专利名称：涉及失控肿瘤细胞和病毒生长循环的异常代谢途径的双链rna校正的制作方法
在历史上已经证明，人的各种淋巴细胞活素(干扰素、白细胞间素、肿瘤坏死因子等)迄今在大部分人体瘤形成和慢性病毒感染的临床治疗方面只具有一定实用性。这可能主要由于这些淋巴细胞活素仅仅增强复杂的生化级联反应的“上游”部分，例如，这些淋巴细胞活素能够在细胞表面多肽的受体水平上或在早期2’-5’A合成酶的酶诱导机制中起作用。
反之，在本申请中，我将论述淋巴细胞活素作用/天然防御途径中的更重要的且更靠近终端的成分中存在的新缺陷，即RNA酶L的异常，这种异常或缺陷若不校正，则将导致肿瘤细胞的失控生长及宿主细胞中各种病毒的增殖。现在我介绍两方面情况，一个是在RNA酶L调节作用中的新的生化缺陷，另一个是稳定校正所说缺陷的一种全新方法。用一般的双链RNA(dsRNA)和用特异的错配dsRNA稳定校正这些缺陷时，伴随着一些惊人的临床变化，其中包括身体更新各种肿瘤，以及抑制各种病毒和真菌病原体的广谱能力的再现，所说的病毒和病原体常常影响癌症病人和各种“高危”群体中的其他个体。
淋巴细胞活素在控制人体肿瘤(Carter等，J.Biol.Res.Mod.4∶613，1985)和人病毒(见Montefiori和Mitchell的引用文章，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.84∶2985，1987)方面效能有限。为了增进其活性，科学家们试图把这些天然多肽与各种其他化合物组合起来。
2-5A合成酶，例如Rosenblum和Cutterman(Proc.Am.Assoc.CancerResearch26∶280，1985年3月，摘要号1105)把干扰素(IFN)和dsRNA加以组合。他们报告说，通过共同使用亚有效量的dsRNA和IFN，对细胞培养中的人黑素瘤具有一种“令人难忘的相同的抗增殖活性”。但是他们发现，这种协同作用“局限于抗增殖性IFN的抗病毒活性上”。并且观察到，利用此组合方法使2’-5’寡A合成酶增加，而且提出“这种，组合中协同的抗增殖性质不能以影响2，5A作为中介”。与之对照，治疗慢性乙肝(CHB)病毒感染时，Furuta等人(J.InterferonRes.7∶111)在单独用IFN作IFN治疗后，提高了2’-5’A合成酶。然而，利用外周血液淋巴细胞(PBL)中2’-5’A合成酶活性作为标记物去估计各种肿瘤或病毒对淋巴细胞活素的敏感程度，通常是有些令人失望的。
我相信事实确是这样，因为2’5’A合成酶仅仅是定位于淋巴细胞活素诱导的生化级联反应的早期中的诸酶之一，特别是因为2’5’A合成酶主要是通过活化该途径中更为远端的RNA酶L而施加抗病毒和抗肿瘤的作用。最近对强化的2’5’寡A合成酶的介绍说明，这种酶在dsRNA存在下十分不稳定(ROVnak和Ranu，J.Inter-feronRes.7∶231，1987)。
现在，我说明了dsRNA在校正RNA酶L中各种异常方面的新作用。我还能够证明，这种校正作用在成功地治疗癌症、免疫和病毒疾病中具有治疗重要性。
RNA酶LRNA酶L经过适当激活后，能够专一性切割病毒RNA，而且大概还有与恶性细胞表型(失控增殖)有关的异常细胞RNA。在最近一份出版物中(Lancet1∶1286，1987年6月6日)，，我介绍了RNA酶L中的一种不同的缺陷，来辅助说明RNA酶L的人免疫缺陷病毒(HIV)抑制剂。我成功地设计了一项由dsRNA剂量计划组成的治疗方案，这种剂量计划通过直接或间接的作用机理可从RNA酶L中取代所说的HIV抑制剂，从而改进病人的临床状况和降低HIV负荷。
