专利名称：仙茅素b、编码仙茅素b的dna以及生产仙茅素b的方法
技术领域：
本发明涉及仙茅素B(curculin B)、编码仙茅素D的DNA以及生产仙茅素B的方法。
宽叶仙茅(Curculigo latifolia)是一种属于仙茅科(Hypoxidaceae)〔按照另一不同的分类方法则属于石蒜科(Amaryllidaceae)〕的植物，它在自然界中生长于马来西亚西部、泰国南部等地区。本发明的发明人在过去就已发现宽叶仙茅中所含有的一种蛋白质即仙茅素(Curculin)同系物(以下称为仙茅素)可用作调味剂。而且，本发明人在日本专利申请公开号2-104263中描述了得自宽叶仙茅的仙茅素，在日本专利申请公开号2-84157中公开了稳定仙茅素的方法，并在日本专利申请公开号2-84160和2-84161中公开了加工仙茅素的方法。另外，在日本专利申请公开号2-190899中公开了仙茅素同系物之一(以下称为仙茅素A)的完整氨基酸序列。
但是，在上面的日本专利申请公开号2-104263、2-84157、2-84160、2-84161和3-190899中所述的技术中，仙茅素是从宽叶仙茅中提取的，因此难以大量生产。而且，还存在宽叶仙茅植物难以处理、通过提取方法所获得的仙茅素的活性较低等问题。
为了提供一种大量生产仙茅素的方法，本发明人根据已阐明的仙茅素A的氨基酸序列制备出寡核苷酸，并利用该寡核苷酸作为探针成功地克隆了编码仙茅素同系物中另一种仙茅素(以下称作仙茅素B)的cDNA。而且还证实由含有上述克隆DNA的质粒所转化的微生物产生了仙茅素B，从而使本发明得以完成。
因此，本发明涉及基本上纯的仙茅素B。在本说明书中，“基本上纯的仙茅素B”具体是指基本上无来源于宽叶仙茅之其它蛋白质的仙茅素B，并可按照本发明的方法由重组宿主细胞或微生物产生之。
本发明也涉及包括编码仙茅素B之碱基序列的DNA。
另外，本发明还涉及生产仙茅素B的方法，该方法包括培养含有重组DNA的转化细胞或微生物，其中所说的重组DNA中含有编码仙茅素B的碱基序列，从而使得被转化的细胞或微生物能够产生仙茅素B;并从被转化细胞或微生物中分离仙茅素B。
再者，本发明还涉及生产包括编码仙茅素B之碱基序列的DNA的方法，该方法包括从宽叶仙茅中分离出含有仙茅素B mRNA的部分，利用逆转录酶由mRNA制备单链DNA，由单链DNA制备双链DNA、将双链DNA插入载体、用该载体转化宿主以产生cDNA库，并且利用含有编码部分氨基酸序列的碱基的一个或多个合成DNA作为探针，从该库中分离出编码仙茅素B的cDNA，其中所说的部分氨基酸序列是根据自宽叶仙茅纯化的仙茅素A推断的。
图1显示了EcoRI接头的结构。
图2是编码仙茅素B之克隆DNA的限制性酶切图。
图3显示了质粒pQ9的结构。
图4显示了表达质粒的制备方法及其结构。
图5显示了电泳和Western分析的结果。
图6显示了通过对宽叶仙茅进行冲洗、提取和脱盐步骤后所获得的调味剂的CM-琼脂糖离子交换层析的洗脱曲线。
图7显示了对图6的峰(B)阴影部分进行Sephadix G-100分子筛层析的洗脱曲线。
图8显示了由高纯度仙茅素A组成的调味剂的活性。
设想植物细胞中的仙茅素是以包括前肽或前肽原的未成熟蛋白质形成产生的，且成熟蛋白质是通过分离处在加工过程中的前肽或前肽原而形成的。根据本发明人的发现，成熟的仙茅素B由114个氨基酸组成，具有下列式(Ⅰ)的氨基酸序列Asp Asn Val Leu Leu Ser Gly Gln Thr Leu His Ala Asp His SerLeu Gln Ala Gly Ala Tyr Thr Leu Thr Ile Gln Asn Lys Cys AsnLeu Val Lys Tyr Gln Asn Gly Arg Gln Ile Trp Ala Ser Asn ThrAsp Arg Arg Gly Ser Gly Cys Arg Leu Thr Leu Leu Ser Asp GlyAsn Leu Val Ile Tyr Asp His Asn Asn Asn Asp Val Trp Gly SerAla Cys Trp Gly Asp Asn Gly Lys Tyr Ala Leu Val Leu Gln LysAsp Gly Arg Phe Val Ile Tyr Gly Pro Val Leu Trp Ser Leu GlyPro Asn Gly Cys Arg Arg Val Asn Gly (Ⅰ).
而且，未成熟的仙茅素B由158个氨基酸组成，其氨基酸序列如式(Ⅱ)所示
Met Ala Ala Lys Phe Leu Leu Thr Ile Leu Val Thr Phe Ala AlaVal Ala Ser Leu Gly Met Ala Asp Asn Val Leu Leu Ser Gly GlnThr Leu His Ala Asp His Ser Leu Gln Ala Gly Ala Tyr Thr LeuThr Ile Gln Asn Lys Cys Asn Leu Val Lys Tyr Gln Asn Gly ArgGln Ile Trp Ala Ser Asn Thr Asp Arg Arg Gly Ser Gly Cys ArgLeu Thr Leu Leu Ser Asp Gly Asn Leu Val Ile Tyr Asp His AsnAsn Asn Asp Val Trp Gly Ser Ala Cys Trp Gly Asp Asn Gly LysTyr Ala Leu Val Leu Gln Lys Asp Gly Arg Phe Val Ile Tyr GlyPro Val Leu Trp Ser Leu Gly Pro Asn Gly Cys Arg Arg Val AsnGly Gly Ile Thr Val Ala Lys Asp Ser Thr Glu Pro Gln His GluAsp Ile Lys Met Val Ile Asn Asn (Ⅱ).
