血纤维蛋白交联和/或转谷氨酰胺酶的抑制剂的制作方法

专利名称：：血纤维蛋白交联和/或转谷氨酰胺酶的抑制剂的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一类新的抑制血纤维蛋白交联和/或转谷氨酰胺酶活性的抑制剂，特别涉及一种例如从水蛭组织和/或从水蛭分泌物衍生的此类抑制剂。转谷氨酰胺酶主要用于稳定诸如血块形成中的许多蛋白质凝聚体。蛋白质通过转谷氨酰胺酶反应而交联是例如稳定血纤维蛋白凝块的主要方式。在哺乳动物中，血块的稳定是通过称为因子XIIIa的转谷氨酰胺酶造成的，其催化血纤维蛋白中纤维间交联的形成。交联的血块对血纤维蛋白溶解酶的作用不敏感，并且实际上不溶于变性溶剂如5M尿素中。因子XIIIa是一个非典型的凝聚酶，因为它不是一种丝氨酸蛋白酶而是一种含半胱氨酸的转酰胺酶，其按下式催化赖氨酸和谷氨酰胺的氨基酸侧链间的反应以形成一个酰胺键并除去氨；当底物为血纤维蛋白时，R1-CONH2和R2-NH2分别是血纤维蛋白多肽的不同链上的谷氨酰胺和赖氨酸的侧链。因子XIIIa也可催化其它蛋白质的交联。例如，已知因子XIIIa将α2抗纤维蛋白溶酶连接到血纤维蛋白上并增强其抗纤维蛋白溶解。而且，它可引起一系列结构完全不相同的收缩蛋白质如胶原、层粘连蛋白、肌动蛋白、肌球蛋白、血小板反应蛋白、粘着斑蛋白和玻连蛋白等之间的交联。据信该性质是伤口愈合过程的一部分并在许多组织重塑性疾病的病理学上有重要作用。因此有必要提供一种转谷氨酰胺酶的抑制剂，其可用于例如治疗各种病理性或血栓栓塞性事件。转谷氨酰胺酶的抑制剂以前已有描述，它们通常主要分为四类(a)针对酶的免疫球蛋白；(b)与天然蛋白质底物竞争的低分子量底物；(c)与酶的活性部位反应的试剂；和(d)因子XIII本身的肽片段。这些抑制剂由于各种原因而不适用于例如药物制剂，原因如下天然循环着的转谷氨酰胺酶抑制剂以前被认为是针对转谷氨酰胺酶亚单位的免疫球蛋白。这类抑制剂由于减少了循环中的因子XIII而引起出血状态。美国专利5470957公开了用已有技术产生针对转谷氨酰胺酶亚单位的单克隆抗体来使用这类治疗性免疫球蛋白。用这类抗体作为转谷氨酰胺酶抑制剂的一个缺点是其具有高分子量，并且通常在使用前如对人的治疗前必需产生嵌合的人免疫球蛋白的类似物。WO91/10427公开了胺作为转谷氨酰胺酶的抑制剂，胺通过交联与一个底物上的谷氨酰胺残基反应，从而阻止了其与另一个底物的交联。这类抑制剂并不非常有效，因为它们必需有与天然底物同样浓度或比天然底物的浓度更高时才能有显著的抑制效果。因此，它们只在浓度为约50μM及更高时才有效。WO92/13530公开了使用各种依赖于转谷氨酰胺酶活性的转谷氨酰胺酶抑制剂，转谷氨酰胺酶活性主要是靠其起反应的巯基基团。因此任何可使巯基基团烷基化或氧化的试剂均可抑制转谷氨酰胺酶的活性。然而，这些试剂非常活泼并很不稳定，因此其特别不适用于如药物或医疗处理。企图提供更有特异性，毒性更低的肽抑制剂的期望只导致目前产生低效率的化合物。例如在美国专利5328898和AchyuthanKE，SlaughterTF，SantiagoMA等人在生物化学杂志(J.Bio1.Chem.)268第21284-21292页，1993中指出“由因子XIIIa衍生出的肽抑制转谷氨酰胺酶的活性底物识别部位的定位”。因此，本发明的一个方面的目的是提供一种有效的转谷氨酰胺酶的抑制剂，且抑制剂可用于例如药物或医疗用途。现在我们已分离出一种新的可抑制转谷氨酰胺酶活性和/或血纤维蛋白交联的多肽，多肽有下列氨基酸序列NH2-Lys-Leu-Leu-Pro-Cys-Lys-Glu-X1-His-Gln-Gly-Ile-Pro-Asn-Pro-Arg-Cys-X2-Cys-Gly-Ala-Asp-Leu-Glu-X3-Ala-Gln-Asp-Gln-Tyr-Cys-Ala-Phe-Ile-Pro-Gln-Z1-Arg-Pro-Arg-Ser-Glu-Leu-Ile-Lys-Pro-Met-Asp-Asp-Ile-Tyr-Gln-Arg-Pro-Val-Z2-Phe-Pro-Asn-Leu-Pro-Leu-Lys-Pro-Arg-Z3-COOH。其中X1、X2和X3各自代表任何氨基酸残基；Z1、Z2和Z3各自同时或者不同时地代表Cys或Glu；或药学上可接受的盐，所述氨基酸序列的衍生物(如嵌合衍生物)或生物前体，或有基本相似活性的氨基酸序列的同源物或类似物。所谓同源物我们指一种多肽，其多肽链中与上面列出序列不同的氨基酸不超过23％。数字23％的根据是天然存在的欧洲医蛭(Hirudomedicinalos)中水蛭素的许多同源物在文献中有所描述；它们之间的最大差异在于多肽链的65个氨基酸中的15个不相同。所谓类似物我们指多肽链中插入一个或多个额外的氨基酸，只要它们不会显著干扰多肽的药物活性。本发明也包括有上述氨基酸序列的截短的多肽形式。本发明的多肽是转谷氨酰胺酶活性和/或血纤维蛋白交联的高效抑制剂。本发明能够防止蛋白质交联形成的多肽对于例如不稳定的血块非常有效。本发明的多肽对于因子XIIIa的抑制效果可通过在5M尿素内的血纤维蛋白凝块的溶解度增加来测定。此外，多肽的抑制效果可通过多肽抑制因在酪蛋白中掺入乙胺和在酪蛋白中掺入氨基戊胺生物素而引起的氨气的释放来测定。氨基末端区域被认为是对转谷氨酰胺酶活性特别有效的抑制剂。因此本发明还包括一种可特异抑制转谷氨酰胺酶活性的多肽，多肽包括下列氨基酸序列NH2-Lys-Leu-Pro-Cys-Lys-Glu-Y-His-Gln-Gly-Ile-Pro-Asn-Pro-Arg-其中Y代表任何氨基酸序列或氨基酸序列的药学上可接受的盐、衍生物或生物前体，或基本上具有相似活性的氨基酸序列的同源物或类似物。本发明的多肽(后称为“Tridegin”)可在1-50纳摩尔浓度范围内有利地直接抑制转谷氨酰胺酶活性(与已知的上述的(b)、(c)和(d)类转谷氨酰胺酶抑制剂相比差别至少为1000倍)。Tridegin可用任何合适的无毒性的有机或无机酸形成药学上可接受的盐。这些无机酸的例子包括盐酸、氢溴酸、硫酸或磷酸及酸金属盐如正磷酸一氢钠和硫氢化钾。有机酸的例子包括单、二和三羧酸如乙酸、乙二酸、乳酸、丙酮酸和磺酸等。羧基端氨基酸盐类包括无毒性的可用任何合适的无机或有机碱形成的羧酸盐。