一种从富硒茶叶片中提取硒蛋白的方法
【专利摘要】本发明公开了一种从富硒茶叶片中提取硒蛋白的方法。本发明以富硒茶叶片为原料，将富硒茶叶片烘干、粉碎过筛，加入乙醇，在60℃下水浴加热30min，离心，所得沉淀重复上述步骤，然后烘干粉碎过筛；所得沉淀加入蒸馏水，在低温冰箱中冰冻3～5h，50～70℃下水浴加热30min，然后在低温冰箱中冰冻3～5h，在50～70℃下水浴加热30min，如此重复三次；加入NaOH溶液，在70～90℃下水浴加热3～4h，3500rpm离心10min，沉淀重复上述过程一次，上清液调节pH至2.5～3.5，静置，离心，干燥得粗硒蛋白。本发明制备工艺简单，操作简便易行，环境友好，所得产品硒蛋白含量较高，是有机硒可靠的来源，适用于工业化生产。
【专利说明】一种从富硒茶叶片中提取硒蛋白的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于茶叶深加工【技术领域】，特别涉及一种从富硒茶叶片中提取硒蛋白的方 法。
【背景技术】
[0002] 硒是人体必需的微量元素之一，现代医学研究证明，硒对癌症、心脑血管疾病、克 山病、大骨节病等疾病均有防治作用。由于硒在地球上分布不均，目前已知有40多个国家 和地区不同程度缺硒，我国也有2/3以上地区缺硒，涉及人口达7亿多。直接利用无机硒盐 补硒具有一定的毒性，通过食物链补硒是解决缺硒问题的重要途径，但天然食物中的硒含 量普遍较低。紫阳富硒茶是天然的补硒饮品，紫阳当地居民饮富硒茶历史可追朔到唐朝，说 明富硒茶对人体是安全的。但是研究表明富硒茶经过两次冲泡，仅有7%?13%的硒溶解 于水中而被人体吸收利用，与国际硒学会推荐人体日摄入量为60?400 μ g相差甚远，据中 国预防医科院与第四军医大的检测推算，欲满足人体对硒的需求每人每天需饮300g富硒 茶干品，而且富硒茶中有机硒含量变动较大，所以通过冲饮紫阳茶难以满足缺硒人群定量 补硒需求。因此有必要开发一种有机硒硒含量更高，含硒量稳定的富硒产品以满足广大人 群的补硒需求。
[0003] 茶叶中有机砸占砸总量的80 %以上，王要以砸蛋白形态存在（占有机砸的 79. 56?88. 70% )。茶叶干重的15?30%为茶叶蛋白，它是由单纯蛋白和结合蛋白两大 类组成。单纯蛋白主要由谷蛋白（溶于稀酸、稀碱溶液，受热不凝固，占总蛋白82. 05%)、 醇溶蛋白（溶于稀酸稀碱溶液中以及70?80%的酒精溶液中，占总蛋白13. 61% )、清蛋白 (溶于水和稀盐溶液，占总蛋白3. 47% )和球蛋白（溶于稀盐溶液，占总蛋白〈1 % )组成。 结合蛋白则由核蛋白、糖蛋白、脂蛋白等组成，数量少，易溶于稀酸。
[0004] 目前国内对茶叶蛋白提取方法研究较多的为碱法提取、酶法提取、盐法提取[3]、 超生辅助提取和反复冻融法辅助提取。
[0005] 碱液可以破坏茶蛋白之间的某些连接集团，提高茶蛋白的溶解度，实现茶蛋白有 效分离的目的，一般选择NaOH为碱液。它因工艺简单、提取率较高、处理量大、易于实现工 厂自动化等特点而被广泛应用，但是对氨基酸有破坏作用，抽提液固比大，等电沉淀要消耗 大量酸、脱盐纯化难度大、提取时需要消耗大量的碱和水等缺点。
[0006] 近年来，酶法提取植物蛋白的研究较为活跃。常用的酶类有蛋白酶、纤维素酶和果 胶酶等。蛋白酶是在特定的条件下（一般是最适温度和PH值），将蛋白质逐步降解，变成分 子量较小的短肽，从而使其溶解性增强，达到分离提取的效果。纤维素酶和果胶酶则是分别 分解细胞壁中的纤维素和果胶，从而破坏细胞壁，使细胞吸水破裂，提高提取物和提取液的 接触机会，从而实现提高提取率的目的。酶法提取具有反应条件温和，反应液固比小，耗能 低，营养物质基本不被破坏，提取率高等优点。但是目前酶法提取的工艺条件并不成熟，而 且存在对酶活力的要求比较高，酶试剂较为昂贵，不适合规模化生产。
[0007] 超声辅助提取是利用超声波的机械作用、空化作用、热效应和化学效应，破坏细胞 壁，加速目标物的扩散，实现提高提取率的目的。超声辅助提取具有提取时间短、提取效率 较高、污染少等优点，但是根据提取物的不同有时也会出现与普通法相比提取效果不明显 的结果。
