 5_二氣苯酌·氧、3, 5_二-二 氟甲基苯酚或五氟酚氧负离子； Μ为过渡金属和镧系金属。
3. 根据权利要求1所述的细胞器，包括溶酶体、吞噬泡、自噬体、自噬溶酶体或它们的 组合。
4. 根据权利要求1所述的方法，其特征是作为药物筛选的方法。
5. 根据权利要求1所述的方法，其特征是作为检测试剂用于细胞实验、荧光共聚焦实 验、高通量筛选、组织学实验。
6. 根据权利要求1所述的方法，其特征是制备检测试剂盒。
【文档编号】G01N21/64GK104152529SQ201310174229
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2013年5月13日 优先权日:2013年5月13日
【发明者】武鹏 申请人:成都鑫诺医药科技有限公司