本发明的Tridegin可从例如在合适缓冲液中的基本匀浆的整个水蛭、唾液腺或吻部等水蛭组织或分泌物抽提出来。转谷氨酰胺酶抑制剂以前没有被确认在水蛭中，或从水蛭中抽提出过；因此本发明包括一种从水蛭组织或水蛭分泌物中衍生得到的转谷氨酰胺酶活性的抑制剂。这里所用的术语“可衍生”包括可直接衍生获得的物质，以及间接获得的或转变成化学修饰的衍生物的物质。本发明的Tridegin通常用已有技术如离子交换、凝胶过滤和/或反相色谱的组合来抽提或纯化。同一属甚至同一种的水蛭通常在其唾液中的多肽有相似的生物化学功能并且其氨基酸结构有高度的同源性。在同种的水蛭中存在一些只有少数氨基酸差异的不同的同种型水蛭。本发明的Tridegin可从水蛭组织或水蛭分泌物中获得，通常是从吻蛭目(RhynchobdellidaI)的水蛭中获得。然而，由于许多有相似生化特异性的从水蛭唾液腺或组织分泌物获得的组分均属于这个同源多肽家族的成员，因此本发明也包括本发明从水蛭衍生获得的Tridegin的同种型和类似物。而且，通常发现水蛭多肽有转录后修饰，由于Tridegin的一些残基不归于已知的氨基酸结构，因此本发明也包括有上述多肽序列的转录后修饰多肽。本发明的第二方面是提供一种抑制血纤维蛋白交联和/或转谷氨酰胺酶活性的抑制剂，抑制剂从水蛭组织或水蛭分泌物中获得，通常从吻蛭目水蛭，较好地为南美水蛭属(Haementeria)的水蛭衍生获得。本发明的抑制剂用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)测得的分子量最好在约7000道尔顿至8000道尔顿，并能抑制因子XIIIa催化的因在酪蛋白中掺入胺及在酪蛋白中掺入氨基戊胺生物素而引起的氨气释放。除了对因子XIIIa有作用外，Tridegin还是许多不同的转谷氨酰胺酶的抑制剂，尽管抑制效果不同，但其还是可抑制从豚鼠肝脏获得的血浆和血小板因子XIIIa和组织转谷氨酰胺酶的活性。因此，它们是通用的转谷氨酰胺酶抑制剂，并预计可抑制这类酶的许多不同类型。本发明也包括测定本发明的抑制剂(如上所确定的)抑制转谷氨酰胺酶活性程度的诊断方法，其方法包括测定在抑制剂存在时，转谷氨酰胺酶催化在酪蛋白中掺入胺时放出的氨气量，其中产生的氨气量和/或掺入的胺提供了一种测定抑制剂对转谷氨酰胺酶活性的抑制程度的方法。本发明的还有一个方面是提供了一种包括本发明第一和第二方面(如上所述)的药物制剂和它的一种药学上可接受的载体，稀释剂或赋形剂。由于Tridegin的低水平毒性和高水平抑制转谷氨酰胺酶活性，它们可有利地掺入药物制剂中，制剂例如可以肠胃外或口服形式对病人给药。这里所用的术语“肠胃外”包括皮下注射，静脉注射，关节间注射和气管内注射和输液技术。也可采用其它给药方式如口服或局部服用。肠胃外用的组合物和组合最好用已有技术以丸剂或连续输液进行静脉给药。这里所用的“药学上可接受的载体”指任何惰性的、无毒性的、固体或液体填充剂、稀释剂或胶囊物质，其不与活性化合物或患者进行不利反应。已知较佳的液体载体包括无菌水、盐溶液、葡萄糖液、蔗糖溶液、乙醇、甘醇和油。口服的片剂和胶囊可含有常规的赋形剂如结合试剂、填充剂、润滑剂和润湿剂等。口服的液体制剂可以是水性或油性的悬浮液、溶液、乳浊液、糖浆、酏剂等，或可以是需用水或其它合适的媒剂重新配制的干燥产品。这些液体制剂可含有常规的添加剂如悬浮剂、乳化剂、非水性媒剂和防腐剂。局部使用可以是水性或油性的悬浮液、溶液、乳浊液、冻胶或较好为乳剂软膏。本发明的药物制剂的单位剂量可含有日剂量的Tridegin，或其几分之一以制成所需的剂量。对患者(可以是哺乳动物如人)给予的治疗上可接受剂量和给药频率与许多因素有关，如所用的具体活性物质的活性、年龄、体重、健康状况、性别、饮食、给药的时间和途径、清除率、治疗的对象即治疗或预防和需治疗的疾病的特征。预计全身的剂量为0.05至50mg/kg体重，较佳为0.05至10mg/kg体重，更佳为0.1至1mg/kg体重时有效。根据待治疗疾病的特征，无论是全身还是局部，单个剂量可含有0.05至10mg/kg体重。Tridegin可有效地用于抑制在如急性冠状综合征、静脉血栓形成或中风时血栓形成的稳定性，因此加强了溶栓治疗或天然裂解过程的效果。由于这个原因，加入纤维蛋白溶解抑制剂如在血纤维蛋白凝块中加入α2抗纤维蛋白溶酶的抑制作用可提供其它好处。Tridegin也可有效地抑制其它转谷氨酰胺酶的事实说明其在由转谷氨酰胺酶活性引起的病理场合下有其它潜在的用途。针对转谷氨酰胺酶的这个作用假设可用于Crohn疾病、肿瘤移植、动脉粥样硬化过程中血管壁增厚、溶解血栓微血管病(如在肾脏中)、皮肤内的纤维生长(如硬皮病)、膜性血管球性肾炎、视网膜损伤的修复、白内障、粉刺、伤口组织的形成和各种微丝蚴线虫的传染。Tridegin不仅可因其对上述或相关的综合征有治疗效果而被使用，而且它们的高效也降低了剂量。该可能性在WO93/18760中已有详细的描述，其描述了不起作用的抑制剂丁二胺治疗伤口肥大的最佳剂量为50mM。在同一情况下Tridegin较佳的浓度为1-100μM。根据本发明的第二方面的制剂可有利地与抗凝血剂，溶解血栓剂，血纤维蛋白溶解剂或溶解纤维蛋白原剂等混合给药，这样可有利地增加制剂消化或抑制例如血块的活力。抗凝血剂可包括多肽如水蛭素或肝素。水蛭素公开在EP0347376和EP0501821中，它是在多种水蛭中发现的同源性多肽家族中的一类，这些多肽可特异性地高效地抑制凝血酶从而抑制血块凝集。同样，可用血纤维蛋白溶解/溶解纤维蛋白原试剂如核蒙叮(hementin)，其活性是消化血纤维蛋白原，并使其不能凝块。核蒙叮是一种在多种水蛭种中发现的血纤维蛋白溶解剂，并在如美国专利4390630和WO91/15576中公开。Tridegin的一个特殊作用是当任何血纤维蛋白溶解酶诱导溶解时可减少无血小板和富含血小板的人血浆凝块的溶解时间。组织型血纤维蛋白溶酶原激活剂或核蒙叮与Tridegin的组合可导致比单用Tridegin的溶解更快。由于Tridegin本身没有作用，因此这表明是两种活性物质间的协同作用。