专利名称：得自幽门螺杆菌的粘附性基因和由其编码的多肽的制作方法
技术领域：
本发明涉及鉴别得自幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)的分泌性基因、特别是粘附性基因的方法。此外，本发明涉及适于鉴别得自幽门螺杆菌的分泌性基因的基因库、可从该基因库获得的多核苷酸和多肽、特别是得自幽门螺杆菌的alpA-基因及其所编码的多肽。这些多核苷酸和多肽可用于诊断、预防和治疗螺杆菌感染。
长期以来，人们已知人胃粘膜中存在螺形菌(Bizzozero，1893)。不过，直到Marshall和Warren从胃溃疡患者的胃粘膜中成功地分离出并培养这种细菌时，人们才认识到它们是致病性细菌这一事实(Warren和Marshall，1983；Marshall等，1984)。最初的分析表明，分离出的微生物是革兰氏阴性螺形菌，它具有极高的游动性和能在强酸性条件下(约达pH1.5)存活的非凡能力。这些最初被称为幽门弯曲杆菌(Campylobacter pylori)的细菌最终根据生化和形态特征归入新确立的“螺杆菌(Helicobacter)”属(Goodwin等，1989)。
几年中，幽门螺杆菌感染以及这一发现的意义已很清楚。Taylor和Blaser(1991)所做的流行病学研究表明，幽门螺杆菌感染在全球范围内发生，约有50％人口受到这种细菌感染，发展中国家比工业化国家的感染率更高。还注意到，随年龄的提高，慢性幽门螺杆菌感染的概率急剧增大。因此，慢性幽门螺杆菌感染是人类最常见的慢性细菌感染之一。
目前已经知道，这种感染不可避免地导致人类细菌性胃炎(B型胃炎)的诱发。另外，还假设幽门螺杆菌在胃溃疡和十二指肠溃疡以及某些形式的胃癌(腺癌)的发展中起诱因作用(Lee等，1993；Solnick和Tompkins，1993)。甚至更少见的、被视为免疫系统B细胞瘤的先兆的胃MALT(粘膜相关淋巴组织)淋巴瘤大概也是幽门螺杆菌感染的结果。对这类病人进行的能成功根除(完全消除)幽门螺杆菌的抗菌治疗导致胃溃疡和低级MALT淋巴瘤的治愈(Sipponen和Hyvrinen，1993；Isaacson和Spencer，1993；Stolte和Eidt，1993)。
长期受幽门螺杆菌感染的一个后果是萎缩性胃炎，粘性、产酸或产胃蛋白酶的胃上皮细胞变性，这必然被视为癌前期损害。根据1980年对全球最常见癌症类型的统计结果，胃癌位居第二，但有下降趋势(Parkin等，1988)。近期的两项研究表明了幽门螺杆菌感染和胃癌发生(肠型)之间的统计学显著相关性；两者得出的结论都是，发生的全部胃癌中约有60％大概是幽门螺杆菌感染的结果(Parsonnet等，1991；Nomura等，1991)。Sipponen(1992)所做的进一步研究表明，许多工业化国家中受到感染的人有20％以上在其一生中患上胃溃疡或十二指肠溃疡；而对胃粘膜正常的人而言，这种危险性小得可以忽略。这意味着，这类常见的胃-十二指肠疾病必被视为传染病并需适当治疗(Alper，1993)。消除已发生的慢性幽门螺杆菌门螺杆菌感染的一项疗法会治愈胃炎、胃溃疡或十二指肠溃疡或者MALT淋巴瘤。因此，可以采用防止幽门螺杆菌感染的预防性疗法(例如，免疫接种)以及消除已发生的幽门螺杆菌门螺杆菌感染的疗法来治疗这类常见的胃-十二指肠疾病。
除了一些高级灵长类之外，人是以前已知的幽门螺杆菌的唯一天然宿主。较近期的发现即家猫也能被幽门螺杆菌感染，新近阐述了传播的问题以及人体之外的可能细菌贮主。从受感染人的粪便中偶尔成功培养出幽门螺杆菌以及这种细菌在水中存活数月都支持了粪便-口传播这一假设。根据家族研究，认为直接口-口传播也是可能的。感染经常发生在家族中的儿童中，恶劣的生活条件和低的卫生标准与感染率有正相关性。
细菌从口摄入后，首先到达极酸的胃腔(pH1-2)中。在此，通过产生脲酶这种酶使细菌可能存活，所述脲酶造成已有脲的分解，从而引起胃中酸性pH值的局部中和。借助趋化定向和依赖于鞭毛的游动性，微生物再移动到胃窦区的碳酸氢盐缓冲的粘膜层，这里实际上是其天然栖所。它们在此处于独特的生态小境中，由于酸性屏障作用，只有几种竞争性细菌能进入该生态小境。为到达上皮，微生物大概借助于腔(pH1-2)和上皮细胞表面(pH6-7)之间的pH梯度进行自身定向。由于其螺形、其在粘膜中的游动性、粘膜修饰酶的产生及其微需氧的生活方式，这些细菌最佳地适应了该栖所中的生活条件。
它们通常生活在窦区的深腺(deep crypts)中，在此免受如酸、胃蛋白酶这样的外界影响，也免受如抗生素这样的药物对其进行的清除。部分菌群(约20％)与上皮细胞、特别是产粘液细胞密切相关。在胃化生的条件下即在十二指肠中由酸诱发的胃上皮形成的条件下，十二指肠中的化生区也被移生；这就产生了十二指肠溃疡发展的前提。随流出的粘液完全排出大概受到其粘附能力的阻碍，这样细菌就可以存活几年、几十年或者甚至一生(慢性感染)。
在知道幽门螺杆菌的存在和其对溃疡病的意义之前，是用所谓的解酸剂或H2-受体拮抗剂进行治疗的。这些物质是能抑制胃壁细胞分泌酸的物质。这些药剂的作用通常能治愈溃疡，但由于不能由此消除溃疡病因之一即幽门螺杆菌感染，所以大多数情况下在短期内复发溃疡病。
更为常用的溃疡疗法是铋处理。各种铋盐(CBS、BSS)对幽门螺杆菌都有杀菌效果。但仅在8-32％的病例中达到完全清除细菌的效果。这种处理表面上造成细菌的暂时抑制，但停止处理后多数病例中感染会再次发作。用高剂量长期治疗会导致这些物质在肝、肾和神经系统中的积累，具有相当大的神经学副作用(Malfertheiner，1994)。
既然已经发现胃十二指肠溃疡是传染病，治疗目的之一就是用抗生素消除病原体。然而，用各种抗生素(阿莫西林、硝基呋喃、furazolidin红霉素a.o.)进行单独治疗已被证实并不令人满意，因为甚至在这种情况下仅有0-15％病例会根除细菌。目前，把酸阻断剂(Ompeprazol)和抗生素(阿莫西林)结合使用达到最成功的治疗效果，这种疗法使清除率达80％(Malfertheiner，1994)。不过，用抗生素治疗消除幽门螺杆菌并不是有前途的长期治疗方案，因为一定会有这种假设，即细菌会迅速产生对抗生素的耐性。