图1-3是聚丙烯酰胺凝胶电泳平板的照片，照片上显示出泳道号码及每条泳道上的带或区。
图4是由三部分组成的曲线图，曲线以治疗天数为横座标，比较了三个不同病人的白细胞计数(用O连接的线)和2-5A合成酶数量(用▲连接的线)。
在此，我介绍另外一种RNA酶L功能中的新的完全不同的异常。而且，这种异常与严重的临床疾病有关，但合理地采用dsRNA可以校正所述RNA酶L异常，同时改进临床治疗。
本发明包括评价RNA酶L的缺陷和生化异常的诊断方法，以及通过在施用淋巴细胞活素(如干扰素或白细胞间素)之前或同时施用dsRNA(优选错配的dsRNA)以校正该缺陷的治疗方法。此外，还介绍了测定病人血液样品中，特别是病人单核细胞中是否存在RNA酶L缺陷特异性裂解产物的方法，以及利用这种裂解产物存在和/或形成时间作为开始进行的dsRNA治疗的标记的方法。
本发明包括治疗癌(尤其是具有抗单独用干扰素处理的肿瘤细胞的癌)以及治疗病毒疾病(包括由许多逆转录病毒引起的疾病)的方法。
在前面引证的Lancet的文章中(图5)，取自一些HIV感染病人的RNA酶L样品未能显示出可测的生物活性。特别是“SCP”区(即专一性裂解产物区)缺乏能证明由这些病人取出的RNA酶L已被抑制剂有效灭活的RNA片段。反之，健康的正常人却相当容易显示出活体激活的RNA酶L。因此，人体肿瘤中的异常RNA酶L与一些新裂解产物(NCP)有关。
NCP不同于专一性裂解产物(SCP)，NCP能鉴别出缺乏控制细胞生长和病毒增殖的正常机理的人体细胞。图1是聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)平板的照片，它表明了由正常人体外周淋巴细胞得到的RNA酶L的活性动力学，与我过去的文章(上面引证过的Lancet)中附图5的泳道2相似。正如过去所述的那样，此分析方法为在与28S和18SRNA源培养之后，通过测定产生专一性裂解产物的能力来测量单核细胞的胞质提取物中的活化RNA酶L。所用的操作方法遵循K.Kariko和J.Ludwig在“Biochem.Biophys.Res.Commun.”(128∶695，1985)中和Wreschner等人在“NucleicAcidRec.”(9∶1571，1981)中所述的方法。由遗传上缺乏RNA酶L的HL929细胞制得核糖体RNA。根据布达佩斯条约，这些LH929细胞寄存在美国马里兰州罗克威尔市的美国曲型培养物收集中心，寄存号为ATCCCRL9659。通过1700分钟(约26小时)长期观察后发现，取自正常人体的RNA酶L最终能形成NCP(图1的第8泳道)。应当注意，正常人体中NCP的最早检出点在保温数小时之后。
但是，使用取自白血病病人的淋巴细胞时，在保温RNA酶L几分钟后就看到了NCP。图2清楚地说明了这一点，其中细胞是取自三名白血病患者〔慢性骨髓性白血病(CML)患者A和B，与一名正常人体(病人C)的相应细胞进行比较〕。应当注意，对于白血病患者(图2中的病人A和B)来说从未看到SCP，而经1-4分钟短时间保温后就见到了NCP。与此截然相反，对于正常人(标记C的志愿者)来说，在高达60分钟的动力学样品中仅发现有SCP而根本没有NCP。
