专利名称：：含d－2－烷基色氨酸、能促进生长激素释放的寡肽化合物的制作方法
技术领域：
：本发明涉及含D-2-烷基色氨酸的寡肽化合物，它们能从生长激素细胞释放生长激素(GH)，并通过口服途径起作用。施用诱导GH释放的化合物后如果得到了足够高的GH水平，哺乳动物体内的生长激素(GH)水平的提高就可以加快生长过程，增加肌肉含量和奶的产量。而且，通过施用已知的生长激素释放剂，例如生长激素释放激素(GHRH)，也能提高哺乳动物体内的生长激素水平。施用生长激素释放肽也可以提高哺乳动物体内生长激素水平，其中一些肽以前已有描述，例如US4，223，019，US4，223，020，US4，223，021，US4，224，316，US4，226，857，US4，228，155，US4，228，156，US4，228，157，US4，228，158，US4，410，512，US4，410，513，US4，411，890和US4，839，344。因此，能促进生长激素释放的相当简单的短链寡肽是目前所希望的，条件是它们容易制备、纯化和设计，并且经口途径施用时是有活性的。现完全出乎意料地发现，含至少一个D-2-烷基色氨酸(2-Mrp)残基的很短的肽具有从生长激素细胞释放生长激素(GH)的活性。本发明的另外一个出乎意料的特征是非常高的功效和良好的口服活性口服／功效比，该系列中即使最短的三肽也显示出功效。本发明的寡肽的结构式为A-D-X-D-Mrp-B其中A是氢，2-氨基异丁酰基，4-氨基丁酰基，D代表右旋异构体，X是Mrp，其中Mrp表示下式的2-烷基色氨酸其中，R是氢，CHO，SO2CH3，1，3，5-三甲基苯-2-磺酰基，PO3(CH3)2，PO3H2；R1是C1-C3烷基；或者X是一个被保护了的丝氨酸残基，即Ser(Y)，其中Y可以是苄基，对氯苄基，4-甲氧苄基，2，4，6-三甲氧苄基，叔丁基；B是NR2R3，其中R2eR3可以相同或不同，它们是氢或C1-C3烷基；一个OR4基团，其中R4是氢或C1-C3烷基C-Lys-NH2基团，其中C是Phe或Mrp。本发明是基于这样一个发现，即一些不同的短链寡肽(能促进动物生长激素释放和在血液中水平的提高)的特征在于它们的肽链中都包含一个2-烷基色氨酸的D-异构体(D-2-Me-Trp或D-Mrp)。包含在本发明的范围内的寡肽由下式定义A-D-X-D-Mrp-B其中A是氢，2-氨基异丁酰基，4-氨基丁酰基，D代表右旋异构体，X是Mrp，其中Mrp表示下式的2-烷基色氨酸其中，R是氢，CHO，SO2CH3，1，3，5-三甲基苯-2-磺酰基，PO36+(CH3)2，PO3H2；R1是C1-C3烷基；或者X是一个被保护了的丝氨酸残基，即Ser(Y)，其中Y可以是苄基，对氯苄基，4-甲氧苄基，2，4，6-三甲氧苄基，叔丁基；B是NR2R3，其中R2和R3可以相同或不同，它们是氢或C1-C3烷基；一个OR4基团，其中R4是氢或C1-C3烷基C-Lys-NH2基团，其中C是Phe或Mrp，以及所述任一种多肽(polipeptide)与药物学上可接受的有机或无机酸形成的加合盐。这里所用氨基酸残基的缩写与用于肽的标准术语一致Lys=L-赖氨酸，此外，Aib=2-氨基异丁酰基GAB=4-氨基丁酰基Mrp=2-烷基色氨酸Bzl=苄基p-Cl-Bzl=对氯苄基Mob=4-甲氧苄基Tmob=2，4，6-三甲氧苄基tbu=叔丁基For=甲酰基Mts=1，3，5-三甲基苯-2-磺酰基。按照本发明，烷基指的是低级烷基，包括1-3个碳原子。低级烷基的例子有甲基，乙基，丙基，异丙基，其中最优选甲基。所有三字母缩写的氨基酸名称前加“D-”表示D构型氨基酸残基，而仅用三字母缩写表示一种氨基酸时，该氨基酸包括L构型。本发明优选的生长激素释放化合物是(a)GAB-D-Mrp-D-Mrp-Phe-Lys-NH2；(b)GAB-D-Mrp-D-Mrp-Mrp-Lys-NH2；(c)Aib-D-Mrp-D-Mrp-NH2；(d)Aib-D-Mrp-Mrp-NH2；(e)Aib-D-Ser(Bzl)-D-Mrp-NH2；其中，Mrp是2-甲基色氨酸，GAB和Aib见前述定义，以及所述任一种寡肽与药物学上可接受的有机或无机酸形成的加合盐。这些化合物优选口服，但它们也可以鼻内施用和非肠道施用，或者可将它们制成控释系统，例如可生物降解的微胶囊，微球，皮下植入物等。本发明的寡肽化合物可以通过常规的固相和溶液肽化学方法合成，或者用本领域公知的经典方法合成。固相合成法从肽的C-端开始。一个合适的起始原料可以通过把所需的保护了的α-氨基酸附着在一种氯甲基化树脂，羟甲基化树脂，二苯甲基胺树脂(BHA)或者对甲基二苯甲基胺树脂(p-Me-BHA)上而制备。例如，氯甲基化树脂可以从位于Richmond，California的BioRadLaboratories购得，商标为BIOBEADSSX1。羟甲基树脂的制备方法见Bodansky等在Chem．Ind．(London)38，15997(1966)中的描述。BHA树脂见Pietta和Marshall在Chem．