因此，需要控制幽门螺杆菌感染用的新型疗法，特别是特异性针对幽门螺杆菌毒力因子的疫苗。毒力因子是指致病菌的某些性质，这些性质使细菌不管宿主体内的免疫反应和非特异性防御机制而在宿主体内的特定生态小境中移生并在那里繁殖。所以，有关毒力因子的理解在于更好地理解传染病的过程和机制。先前研究的幽门螺杆菌的最重要的毒力因子是脲酶、鞭毛、粘附素以及细胞毒素的产生。
脲酶和细菌表面上的酶由两个亚基(UreA，26kDa，UreB，66kDa)组成，它们占总细菌蛋白达5％。脲酶把胃汁中低浓度的脲分解为氨和二氧化碳。根据目前的理解，细菌周围环绕着一团氨，这能局部中和胃汁中的酸。细菌极高的游动性可归因于极生鞭毛的存在，它使细菌能在胃粘膜的粘液中移动，从而到达上皮细胞层。把脲酶基因族(ureA-ureH)以及形成鞭毛用的基因(flaA，flaB)克隆在大肠杆菌(E.coli)中并测序，构建出同基因的突变体。
所有分离出的幽门螺杆菌菌株中大约有50-60％能产生一种87kDa蛋白即所谓的空泡形成细胞毒素(vacuolising cytotoxin)，它能诱发体外细胞培养物中形成胞质液泡。同时，还克隆了编码幽门螺杆菌细胞毒素的vacA基因，并作了遗传鉴定。因此可以假设，细胞毒素生产菌株比不产生这种毒素的菌株具有更高的致病性。此外，发现了细胞毒素产生与胃溃疡发展之间的正相关关系。
关于幽门螺杆菌在体外对上皮细胞系的粘附性研究表明，该细菌能结合不同组织的许多细胞系。相反，幽门螺杆菌在宿主体内显示出非常明显的种和组织选择性粘附(嗜性)。所以，只发现该细菌结合胃型上皮细胞。这种选择性被解释为细菌粘附素和特异性细胞受体之间的特异性相互作用。
迄至已描述了几种有潜力的幽门螺杆菌粘附素，并克隆了编码所谓N-乙酰神经氨基乳糖-结合血凝集素的一种基因(hpaA)并进行测序(Evans等，1993)。它是一种应能识别上皮细胞上含唾液酸的受体的蛋白质。不过，有关这种粘附素对幽门螺杆菌感染的意义却是有争议的。其它有潜力的粘附素或者仅通过其分子量或者根据其受体结合特异性来鉴定。它们包括一种63kDa蛋白，它似乎与绿脓假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)的胞外酶S同源，是一种具有ADP-核糖基-转移酶活性的粘附素。还怀疑有一种尚未鉴定出的粘附素，它能介导与胃上皮细胞的Lewisb血型抗原的特异性结合(Falk等，1993；Boren等，1993)。
受幽门螺杆菌感染会导致胃粘膜的慢性炎症反应(胃炎)。另外，诱发对幽门螺杆菌抗原的特异性全身免疫反应；不过，分泌性抗体(sIgA)在胃中的形成尚未得到无可争议的阐述。发炎的结果是在胃粘膜和亚粘膜中存在多种免疫细胞，例如多形核白细胞、单核细胞、巨噬细胞、淋巴细胞和浆细胞(Blaser，1992)。此外，幽门螺杆菌在体外激活嗜中性白细胞、单核细胞和巨噬细胞(Mai等，1991)。用特异性抗体和补体进行的实验表明，在体外嗜中性白细胞使幽门螺杆菌迅速失活。不过，在体内的情形中，这些机制并不会造成致病菌的失活。尚不清楚幽门螺杆菌是如何在激活前述防御系统的情况下还能在宿主内长期存活。
在天然条件下，宿主无力对抗幽门螺杆菌感染。所以更令人惊奇的是，脲酶这种幽门螺杆菌必需毒力因子(见前述)具有作为疫苗的巨大潜力(美国专利申请USSN 07/970,996，基于脲酶的抗螺杆菌感染用的疫苗)。
在猫螺杆菌(Helicobacter felis)/小鼠模型中(猫螺杆菌是一种天然移生在猫的胃上并且也能感染小鼠的螺杆菌)，可能表明，口服接种幽门螺杆菌脲酶或重组脲酶B亚单位(rUreB)可以防止小鼠受猫螺杆菌感染(预防性疫苗)，也可消除已有的感染(治疗性疫苗)(Michetti等，1994；Corthesy-Theulaz等，Gastroenterol，发表中)。口服接种中的一个决定性因素是使用佐剂，例如霍乱毒素，除其它佐剂之外它对于把免疫反应从产生全身性抗体转换到产生分泌性抗体似乎是重要的。
本发明的目的是提供一种方法，用这种方法可以简便、迅速的方式来鉴别有成为疫苗的潜力的、得自幽门螺杆菌的分泌性基因。
这一目的是通过一种鉴别得自幽门螺杆菌的分泌性基因的方法来实现的。该方法中(a)在宿主生物体中建立幽门螺杆菌DNA的基因库，所述宿主生物体含有与分泌活性用标记结合的诱导型转座子，(b)诱导转座子到幽门螺杆菌DNA的插入过程，(c)用标记来选择含分泌性基因的克隆。
术语“分泌性基因”或“有分泌活性的基因”意指编码分泌性多肽即编码从胞质输出的多肽的基因。
本发明的方法特别适于鉴别得自幽门螺杆菌的粘附性基因，该方法还包括
(d)用该基因库的克隆的DNA、优选是用包含有分泌活性的基因的克隆进行幽门螺杆菌的再转化，通过把该DNA整合到染色体中而产生同基因的幽门螺杆菌突变菌株，以及(e)选择粘附性缺陷幽门螺杆菌突变菌株。
本发明的方法使得自幽门螺杆菌的粘附性基因和由其编码的粘附性蛋白(粘附素)得以鉴定和分离，它们决定着细菌与胃粘膜上皮细胞的特异性相互作用。由于得自幽门螺杆菌的粘附素通常仅很少量地产生，所以很难用生化手段鉴别和分离它们。此外，因为幽门螺杆菌具有自溶趋向，因而胞浆蛋白被释放并结合到细菌表面上。在生化纯化中，这类蛋白过去被错误地鉴别为粘附素(Doig等，1992；Doig等，1993)。
本发明的方法能快速、简便地鉴别粘附素。该方法中，借助转座子使幽门螺杆菌染色体中的各基因失活并产生在不同染色体基因中有缺陷的突变体。通过特异性选择那些粘附素基因失活、从而不能再结合相应靶细胞的受体的突变体，可以从这些独立缺陷突变体中选择突变体。
本发明方法的第一步包括在宿主生物体中建立幽门螺杆菌DNA的基因库、优选是在诸如大肠杆菌这样的原核宿主生物体中建立质粒基因库。然后，借助于与分泌活性用标记结合的转座子使克隆化幽门螺杆菌基因诱变。