因此，本发明也涉及包括了编码具有式(Ⅰ)或(Ⅱ)之氨基酸序列的碱基序列的DNA;还涉及包括了所说的碱基序列以及与之结合的ATG(编码起始的甲硫氨酸)的DNA，其中将所说的碱基序列与ATG结合是为了由微生物或培养的细胞产生成熟或未成熟的仙茅素B。
通过自然突变或人工诱变，有可能在不改变主要活性的情况下改变DNA结构或相应肽结构之一部分或多个部分。因此，上述本发明的DNA甚至包括编码具有对应于所有上述多肽的同源突变体的结构的多肽的碱基序列。
可按以下方法得到编码仙茅素B的DNA(A)提取mRNA研磨能够以极高浓度产生仙茅素的宽叶仙茅的果实，并从粉末样品中提取RNA。可使用硫氰酸胍法(Maniatis et al.，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Habor Laboratory，New York(1982))或是苯酚-SDS法(Brawerman等，Biochemistry，11，637-641(1972))提取RNA。
硫氰酸胍法包括向样品中加入硫氰酸胍溶液然后制备匀浆。然后将匀浆置于晶形塑料离心管中，离心后得到RNA残余物。精提该RNA残余物后得到mRNA。
苯酚-SDS法包括将含有苯酚、EDTA和SDS以及二硫苏糖醇的Tris-盐酸缓冲液加到粉末样品中，得到一水相。所产生的水相中除RNA外还含有其它物质(如多糖)，因此，须利用氯化锂等进行脱盐处理以得到RNA残余物。然后，将RNA残余物重新溶于合适的溶剂中，并经用Oligo(dT)柱纯化而提取mRNA(Aviv et al.，Proc Natl.Acad.Sci.U.S.A.69，1408-1418(1972))。在本发明中，因为宽叶仙茅植物具有坚硬的细胞壁，故最好使用苯酚-SDS法。
(B)合成cDNA并将cDNA插入载体中为了合成cDNA，可以使用Okayama-Berg的方法(Okayama et al.，;Mol.Cell Biol.2，161(1982))、Gubler-Hoffman的方法(Gubler et al.，Gene 25，263(1983))以及其它方法。
下面解释Okayama-Berg法。
〔1〕用限制酶KpnⅠ切割PBR322-SV40载体质粒，然后加入Oligo dT，并与限制酶HpaⅠ反应。利用OligodT纤维素(Pharmacia LKB Biotechnology Co.)柱分离出无额外dT或具有Oligo dT短链的产物，从而制得载体引物。
〔2〕用限制酶pstⅠ切割另一个pBR322-SV40融合质粒DNA并纯化之。然后接上Oligo dG链以制备出具有可被限制酶HindⅢ切割之碱基序列的接头DNA。
〔3〕将纯化的mRNA和上面〔1〕中制备的载体引物混合，并利用转录酶合成cDNA。
〔4〕将Oligo dG链连接到与合成之cDNA融合的引物上，然后用HindⅢ消化，并除去在cDNA融合之末端的相反侧连接了Oligo dG链的部分。
〔5〕利用T4连接酶或另一种DNA连接酶连接HindⅢ片段，使上面〔2〕中制得的带有Oligo dG链的接头DNA与上面〔4〕中制得的载体引物DNA-mRNA杂合体连接成环，然后用核糖核酸酶H部分消化RNA。再利用此RNA片段作引物，并依靠DNA聚合酶用DNA链取代RNA链。利用T4连接酶连接DNA后制备双链DNA。
〔6〕制备感受态细胞，进行转化后将细胞培养于含有氨苄青霉素的培养基中(例如X-培养液，LB-培养液，或YT-培养液)，从而得到含有所需DNA的菌落。
下面介绍Gubler-Hoffman法。在该方法中，有可能利用λgt10、λgt11、λZAP等作为载体。
〔1〕利用退火至纯化之mRNA的poly A部分上的Oligo dT作为引物，并利用逆转录酶，合成第一条cDNA链(或sscDNA)。
〔2〕将核糖核酸酶H或另一种内切型RNA酶加到上面〔1〕中制备的cDNA-mRNA杂合体中以消化mRNA，然后加入dATP、dTTP、dGTP和dCTP，用DNA聚合酶Ⅰ或Klenow片段引发反应，以合成第二条cDNA链(或dsc DNA)。
〔3〕通过T4 DNA聚合酶反应处理上面〔2〕中制备的dscDNA以使其两端均匀，并利用EcoRI甲基化酶使EcoRI位点甲基化，然后将EcoRI接头连接至两末端，并进行EcoRI消化。
〔4〕用T4连接酶连接上面〔3〕中制备的EcoRI消化的cDNA和EcoRI消化的λgt载体，然后包装以制备cDNA文库。
可按照上述方式合成cDNA并将其插入载体中。但是在本发明的方法中，如后面的实施例所示，最好使用Gubler-Hoffman法，并且最好用λgt10作为载体。
(C)制备探针本发明人已从宽叶仙茅植物中纯化仙茅素A，测定出该蛋白质的完整氨基酸序列，并公开在日本专利申请公开号3-190899中。可选择该氨基酸序列中的合适部分来制备探针。可利用已知方法(例如利用自动DNA合成仪的磷酰亚胺法，The Japanese Biochemical Society ed.，Henetic Research Mechods I，1-27(1986)或Matteucci et al.，Tetrahedron Lett.，21，719(1980))来合成用作探针的DNA。
(D)筛选可利用上面(C)中制备的探针从上面(B)中制备的cDNA文库中筛选出含有所需基因的噬斑。将该噬斑在尼龙膜、硝酸纤维素或其它滤膜上烘烤。然后按照上面提到的Manitis等人的方法，用放射性核素(如〔32P〕)标记上面(C)中获得的探针。将在上述滤膜上烘烤过的噬斑与用32P等标记的探针杂交，以筛选出含有所需基因的噬斑。
另外，也可利用Glover，DNA Cloning，1，51-52，IRL Press中所述的方法从cDNA文库中筛选含有所需基因的噬斑。该筛选方法包括利用该蛋白质的特异性抗体检测与所需cDNA的表达相对应的蛋白质活性或检测与所需cDNA的表达相对应的蛋白质，并鉴定cDNA。但是，在本发明中所使用的是噬斑杂交(或菌落杂交)法。
(E)亚克隆可用于亚克隆的载体的例子有puc系的质粒(如pUC7、pUC8、pUC9、pUC18或pUC19)或pBR系的质粒(如pBR322、pBR325或pBR327)。最好是使用pUC18。从通过上述筛选方法所选择的噬斑或菌落中提取并纯化噬菌体DNA或质粒DNA，并在用合适的限制酶消化后插入到亚克隆载体中。
按照例如Hanahan等人所述的方法(Mol.Biol.166 557-580(1983))。将由此获得的重组载体引入到感受态细胞中。所使用的宿主细胞可以是得自大肠杆菌K12菌株的细胞，如HB101或MM294、MC1061、C600、DH1以及JM109。可利用上面Maniatis等人的文章中所述的方法，例如使用异丙基吡喃硫代半乳糖苷(IPTG)的方法检测由此获得的转化株。