Tridegin可与直接水解血纤维蛋白的血纤维蛋白溶解剂(如核蒙叮，血纤维蛋白溶酶或Eminase)混合使用，或与通过血纤维蛋白溶酶作用的血纤维蛋白溶酶原激活剂(如链激酶、尿激酶、葡激酶、组织型血纤维蛋白溶酶原激活剂或它们的衍生物)混合使用，或与截短形式或有这些试剂的两个或多个特征的杂交分子混合使用。本发明的制剂中的溶解血栓剂可包括组织型血纤维蛋白溶酶原激活剂、链激酶、Eminase、尿激酶和葡激酶，以及它们的衍生物、截短形式和杂交体中的一种或多种。有利的是，当制剂除Tridegin外还包括抗凝血剂，溶解血栓或血纤维蛋白溶解剂时，制剂可大大缩短血块消化所需的的时间。因此，Tridegin可有效地用于抑制在如急性冠状综合征，静脉血栓形成等中的血栓形成的稳定性，从而增强了溶栓治疗的效果。如果交联被一种或多种Tridegin抑制，那么通常血纤维蛋白凝块在血纤维蛋白溶酶存在时其50％水解所需的时间约减少一半。此外，血浆凝块在组织型血纤维蛋白溶酶原激活剂存在时的50％水解所需的时间减少至40％，同样在链激酶存在时时间减少超过25％。整篇说明书中所用的术语“组合”是指本发明的Tridegin与抗凝血剂，血纤维蛋白溶解剂，溶解纤维蛋白原剂或溶解血栓剂中任何一种或全部一起同时或依次给药。本发明的Tridegin可有利地用于制备一种治疗血栓栓塞疾病的药物。其它可用本发明的Tridegin治疗的病理学疾病包括Crohn疾病、肿瘤移植、动脉粥样硬化过程中的血管壁增厚、溶解血栓微血管病(如在肾脏中)、皮肤内的纤维生长、膜性血管球性肾炎、白内障、粉刺、伤口组织的形成和各种微丝蚴线虫的传染。有利的是，本发明的Tridegin不仅可用于治疗用途或防止这些综合征，而且Tridegin的高效性可减少使用的剂量。本发明还包括一种用重组DNA技术制备的多肽，其与上面定义的多肽相当本发明还包括一种与本发明的多肽相当的合成的或蛋白质工程化的多肽。典型的分离和鉴定本发明的多肽的方法将参照给出的附图通过实施例来描述，其中图1说明按下面所述的实施例3分离获得的本发明多肽的抑制活性的洗脱结果；图2说明实施例4中本发明多肽的抑制活性的洗脱结果与核蒙叮和结拉叮(ghilantin)的比较；图3说明实施例6中本发明的多肽的抑制活性的结果；图4是实施例3的抑制活性的色谱；图5是实施例4中获得的活性片段的色谱；图6说明实施例7中的十二烷基硫酸钠(SDS)聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果；图7说明从实施例22得到的结果；图8说明从实施例24得到的结果；和图9说明从实施例25得到的结果。实施例1在第一个实验A中，在Potter匀浆器中，在10mMTrisHCl和0.85％w/vNaCl(pH7.0，1ml)中，对Haementeriaghilianii种水蛭的吻部、前侧和后侧唾液腺进行匀浆，并在13000rpm下离心。上清液用血块溶解度测定法测定，其与Tymiak，Tuttle，Kimball，Wang和Lee在抗生素杂志(J.Antibiotics)46卷(1993)204-206页的“一种简单快速筛选因子XIIIa的抑制剂的方法”中的方法相似。在第二个实验B中，吻部、前侧和后侧唾液腺是Haementeriaghilianii种水蛭分泌的，将它们分别在0.2ml等分的缓冲液中匀浆。结果与制备在0.2ml缓冲液中，从两只Haementeriaofficinalis种水蛭的吻部、前侧和后侧唾液腺获得的抽提物比较。测试样品(30μl)加入含有因子XIII(30μl)的10mg/ml的粗制牛血纤维蛋白原中。加入含9mM的CaCl2的6.25单位/ml的牛凝血酶(40μl)中开始反应。在15分钟内形成凝块，并加入8M尿素(160μl)，使其与凝块接触。30分钟后，在405nm处读取由凝块乳光产生的吸光度。吸光度降低表示由于抑制交联而导致凝块的可溶性。表1表示与碘乙酰胺(一种已知的因子XIIIa的抑制剂)相比，不同的抽提物对于血纤维蛋白凝块溶解度的抑制效果(405nm处的吸光度)。表中的数值是405nm处的吸光度。表1</tables>实施例2为确定存在剂对因子XIIIa的抑制剂，用微量滴定板法测定抽提物对人因子XIIIa催化在酪蛋白中掺入氨基戊胺生物素的效果，该法描述于SlaughterTF，AchyuthanKE，LaiT-S和GrecnbergCS.在1992年生物化学年鉴(Anal.Biochem)205卷166-171页的“用5-(生物素氨基)戊胺作为底物的微量滴定转谷氨酰胺酶测定方法”中。与实施例1中实验A相同，制备南美水蛭属种水蛭的吻部、前侧和后侧唾液腺的抽提物。那些从Haementeriadepressa获得的被冻干。由于唾液腺不易从欧洲医蛭和Hirudinariamanillensis种水蛭中除去，因此，抽提物是通过除去三分之一的水蛭的前唾液腺来制备的，并在1毫升含0.85％NaCl的10mMTrisHCl中匀浆。在13000rpm离心后取上清液用于测定。将N，N二甲基酪蛋白溶解在0.1M，pH8.5的TrisHCl中，并在85℃下搅拌30分钟，2000g下离心20分钟。微量滴定板的孔用浓度为10-20mg/ml(0.2ml)的该溶液包被并在37℃下培育1小时。多余的酪蛋白被除去，孔用含0.5％脱脂干牛奶的0.1MHCl(pH8.5)封闭30分钟。然后板用0.35ml等分的Tris缓冲液洗两次。因子XIIIa的制备是在含柠檬酸盐的人血浆中通过加入固体皂土(40mg/ml)以去除纤维蛋白原，培育10分钟并在12000g下离心20分钟。上清液通过加入1000U/ml的牛凝血酶(0.05ml)和200mM氯化钙(0.025ml)并在37℃下培育15分钟来激活。血栓通过加入2000ATU/ml水蛭素(0.5ml)来中和。微量滴定板的孔(总体积为0.2ml)含有5mM氯化钙、10mM二硫苏糖醇、0.5mM生物素氨基戊胺，测试样品(0.05ml)和激活的血浆(0.05ml)。在37℃培育30分钟后除去液体，并用0.2MEDTA洗涤两次(每次0.35ml)，用0.1M，pH8.5的TrisHCl洗涤两次(每次0.35ml)以终止反应。将0.25mg/ml的链霉抗生物素蛋白-碱性磷酸酶用含0.5％脱脂干牛奶的Tris缓冲液按1∶150稀释，并在每个孔中加入0.25ml并在20℃下培育1小时。