特别优选的一个转座子是转座子TnMax9，根据布达佩斯条约的规定，于95年5月26日将其保藏于“Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH(DSM)”，Mascheroder Weglb，De-38124 Braunschweig，于大肠杆菌菌株E181中，入藏号为DSM10008。
TnMax9简略示于
图1。TnMax9带有没有启动子和信号序列的作为标记物的β-内酰胺酶基因(blaM)的一个拷贝，它紧接在限定实际转座子的反向重复序列(IR)之后(Tadayyon和Broome-Smith，1982)。TnMax9插入之后，blaM基因与靶基因融合，而且，当表达出失活的靶基因时，如果转座子以相对于基因X的正确方向和正确阅读框插入的话，就会在靶基因X和blaM之间产生融合蛋白。假如失活的基因X编码分泌性蛋白、特别是编码由sec-依赖型转运途径输出的蛋白的话(Pugsley，1993)，融合蛋白将通过大肠杆菌宿主细胞的胞质膜转运到外周质中。融合蛋白在此显示其活性(裂解β-内酰胺抗生素)，从而介导相应的大肠杆菌克隆对抗生素氨苄青霉素的抗性。
然而，如果基因X是胞质蛋白的基因，它同样可以根据插入情况(方向、阅读框)产生一种融合蛋白，但这种蛋白不能表现任何β-内酰胺酶活性，因为β-内酰胺酶只在外周质环境中有活性而在胞质中无活性。所以，这种方法可用于在编码输出蛋白质的基因中鉴别特异性突变体，方法是转座子在大肠杆菌中诱变后针对β-内酰胺酶活性进行突变体筛选。由于正被探寻的幽门螺杆菌粘附素基因还必须是输出蛋白，在编码输出蛋白的基因中特别收集幽门螺杆菌转座子突变体就能大大减少必须检验的突变体的数目。这样，本发明的方法提供了一个大得多的突变体库，这就避免了很难在实验室中实施的、对带有约2000～4000个克隆的常规突变体库的筛选。通过意在鉴别分泌性基因的选择步骤，可以从开始就消减编码胞质蛋白的大部分细菌染色体基因。因此，就可以将必须针对特定靶细胞对丧失其粘附能力进行检验的幽门螺杆菌突变体的数目减少到实际可以接受的水平。
可在各种水平上进行细菌粘附性突变体的筛选。通常，把与细菌特异性结合的上皮细胞系用于此目的。在幽门螺杆菌情形中，可采用特殊的胃癌细胞系，例如已被多位作者(Clyne和Drumm，1993)描述为粘附模型的KatoIII细胞系(ATCC HTB103)。尽管细胞系较易处理而且通常可以在体外大量培养，但还不可能从根本上排除由于细胞无限增殖化造成的表面蛋白(例如受体)的定量和定性表达中的变化。因此，组织模型是其替代方式。在此情形中，由固定组织(切片机)制备超薄切片，这些切片在用细菌进行饱和之后培养过。洗掉未与受体结合的细菌，结合的细菌可用染料(荧光染料或特殊的细菌染料)显色。作为第三步骤，可以采用动物模型。有一些体内实验，只有能得到微生物用的合适的动物模型时，才能进行这些实验。
最好首先借助KatoIII细胞系进行粘附性-缺陷幽门螺杆菌突变体的筛选。为此，可以在琼脂平板上培养突变体，随后用荧光染料即异硫氰酸荧光素(FITC)进行标记。然后，优选将标记过的细菌添加到上皮细胞中并于37℃下培养1小时。然后采用荧光显微镜检查各个突变体是否仍能结合上皮细胞系。
在本发明方法的一个优选实施方案中，在一个最小质粒载体中建立幽门螺杆菌基因库，它能选择载体DNA中转座子的插入。采用这类最小质粒载体大大改善了诱变过程的效率，这是由于该质粒的遗传因子尺寸小。此外，转座子插入载体DNA(该载体DNA基本上只由复制、选择和克隆所必需的因子组成)中可能造成载体在宿主细胞中增殖能力的丧失。
另外，最好在一质粒载体中建立幽门螺杆菌基因库，该载体中含有适于接合转移入其它宿主生物体的序列。这种序列的一个例子是oriT序列(Fürste等，1989)，该序列的存在避免了在诱导转座子并在适宜受体细胞中转化之后复杂的质粒DNA分离过程。
质粒载体上表达信号的存在也是优选的，所述表达信号与插入的幽门螺杆菌DNA操纵性地连接。这样，就可能转录那些因特化启动子序列的存在而原本不能转录的幽门螺杆菌基因序列。此外，也可能转录那些构建入操纵子且不能以整体单位克隆化的基因。优选使用弱启动子，因为强启动子可造成转化率低，甚至造成克隆化幽门螺杆菌序列的缺失和转座。
一个特别优选的质粒载体是pMin2(DSM 10007)，按布达佩斯条约的规定，于95年5月26日保藏在大肠杆菌菌株DH5α中。用于构建pMin2的步骤示于图2。
正如已提到的那样，下列情况对本发明方法来说是优选的为选择含分泌性基因的克隆，进行质粒DNA从宿主生物体到受体生物体的接合转移，这样能选择含转座子的质粒。
最好通过幽门螺杆菌的再转化进行粘附性基因的选择，借助这种方法，通过将DNA整合入染色体而产生突变菌株。在此再转化过程之前，为获得高转化率最好缺失掉标记基因(例如blaM基因)，以避免产生能生产β-内酰胺酶的幽门螺杆菌菌株，避免BlaM融合蛋白对细菌输出装置可能的干扰。
本发明的另一主题是宿主生物体中的幽门螺杆菌DNA的基因库，该宿主生物体含有插入到载体中的幽门螺杆菌DNA片断，其特征在于，该幽门螺杆菌基因组以90％以上概率彻底表征，而且该宿主生物体还含有与分泌活性标记偶联的诱导型转座子。
有1.7Mb大小的幽门螺杆菌基因组(Bukanov和Berg，1994)和平均大小优选为3-6kb(特别优选约4kb)的DNA插入片段，本发明的基因库优选包括至少400个克隆/基因组。特别优选该基因库含2000～4000个克隆。
幽门螺杆菌DNA优选插入到质粒载体中，特别是优选插入前述的最小质粒载体中。基因库位于其中的宿主生物体优选是细菌，特别优选是革兰氏阴性细菌，最优选是大肠杆菌。
本发明的基因库可用于鉴别得自幽门螺杆菌的分泌性基因，特别是粘附性基因。
可能采用本发明的方法鉴别得自幽门螺杆菌、称作alpA的粘附素基因和由该基因编码的多肽。因此，本发明的主题还有一种DNA分子，该分子包括(a)SEQ ID NO1所示的核苷酸序列(b)在遗传密码简并性范围内与(a)中序列相应的核苷酸序列，或(c)在严格条件下与(a)或/和(b)中序列杂交的核苷酸序列。