(F)制备质粒DNA按照例如上面Maniatis等人的文献中所述的碱性SDS法或者煮沸法，有可能从通过亚克隆所获得的克隆中纯化质粒DNA。如果需要，也可使用氯化铯超离心法。
(G)cDNA的结构分析用各种类型的限制酶切割上面(F)中制得的质粒DNA以制备限制性酶切图。另外，用双脱氧法(Sanger et al.，J.Mol.Biol.143，161-178(1980))测定核苷酸序列。
(H)表达可利用上面(F)中所获得的质粒DNA以及利用例如上面Maniatis等人的文献中所述的方法来转化大肠杆菌YA21菌株的感受态细胞并表达仙茅素B。除了上述大肠杆菌YA21菌株外，用于表达的宿主细胞还可以是大肠杆菌MM294、DH1、DH5JM109、HB101、GC508或CES201等。
另外，用于本发明的载体可以是ColE1质粒载体，如pUC系(例如pUC7、pUC8、pUC9、pUC18、pUC19等)、pBR系(例如pBR322、pBR325和pBR327等)及其衍生物pTV118、pUC118、pUC119等。可提到的噬菌体载体包括得自λ-噬菌体的载体，如λgt10、λgt11、Charon 4A、λgt WES-λB、EMBL3、EMBL4等。
再者，适于在酵母中表达的载体可以是例如pYES2.0、pAH9、pMAC561、pLG669、pMA91、pMM82、pMC2010、pOP、pTE432和pSD922。适于在枯草芽孢杆菌中表达的载体可以是例如pPL608、pKTH50、pKTH51、pKTH53、pKTH38、pHY300pLH等。适于在动物细胞(如COS-7细胞、Bowes黑素瘤细胞、CHO细胞)中表达的载体可以是例如pMT、pSV、pCD pMDSG、pBPV等。
在合适的已知培养基中培养所得的转化株，直至达到足够的细胞浓度。然后通过例如超声波处理等手段破碎细胞，并用已知方法处理所得的液体以纯化仙茅素B。所获得的仙茅素B可用作调味剂、食品、药物等。
下述实施例旨在进一步说明本发明，而不是限制本发明。
实施例1提取RNA
用干冰冷冻约6g宽叶仙茅果实(从开花后不久至完全成熟的各个不同时期，即从0周至大约8周不同生长阶段之果实的混合物;由于使用的是整个果实，所以所有的果实成分如果皮、种子、果肉等均包括在内)，并在防止融化的情况下用干冰冷冻并粉碎之，得到5g粉状物。
向5g所产生的粉末中加入15ml苯酚、15ml0.1M Tris-HCl缓冲液(pH8.5，5mM EDTA，1%SDS)和600μl 1M二硫苏糖醇。混合后立刻剧烈摇动该混合物。离心分离出水相，然后用苯酚提取三次。所产生的水相中包含有除RNA之外的物质如多糖。因此，加入1.05体积的5M氯化锂，并将混合物于4℃放置2小时，然后离心得到RNA沉淀物。接着，用乙醇处理该沉淀物，得到768μg RNA。
实施例2提取mRNA对得自实施例1的768μg RNA进行热变性处理(65℃10分钟)，并制备含有热变性之RNA的0.5M氯化钠溶液，然后使该溶液通过Oligo(dT)柱(mRNA纯化柱;Pharmacia LKB Biotechnology Co.)。用0.5M氯化钠溶液除去未吸附的部分，并用不含氯化钠的洗脱液洗柱，得到8μg高浓度的RNA。
实施例3合成cDNA利用市售的cDNA合成试剂盒(cDNA合成试剂盒;Pharmacia LKB Biotechnology Co.)由mRNA合成sscDNA，然后再合成dscDNA。用Klenow片段修成平头，并与EcoRI接头一起退火。
即，向包括Oligod(T)12-18引物、Maloney氏小鼠白血病病毒(MMLV)之逆转录酶、dATP、dCTP、dGTP和dTTP的缓冲液(第一链反应混合物)中加入含有4μg热变性mRNA的20μl无核糖核酸酶的水。使反应混合物于37℃反应1小时。然后将上述反应混合物加至含有核糖核酸酶H、DNA聚合酶Ⅰ、dATP、dCTP、dGTP和dTTP的缓冲液(第二链反应混合物)中，使总体积达到100μl。整个混合物于12℃反应1小时，然后于22℃反应1小时。反应完成后，加入1μl Klenow片段，使反应混合物再于37℃反应30分钟。加入100μl苯酚/氯仿后，将混合物离心1分钟，用层析柱纯化上层水相。向100μl洗脱液中加入4μl EcoRI接头(其结构示于图1)溶液、1μl ATP溶液和3μl T4 DNA连接酶。将混合物温和搅拌并作短时间离心后，于12℃反应过夜。将反应溶液于65℃加热10分钟使DNA连接酶变性并用冰冷却，然后加入10μl ATP溶液和1μl T4多核苷酸激酶。温和搅拌后于37℃反应30分钟。向反应溶液中加入100μl苯酚/氯仿，然后离心1分钟，上层水相通过层析柱纯化，从而得到与EcoRI接头连接的dscDNA。
实施例4将cDNA插入载体中用EcoRI切割λgt10的EcoRI位点，经碱性磷酸酶处理并脱去磷酸后，使之与实施例3中得到的连接了EcoRI接头的dscDNA相连接。
为找到最好的混合比例，进行试验连接。即，将2μl λgt10、3μl 3M乙酸钠和60μl冷乙醇加到实例3中得到的30μl洗脱液(用洗柱缓冲液稀释成含有5.0ng、15.0ng或40.0ng dscDNA的溶液)。将整个混合物混合后于-70℃冷却15分钟，离心10分钟以得到沉淀物。干燥所得沉淀物。将干燥过的cDNA重新悬浮于9μl洗柱缓冲液中，然后加入1μl ATP溶液和1μl T4DNA连接酶。搅拌后离心该混合物，并于12℃反应16小时。然后按照Maniatis等人的文献中所述的方法进行体内包装(Giga pack golol)并用重组噬菌体感染大肠杆菌c600hf1，由此发现当0.3μg λgt与40ng EcoRI接头连接的dscDNA混合时可得到最佳结果。然后，按照上述摩尔比放大连接和包装，以制得约含300，000个单独的噬斑的文库。
实施例5筛选根据日本专利申请公开号3-190899中所述的仙茅素A的氨基酸序列，制备出以下三种类型的探针。在下面的碱基序列中，N代表脱氧核糖核苷酸残基A、C、G和T，H代表A、C和T，D代表A、G和T，R代表A和G，K代表G和T，Y代表C和T。所使用的合成方法可以是上面提到的Japanese Biochemical Society(Genetic Research Methods I)文献中所述的方法。