因此，我观察到一种过去未检测到的生化异常现象，其中，涉及人体对癌、免疫及病毒疾病的防御机制的关键酶(RNA酶L)在以加速和明显失控的方式起作用。在一些单独的实验中，我比较了这两种不同细胞(含异常RNA酶L的细胞)经受病毒攻击的相对能力。我观察到，子代病毒的效价(产率)在具有能迅速产生NCP的异常RNA酶L活性的那些细胞中明显高得多。
我发现并在此公开这样一种方法，其中用双链RNA，尤其是错配的双链RNA使RNA酶L的动力学和降解产物恢复正常状态，而且，通过事先暴露于淋巴细胞活素可以加速双链RNA的恢复速度。
术语“错配的双链RNA”是指这样一些双链RNA，其中，相对两链间的氢键(碱基堆积)是相对完整的，也就是说平均每29个依次相连的碱基中有不到一个的碱基对被打断。因此应当这样理解术语“错配的双链RNA”。所说的双链RNA可以是多肌苷酸和含有一定比例尿嘧啶或鸟嘌呤碱基的多胞苷酸(例如在5-30个中含有一个这种碱基)的复合物〔多聚I·多聚(C4-C29×＞U或G)〕或者在某些情况下，也可以使适当的寡核苷酸(小核苷酸片段)与适当的互补的多核苷酸或寡核苷酸复合。
所说的双链RNA可以是多聚I·多聚(C，U)，其中C与U之比约为13∶1，而且多聚I和多聚(C，U)的沉降系数均小于9(优选值均为6.5-7.5)，二者沉降系数的差别不大于2。
双链RNA可以有通式rIn·r(C11-14，U)n，特别是rIn·r(C12，U)n。双链RNA的其他适用实例介绍如下。
本发明中优选使用的错配双链RNA，以从多聚(Cn，U)和多聚(Cn，G)中选出的共聚核苷酸为基础，其中n是4-29之间的整数，并且是复合物多聚核糖胞苷酸(rCn)的错配类似物，例如使之包含进2’-O-甲基核糖残基。rIn·rCn的这些错配类似物〔其中优选通式猺In·r(C12，U)n〕载于Carter和TS’O的美国专利4130641和4024222之中。其中所述的dsRNA通常适于本发明用途。
用于本发明中的错配dsRNA之特例包括多聚(I)·多聚(C4，U)，多聚(I)·多聚(C7，U)，多聚(I)·多聚(C13，U)，多聚(I)·多聚(C22，U)，多聚(I)·多聚(C20，G)，多聚(I)·多聚(C29，G)和多聚(I)·多聚(Cp)23G＞P。
错配dsRNA的用量最好足以使施用之后在输入点远端血液循环中的峰值浓度立即达到0.01-1000微克/毫升dsRNA。
在这里我介绍三名白血病(CML)患者，他们表现出与其恶性肿瘤细胞的失控生长相关的新的RNA酶L缺陷，以及由于各种联合的病毒感染(包括带状疱疹、CMV、EBV、单纯疱疹或肝炎)而表现出明显的临床恶化(不适、体重剧减和不能经受多次感染)。一些病人还经历了口腔的慢性真菌感染。
我既说明了这种新的生物化学紊乱，又设计了dsRNA的单独或与淋巴细胞活素合并的用药方案，此方案有效地校正了所说的RNA酶L异常，从而导致了其特征在于显著减少肿瘤负担的惊人的临床改善，并且导致了可由间发性病毒和真菌感染的减少所证明的总的抗病毒和免疫防御的显著改善。
淋巴细胞活素包括干扰素(α、β、γ)(优选α干扰素)、白细胞间素(特别是白细胞间素1、2或3)和重组白细胞间素-2(rIL-2)和肿瘤坏死因子(TNF)。此外还包括由于暴露于淋巴细胞活素而在动物体中形成的淋巴细胞活素激活的杀伤细胞(LAK)。