板再次用0.1％TritonX-100(0.35ml)洗一次，然后用Tris缓冲液(0.35ml)洗三次。结合的碱性磷酸酶的测定可通过加入1mg/ml对-硝基苯磷酸酯，含5mM氯化镁的Tris缓冲液(0.05ml)及Tris缓冲液(0.2ml)，并在30分钟后用TitertekUniskanII微量滴定板读数器在405nm下测定吸光度。表2证明，在不同的更敏感测定方法中，在Haementeriaghilianii和Haementeriaofficinalis的唾液器官中均发现因子XIIIa抑制活性(并用人血浆因子XIIIa催化在酪蛋白中掺入生物素氨基戊胺来测定)。而且，在欧洲医蛭的唾液腺和欧洲医蛭和Hirudinariamanillensis的前侧部分均可检测到明显的但较低的抑制活性。表2</tables>*1单位用抑制1ml正常人血浆中50％的人因子XIIIa所需的转谷氨酰胺酶抑制剂的量的两倍来确定。标准采用的是来自7个健康的献血者的血浆。实施例3如实施例1所述的方法从haementeriaghilianii水蛭获得的五组全部唾液腺混合物(前侧，后侧唾液腺和吻部)在磷酸盐缓冲液中制成匀浆物，并将上清液上柱于1.6×80cm柱的SuperdexG-200中，并用pH7.2磷酸盐缓冲液以1ml/min流速走柱。在280nm处检测洗脱液吸光度，并用与实施例1所述的相同测定方法测定抑制活性。图1表示分离过程及抑制活性洗脱的位置。线条表示含有Tridegin活性的组分。实施例4如实施例1，在20mM，pH8.0的TrisHCl中制备五只Haementeriaghilianii全部唾液腺混合物的匀浆物。上清液上柱于Express-IonExchangerQ(Whatman)的0.8×7.5cm柱上，并用含0.3mMNaCl的20mM，pH8.0的TrisHCl线性梯度洗脱。洗脱液用280nm处的吸光度来监测，Tridegin的活性用实施例1的凝块溶解度测定法来测定。此外用溶解纤维蛋白原测定法测定核蒙叮的活性，用显色底物测定法测定因子Xa的抑制活性。核蒙叮活性的测定是使2mg/ml的牛血纤维蛋白原(50μl)和含10mMCaCl2的20mMHEPES缓冲液和0.1％w/v，pH7.5的Brij35(25μl)及柱组分的连续稀释液(25μl)在37℃培育60分钟。然后加入100U/ml的凝血酶(10μl)形成凝块，30分钟后在405nm处测定其浊度。浊度的减少表示被消化的血纤维蛋白原的量。因子Xa的显色底物法的进行是在分光光度计中在50mM，pH8.3TrisHCl中培育2mM的S2765，并测定在405nm处的吸光度的变化率。反应在加入人因子Xa后开始。图2表示在SPSepharose柱上用线性梯度洗脱至0.3MNaCl的洗脱曲线。其中表示了出现Tridegin(T)、核蒙叮和因子Xa的抑制活性的部位；Tridegin可很明显地与其它两种唾液腺组分即已知这种水蛭唾液腺的核蒙叮(H)和ghilanten(G)分离，从而证明Tridegin与已知的组分不同。含有抑制活性的部分分别用一条横线及字母T，G和H标记。实施例5与实施例1的方法相同，在20mM，pH3.5的甲酸氨(5ml)中制备从Haementeriaghilianii获得的全部唾液腺混合物的匀浆物，并将匀浆物上柱于0.8×7.5cm的Express-IonExchangerS(Whatman)柱。组分用线性盐梯度洗脱至含1MNaCl的20mM，pH3.5的甲酸钠。如实施例1一样监测并测定洗脱液在280nm处的吸光度。抑制活性组分在约0.6M处洗出。实施例6结合实施例3、4和5中例举的色谱步骤，制备一大批量。在20mM，pH8.0的TrisHCl(50ml)中制备从五十只至少3个月未喂养的Haementeriaghilianii水蛭获得的全部唾液腺混合物的匀浆物，并如实施例1一样离心。上清液上柱于60×10cm的SephroseFastFlow(Pharmacia)柱。组分用起始缓冲液至含有0.1MNaCl的缓冲液的线性梯度洗脱。在280nm处监测洗脱液并发现在约0.09MNaCl的洗脱液处有活性组分(见图3，其中含有抑制活性的部分用一条横线标出)。在活性组分(145ml)中加入甲酸调节至pH4并上柱于5×12cm的SPSepharoseFastFlow(Pharmacia)柱，柱预先用20mM，pH3.5的甲酸钠缓冲液平衡。柱用从平衡缓冲液至含有1MNaCl相同缓冲液的线性梯度洗脱。活性部分在约0.75MNaCl处有洗脱蜂(见图4，其中含有抑制活性的部分用一条横线标记)。将其冻干然后再生在水中至最后体积为2.4ml，并上柱于1.6×60cm的SuperdexG-75柱，柱预先用pH7.2的磷酸盐缓冲液平衡。图5表示其洗脱曲线，其中有抑制活性的部分用一条横线标记。获得的蛋白质含有715μg蛋白质，并冷冻保藏。用考马斯蓝或银染色的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳显示在该步骤后蛋白质基本上是纯的，与已知分子量的标准品比较，主条带表观分子量在约7800道尔顿，而有更高分子量的次要条带只能用更灵敏的银染色法才能测得。实施例7为进行测序，还需进行一步纯化步骤。将实施例6获得的0.3ml活性组分上柱于0.5×10cm的ProRPC柱，柱预先用0.1％三氟乙酸平衡，然后柱用从含0.1％三氟乙酸的0％乙腈至100％乙腈的梯度洗脱。在两个很小的无活性峰后出现与之完全分离的含有抑制活性的主峰。如实施例6所述，在SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳中活性组分显示单一条带且与已知分子量的肽标准品对比，其表观分子量为约7800道尔顿。图6是纯的多肽在PhastGelhighdensity凝胶(Pharmacia)上的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。左边的泳道(条1)和泳道7是低分子量的标记组分(Pharmacia)，其中分子量分别是94、67、43、30、20.1和14.4KD以及抑蛋白酶肽(分子量为6.5KD)。泳道2和7肽标记组分(Pharmacia)，分子量为16.9、14.4、10.7、8.2和6.2KD以及抑蛋白酶肽(6.5KD)。