【发明内容】
[0008] 为解决现有技术问题，本发明提供了一种从富硒茶叶片中提取硒蛋白的方法，本 发明制备工艺简单，操作简便易行，环境友好，适用于工业化生产。
[0009] 为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
[0010] 一种从富硒茶叶片中提取硒蛋白的方法包括以下步骤：
[0011] ⑴将富硒茶叶片粉碎过80?100目筛得到富硒茶粉，富硒茶粉去除茶多酚后，烘 干、再粉碎、再过80?100目筛，得物质A ;
[0012] (2)向步骤⑴所得物质A中按照固液比Ig :(5?10)mL加入蒸馏水溶解， 在-30?-18°C中冰冻3?5h，50?70°C下水浴加热20?40min，重复多次，得到溶液A ;
[0013] (3)按照Ig溶液A加入30?70mL NaOH溶液的比例，向步骤⑵所得溶液A中加 入NaOH溶液，在70?90°C下水浴加热3?4h，离心分离上清液；
[0014] (4)步骤（3)中离心所得上清液调节pH值至2. 5?3. 5,静置，再离心，得沉淀，沉 淀烘干得到粗硒蛋白。
[0015] 作为本发明的进一步改进，步骤（1)中去除茶多酚步骤具体操作为：向富硒茶粉 中按照固液比Ig : (20?30)mL加入乙醇，在60°C水浴加热30min，离心，分离得沉淀，所得 沉淀重复以上步骤。
[0016] 作为本发明的进一步改进,所述乙醇质量浓度为40?60%。
[0017] 作为本发明的进一步改进，步骤（3)中NaOH溶液浓度为0· 05?0· 15mol/L。
[0018] 作为本发明的进一步改进，步骤（3)所述的pH值用0· lmol/L HCl调节。
[0019] 作为本发明的进一步改进，所述离心步骤的离心转速为3500rpm，时间为lOmin。
[0020] 相对于现有技术，本发明具有以下优点：
[0021] 本发明以富硒茶叶片为原料，先去除茶多酚，以反复冻融细胞方式，达到破碎细胞 的效果，以碱提方法提取蛋白质，以PH值为2. 5?3. 5来沉淀硒蛋白，制得的硒蛋白粉呈浅 黑色、纯度达到75%以上。其中反复冻融法辅助提取是利用低温冰箱（-30?-18°C )把提 取液冰冻，然后加热溶化，反复三次，在冻融过程中实现细胞壁破碎的目的，从而提高蛋白 质的提取率。
[0022] 进一步，去除茶多酚采用质量浓度为40?60 %的乙醇，去除完全，对后期的提取 影响小。
[0023] 本发明制得的硒蛋白，有机硒含量达到4. 000yg/g以上，可以作为安全、有效补 硒的原料进一步加工成各种补硒功能产品。本发明制备工艺简单，操作简便易行，环境友 好，无污染。
【专利附图】
【附图说明】
[0024] 图1为硒标准曲线图；
[0025] 图2为不同样品中硒含量对比图。
【具体实施方式】
[0026] 本发明以富硒茶叶片为原料，用40?60%乙醇去除茶多酚，以反复冻融细胞方 式，达到破碎细胞的效果，以碱提方法提取蛋白质，以PH2. 5?3. 5来沉淀硒蛋白，本发明内 容包括以下步骤：
[0027] (1)将富硒茶叶片粉碎过80?100目筛，按照1 : (20?30) (g:mL)加入40?60% 乙醇，在60°C下水浴加热30min，3500rpm离心lOmin，所得沉淀重复步骤（1)后烘干粉碎过 80?100目筛；
[0028] (2)步骤⑴所得沉淀按照料液比1 :(5?10) (g:mL)加入蒸馏水，在低温 冰箱（-30?-18 °C )中冰冻3?5h，50?70°C下水浴加热30min，然后在低温冰箱 (-30?-18°C )中冰冻3?5h，在50?70°C下水浴加热30min，如此重复三次；
[0029] (3)向步骤（2)中按照料液比 1 : (30 ?70) (g:mL)加入 0· 05 ?0· 15mol/L NaOH 溶液，在70?90°C下水浴加热3?4h，3500rpm离心IOmin ;
[0030] (4)步骤（3)中离心所得上清液用O.lmol/L HCl调节pH至2. 5?3. 5,静置 lOmin，3500rpm离心IOmin,所得沉淀烘干得到粗硒蛋白。