使用α干扰素作为淋巴细胞活素时，在每毫升病人体液中提供0.01-100000IRU。当淋巴细胞活素是IL-2(优选rIL-2)时，用量范围大约为102IL-2单位/千克病人体重直到该病人不能接受的毒性水平值(可高达106IL-2单位)。然而，最有效而且能控制毒性反应的数值大约处于103-104IL-2单位/千克体重范围内。
按前述方法施用两种药剂(dsRNA和淋巴细胞活素)时，可以以混合物形式或者将两种药剂分开同时或相继施用。
“共同”施用dsRNA和淋巴细胞活素既包括以治疗混合物形式共同施用两种药剂的方案，也包括将两种药剂分开同时施用的方案，例如给同一患者经不同的静脉路线施用。“共同”施用还包括两种药剂分开相继施用，即施用一种药剂短时间后再施用第二种药剂。
图3表明最初暴露于低剂量淋巴细胞活素(剂量为0.5-3.0百万IRU的αIFN，每周4-7次)的三名患者(TATR、DEFD和DALR)的生化状况恢复的典型情况。每名病人体重均约60公斤。应当注意，每一病例中单独施用淋巴细胞活素显然不足以导致所述RNA酶L缺陷的任何可察觉到的改善。尤其是当所有的病人只接受淋巴细胞活素时，均只显示出NCP。病人(DALR)对传统的化学疗法(羟基脲等)有一短促的应答期，此期间病人的淋巴细胞瞬时恢复了SCP活性;但是其疾病由于SCP转化为NCP而复化，临床症状随时间的推移而恶化，用淋巴细胞活素使其有可测的临床或生化改善。在结合淋巴细胞然后施用dsRNA的各例中，同时清楚地出现惊人的临床改善和RNA酶L的生物化学正常性的恢复。
图3表明在40-300毫克剂量范围内施用(经静脉，每周两次)错配的双链RNArIn、r(C11-14，U)n或AMPLIGEN (美国马里兰州罗克威尔市HEM Research的注册商标)的效力。我观察到通过监测所述酶(RNA酶L)和单独施用错配的双链RNA可以取得类似的临床效果，但是所需的dsRNA量却常常高出2-20倍，而且临床应答的开始时间显著延迟。
通过结合RNA酶L测试法和错配RNA的合理使用(单独或与淋巴细胞活素共同)，我能够一致地改进总的临床状态(降低病毒和真菌感染)，同时显著减少肿瘤负担(如图4所示，下面将讨论)。重要的一点是，现在可以在成本/效果基础上实现这些显著的临床变化，而且也可以把这些药剂对病人的毒性减至最小(如果不能消除)。因此，我的发明广泛适用于多种淋巴细胞活素以及一大族除采用这种方案之外几乎没有临床用途的双链RNA。
图4中的曲线说明在图3中报道过其RNA酶L图型的三名白血病患者身上所获得的惊人的生化和临床效果。图4中，白血球计数(每毫升中的细胞数，由“O”连接的线表示)和外周淋巴细胞2’-5’A合成酶活性(用▲连接的线表示)均对时间作图。为了分离淋巴细胞以便测量2’-5’A合成酶，利用标准的Ficol Hypaque法首先纯化外周血液中大约1×106单核细胞。在所有三个病例中，先进行的化学疗法或淋巴细胞活素疗法的效应十分有限，这一点已由高的白细胞(WBC)计数(即高于3000个/毫升)和低的2’-5’A合成酶(用毫微摩尔/毫克细胞蛋白质表示)所证明。但是，向先用低剂量淋巴细胞活素进行“诱发”的细胞中加入错配的dsRNA，可同时表现出循环中的肿瘤细胞数(WBC计数)降低，淋巴细胞RNA酶L恢复正常和总抗病毒状态得到改进。这种方案的临床效力持续极长时间，某些病人可能最终达到“痊愈”的严格临床标准。我用相关的动物模型评价了这种可能性，在动物试验中通过用ds RNA按计划单独或与淋巴细胞活素共同处理，根据RNA酶L恢复的相对水平和完整的2’-5’A/合成酶/RNA酶L途径的恢复正常，我不但证明了肿瘤生长的抑制作用，而且还提高了存活率(P＜0.001)。此外，我还注意到，这种治疗方法增进了天然的免疫监督作用(NK细胞、LAK细胞等等)，并通过减少存活的肿瘤细胞而直接受益。