泳道3水空白。泳道4纯化的Tridegin。泳道5和6反相色谱柱上的次要峰。最低分子量的组分迁移至离凝胶的顶端最近。用AppliedBiosystems473A自动蛋白质测序仪从氨基末端测得一条单一的清晰的氨基酸序列，其表明只存在一条多肽。发现的氨基酸序列为NH2-Lys-Leu-Leu-Pro-X-Lys-Glu-Y-His-Gly-Ile-Pro-Asn-Pro-Arg-其中X和Y并不确定，因此可以是任何氨基酸。样品中的半胱氨酸并没衍生，因此不能归入。在吡啶乙基化后重新测序，显示X为半胱氨酸，而Y没有显示任何峰，因此不能归为任何常见的氨基酸。实施例8为产生足够的用于氨基酸测序的材料，如实施例6和7一样，从五十只Haementeriaghilianii种水蛭后侧唾液腺制备转谷氨酰胺酶抑制剂。等分试样用Matsudaira(一种蛋白质和肽纯化进行微测序的实用方法“Apraticalguidetoproteinandpeptidepurificationformicrosequencing”，学院出版社，第二版，45-67页)所述的标准方法进行变性，氨基羧基甲基化和用胰蛋白酶或AspN内切蛋白酶消化，然后片段在0.5×10cm的预先用0.06％三氟乙酸平衡的ProRPC柱上分离，然后用从2至38％、38至75％及从75至98％洗脱缓冲液线性梯度洗脱，其中洗脱缓冲液为含80％乙腈的0.0675％三氟乙酸，并在210nm处检测。分离片段的序列用AppliedBiosystems473A自动蛋白质测序仪测序。从中推导出整个多肽的氨基酸序列并发现重叠的多肽NH2-Lys-Leu-Leu-Pro-Cys-Lys-Glu-X1-His-Gln-Gly-Ile-Pro-Asn-Pro-Arg-Cys-X2-Cys-Gly-Ala-Asp-Leu-Glu-X3-Ala-Gln-Asp-Gln-Tyr-Cys-Ala-Phe-Ile-Pro-Gln-Z1-Arg-Pro-Arg-Ser-Glu-Leu-Ile-Lys-Pro-Met-Asp-Asp-Ile-TyrGln-Arg-Pro-Val-Z2-Phe-Pro-Asn-Leu-Pro-Leu-Lys-Pro-Arg-Z3-COOH其中氨基酸X1、X2和X3不确定，可表示在转录后修饰的残基，Z1、Z2和Z3表示不能从Cys或Glu中分出的氨基酸。有该序列的多肽被定义为Tridegin变异体1。实施例9除了证明因子XIIIa能够将胺掺入于酪蛋白中和因子XIIIa影响凝块溶解度的测定方法外，通过测定胺加入后从酪蛋白中产生的氨气的量的测定能显示抑制作用的特异性。用Muszbek，Polgar和Fesus(血浆中凝血因子XIII的动力学测定法“KineticdeterminationofbloodcoagulationfactorXIIIinplasma”，ClinChem31(1985)，第35-40页)的改进方法通过分光光度计可测定人血浆因子XIIIa的转谷氨酰胺酶的活性。该氨气测定方法是通过谷氨酸脱氢酶反应将氨气的产生与NADH氧化反应连接，而NADH氧化反应可通过340nm处的吸光度的变化来监测。将去血纤维蛋白的人血浆(2ml)和200mMCaCl2(0.1ml)与1000单位/ml的牛凝血酶(0.1ml)一起在37℃下培育来活化因子XIII。15分钟后加入260抗凝血酶单位的水蛭素终止反应。反应槽含有2.5mM二硫苏糖醇(0.1ml)、40mg/ml去磷酸化的β-酪蛋白(0.05ml)、70mM乙胺(0.1ml)、12mM2-酮戊二酸(0.1ml)、4mMNADH(0.1ml)、1.2mMADP(0.1ml)、40单位/毫升的谷氨酸脱氢酶(0.1ml)、70mM，pH7.5的HEPES缓冲液(0.25ml)，其20℃下放在分光光度计中。可能的话，所有组分溶解在70mMHEPES缓冲液(pH7.5)中。加入活化的因子XIII(0.2ml)开始反应并在340nm处监测。测定方法用因子XIII缺陷的血浆(Sigma)来实现。用缺陷的血浆代替普通血浆将导致反应速率低于88％(从11.3至1.87mAbs/min)，这证明测定方法准确地测定了因子XIIIa。在反应槽的0.1mlHEPES缓冲液中加入测试样品。表3中显示了Tridegin变异体1的抑制效果与碘乙酰胺(一种已知的依赖于巯基的因子XIIIa的抑制剂)和ETGA(一种利用与基本的钙螯合而抑制因子XIII活化和活性的抑制剂)的比较。Tridegin可降低氨气产生率约93％，即抑制效果与碘乙酰胺的相当(如表3所示)。还有证据表明Tridegin是凝块增溶性的抑制剂，还是血浆转谷氨酰胺酶或因子XIIIa的抑制剂。表3实施例10用SlaughterTF，AchyuthanKE，LaiT-SandGreenbergCS.(1992)((用5-生物素氨基戊胺作为底物的微量滴定板转谷氨酰胺酶测定，生物化学年鉴(Anal.Biochem)205卷166-171页))描述的微量滴定板法测定实施例6中纯化的Tridegin变异体1对人因子XIIIa催化在酪蛋白中掺入生物素氨基戊胺的抑制效果。N，N二甲基酪蛋白溶解在0.1M，pH8.5的TrisHCl中并在85℃搅拌30分钟，然后在12000g离心20分钟。浓度为10-20mg/ml(0.2ml)的溶液用于包被微量滴定板的孔并在37℃培育1小时。丢弃剩余的酪蛋白，孔用含0.5％的脱脂于牛奶的0.1M，pH8.5的TrisHCl封闭30分钟。然后板用0.35ml每份的Tris缓冲液洗两次。加入含150U/ml的凝血酶的15mM氯化钙(0.18ml)来活化纯化的人血小板因子XIII(0.6单位/0.12ml)，并在37℃培育15分钟。然后加入天然的140ATU/ml的水蛭素(0.3ml)抑制凝血酶。微量滴定板的孔(总体积为0.2ml)含有5mM氯化钙，10mM二硫苏糖醇，0.5mM生物素氨基戊胺、按实施例6所述方法制成的Tridegin样品和在0.1M，pH8.5的TrisHCl中的0.25单位/毫升的激活的因子XIIIa。在37℃培育30分钟后除去液体，并用0.2MEDTA洗涤两次(每次0.35ml)，然后0.1M，pH8.5的TrisHCl洗涤两次(每次0.35ml)以终止反应。