(1)基于Ile-Gln-Asn-Asn-Cys-Asn(从成熟仙茅素A的氨基末端的第25位至第30位氨基酸)的有意义链DNA探针(17mer;48种类型)5'-ATH-CAR-AAK-AAK-TGY-AA-3'(2)基于Tyr-Gln-Asn-Gly-Arg-Gln-Ile-Trp-Ala(第34至第42位氨基酸)的反义链DNA探针(26mer;1536种类型)5'-GC-CCA-DAT-YTG-NCK-NCC-RTT-YTG-RTA-3'(3)基于Phe-Val-Ile-Tyr-Gly-Pro-Val(第94至第100位氨基酸)的反义链DNA探针(20mer;768种类型)5'-AC-NGG-NCC-RTA-DAT-NAC-RAA-3'利用T4多核苷酸激酶，用〔γ-32P〕dATP标记这些探针的5′末端，并在下面的实施例6中使用之。
实施例6噬斑杂交将实施例4所得文库中的噬斑转移到尼龙膜上并固定该DNA。然后用实施例5制备的探针(1)至(3)依次进行杂交。用探针(1)进行杂交时的温度为33-34℃，探针(2)为55℃，探针(3)为45-46℃。对探针(1)至(3)的洗涤条件均为6X SSC(1X SSC为0.15M氯化钠和0.015M柠檬酸钠)，且洗涤温度与杂交时的相应温度相同。结果从大约300，000个噬斑中得到16组与所有探针杂交的噬斑。
实施例7分离单个噬斑对实施例6所获得的16组噬斑中的每一组进行第二次筛选。即每一组噬斑均分离成单独的噬斑，按照与实施例6相同的方式使它们依次与探针(1)-(3)杂交。分别从16组噬斑中的每一组中得到与所有探针(1)至(3)杂交的噬斑。所得的噬斑分别命名为噬菌体λQ1至λQ16。从噬菌体λQ1至λQ16中提取出噬菌体DNA，用EcoRI消化，并通过电泳比较插入子的分子量，结果发现包含于噬菌体λQ9中的插入子最长(约1.2kbp)。
实施例8亚克隆利用pUC18再克隆包含于噬菌体λQ9中的插入子。即，按照例如Japanese Biochemical Society ed.，Cont.Biochemical Experiment Lectures I，Genetic Research Methods 2，100(1986)中所述的方法从噬菌体λQ9中纯化30μg DNA，并用100单位EcoRI消化，从而得到400ng编码仙茅素的EcoRI片段。另一方面，用EcoRI切割pUC18(50ng)，用碱性磷酸酶处理并脱磷酸。然后向其中加入含有100ng上述EcoRI片段和1.0μl T4连接酶的20μl连接缓冲液(66mM Tris-HCl缓冲液，含有0.01mM ATP、6.6mM氯化镁和10mM二硫苏糖醇，PH7.6)，将该混合物于12℃保温16小时以进行连接。
然后，按照上面提到的Hanahan等人的文献中所述的方法进行转化。即，将含有100ng cDNA-质粒DNA的5μl上述缓冲液加到为转化而制备的210μl大肠杆菌MM294的感受态细胞中。将混合物于0℃放置30分钟，42℃放置80秒钟后用冰冰却。加入800μl SOC培养基，并将混合物于37℃振荡1小时。将混合物在含有50μg/ml氨苄青霉素的X-液体琼脂培养基中于37℃培养，每板约得到100个转化体。
实施例9菌落杂交按常规方法对实施例8中获得的多个平板进行变性和烘烤处理以固定DNA。于55°用上述实施例5制备的探针(2)进行杂交，并在同一温度下用6X SSC洗涤。得到75个阳性克隆。
实施例10质粒DNA将实施例9中认定为阳性的一个转化株重新植入含有50μl/ml氨苄青霉素的30ml X-培养基中。将该混合物于37℃过夜振荡培养，然后于4℃离心(2000×g，7分钟)以得到大约200μg细胞。将该细胞(约200μg)溶于800μl含溶菌酶(10mg/ml的25mM Tris-HCl缓冲溶液(含有50mM葡萄糖和10mM EDTA，pH8.0)中，按照上面提到的Maniatis等人的文献中所述的方法获得约20μg质粒(以下称作质粒PQ9)DNA。质粒PQ9的结构示于图3中(在图3的插入部分中，箭头指示编码仙茅素B的DNA的插入方向)。
实施例11制备限制酶切图并测定碱基序列用各种限制酶切割质粒PQ9，制备出图2所示的限制性酶切图。另外，利用双脱氧法(见上述Sanger等人的文献)测定各种DNA片段的核苷酸序列，其结果示于下面的表1中。表1中也显示了根据碱基序列推导出的氨基酸序列。图2中的阴影部分显示编码部分，箭头表示碱基序列的测定方向。表1中所示的5′和3′非翻译区的各碱基序列分别是一个例子。即，当利用λQ1至λQ16中除λQ9之外的噬菌体作同样处理以测定碱基序列时，发现了与表1所示的5′和3′非翻译区的碱基序列存在部分差异的序列。
表ⅠCGCAAAGACA ATG GCG GCC AAG TTT CTT CTC ACC ATT CTT GTC ACCMet Ala Ala Lys Phe Leu Leu Thr Ile Leu Val Thr-20 -15TTT GCG GCC GTC GCT AGC CTT GGC ATG GCC GAC AAT GTC CTG CTCPhe Ala Ala Val Ala Ser Leu Gly Met Ala Asp Asn Val Leu Leu-10 -5 1 5TCC GGG CAA ACT CTG CAT GCC GAC CAC TCT CTC CAG GCG GGC GCCSer Gly Gln Thr Leu His Ala Asp His Ser Leu Gln Ala Gly Ala10 15 20TAT ACC TTA ACC ATA CAA AAC AAG TGC AAC CTG GTG AAA TAC CAGTyr Thr Leu Thr Ile Gln Asn Lys Cys Asn Leu Val Lys Tyr Gln25 30 35AAC GGG AGG CAG ATC TGG GCT AGC AAC ACT GAC AGG CGG GGC TCCAsn Gly Arg Gln Ile Trp Ala Ser Asn Thr Asp Arg Arg Gly Ser40 45 50GGC TGC CGC CTC ACA TTG CTG AGT GAC GGG AAC CTC GTT ATC TACGly Cys Arg Leu Thr Leu Leu Ser Asp Gly Asn Leu Val Ile Tyr55 60 65GAC CAC AAC AAC AAC GAC GTG TGG GGG AGC GCC TGC TGG GGG GACAsp His Asn Asn Asn Asp Val Trp Gly Ser Ala Cys Trp Gly Asp70 75 80AAC GGC AAG TAT GCT CTT GTT CTT CAG AAG GAT GGC AGA TTT GTCAsn Gly Lys Tyr Ala Leu Val Leu Gln Lys Asp