另外，确定的研究表明这样安排的治疗方案，即单独或与淋巴细胞活素共同施用dsRNA治疗，实际上使各种肿瘤细胞对裂解更敏感，而单独使用淋巴细胞活素通常既未有效地提高肿瘤目标细胞的敏感性，也未惊人地增强免疫作用。
权利要求
1.一种恢复病体中紊乱的2’-5’寡腺苷酸合成酶(2’，5’A)/RNA酶L天然防御系统的方法，其中包括(a)通过监测病人样品，例如病人单核细胞的胞质提取物中的RNA酶L，来评定RNA酶L和测定RNA酶L调节中的缺陷，所说的缺陷由与28S和18SRNA源保温时特有的裂解产物来证实；如果有缺陷的话，则(b)在预定期间内施用有效量的双链RNA，以便分期恢复所说的2’，5’/RNA酶L的天然防御系统并使之恢复到正常状态。
2.权利要求1的方法，其中所说的双链RNA能够用作胞内2’-5’A合成酶的辅因子和用作能够激活RNA酶L的具专一生物活性的2’-5’A寡聚物发生器的任何双螺旋RNA。
3.权利要求1的方法，其中使用的错配dsRNA优选r In·r(C11-14，U)n。
4.权利要求3的方法，其中以在每毫升病人体液中产生1-1000微克所述错配dsRNA水平的剂量施用所说的错配dsRNA。
5.一种治疗其天然的细胞防御系统作用减弱或不起作用的病人癌症、免疫或病毒疾病的方法，利用2’-5’A/RNA酶L天然防御系统评定所说的疾病，所说的方法包括给癌症、免疫或病毒疾病患者，在足以使所说病人的2’-5’/RNA酶L天然防御系统达到分期改善的期间内，与某种淋巴细胞活素同时或在其之后施用有效量的dsRNA。
6.权利要求5的方法，其中所说的疾病是癌，而且其肿瘤细胞是抗单独用干扰素治疗的。
7.权利要求5的方法，其中所说的dsRNA是由寡聚复合物、多聚复合物或二者共同构成的，最好是由与互补的单链多聚RNA杂交的寡核苷酸构成的，它嵌咝纬伤碦NA双螺旋。
8.权利要求5的方法，其中所说的dsRNA含有一些键断裂区，而且所说的dsRNA表现出rIn·r(C11-14，U)n的有利的治疗比率性质。
9.权利要求5的方法，其中与所说的dsRNA同时施用淋巴细胞活素，例如α、β或γ干扰素或白细胞间素。
10.一种评定RNA酶L中缺陷的诊断方法，其中包括测量病人单核细胞的胞质提取物中激活的RNA酶L，最好是测量所说的单核细胞与28S和18SRNA保温时产生专一性裂解产物的能力，或者在预定期间内测定所说的单核细胞产生裂解产物的能力。
全文摘要
通过用所述的诊断方法测量病人单核细胞的胞质提取物中激活的RNA酶L来检测2′-5′-寡腺苷酸(2′-5′A)RNA酶L天然防御系统的缺陷和RNA酶本身的缺陷。单独用dsRNA或与淋巴细胞活素一起使减弱的2′-5′-A/RNA酶L天然防御系统恢复到正常状态。当用所述方法诊断时，在正常情况下对淋巴细胞活素治疗不敏感的条件对这一方法特别敏感。
文档编号C07H21/02GK1032741SQ8810611
公开日1989年5月10日 申请日期1988年7月16日 优先权日1987年7月17日
发明者威廉A·卡特 申请人:Hem研究公司