将0.25mg/ml的链霉抗生物素蛋白-碱性磷酸酶用含0.5％脱脂干牛奶的Tris缓冲液按1∶150稀释，并在每个孔中加入0.25ml于20℃下培育1小时。板再次用0.1％TritonX-100(0.35ml)洗涤一次，然后用Tris缓冲液(0.35ml)洗三次。通过加入1mg/ml的对硝基苯磷酸盐、含有5mM氯化镁的Tris缓冲液(0.05ml)中及Tris缓冲液(0.2ml)测定结合的碱性磷酸酶，30分钟后用TitertekUniskanII微量滴定板读数器在405nm处测定吸光度。Tridegin变异体1明显地抑制胺的掺入反应，其IC50为0.026±0.002μg/ml(3.4nM)，这证明它有有效抑制血小板因子XIIIa的活性。在一个单独的实验中，进行相同的过程，只是用健康献血者的血浆代替纯化的因子XIII，且Tridegin的浓度不同，结果测得血浆的因子XIIIa的IC50为0.07±0.003μg/ml(9.2nM)。实施例11用显色底物法测定实施例6中纯化的Tridegin变异体1对凝固酶、凝血酶的作用。在50mM，pH8.3的TrisHCl中培育1mMS2238，加入凝血酶至最终浓度为0.15U/ml，开始反应。反应在405nm处用分光光度计检测。表4显示Tridegin在浓度为4.6μg/ml时对凝血酶无作用，而水蛭素在浓度为0.046μg/ml时则有显著的抑制效果(95％)。表5实施例13为确定Tridegin是否有核蒙叮样的溶解纤维蛋白原的活性，通过将血纤维蛋白原和抑制剂培育后测定血纤维蛋白原的可凝性来评估实施例6中纯化物质消化纤维蛋白原的能力。2mg/ml牛血纤维蛋白原(50μl)和Tridegin、纯化的核蒙叮或载体(50μl)、含有10mM氯化钙的20mMHEPES缓冲液，及0.1％w/v，pH7.5Brij35(50μl)在37℃培育60分钟。然后加入100U/ml凝血酶(10μl)以形成凝块，30分钟后凝块在405nm处测定其浊度。表6显示转谷氨酰胺酶抑制剂对于凝块形成无作用，而纯化的核蒙叮可明显消化血纤维蛋白原从而形成较少的凝块。这表明Tridegin对于血纤维蛋白原无蛋白水解作用，因此其并不是WO91/15576(“血栓形成事件的处理(Treatmentofthromboticevents)”)和美国专利4,390,630(“核蒙叮-一种血纤维蛋白溶解剂”)中所述的核蒙叮。此外，这个实施例还进一步证明在Haementeriaghilianii中发现的核蒙叮在例举的纯化过程中与转谷氨酰胺酶抑制剂分离。表6实施例14去稳定酶的活力可通过其使对-硝基苯胺从显色底物L-γ-谷胺酰基-对-硝基酰苯胺中解离出来的效果而测定。为确定去稳定酶和Tridegin是否有同样性质，对两种试剂对于显色底物的作用进行了比较。含有0.45mg/mlL-γ-谷胺酰基-对-硝基酰苯胺的50mMTrisHCl、10mM，pH8.0氯化钙(0.9ml)的比色皿在分光光度计内于405nm下分别读吸光度。加入0.046mg/mlTridegin变异体1(0.1ml)或欧洲医蛭抽提物上清液(一种已知的去稳定酶的来源，如实施例2一样制备)(0.1ml)，测定硝基苯胺的产生速率。表7显示了Tridegin对于去稳定酶的底物L-γ-谷胺酰基-对-硝基酰苯胺的作用，并表示尽管欧洲医蛭抽提物含有的活性可使吸光度增加(这表示由于去稳定酶而使该底物解离)，但是Tridegin没有如此作用，因此导致吸光度在一段时间内稍稍降低。表7实施例15通过在普通血浆中加入0.1体积的实施例6中纯化的(46μg/ml)在磷酸盐缓冲液中的抑制剂，将普通血浆样品与只加入缓冲液中样品进行比较，测定Tridegin对血浆中凝块的作用。在一个自动分析器中进行标准凝块测定。表8中的结果表明两种样品间没有区别，因此Tridegin对于普通入血浆的凝结时间无影响。由于血纤维蛋白交联的抑制剂对于凝块形成无影响，它只影响其形成后的物理和化学性质，因此该性质是可以预计到的。而且这证明在不同的测试中，在Tridegin中存在其它抗凝活性如对因子Xa或凝血酶的抑制。在一个生物/数据凝聚器(Bio/Dataaggregometer)中，评估在6.7μg/ml胶原、6.3μMADP或0.4U/ml凝血酶下人含柠檬酸盐的富含血小板的血浆的血小板凝聚。实施例6的最终浓度为4.6μg/ml的Tridegin与缓冲液对照进行比较。表8显示Tridegin在这些条件下对于血小板凝聚明显无作用。表8实施例16如实施例10所述的测定方法，测定抑制剂对豚鼠肝脏组织型转谷氨酰胺酶的作用，其中用组织型转谷氨酰胺酶代替激活的因子XIIIa。Tridegin(4.5μg/ml)95.5％抑制由这个酶催化酪蛋白中掺入胺的反应。用不同浓度的Tridegin发现IC50为1.55μg/ml。这个测定表示Tridegin是组织型转谷氨酰胺酶和血浆转谷氨酰胺酶因子XIIIa的抑制剂，其也可是许多转谷氨酰胺酶的抑制剂。实施例17通过SlaughterTF，AchyuthanKE，LaiT-SandGreenbergCS.(1992)((用5-生物素氨基戊胺作为底物的微量滴定转谷氨酰胺酶测定)，生物化学年鉴(Anal.Biochem)205卷166-171页)的胺掺入测定法可测定Haementeriaghilianii唾液腺系统和唾液分泌物中的转谷氨酰胺酶抑制剂。从饥饿了三次喂养的水蛭取下前侧和后侧唾液腺和吻部以及后吸盘。样品在玻璃匀浆器中，用1mM，pH8.0TrisHCl(1ml或在后侧腺体时0.5ml)匀浆，并在12000rpm下离心。上清液用于测定。为收集唾液腺分泌物，八个饥饿了三次喂养Haementeriaghilianii水蛭在5℃冷冻2-3小时后取出其完整的唾液腺器官(吻部、前侧和后侧腺体)。将其钉在Sylgard基片上并浸泡在20℃的生理盐溶液(65mMNaCl，50mMNH4Cl，4mmKGl，1mMEGTA，11mM葡萄糖，10mM，pH7.4HEPES)中15分钟。纵向切开吻部的壁，进入体腔并用微吸管收集其中含有的分泌物。表9表示Haementeriaghilianii水蛭的抽提物和分泌物对人血浆因子XIIIa的抑制情况。