Gly Arg Phe Val85 90 95ATC TAT GGC CCG GTT TTG TGG TCC CTT GGC CCT AAT GGG TGC CGCIle Tyr Gly Pro Val Leu Trp Ser Leu Gly Pro Asn Gly Cys Arg100 105 110CGT GTT AAT GGT GGA ATC ACA GTT GCT AAG GAT TCT ACT GAA CCAArg Val Asn Gly Gly Ile Thr Val Ala Lys Asp Ser Thr Glu Pro115 120 125CAA CAT GAG GAT ATT AAG ATG GTG ATT AAT AATGln His Glu Asp Ile Lys Met Val Ile Asn Asn130 135TAATCAAGTG AGAGGATTGT TATGAGAATA ATGAGTGGAA TGGAAGACCAATCTCATGTC GGTGTGGCCT ATCTCCACCT GTTTGCAGTG CCTTTGTTAAAATAACACAT TGGGGAATAA TAAAGTGAAA CTATATAGAT TGGTTCAGCAAATTTTCTGT TCAGTTTTCC TCTCACATGT CAATGTCGAT TTTTTGCCGCGGATCATACA TGTGCTTGGT ATTCTAATCG ATAGAATTAT GGCTCAAATGGAGGCAGGGA TTATGAGAGT TTATTCGCAT CTCCGGGTCT TCCAACTTACGAATTATAAC AAGATTCAAG GATGCATCTG AGAGCCAACT TAACGTCTTACATCAAAGGA GCTAGCCGAA GTTTATTCCC AGAGCTAGAG GAAGTTCGCTGCCATGGTTG ATAGTACAAG TAGAACGACG CATGTATTGC TTCCAGGAATCACTTCCAGC TTCTCGACAC CTCCAGTGGC CTTTTCACCA CCGAAAGCACCACCAATTTC AGCACCATTG GTAGGTATAT TTACATTAAC AATACCACAGTCACTGCCAT GGGGTCCAAT CCACTTGAAA ATAACTTCAG GTCTACGAGTGAAAATAGAA CTGCTTAAAC TTGCGGTACA GAGTTATTTA TTTCAATTGCTTCTTTCAGA GTCTGGAATT TCATTACGTA AA (III)
实施例12表达按照Hanahan等人所述的方法(文献同上)制备表达载体。即用EcorⅠ消化质粒pQ9(10μg)，并利用klenow片段(1.0μl5.0单位)。充填其末端，从而得到编码仙茅素B的DNA片段(约1.2kb)。然后，将100ng该DNA片段插入被HincⅡ消化的puc18(50ng)中，制备一重组质粒(见图4)。另一方面，利用氯化钙处理法使大肠杆菌YA21菌株成为感受态细胞，并用上述重组质粒转化之。将转化体接种在含有50μg/ml氨苄青霉素的0.2mlx-液体培养基中，并于37℃保温18小时。然后离心(3000xg，10分钟)细菌悬浮液，将约5μg所得沉淀物悬浮于1.0mlM9培养基中，并进行预保留。然后以1mM的浓度加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，继续保温2小时。
实施例13制备抗血清将含有1mg/4ml在对比实施例4(见下)中制备并在对比实施例5(见下)中鉴定的仙茅素A的0.1M pBS磷酸盐生理缓冲液(pH7.6)用作抗原溶液(用于一次免疫)。将4ml抗原溶液与等量的弗氏完全佐剂(FCA)和弗氏不完全佐剂(FIA混合所获得的油包水型乳液分别用作FCA抗原溶液和FIA抗原溶液，将2ml上述FUA抗原溶液通过肌肉注射到兔(两只体重约1.5kg的雌兔)的左、右大腿部位以对其进行免疫(初次免疫)。初次免疫一周后，按同样方式再次免疫(加强免疫)，不同的是这次使用的是FIA抗原溶液。加强免疫一周后，按30ml/兔抽取血样。将所得血液于室温放置2小时，然后以3500rpm离心5分钟。所得上清液以10，000rpm的速度继续离心20分钟，从上清中制取含有抗仙茅素A抗体的抗血清。通过柱层析(1.0×4.0cm柱，自然降落)用不溶性蛋白质A处理该抗血清以制备出纯化的抗血清。
实施例14Western分析将实施例12中制及的细胞悬浮在100μl含有1mM pMSF(苯甲磺酰氟)的10mM Tris-1mM EDTA缓冲液(pH7.5)中，并通过超声波处理将其破碎，然后通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离到3μl所得液体。其结果示于图5的第3泳道。图5的第4泳道是对照样品，它是通过破碎未经实施例12所述之一重组步骤的质粒转化的大肠杆菌YA21菌株并按同样方式通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离所产生的液体而得到的如第三泳道左边的箭头所示，蛋白质成分见于约17kd处。所使用的标记物(未示出)是预染色的SDS-PAGE标准品(含有磷酰酶B(PhospholyraseB)(110kd)，牛血清白蛋白(84kd)，卵白蛋白(47kd)，碳酸酐酶(33kd)，大豆胰蛋白酶抑制剂(24kd)和溶菌酶(16kd);Biorad Laboratories)。
然后，将分离的成分转移至硝酸纤维素滤膜上，于室温下用10mM磷酸钠缓冲液(pH7.4;含有0.14M氯化钠和0.05%(v/v)吐温20，以下称作TPBS)洗涤滤膜，然后加入20mM磷酸钠缓冲液(pH7.4;含有3%白蛋白和0.5M氯化钠)作为封阻渗液。将混合物于37℃放置60分钟，进行封阻。向上述滤膜中加入10ml1500倍稀释的实施例13所获得的纯化抗血清于4℃放置1天。用TPBS洗涤三次后加入第二抗体。再将滤膜于室温放置2小时。既使用的第二抗体是5ml1000倍稀释的碱性磷酸酶接合的抗兔IgG(Sigma co)。
接着，加入约10ml碱性磷酸酶缓冲液，并将滤膜于室温下放置10分钟。然后，加入含66μlNBT(四唑氮蓝)溶液、33μlBCIP(5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸)溶液和9.9ml碱性磷酸酶缓冲液的底物溶液，使滤膜在室温下显色5分钟。加入3%三氯乙酸溶液终止反应，并用蒸馏水漂洗滤膜。其中NBT溶液是将50mg NBT溶于1ml70%二甲基甲酰胺而制得的，BCIP溶液是将50mg BCIP溶于1ml100%甲酰胺而制得的。