除了SEQ ID NO1所示核苷酸序列和在遗传密码简并性范围内与该序列相应的核苷酸序列之外，本发明还包括在严格条件下与这些序列之一杂交的DNA序列。本发明中使用的术语“杂交”如Sambrook等所述(Molecular Cloning.A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory Press(1989)1.101～1.104)。按照本发明，严格条件下的杂交是指在55℃、优选62℃、特别优选68℃下，用1×SSC和0.1％SDS洗涤1小时后，特别是在55℃、优选62℃、特别优选68℃下，用0.2×SSC和0.1％SDS洗涤1小时后仍观察到阳性杂交信号。本发明包括在这些洗涤条件下与SEQ ID NO1所示核苷酸序列之一杂交或与在遗传密码简并性范围内的相应核苷酸序列杂交的核苷酸序列。
本发明的DNA分子最好编码能粘附到人细胞上、特别是人胃上皮细胞上的多肽。此外，本发明的DNA分子最好在核苷酸水平上与SEQ IDNO1所示核苷酸序列有至少70％、特别优选至少80％的同源性。而且，该DNA分子的长度最好至少为15个核苷酸，优选至少20个核苷酸。
本发明的又一个主题是含本发明DNA分子的至少一个拷贝的载体。该载体可以是最好在表达信号(启动子、操纵基因、增强子等)控制下本发明DNA分子位于其上的任何原核或真核载体。原核载体的例子有象噬菌体(例如λ噬菌体)这样的染色体载体以及象质粒这样的染色体外载体，而环状质粒载体是特别优选的。合适的原核载体例如由Sambrook等描述于前述第1～4章。
另一方面，本发明的载体也可以是真核载体例如酵母载体或者是适于高等细胞的载体(例如，质粒载体、病毒载体、植物载体)。这类载体例如由Sambrook等人描述于前述第16章。
本发明的又一主题是用本发明载体转化的细胞。在一优选实施方案中，该细胞是原核细胞、优选革兰氏阴性的原核细胞、特别优选大肠杆菌细胞。不过，另一方面，本发明的细胞也可以是真核细胞，例如真菌细胞(如酵母)、动物或植物细胞。
本发明还涉及由本发明DNA分子编码的多肽。该多肽最好能粘附人细胞，并且包括(a)SEQ ID NO2所示氨基酸序列，或(b)与(a)中序列发生免疫交叉反应的氨基酸序列。
本发明的多肽最好与SEQ ID NO2所示氨基酸序列有至少80％的同源性，最优选至少90％的同源性。
本发明的多肽最好通过下述方法生产用本发明的DNA分子或载体转化一种细胞，在多肽能得以表达的条件下培养转化的细胞，从细胞或/和培养物上清液中分离多肽。该方法中可获得融合多肽以及非融合多肽形式的本发明多肽。
本发明的多肽也可用作免疫原来产生抗体。因此，本发明还涉及抗本发明多肽的抗体。该抗体最好针对SEQ ID NO2所示氨基酸序列的N-末端，例如前250个氨基酸。
本发明另一方面涉及一种药用组合物，它包含作为活性物质的本发明的DNA分子、本发明的多肽或本发明的抗体，选择性地含有常见药用辅助物质、稀释剂、添加剂和载体。
一方面，本发明的药用组合物可用于诊断幽门螺杆菌感染。核酸水平的诊断最好这样进行通过使用含对alpA基因具有特异性的本发明DNA的杂交探针；或者通过用本发明DNA分子作引物的扩增法。蛋白质水平的诊断学最好借助本发明的抗体来进行。
另一方面，该药用组合物也可用于防止或治疗幽门螺杆菌感染。对治疗应用而言，将多肽或其片断用于产生主动疫苗，或将抗体用于产生被动疫苗。
用下列实施例和附图进一步阐述本发明。
图1表示转座子TnMax9(DSM 10008)的线性限制图，该转座子用于鉴别和灭活alpA基因。
图2表示构建最小质粒载体pMin1和pMin2(DSM 10007)的简图，这两个载体适合于有效的转座子诱变。
图3A表示采用TnMax9的转座子诱变的选择原理，以及生产分泌性基因有缺陷的幽门螺杆菌突变体的简图。
图3B表示鉴别分泌性基因有缺陷的幽门螺杆菌突变体的方法的简图。
图4表示含有调节区和alpA基因(SEQ ID NO1)的5′端的质粒pMu140的限制图。通过转座子TnMax9的插入使alpA基因失活(参见三角标记的TnMax9)。该质粒得到表达时就获得一种alpA-β-内酰胺酶融合蛋白。pMu140是得自突变体基因库的初始克隆，通过再转化和同源重组从该克隆获得粘附性缺陷的幽门螺杆菌菌株。
图5表示野生型菌株69A(1)、同基因突变菌株P1-140(2)和P1-179a(3)的幽门螺杆菌总细胞裂解物的免疫印迹。野生型菌株69A含有分子量约为53kDa的alpA蛋白。alpa突变体P1-140和P1-179a没有AlpA蛋白。用针对重组AlpA蛋白N-末端的抗体AB202对免疫印迹进行显影。
SEQ ID NO1表示幽门螺杆菌粘附性基因alpA的核苷酸序列以及相应的氨基酸序列。
SEQ ID NO2表示得自幽门螺杆菌的AlpA粘附性多肽的氨基酸序列。
实施例1构建最小载体通过连接ColE1复制区(ori.E1)和四环素抗性基因(Tet)来构建质粒pRH144，所述复制区和抗性基因都是采用下列引物对由pBR322以PCR片断形式扩增的RH104(5′-AGC TGA ATT CAT GTT TGA CAT TGC CATATA GAT GAG CTT TAA TGC GGT AGT T-3′)和RH105(5′-AGC TCT GCA GCC GCC GGC TTC CAT TCA G-3′)或者RH106(5′-AGC TCT GCA GAG ATC AAA GGA TCT TCT T-3′)和RH107(5′-TCT AGA ATT CGT ATC AGC TCA CTCAAA G-3′)。
通过oriT片断的插入来构建pRH146，所述oriT片断是通过采用下述引物对的PCR扩增法从质粒RP4(Marsh等，1984)获得的DF001(5′-GTA CTG CAG CTT GGT TTC ATC AGC CA-3′)和DF 002(5′-GTA CTG CAG TTC AGT AAT TTC CTG CAT-3′)。