在两种唾液腺，唾液分泌物和吻部中均发现有抑制活性。在后吸盘发现可检测到少量活性，其比活很低，为后侧唾液腺的0.35％，实际上明显可检测到的活性是由这一大片组织抽提出的高浓度蛋白质产生的。表9#如实施例10所述，在胺掺入测定中一个单位用以抑制1ml正常人血浆中50％的因子XIIIa所需的转谷氨酰胺酶抑制剂的量的两倍来确定。*8个单独的实验的平均值。+蛋白质浓度太低而不能测定(比活非常高)。实施例18用吸光度法可证明Tridegin对纤溶酶诱导的血纤维蛋白溶解有加强作用。在微量滴定板中将10mg/ml牛血纤维蛋白原与50U/ml牛凝血酶(0.01ml)及缓冲液或实施例6的Tridegin一起在37℃培育2小时。加入2.56U/ml纤溶酶(0.05ml)，板在37℃下培育。每隔15分钟在TitretekUniskanII微量滴定板读数器测定吸光度。每隔15分钟观察凝块并记录凝块完全溶解的时间。如表10所述，在所有测定的浓度中转谷氨酰胺酶抑制剂减少了溶解的时间。表10</tables>实施例19Tridegin对由组织型血纤维蛋白溶酶原激活剂诱导的血纤维蛋白溶解的提高的效果也表现在人血浆凝块上。将人血浆(0.1ml)和5U/ml牛凝血酶在含0.14MKCl的0.18MCaCl2(0.01ml)，及缓冲液或如实施例6所制备的Tridegin(0.4ml)一起在微量滴定板中一式六份37℃培育2小时，只是该Tridegin从Haementeriaghilianii水蛭后侧唾液腺获得。然后加入组织型血纤维蛋白溶酶原激活剂(0.05ml)至最终浓度为10IU/ml，板在37℃培育，每隔30分钟用TitretekUniskanII微量滴定板读数器在405nm读吸光度。吸光度的减少表示血浆凝块的溶解。对照孔的50％溶解的时间为12.9±1.1小时，在含有转谷氨酰胺酶抑制剂的孔中为7.9±0.7小时，这在统计学上显著减少了。该实施例证明转谷氨酰胺酶抑制剂可大幅度加速组织型血纤维蛋白溶酶原激活剂对于人血浆凝块的反应。实施例20由于血小板在体内与血栓相关联，因此感兴趣的是如果转谷氨酰胺酶抑制剂可使富含血小板的凝块更快溶解，那么还可进行生理性试验。血小板是血浆转谷氨酰胺酶、因子XIII和血纤维蛋白溶解抑制剂的富含源，因此它们大大降低了血纤维蛋白溶解剂的效力。从同一献血者制备人富含血小板或缺少血小板血浆(0.1ml)，使它们与5U/ml牛凝血酶在含0.14MKCl的0.18M氯化钙(0.01ml)和缓冲液或Tridegin(如实施例6所述制备，只是从Haementeriaghilianii水蛭的后侧唾液腺制备，0.04ml)一起在37℃培育2小时，样品一式六份放在微量滴定板中。加入组织型血纤维蛋白溶酶原激活剂(0.5ml)至最后浓度为10IU/ml，板在37℃下培育。在72小时内每隔30分钟用MolecularDevicesThermomax动力学微量滴定板读数器记录在405nm处的吸光度(吸光度的降低表示血浆凝块的溶解)。表11显示在血小板存在下，凝块在72小时培育期间内溶解不超过50％。Tridegin可更有效地减少血小板存在时血小板的作用，在该实施例中，当血小板存在时Tridegin将时间从大于72小时减少至24.9小时，在血小板不存在时它将时间从22.5小时减少至18.0小时。表11</tables>实施例21Tridegin减少凝块溶解时间的作用是普遍的作用，其在用链激酶作为溶解剂时可表现出。人血浆(0.1ml)与5U/ml牛凝血酶在含0.14MKCl的0.18M氯化钙(0.01ml)和缓冲液或Tridegin(如实施例6所述制备，只是从Haementeriaghilianii水蛭的后侧唾液腺制备，0.04ml)一起在37℃培育2小时，样品一式三份放在微量滴定板中。加入链激酶至最后浓度为30U/ml，板在37℃下培育在iEMS动力学微量滴定板读数器中，在47.5小时内每隔30分钟记录在405nm处的吸光度。尽管只含链激酶的孔不能充分溶解凝块以获得50％溶解的时间，但是所有含Tridegin的孔的50％的溶解时间为36.1±1.6小时，这再次证明当其与血纤维蛋白溶解剂如链激酶一起使用时其效果大大增加，结果表示在图7中(其表示Tridegin对链激酶诱导血浆凝块溶解反应的作用)。结果是±SEM(n＝3)。实施例22如实施例21所述，测试Tridegin和核蒙叮的混合使用效果，其中用110U/ml核蒙叮代替组织型血纤维蛋白溶酶原激活剂。在该实施例中采用来自同一献血者的无血小板的和富含血小板的血浆用于确定它们之间是否存在不同。表12表示记录的样品的50％溶解的时间。血小板有明显增加溶解所需时间的效果，其使时间从34小时增加至大于56小时，而很明显Tridegin可减少50％溶解的时间，无论血小板存在与否。Tridegin可将溶解时间减少至与对照接近，因此Tridegin看上去可大大克服血小板的作用。表12实施例23为研究从墨西哥的Haementeriaofficinalis水蛭获得的Tridegin的性质，在凝胶过滤色谱后，抽提物进行反相高压液相色谱分析。从五个Haementeriaofficinalis水蛭获得唾液腺和吻部，使水蛭饥饿至前肠内没有发现有血液。将它们在特氟隆/玻璃匀浆器中在pH7.2磷酸盐缓冲液(1ml)内匀浆，并在12000g离心5分钟以获得澄清的上清液。将上清液上柱于1.6×60cm的SuperdexG75柱，在280nm处监测，收集所有的组分并如实施例1进行凝块溶解度测定。如图8所示，仅在一个峰中发现有抑制活性(其中含抑制活性的组分用一条横线标记)。活性部分冻干，然后重新溶解在水(1ml)中。其中部分(0.3ml)上柱于0.5×10cm的预先用0.1％三氟乙酸(TFA)平衡的Pro-RPC柱。用0.1％TFA至含0.1％TFA的乙腈进行线性梯度洗脱，洗脱液在280nm处有多个吸收峰。每个吸收峰用如实施例1所述的凝块溶解度测定法测定，并仅在一个峰内发现含有活性。将两个柱上的洗脱部位与相似的Haementeriaghilianii抽提物的洗脱部位比较，结果表明其洗脱部位与Tridegin变异体1的非常接近。从Haementeriaofficinalis的唾液腺纯化获得的抑制活性在分子量(用凝胶过滤测定)和分配系数(用反相高压液相色谱变异体1的测定)上有与Tridegin变异体1的非常接近的生理化学性质。