所得结果示于图5的第1和第2泳道。第1泳道是第3泳道的转移，而第2泳道是第4泳道(对照)的转移。第2泳道不含有与抗仙茅素A抗体反应的任何成分，而第1泳道则如左边的箭头所示，含有与在第3泳道的约17kd处出现的蛋白质相应之位置的抗仙茅素A抗体反应的成分。
参考实施例1漂洗和用氯化钠溶液提取。
称取约30g宽叶仙茅果肉，向其中加入40ml水。将该混合物制成匀浆并离心(12，500rpm，60分钟)。上清液呈现棕色且不具有调味活性。向所得残渣中加入40ml水，将混合物制成匀浆并离心(12，500rpm，20分钟)。上清为无色液体且不具有调味活性。
然后，将0.5M氯化钠水溶液加至所得残渣中。将混合物制成匀浆并离心(30，000rpm，60分钟)。所得上清为无色液体且显示出调味活性。使用40ml 0.5M氯化钠水溶液重复提取步骤三次。合并三份上清液后得到含有仙茅素的粗提物。
参考实施例2用硫酸铵盐析向参考实施例1中制得的粗提物中加入硫酸铵至80%饱和度以沉淀活性物质。离心(32，000rpm，60分钟)所得液体以得到沉淀物，将其溶于100ml 0.01M磷酸盐缓冲液(PH6.8)中。
参考实施例3CM-Sepharose离子交换层析将参考实施例2中得到的溶液通过CM-Sepharose CL-6B柱(直径＝2.2cm×18cm;柱床体积＝68ml;Pharmacia LKB Biotechnology Co.)以进行吸附。然后，用0.01M磷酸盐缓冲液(pH6.8)除去未吸附的部分再用0-1.0M线性梯度的氯化钠溶液(流速＝5ml/小时，每管5ml;总洗脱物＝500ml)洗脱仙茅素。根据280nm处的吸收值监测洗脱的蛋白质。所得结果显示于图6中。图6所示的峰(B)是包含调味仙茅素的部分。
参考实施例4分子筛层析向参考实施例3所获得的部分(如图6的峰(B)之阴影部分所示)中加入硫酸铵至80%饱和以沉淀活性物质。离心(32，000rpm，60分钟)所得液体，得到沉淀物，然后将其溶解于1.5ml 0.01M磷酸盐缓冲液(PH6.8)中。用Sephadex(Pharmacia LKB Biotechology Co.)G-100柱(直径＝1.6cm×58cm;柱床体积＝160ml)及含有0.5M NaCl的0.01M磷酸盐缓冲液(PH6.8)(流速＝8.4ml/hr;每管收集2.8ml;总洗脱物＝182ml)分离所得到的浓缩溶液。根据280nm处的吸收值监测蛋白质。图7所示的峰(A)是包含调味仙茅素的部分。
参考实施例5SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳利用含8M尿素的SDS-聚丙烯酰胺凝胶，以电泳法测定参考实施例4所得的图7峰(A)阴影部分所示之部分的物质纯度及其分子量。结果可见在分子量12，000道尔顿处显示出单一带，从而证实图7峰(A)阴影部分所示之部分的调味仙茅素是纯的。因此，将所得到的纯化的仙茅素称为“仙茅素A”。
表2列出了从30g宽叶仙茅果肉中制得的仙茅素成分的蛋白质含量、活性物质的产率以及纯化程度。其中蛋白质含量是采用Lowry等人的方法测定的。
另外，按如下方法测定其活性将样品在口中放3分钟，用水漱口后通过品尝含有各种浓度之蔗糖溶液的0.02M柠檬酸溶液来进行甜度比较，从而确定达到相同甜度的蔗糖浓度。所得结果示于图8。从图8可以看出，高纯度仙茅素A的活性相当于0.3M蔗糖的甜度。
参考实施例6等电点电泳以使用Phast Gel IEF5-8的Phast System(商标)(Pharmacia LKB Biotechnology Co.)装置对高纯度的仙茅素A进行等电点电泳。由此测得的等电点为7.1。
按照本发明，可采用比现有技术更简便的方法制备出基本上纯的和稳定的仙茅素B，并具有可能对其进行大规模生产。
尽管参照具体的实施方案对本发明进行了叙述，对本发明所作的对于本领域技术人员来说显而易见的各种改动和改进均视为包括在本发明的范围和构思之内。
序列目录序列号1序列长度114序列类型氨基酸分子类型蛋白质原始来源宽叶仙茅序列描述:
Asp Asn Val Leu Leu Ser Gly Gln Thr Leu His Ala Asp His Ser1 5 10 15Leu Gln Ala Gly Ala Tyr Thr Leu Thr Ile Gln Asn Lys Cys Asn20 25 30Leu Val Lys Tyr Gln Asn Gly Arg Gln Ile Trp Ala Ser Asn Thr35 40 45Asp Arg Arg Gly Ser Gly Cys Arg Leu Thr Leu Leu Ser Asp Gly50 55 60Asn Leu Val Ile Tyr Asp His Asn Asn Asn Asp Val Trp Gly Ser65 70 75Ala Cys Trp Gly Asp Asn Gly Lys Tyr Ala Leu Val Leu Gln Lys80 85 90Asp Gly Arg Phe Val Ile Tyr Gly Pro Val Leu Trp Ser Leu Gly95 100 105Pro Asn Gly Cys Arg Arg Val Asn Gly110序列号2序列长度158序列类型氨基酸分子类型蛋白质原始来源宽叶仙茅序列描述Met Ala Ala Lys Phe Leu Leu Thr Ile Leu Val Thr Phe Ala Ala-20 -15 -10Val Ala Ser Leu Gly Met Ala Asp Asn Val Leu Leu Ser Gly Gln-5 1 5Thr Leu His Ala Asp His Ser Leu Gln Ala Gly Ala Tyr Thr Leu10 15 20Thr Ile Gln Asn Lys Cys Asn Leu Val Lys Tyr Gln Asn Gly Arg25 30 35Gln Ile Trp Ala Ser Asn Thr Asp Arg Arg Gly Ser Gly Cys Arg40 45 50Leu Thr Leu Leu Ser Asp Gly Asn Leu Val Ile Tyr Asp His Asn55 60 65Asn Asn Asp Val Trp Gly Ser Ala Cys Trp Gly Asp Asn Gly Lys70 75 80Tyr Ala Leu Val Leu Gln Lys Asp Gly Arg Phe Val Ile Tyr Gly85 90 95Pro Val Leu Trp Ser Leu Gly Pro Asn Gly Cys Arg Arg Val Asn100 105 110Gly Gly Ile Thr Val Ala Lys Asp Ser Thr Glu Pro Gln His Glu115 120 125Asp Ile Lys Met Val Ile Asn Asn (II).