随后，将质粒pIC20R1(Thomas，1981)的多克隆位点插入pRH 146的EcoRI位点。为获得质粒pMin1，pRH146的多接头用双链的合成多接头区来替代，该区被克隆到pRH146的EcoRI位点上并由以下两个部分互补的寡核苷酸构成RH117(5′-AAT TAG ATC ATT AAA GGC TCC TTT TGGAGC CTT TTT TTT TGA ATT CAG ATC TCG AGG TAC CCG GGATCC TCT AGA-3′)和RH118(5′-AAT TAG ATC AAAAAA AAA GCC CGC TCA TTA GGC GGG CTA AGC TTG TCG ACATCG ATC TAG AGG ATC CCG GGT ACC-3′)。
用克隆法破坏侧翼EcoRI位点。克隆化的多接头区含有噬菌体fd的转录终止子(terfd)和trpA基因(tertrpA)。
为获得质粒pMin2，得自淋球菌的iga基因启动子(Piga)采用寡核苷酸SO009(5′-GGA TCC GAA TTC TCA TGT TTG ACA G-3′)和SO010(5′-GTC GAC AGA TCT TTT AAT AGC GATAAT GT-3′)由质粒pIP100(Pohlner等，1987)以PCR片断形式扩增。把扩增片断连接到pRH160的EcoRI和BgIII位点上。通过用pRH146的相应片断替代pMin1的BgIII/BamHI片断来除去trpA终止子。
pMinI和pMin2的构建图示于图2。含质粒pMin的大肠杆菌菌株DH5α保藏于DSM，保藏号为10007。
实施例2构建转压子TnMax9在单一SaII切割位点中带有SalI线性化pIC20R2载体的pTnMax1(Haas等，1993)衍生物的质粒pRH110被用作构建pTnMax9的基础。然后，通过HindIII切割和再连接来消除TnMax1的中心区(oriGC-res-catgc)。将M13-正向(M13引物)和M13-反向(M13-RP1)测序引物的序列引入(连接到)pRH110的HindIII切割位点上，方法是插入两个部分互补的寡核苷酸RH096-(5′-AGC TTA CTGGCC GTC GTT TTA CAG CGG CCG CAG GAA ACA GCT ATG ACCGA-3′)和RH097(5′-AGC TTC GGT CAT AGC TGT TTCCTG CGG CCG CTG TAA AAC GAC GGC CAG TA-3′)。得到的质粒pRH140在两个引物结合位点之间含有单一NotI限制切割位点。借助寡核苷酸引物对RH098(5′-AGA AGC GGC CGC AAA AGGATC CAT AGG TGC AAG CAA GTT A-3′)和RH099(5′-AGC TGC GGC CGC AAA AAG ATC TCA AAG CCC ATT TCT GTCAGG-3′)由质粒pJOE106(Schffl等，1981)扩增Tn1721的res DNA片断，并将其插入pRH140 NotI切割位点。结果形成了质粒pRH141，该质在res左侧和右侧具有单一BamHI和BgIII限制切割位点。现在，以BamHI片断形式从pRH42中分离复制区(orifd)以及catGC抗性区，并连接到pRH141的BamHI切割位点上。(用SalI)消除pIC20R2载体最终形成pTnMax5，它是用于所有其它TnMax转座子的基础构建物。最后，把没有启动子且没有信号序列的β-内酰胺酶基因(blaM基因)借助于寡核苷酸RH124(5′-AGT TGC GGC CGC ACC CAG AAACGC TGG TG-3′)和RH127(5′-AGC TAG ATC TAG ATTATC AAA AAG GAT C-3′)用PCR由质粒pBR322(Sutcliffe，1979)进行扩增，并插入TnMax5的NotI和BglII切割位点，形成pTnMax7。用Klenow聚合酶填补突出端来消除pTnMax7的catGC和反向重复序列(IR)之间的NotI切割位点。通过插入互补寡核苷酸对SO012(5′-GAT CAA GTC GCG GCC GCC TGA T-3′)和SO013(5′-GAT CAT CAG GCG GCC GCG ACTT-3′)把blaM的3′端的BgIII切割位点转变为NotI切割位点，得到转座子衍生物pTnMax9。
含转座子衍生物pTnMax9的大肠杆菌菌株E181保藏于DSM，保藏号为10008。
实施例3构建幽门螺杆菌质粒基因库建立幽门螺杆菌野生型菌株69A的染色体DNA的质粒基因库。为此，用Leying等(1992)的方法从幽门螺杆菌分离染色体DNA，并用限制性内切核酸酶Sau3AI和HpaII中的每一种部分切割。然后，在制备型琼脂糖凝胶上分离这些DNA片断，从凝胶上洗脱3～6kb的片断。把这些DNA片断连接到质粒载体pMin2上，所述质粒载体是为此目的而专门构建，它已用限制酶BgIII和ClaI切割、连接(T4连接酶)，并将连接混合物转化入大肠杆菌菌株E181中，该菌株是含溶原性λ噬菌体λCH616、已用转座子TnMax9转化过的菌株HB101(Bayer和Roulland-Dussoix，1969)的衍生物。在此过程中得到大约2400个独立转化体。
实施例4幽门螺杆菌突变体的分离诱变的选择原理和鉴定突变体的步骤简要表示在图3A和3B中。
为进行转座子诱变，在每一情形中收集10个转化体并相互诱导，通过这种方法对每一个都带有10～20个克隆的共190个收集物进行进一步处理。从这一诱变分离出191个氨苄青霉素抗性的大肠杆菌质粒克隆，它们独立地携带突变的幽门螺杆菌基因。这192个质粒从大肠杆菌中分离出来，用于幽门螺杆菌菌株69A的再转化。从这192个估计可能在编码分泌性蛋白的基因上发生了突变的转化体中分离出135个幽门螺杆菌突变体。然后，在用于丧失了其结合KatoIII上皮细胞的能力的幽门螺杆菌突变体的筛选分析中，检验幽门螺杆菌突变体收集物。