实施例24为测定Tridegin变异体1的在体内行为，对一组四个大鼠静脉注射含0.207mg/kgTridegin变异体1的含0.01M磷酸钠、0.027MKCl、0.137MNaCl、pH7.4的静脉注射制剂(4.7ml)。在给药2或5及10、20、30、60和120分钟时从尾部静脉取出血样品(约0.3ml)，并立即与0.04ml3.8％的柠檬酸三钠混合。样品立即在12000g离心5分钟，取出上清液在干冰上急速冷冻。没有发现Tridegin给药副作用。样品中的Tridegin用实施例2所用的胺掺入测定的改进法测定，其中内因子XIII的激活是在每个样品(0.097ml)中通过加入0.1MpH8.5TrisHCl(0.03ml)和1000U/ml牛凝血酶(0.01ml)并在37℃下培育15分钟。离心除去血纤维蛋白凝块，血清用于测定。标准曲线的样品通过在柠檬酸化的大鼠血浆中加入已知浓度的纯Tridegin变异体1的以及以相同方式激活因子XIIIa来制备。然后用如实施例2的因子XIIIa的抑制百分数与标准曲线的比较来获得每个样品中的Tridegin的浓度。图9显示Tridegin在大鼠中的药物动力学。时间过程明显有多相；末端半衰期30-60分钟表示其显著的作用持续性，且Tridegin的药物动力学使其可适用于药物用途。权利要求1.一种多肽，其有下列氨基酸序列NH2-Lys-Leu-Pro-Cys-Lys-Glu-Y-His-Gln-Gly-Ile-Pro-Asn-Pro-Arg-其中Y代表任何氨基酸序列；或所述序列的药学上可接受的盐、衍生物或生物前体，或具有基本相似活性的氨基酸序列的同源物、类似物或截短的形式。2.一种多肽，其有下列氨基酸序列，110NH2-Lys-Leu-Leu-Pro-Cys-Lys-Glu-X1-His-Gln-Gly-Ile-Pro-Asn-Pro-Arg-Cys-2030X2-Cys-Gly-Ala-Asp-Leu-Glu-X3-Ala-Gln-Asp-Gln-Tyr-Cys-Ala-Phe-Ile-Pro-4050Gln-Z1-Arg-Pro-Arg-Ser-Glu-Leu-Ile-Lys-Pro-Met-Asp-Asp-Ile-Tyr-Gln-Arg-6066Pro-Val-Z2-Phe-Pro-Asn-Leu-Pro-Leu-Lys-Pro-Arg-Z3-COOH其中X1，X2和X3各自代表任何氨基酸残基；Z1，Z2和Z3各自同时或者不同时代表Cys或Glu；或所述氨基酸序列的药学上可接受的盐、衍生物或生物前体，或基本上有相同活性的氨基酸序列的截短形式，同源物或类似物。3.根据权利要求1或2所述的多肽，其从水蛭组织或分泌物获得。4.根据权利要求3所述的多肽，其中水蛭属于吻蛭目。5.根据权利要求1至4的任一条所述的多肽，其从南美水蛭属水蛭的组织或分泌物获得。6.一种转谷氨酰胺酶活性的抑制剂，抑制剂从水蛭组织或水蛭分泌物中获得。7.根据权利要求6所述的抑制剂，其中水蛭属于吻蛭目。8.根据权利要求7所述的抑制剂，其中水蛭属于南美水蛭属。9.根据权利要求6至8的任一所述的抑制剂，其中所述抑制剂为一种多肽，用聚丙烯酰胺凝胶电泳测得其表观分子量为约7000至8000道尔顿。10.根据权利要求6至9的任一所述的抑制剂，其中所述的抑制剂有抑制因子XIIIa催化胺掺入酪蛋白的活性。11.根据权利要求6至10的任一所述的抑制剂，其中所述的抑制剂抑制因子XIIIa催化胺掺入酪蛋白的活性的IC50为0.026±0.002mg/ml。12.一种测定权利要求1至5的任一所述的多肽或权利要求6至11的任一条所述的抑制剂抑制转谷氨酰胺酶活性的水平的诊断方法，方法包括在所述的多肽或抽提物存在时分别测定由转谷氨酰胺酶催化酪蛋白中掺入胺后产生的氨气量，其中产生的氨气量提供了测定抑制转谷氨酰胺酶的水平的标准。13.一种权利要求1至5的任一所述的多肽或权利要求6至1l的任一所述的抑制剂在制备治疗血栓疾病的药物中的应用。14.一种权利要求1至5的任一条所述的多肽或权利要求6至11的任一所述的抑制剂在制备药物中的应用，其中药物用于治疗Crohn疾病、肿瘤移植、动脉粥样硬化过程中血管壁增厚、溶解血栓微血管病、皮肤内的纤维生长、膜性血管球性肾炎、白内障、粉刺或伤口组织的形成或各种微丝蚴线虫的传染。15.一种药物制剂，包括权利要求1至5的任一所述的多肽，和/或权利要求6至11的任一所述的抑制剂，和一种药学上可接受的载体，稀释剂或赋形剂。16.根据权利要求15所述的药物制剂，其可与一种抗凝血剂合并给药。17.根据权利要求16所述的制剂，其中抗凝血剂包括水蛭素或肝素。18.根据权利要求15所述的制剂，其可与一种血纤维蛋白溶解剂，溶解纤维蛋白原剂或溶解血栓剂混合给药。19.根据权利要求18所述的制剂，其中溶解血栓剂包括组织型血纤维蛋白溶酶原激活剂、血纤维蛋白溶酶、链激酶、eminase、尿激酶、核蒙叮和葡激酶中的一种或多种。20.根据权利要求18所述的制剂，其中血纤维蛋白溶解剂或溶解纤维蛋白原剂包括核蒙叮。21.一种用权利要求15至20的任一所述的制剂制备治疗血栓疾病的药物的应用。22.一种用权利要求15至20的任一所述的制剂在制备药物中的应用，其中药物用于治疗Crohn疾病、肿瘤移植、动脉粥样硬化过程中血管壁增厚、溶解血栓微血管病蚴、皮肤内的纤维生长、膜性血管球性肾炎、白内障、粉刺或伤口组织的形成或各种微丝蚴线虫的传染。23.一种可抑制转谷氨酰胺酶活性的基本纯化的多肽，所述多肽通过一种方法从水蛭组织或水蛭分泌物中获得，方法包括离子交换色谱纯化和/或凝胶过滤柱色谱纯化。24.一种用于分离权利要求1至5的任一条所述的多肽或权利要求6至11的任一条所述的抑制剂的方法，方法包括抽提吻蛭目水蛭的组织或分泌物，用离子交换柱色谱，凝胶过滤柱色谱和反相色谱来纯化抽提物。全文摘要从吻蛭目的水蛭组织或分泌物中获得的抑制剂,有下列氨基酸序列:NH文档编号C07K14/815GK1187201SQ9619464公开日1998年7月8日申请日期1996年5月7日优先权日1996年5月7日发明者R·T·索耶,R·B·沃利斯,L·西尔,S·芬尼申请人:生物药物研究与发展有限公司