[0031] 实施例1
[0032] -种从富硒茶叶片中提取硒蛋白的方法，包括以下步骤：
[0033] (1)将富硒茶叶片粉碎过100目筛，按照I :25(g:mL)加入60%乙醇，在60°C下水 浴加热30min，3500rpm离心IOmin,所得沉淀重复步骤（1)后烘干粉碎过100目筛；
[0034] (2)步骤（1)所得沉淀按照料液比I :7(g:mL)加入蒸馏水，在低温冰箱中冰冻4h， 60°C下水浴加热30min，然后在低温冰箱中冰冻4h，在60°C下水浴加热30min，如此重复三 次；
[0035] (3)向步骤（2)中按照料液比I :50(g:mL)加入0· 10mol/L NaOH溶液，在70°C下 水浴加热3. 5h，3500rpm离心IOmin ;
[0036] (4)步骤（3)中离心所得上清液用0· lmol/L HCl调节pH至3. 5,静置10min， 3500rpm离心10min，所得沉淀烘干得到粗硒蛋白。
[0037] 实施例2
[0038] -种从富硒茶叶片中提取硒蛋白的方法，包括以下步骤：
[0039] (1)将富硒茶叶片粉碎过80目筛，按照I :20(g:mL)加入60%乙醇，在60°C下水 浴加热30min，3500rpm离心IOmin,所得沉淀重复步骤（1)后烘干粉碎过80目筛；
[0040] (2)步骤（1)所得沉淀按照料液比I :5(g:mL)加入蒸馏水，在低温冰箱中冰冻3h， 50°C下水浴加热30min，然后在低温冰箱中冰冻3h，在50°C下水浴加热30min，如此重复三 次；
[0041] (3)向步骤（2)中按照料液比I :50(g:mL)加入0· 10mol/L NaOH溶液，在80°C下 水浴加热4h，3500rpm离心IOmin ;
[0042] (4)步骤（3)中离心所得上清液用0· lmol/L HCl调节pH至2. 5,静置10min， 3500rpm离心10min，所得沉淀烘干得到粗硒蛋白。
[0043] 实施例3
[0044] 一种从富硒茶叶片中提取硒蛋白的方法，包括以下步骤：
[0045] (1)将富硒茶叶片粉碎过90目筛，按照I :30(g:mL)加入50%乙醇，在60°C下水 浴加热30min，3500rpm离心IOmin,所得沉淀重复步骤（1)后烘干粉碎过90目筛；
[0046] (2)步骤（1)所得沉淀按照料液比I :10(g:mL)加入蒸馏水，在低温冰箱中冰冻 5h，70°C下水浴加热20min，然后在低温冰箱中冰冻5h，在70°C下水浴加热30min，如此重复 三次；
[0047] (3)向步骤（2)中按照料液比I :70(g:mL)加入0· 15mol/L NaOH溶液，在80°C下 水浴加热4h，3500rpm离心IOmin ;
[0048] (4)步骤（3)中离心所得上清液用0· lmol/L HCl调节pH至3. 0,静置lOmin， 3500rpm离心lOmin，所得沉淀烘干得到粗硒蛋白。
[0049] 实施例4
[0050] -种从富硒茶叶片中提取硒蛋白的方法，包括以下步骤：
[0051] (1)将富硒茶叶片粉碎过100目筛，按照I :25(g:mL)加入40%乙醇，在60°C下水 浴加热30min，3500rpm离心IOmin,所得沉淀重复步骤（1)后烘干粉碎过100目筛；
[0052] (2)步骤（1)所得沉淀按照料液比I :10(g:mL)加入蒸馏水，在低温冰箱中冰冻 4h，60°C下水浴加热40min，然后在低温冰箱中冰冻4h，在60°C下水浴加热30min，如此重复 三次；
[0053] (3)向步骤（2)中按照料液比I :60(g:mL)加入0· 10mol/L NaOH溶液，在90°C下 水浴加热3h，3500rpm离心IOmin ;
[0054] (4)步骤（3)中离心所得上清液用0· lmol/L HCl调节pH至2. 5,静置10min， 3500rpm离心10min，所得沉淀烘干得到粗硒蛋白。
[0055] 实施例5
[0056] -种从富硒茶叶片中提取硒蛋白的方法，包括以下步骤：