为此，用FITC标记突变体并在37℃与上皮细胞一起培养1小时。直接用荧光显微镜观察来进行粘附性试验。在这种情况下发现2个粘附性大为降低的突变体(No.P1-140和P1-179a)。
在第二粘附模型即人胃的组织切片中，两个突变体都未表现粘附性。在该模型中，幽门螺杆菌野生型菌株以及所有其他突变体同样表现强粘附性。
用于产生突变菌株P1-140的质粒pMu140示于图4中。质粒pMU179a(未示出)用于产生突变菌株P1-179a。幽门螺杆菌69A中两种质粒的独立转化造成鉴别出的粘附性缺陷，这证实，在细菌染色体中没有发生次级突变，而是克隆化粘附素基因中TnMax9的插入导致观察到的幽门螺杆菌突变体的表型。对由转座子TnMax9灭活的质粒克隆pMu140和pMu179的基因进行作图和测序表明，两种克隆的基因相同；转座子只是插在不同位点处。由于编码的蛋白是一种脂蛋白即用脂质锚锚定在膜中的蛋白，所以把相应的基因称作alpA(粘附性相关脂蛋白A)。我们得自对膜蛋白和对该蛋白C-端某些保守蛋白序列(C-端苯丙氨酸；Struyve等，1991)进行的计算机二级结构预测的数据支持了该蛋白是掺入革兰氏阴性细菌外膜的膜内在蛋白这一论断。
实施例5alpA基因的表达和抗体的产生接着借助于含大约50％N-端AlpA和N-端组氨酸标签的pEV40大肠杆菌表达系统(Pohlner等，1993)产生融合蛋白。将它用于纯化融合蛋白，方法是通过带Ni2琼脂糖柱的螯合物亲和层析法，并用于从小鼠获得抗血清。这种称为AK202的抗血清把幽门螺杆菌总细胞裂解物免疫印迹中的AlpA蛋白识别为53kDa蛋白。如预料的那样，在幽门螺杆菌突变体P1-140和P1-179a的情形中，在免疫印迹中检测不到该53kDaAlpA蛋白(见图5)。通过AlpA-β-内酰胺酶融合蛋白的特异性棕榈基化作用来进行AlpA为脂蛋白的试验，所述融合蛋白是通过TnMax9在alpA中的初始插入而形成的。
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Ile50 55 60TTA AAC AAC AAC ACC GGA GGC AAC ATC GCA GGG GCG TTG AGT AAC GCT 240Leu Asn Asn Asn Thr Gly Gly Asn Ile Ala Gly Ala Leu Ser Asn Ala65 70 75 80TTC TCC CAA TAC CTT TAT TCG CTT TTA GGG GCT TAC CCC ACA AAA CTC 288Phe Ser Gln Tyr Leu Tyr Ser Leu Leu Gly Ala Tyr Pro Thr Lys Leu85 90 95AAT GGT AGC GAT GTG TCT GCG AAC GCT CTT TTA AGT GGT GCG GTA GGC 336Asn Gly Ser Asp Val Ser Ala Asn Ala Leu Leu Ser Gly Ala Val Gly100 105 110TCT GGG ACT TGT GCG GCT GCA GGG ACG GCT GGT GGC ACT TCT CTT AAC 384Ser Gly Thr Cys Ala Ala Ala Gly Thr Ala Gly Gly Thr Ser Leu Asn115 120 125ACT CAA AGC ACT TGC ACC GTT GCG GGC TAT TAC TGG CTC CCT AGC TTG 432Thr Gln Ser Thr Cys Thr Val Ala Gly Tyr Tyr Trp Leu Pro Ser Leu130 135 140ACT GAC AGG ATT TTA AGC ACG ATC GGC AGC CAG ACT AAC TAC GGC ACG 480Thr Asp Arg Ile Leu Ser Thr Ile Gly Ser Gln Thr Asn Tyr Gly Thr145 150 155 160AAC ACC AAT TTC CCC AAC ATG CAA CAA CAG CTC ACC TAC TTG AAT GCG 528Asn Thr Asn Phe Pro Asn Met Gln Gln Gln Leu Thr Tyr Leu Asn Ala165 170 175GGG AAT GTG TTT TTT AAT GCG ATG AAT AAG GCT TTA GAG AAT AAG AAT 576Gly Asn Val Phe Phe Asn Ala Met Asn Lys Ala Leu Glu Asn Lys Asn180 185 190GGA ACT AGT AGT GCT AGT GGA ACT AGT GGT GCG ACT GGT TCA GAT GGT 624Gly Thr Ser Ser Ala Ser Gly Thr Ser Gly Ala Thr Gly Ser Asp Gly195 200 205CAA ACT TAC TCC ACA CAA GCT ATC CAA TAC CTT CAA GGC CAA CAA AAT 672Gln Thr Tyr Ser Thr Gln Ala Ile Gln Tyr Leu Gln Gly Gln Gln Asn210 215 220ATC TTA AAT AAC GCA GCG AAC TTG CTC AAG CAA GAT GAA TTG CTC TTA 720Ile Leu Asn ASn Ala Ala Asn Leu Leu Lys Gln Asp Glu Leu Leu Leu225 230 235 