130 135序列号3序列长度1166序列类型核苷酸分子类型cDNA或mRNA原始来源宽叶仙茅序列描述
CGCAAAGACA ATG GCG GCC AAG TTT CTT CTC ACC ATT CTT GTC ACCMet Ala Ala Lys Phe Leu Leu Thr Ile Leu Val Thr-20 -15TTT GCG GCC GTC GCT AGC CTT GGC ATG GCC GAC AAT GTC CTG CTCPhe Ala Ala Val Ala Ser Leu Gly Met Ala Asp Asn Val Leu Leu-10 -5 1 5TCC GGG CAA ACT CTG CAT GCC GAC CAC TCT CTC CAG GCG GGC GCCSer Gly Gln Thr Leu His Ala Asp His Ser Leu Gln Ala Gly Ala10 15 20TAT ACC TTA ACC ATA CAA AAC AAG TGC AAC CTG GTG AAA TAC CAGTyr Thr Leu Thr Ile Gln Asn Lys Cys Asn Leu Val Lys Tyr Gln25 30 35AAC GGG AGG CAG ATC TGG GCT AGC AAC ACT GAC AGG CGG GGC TCCAsn Gly Arg Gln Ile Trp Ala Ser Asn Thr Asp Arg Arg Gly Ser40 45 50GGC TGC CGC CTC ACA TTG CTG AGT GAC GGG AAC CTC GTT ATC TACGly Cys Arg Leu Thr Leu Leu Ser Asp Gly Asn Leu Val Ile Tyr55 60 65GAC CAC AAC AAC AAC GAC GTG TGG GGG AGC GCC TGC TGG GGG GACAsp His Asn Asn Asn Asp Val Trp Gly Ser Ala Cys Trp Gly Asp70 75 80AAC GGC AAG TAT GCT CTT GTT CTT CAG AAG GAT GGC AGA TTT GTCAsn Gly Lys Tyr Ala Leu Val Leu Gln Lys Asp Gly Arg Phe Val85 90 95ATC TAT GGC CCG GTT TTG TGG TCC CTT GGC CCT AAT GGG TGC CGCIle Tyr Gly Pro Val Leu Trp Ser Leu Gly Pro Asn Gly Cys Arg100 105 110CGT GTT AAT GGT GGA ATC ACA GTT GCT AAG GAT TCT ACT GAA CCAArg Val Asn Gly Gly Ile Thr Val Ala Lys Asp Ser Thr Glu Pro115 120 125CAA CAT GAG GAT ATT AAG ATG GTG ATT AAT AATGln His Glu Asp Ile Lys Met Val Ile Asn Asn130 135TAATCAAGTG AGAGGATTGT TATGAGAATA ATGAGTGGAA TGGAAGACCAATCTCATGTC GGTGTGGCCT ATCTCCACCT GTTTGCAGTG CCTTTGTTAAAATAACACAT TGGGGAATAA TAAAGTGAAA CTATATAGAT TGGTTCAGCAAATTTTCTGT TCAGTTTTCC TCTCACATGT CAATGTCGAT TTTTTGCCGCGGATCATACA TGTGCTTGGT ATTCTAATCG ATAGAATTAT GGCTCAAATGGAGGCAGGGA TTATGAGAGT TTATTCGCAT CTCCGGGTCT TCCAACTTACGAATTATAAC AAGATTCAAG GATGCATCTG AGAGCCAACT TAACGTCTTACATCAAAGGA GCTAGCCGAA GTTTATTCCC AGAGCTAGAG GAAGTTCGCTGCCATGGTTG ATAGTACAAG TAGAACGACG CATGTATTGC TTCCAGGAATCACTTCCAGC TTCTCGACAC CTCCAGTGGC CTTTTCACCA CCGAAAGCACCACCAATTTC AGCACCATTG GTAGGTATAT TTACATTAAC AATACCACAGTCACTGCCAT GGGGTCCAAT CCACTTGAAA ATAACTTCAG GTCTACGAGTGAAAATAGAA CTGCTTAAAC TTGCGGTACA GAGTTATTTA TTTCAATTGCTTCTTTCAGA GTCTGGAATT TCATTACGTA AA
权利要求
1.利用重组宿主细胞或微生物生产基本上纯的仙茅素B的方法。
2.根据权利要求1所述的方法，它用于生产基本上没有来源于宽叶仙茅之其它蛋白质的仙茅素B。
3.根据权利要求1所述的方法，它用于生产包括式(Ⅰ)氨基酸序列的肽Asp Asn Val Leu Leu Ser Gly Gln Thr Leu His Ala Asp His SerLeu Gln Ala Gly Ala Tyr Thr Leu Thr Ile Gln Asn Lys Cys AsnLeu Val Lys Tyr Gln Asn Gly Arg Gln Ile Trp Ala Ser Asn ThrAsp Arg Arg Gly Ser Gly Cys Arg Leu Thr Leu Leu Ser Asp GlyAsn Leu Val Ile Tyr Asp His Asn Asn Asn Asp Val Trp Gly SerAla Cys Trp Gly Asp Asn Gly Lys Tyr Ala Leu Val Leu Gln LysAsp Gly Arg Phe Val Ile Tyr Gly Pro Val Leu Trp Ser Leu GlyPro Asn Gly Cys Arg Arg Val Asn Gly (Ⅰ).