[0057] (1)将富硒茶叶片粉碎过100目筛，按照I :25(g:mL)加入40%乙醇，在60°C下水 浴加热30min，3500rpm离心IOmin,所得沉淀重复步骤（1)后烘干粉碎过100目筛；
[0058] (2)步骤（1)所得沉淀按照料液比I :10(g:mL)加入蒸馏水，在低温冰箱中冰冻 5h，70°C下水浴加热30min，然后在低温冰箱中冰冻5h，在70°C下水浴加热30min，如此重复 三次；
[0059] (3)向步骤（2)中按照料液比I :30(g:mL)加入0.05mol/L NaOH溶液，在90°C下 水浴加热4h，3500rpm离心IOmin ;
[0060] (4)步骤（3)中离心所得上清液用0· lmol/L HCl调节pH至3. 0,静置10min， 3500rpm离心10min，所得沉淀烘干得到粗硒蛋白。
[0061] 本发明所用原料为富硒茶叶片，特别是老叶效果更好。
[0062] 测试1 :硒含量检测
[0063] 1)试验材料
[0064] 富硒茶粉、未纯化硒蛋白（用冻融法提取蛋白质）、纯化硒蛋白、粗多酚、二次提取 蛋白后茶渣
[0065] 2)试验方法：利用微波消解-紫外分光光度法测定硒含量
[0066] 3)结果与分析
[0067] 3. 1硒标准曲线的绘制
[0068] 由图1可知，硒含量在1-5 μ g时具有线性相关性，其线性方程为y = 0· 0191χ-0· 003,相关系数 R2 = 0· 9994。
[0069] 3. 2各种样品硒含量检测
[0070] 由图2和表1可知，在陕西紫阳县"硒谷"采集的富硒茶含硒量为2. 110μ g/g ;粗 蛋白质中硒含量为4. 002 μ g/g，占样品总硒的71. 1%，并且经纯化后蛋白质中硒含量可达 5. 174 μ g/g ;二次提取蛋白后茶渣中硒含量为0. 930 μ g/g，这可能是因为茶渣中还存在硒 核酸、部分硒蛋白、硒多糖以及无机态游离硒；粗多酚中硒含量为〇. 〇53μ g/g，这可能是由 于粗多酚中含有部分硒多糖而使多酚中存在硒。
[0071] 表 1
【权利要求】
1. 一种从富硒茶叶片中提取硒蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤： (1)将富硒茶叶片粉碎过80?100目筛得到富硒茶粉，富硒茶粉去除茶多酚后，烘干、 再粉碎、再过80?100目筛，得物质A ; ⑵向步骤⑴所得物质A中按照固液比lg :(5?10)mL加入蒸馏水溶解， 在-30?-18°C中冰冻3?5h，50?70°C下水浴加热20?40min，重复多次，得到溶液A ; (3) 按照lg溶液A加入30?70mL NaOH溶液的比例，向步骤⑵所得溶液A中加入 NaOH溶液，在70?90°C下水浴加热3?4h，离心分离上清液； (4) 步骤（3)中离心所得上清液调节pH值至2. 5?3. 5,静置，再离心，得沉淀，沉淀烘 干得到粗硒蛋白。
2. 根据权利要求1所述的一种从富硒茶叶片中提取硒蛋白的方法，其特征在于，步骤 (1)中去除茶多酚步骤具体操作为：向富硒茶粉中按照固液比lg:(20?30)mL加入乙醇， 在60°C水浴加热30min，离心，分离得沉淀，所得沉淀重复以上步骤。
3. 根据权利要求2所述的一种从富硒茶叶片中提取硒蛋白的方法，其特征在于，所述 乙醇质量浓度为40?60%。
4. 根据权利要求1所述的一种从富硒茶叶片中提取硒蛋白的方法，其特征在于，步骤 (3)中NaOH溶液浓度为0? 05?0? 15mol/L。
5. 根据权利要求1所述的一种从富硒茶叶片中提取硒蛋白的方法，其特征在于，步骤 ⑶所述的pH值用0? lmol/L HC1调节。
6. 根据权利要求1或2所述的一种从富硒茶叶片中提取硒蛋白的方法，其特征在于，所 述离心步骤的离心转速为3500rpm，时间为lOmin。
【文档编号】C07K1/14GK104402966SQ201410650029
【公开日】2015年3月11日 申请日期:2014年11月14日 优先权日:2014年11月14日
【发明者】董文宾, 王洪言, 王珺 申请人:陕西科技大学