240GAA GCT TTC AAC TCT GCC GTA GCC GCC AAC ATT GGG AAT AAG GAA TTC 768Glu Ala Phe Asn Ser Ala Val Ala Ala Asn Ile Gly Asn Lys Glu Phe245 250 255AAT TCA GCC GCT TTT ACA GGT TTG GTG CAA GGC ATT ATT GAT CAA TCT 816Asn Ser Ala Ala Phe Thr Gly Leu Val Gln Gly Ile Ile Asp Gln Ser260 265 270CAA GCG GTT TAT AAC GAG CTC ACT AAA AAC ACC ATT AGC GGG AGT GCG 864Gln Ala Val Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Asn Thr Ile Ser Gly Ser Ala275 280 285GTT ATT AGC GCT GGG ATA AAC TCC AAC CAA GCT AAC GCT GTG CAA GGG 912Val Ile Ser Ala Gly Ile Asn Ser Asn Gln Ala Asn Ala Val Gln Gly290 295 300CGC GCT AGT CAG CTC CCT AAC GCT CTT TAT AAC GCG CAA GTA ACT TTG 960Arg Ala Ser Gln Leu Pro Asn Ala Leu Tyr Asn Ala Gln Val Thr Leu305 310 315 320GAT AAA ATC AAT GCG CTC AAT AAT CAA GTG AGA AGC ATG CCT TAC TTG 1008Asp Lys Ile Asn Ala Leu Asn Asn Gln Val Arg Ser Met Pro Tyr Leu325 330 335CCC CAA TTC AGA GCC GGG AAC AGC CGT TCA ACG AAT ATT TTA AAC GGG 1056Pro Gln Phe Arg Ala Gly Asn Ser Arg Ser Thr Asn Ile Leu Asn Gly340 345 350TTT TAC ACC AAA ATA GGC TAT AAG CAA TTC TTC GGG AAG AAA AGG AAT 1104Phe Tyr Thr Lys Ile Gly Tyr Lys Gln Phe Phe Gly Lys Lys Arg Asn355 360 365ATC GGT TTG CGC TAT TAT GGT TTC TTT TCT TAT AAC GGA GCG AGC GTG 1152Ile Gly Leu Arg Tyr Tyr Gly Phe Phe Ser Tyr Asn Gly Ala Ser Val370 375 380GGC TTT AGA TCC ACT CAA AAT AAT GTA GGG TTA TAC ACT TAT GGG GTG 1200Gly Phe Arg Ser Thr Gln Asn Asn Val Gly Leu Tyr Thr Tyr Gly Val385 390 395 400GGG 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TAT GGG TAT TCA TTC TAA 1557Ser Tyr Gly Tyr Ser Phe515(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)长度518个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学线型(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID NO2Met Ile Lys Lys Asn Arg Thr Leu Phe Leu Ser Leu Ala Leu Cys Ala1 5 10 15Ser Ile Ser Tyr Ala Glu Asp Asp Gly Gly Phe Phe Thr Val Gly Tyr20 25 30Gln Leu Gly Gln Val Met Gln Asp Val Gln Asn Pro Gly Gly Ala Lys35 40 45Ser Asp Glu Leu Ala Arg Glu Leu Asn Ala Asp Val Thr Asn Asn Ile50 55 60Leu Asn Asn Asn Thr Gly Gly Asn Ile Ala Gly Ala Leu Ser Asn Ala65 70 75 80Phe Ser Gln Tyr Leu Tyr Ser Leu Leu Gly Ala Tyr Pro Thr Lys Leu85 90 95Asn Gly Ser Asp Val Ser Ala Asn Ala Leu Leu Ser Gly Ala Val Gly100 105 110Ser Gly Thr Cys Ala Ala Ala Gly Thr Ala Gly Gly Thr Ser Leu Asn115 120 125Thr Gln Ser Thr Cys Thr Val Ala Gly Tyr Tyr Trp Leu Pro Ser Leu130 135 140Thr Asp Arg Ile Leu Ser Thr Ile Gly Ser Gln Thr Asn Tyr Gly Thr145 150 155 160Asn Thr Asn Phe Pro Asn Met Gln Gln Gln Leu Thr Tyr Leu Asn Ala165 170 175Gly