4.根据权利要求1所述的方法，它用于生产包括式(Ⅱ)氨基酸序列的肽Met Ala Ala Lys Phe Leu Leu Thr Ile Leu Val Thr Phe Ala AlaVal Ala Ser Leu Gly Met Ala Asp Asn Val Leu Leu Ser Gly GlnThr Leu His Ala Asp His Ser Leu Gln Ala Gly Ala Tyr Thr LeuThr Ile Gln Asn Lys Cys Asn Leu Val Lys Tyr Gln Asn Gly ArgGln Ile Trp Ala Ser Asn Thr Asp Arg Arg Gly Ser Gly Cys ArgLeu Thr Leu Leu Ser Asp Gly Asn Leu Val Ile Tyr Asp His AsnAsn Asn Asp Val Trp Gly Ser Ala Cys Trp Gly Asp Asn Gly LysTyr Ala Leu Val Leu Gln Lys Asp Gly Arg Phe Val Ile Tyr GlyPro Val Leu Trp Ser Leu Gly Pro Asn Gly Cys Arg Arg Val AsnGly Gly Ile Thr Val Ala Lys Asp Ser Thr Glu Pro Gln His GluAsp Ile Lys Met Val Ile Asn Asn (Ⅱ).
5.生产仙茅素B的方法，它包括培养含有重组DNA的转化细胞或微生物，其中所说的重组DNA含有编码仙茅素B的碱基序列，从而使得该转化细胞或微生物产生仙茅素B，并从所说的被转化细胞或微生物中分离仙茅素B。
6.利用含有编码自宽叶仙茅(Curc u ligo latifolia)纯化的仙茅素A推导出的部分氨基酸序列之碱基序列的一个或多个合成的DNA作为探针，由分离自宽叶仙茅的mRNA生产包括编码仙茅素B的碱基序列之DNA的方法。
7.利用含有编码自宽叶仙茅纯化的仙茅素A推导出之部分氨基酸序列的碱基序列的一个或多个合成的DNA作为探针，由分离自宽叶仙茅的mRNA生产包括编码未成熟仙茅素B之碱基序列的DNA的方法。
8.生产包括编码仙茅B之碱基序列的DNA的方法，该方法包括从宽叶仙茅中分离含有仙茅素mRNA的部分;利用逆转录酶从所说的mRNA制备单链DNA;从所说的单链DNA制备双链DNA;将所说的双链DNA插入载体中，用所说的载体转化宿主以产生cDNA文库，以及利用一个或多个合成的DNA体为探针从所说的cDNA文库中分离编码仙茅素B的cDNA，其中所说的合成的DNA含有编码部分氨基酸序列的碱基序列，所说的碱基序列是根据自宽叶仙茅纯化的仙茅素A推导出的。
9.根据权利要求8所述的方法，其中使用至少一种选自包括下列碱基序列式之DNA的DNA作为探针5'-ATH-CAR-AAK-AAK-TGY-AA-3',5'-GC-CCA-DAT-YTG-NCK-NCC-RTT-YTG-RTA-3'和5'-AC-NGG-NCC-RTA-DAT-NAC-RAA-3'其中N代表脱氧核糖核苷酸残基A、C、G或T，H代表脱氧核糖核苷酸残基A、C或T，D代表脱氧核糖核苷酸残基A、G或T，R代表脱氧核糖核苷酸残基A或G，K代表脱氧核糖核苷酸残基G或T，Y代表脱氧核糖核苷酸残基C或T。
10.根据权利要求9所述的方法，其中使用包括了下式碱基序列的DNA5'-ATH-CAR-AAK-AAK-TGY-AA-3'或包括了下式碱基序列的一个或两个DNA作为探针5'-GC-CCA-DAT-YTG-NCK-NCC-RTT-YTG-RTA-3'或5'-AC-NGG-NCC-RTA-DAT-NAC-RAA-3',其中N代表脱氧核糖核苷酸残基A、C、G或T，H代表脱氧核糖核苷酸残基A、C或T，D代表脱氧核糖核苷酸残基A、G或T，R代表脱氧核糖核苷酸残基A或G，K代表脱氧核糖核苷酸残基G或T，Y代表脱氧核糖核酸残基C或T。
全文摘要
本发明涉及基本上纯的仙茅素B、生产仙茅素B的方法以及编码成熟或未成熟仙茅素B的DNA。
文档编号C07K14/245GK1064704SQ9210136
公开日1992年9月23日 申请日期1992年3月4日 优先权日1991年3月4日
发明者栗原良枝, 荒井综一, 阿部启子, 山下治之 申请人:栗原良枝, 荒井综一, 旭电化工业株式会社