Asn Val Phe Phe Asn Ala Met Asn Lys Ala Leu Glu Asn Lys Asn180 185 190Gly Thr Ser Ser Ala Ser Gly Thr Ser Gly Ala Thr Gly Ser Asp Gly195 200 205Gln Thr Tyr Ser Thr Gln Ala Ile Gln Tyr Leu Gln Gly Gln Gln Asn210 215 220Ile Leu Asn Asn Ala Ala Asn Leu Leu Lys Gln Asp Glu Leu Leu Leu225 230 235 240Glu Ala Phe Asn Ser Ala Val Ala Ala Asn Ile Gly Asn Lys Glu Phe245 250 255Asn Ser Ala Ala Phe Thr Gly Leu Val Gln Gly Ile Ile Asp Gln Ser260 265 270Gln Ala Val Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Asn Thr Ile Ser Gly Ser Ala275 280 285Val Ile Ser Ala Gly Ile Asn Ser Asn Gln Ala Asn Ala Val Gln Gly290 295 300Arg Ala Ser Gln Leu Pro Asn Ala Leu Tyr Asn Ala Gln Val Thr Leu305 310 315 320Asp Lys Ile Asn Ala Leu Asn Asn Gln Val Arg Ser Met Pro Tyr Leu325 330 335Pro Gln Phe Arg Ala Gly Asn Ser Arg Ser Thr Asn Ile Leu Asn Gly340 345 350Phe Tyr Thr Lys Ile Gly Tyr Lys Gln Phe Phe Gly Lys Lys Arg Asn355 360 365Ile Gly Leu Arg Tyr Tyr Gly Phe Phe Ser Tyr Asn Gly Ala Ser Val370 375 380Gly Phe Arg Ser Thr Gln Asn Asn Val Gly Leu Tyr Thr Tyr Gly Val385 390 395 400Gly Thr Asp Val Leu Tyr Asn Ile Phe Ser Arg Ser Tyr Gln Asn Arg405 410 415Ser Val Asp Met Gly Phe Phe Ser Gly Ile Gln Leu Ala Gly Glu Thr420 425 430Phe Gln Ser Thr Leu Arg Asp Asp Pro Asn Val Lys Leu His Gly Lys435 440 445Ile Asn Asn Thr His Phe Gln Phe Leu Phe Asp Phe Gly Met Arg Met450 455 460Asn Phe Gly Lys Leu Asp Gly Lys Ser Asn Arg His Asn Gln His Thr465 470 475 480Val Glu Phe Gly Val Val Val Pro Thr Ile Tyr Ash Thr Tyr Tyr Lys485 490 495Ser Ala Gly Thr Thr Val Lys Tyr Phe Arg Pro Tyr Ser Val Tyr Trp500 505 510Ser Tyr Gly Tyr Ser Phe51权利要求
1.DNA分子，其中，它包括(a)SEQ ID NO1所示核苷酸序列，(b)在遗传密码简并性范围内与(a)中序列相应的核苷酸序列，或(c)在严格条件下与(a)或/和(b)中序列杂交的核苷酸序列。
2.如权利要求1的DNA分子，其中，在核苷酸水平上它与SEQ ID NO1所示核苷酸序列有至少80％的同源性。
3.权利要求1或2的DNA分子，其中，它的长度至少为15个核苷酸。
4.权利要求1-3之一的DNA分子，其中，它编码一种能粘附人细胞的多肽。
5.载体，其中，它含有权利要求1-4之一的DNA分子的至少一个拷贝。
6.细胞，其中，它被权利要求5的载体所转化。
7.多肽，其中，它由权利要求1-4之一的DNA分子所编码。
8.权利要求7的多肽，其中，它包括(a)SEQ ID NO2所示氨基酸序列，或(b)与(a)中序列发生免疫交叉反应的氨基酸序列。
9.多肽，其中，它能粘附人细胞。
10.产生权利要求7-9之一的多肽的方法，其中，用权利要求1-4之一的DNA分子或权利要求5的载体转化一种细胞，在多肽得以表达的条件下培养转化的细胞，并从细胞或/和培养物上清液中分离出多肽。
11.权利要求7-9之一的多肽作为免疫原产生抗体的应用。
12.抗权利要求7-9之一的多肽的抗体。
13.权利要求12的抗体，其中该抗体针对SEQ ID NO2所示氨基酸序列的N-端。
14.药用组合物，其中它包含作为活性物质的权利要求1-4之一的DNA分子、权利要求7-9之一的多肽或者权利要求12或13的抗体，选择性地包含常见药用辅助物质、稀释剂、添加剂和载体。
15.权利要求14的药用组合物用来诊断幽门螺杆菌感染的应用。
16.权利要求14的药用组合物用于生产防止或治疗幽门螺杆菌感染用的药剂的应用。
全文摘要
本发明涉及一种得自幽门螺杆菌的粘附性基因,由其编码的多肽以及抗该多肽的抗体。
文档编号C07K16/12GK1187852SQ96194763
公开日1998年7月15日 申请日期1996年6月12日 优先权日1996年6月12日
发明者R·哈斯, S·奥登莱特, T·F·梅尔, A·L·比卢姆, I·科斯塞－西拉兹 申请人:马普科技促进协会