Comm．，650(1970)中的描述，可以从位于Belmont，California的PeninsulaLaboratories商购。附着起始以后，α-氨基酸的保护基团可以通过不同的酸试剂去除，所述酸试剂包括室温下溶于有机溶剂中的三氟乙酸(TFA)或盐酸(HCl)。除去α-氨基酸保护基团之后，剩余的被保护了的氨基酸就可以逐步按既定的顺序偶联上去。通常，每种被保护了的氨基酸能反应大约三次以上，使用合适的羧基活化基团，例如溶解在诸如二氯甲烷(CH2Cl2)或二甲基甲酰胺(DMF)和它们的混合物中的二环己基碳化二亚胺(DCC)或二异丙基碳化二亚胺(DIC)。完成既定的氨基酸序列后，目标肽可以通过用诸如氟化氢(HF)的试剂处理从支持树脂上裂解下来，氟化氢不仅从树脂上裂解下来肽，而且也把侧链上更普通的保护基团裂解下来。当使用氯甲基化树脂或羟甲基化树脂时，HF处理会导致游离形式的酸性肽形成；而使用BHA或p-Me-BHA树脂时，HF处理则直接导致游离形式的酰胺肽形成。上述讨论的固相合成程序是本领域已知的，其描述见Atherton和Sheppard，“固相肽合成”(IRLPress，Oxford，1989)。一些可用于合成本发明的肽部分的溶液合成法详述于Bodansky等．，PeptideSynthesis，2ndedition，JohnWiley&Sons，NewYork，N．Y．1976以及Jones，TheChemicalSynthesisofPeptides，(ClarendonPress，Oxford，1994)。这些化合物可以有效剂量施用于人和动物，其有效剂量可以由该领域专家很容易地确定并按照治疗对象的物种，年龄，性别和重量的不同而变化。例如，对人静脉施用，优选的剂量范围是每kg体重约0．1-10μg总肽，而口服时一般需更高剂量。例如，供人口服时，剂量水平通常为每kg体重约30μg-约1000μg多肽。精确的剂量水平能根据上述公开的内容凭经验很容易地确定。本发明范围内也包括这类组合物，该组合物包括作为活性成分的上述寡肽的有机和无机加合盐及其组合，任选与载体、稀释剂、基质或缓释包衣混合。特别令人感兴趣的是适于皮下植入、包括可生物侵蚀的基质的缓释药物形式。这些基质的例子描述于WO9222600和WO9512629。生物活性这些化合物的体内活性在十日龄的大鼠中测定，对所述大鼠用300μg／kg的剂量进行皮下注射(s．c．)，在剂量一响应研究中用不同的剂量注射，测量方法按照R．Deghenghi等在LifeScience54，1321(1994)中的详细描述。结果总结见下表，释放的GH于处理后15分钟测定。表<tablesid="table1"num="001"><table>实施例的肽剂量(μg／kgs．c．)释放的GH(ng／ml)1300155．4+／-19．72300165．4+／-18．53300174．2+／-25．9430064．2+／-12．651．2mg／kg59．4+／-12．3对照-7-23</table></tables>下面的实施例进一步阐述本发明实施例1利用E．Atherton和R．C．Sheppard在“固相肽合成”(IRLPress，OxfordUniversityPress，1984)中所描述的固相肽合成技术，用芴基甲氧碳基(Fmoc)作为保护基团，制备下式肽GAB-D-2-Mrp-D-2-Mrp-Phe-Lys-NH2，其中Mrp是2-甲基色氨酸，分子量为779．9，实测值778．4；纯度(HPLC)98．0％。实施例2用类似于实施例1的方法，合成了下列肽GAB-D-2-Mrp-D-2-Mrp-2-Mrp-Lys-NH2，其中Mrp是2-甲基色氨酸，分子量为830．8，实测值831．3；纯度(HPLC)98．0％。实施例3用类似于实施例1的方法，合成了下列肽Aib-D-2-Mrp-D-2-Mrp-NH2，其中Mrp是2-甲基色氨酸，分子量为502．6，实测值503．3；纯度(HPLC)99．0％。实施例4用类似于实施例1的方法，合成了下列肽Aib-D-2-Mrp-2-Mrp-NH2其中Mrp是2-甲基色氨酸，分子量为502．6，实测值503．3；纯度(HPLC)99．0％。实施例5用类似于实施例1的方法，合成了下列肽Aib-D-Ser(Bzl)-D-Mrp-NH2其中Mrp是2-甲基色氨酸，分子量为479．6，实测值480．5；纯度(HPLC)99．0％。权利要求1．下式的肽A-D-X-D-Mrp-B其中A是氢，2-氨基异丁酰基，4-氨基丁酰基，D代表右旋异构体，X是Mrp，其中Mrp表示下式的2-烷基色氨酸其中，R是氢，CHO，SO2CH3，1，3，5-三甲基苯-2-磺酰基，PO3(CH3)2，PO3H2；R1是C1-C3烷基；或者X是一个被保护了的丝氨酸残基，即Ser(Y)，其中Y可以是苄基，对氯苄基，4-甲氧苄基，2，4，6-三甲氧苄基，叔丁基；B是NR2R3，其中R2eR3可以相同或不同，它们是氢或C1-C3烷基；一个OR4基团，其中R4是氢或C1-C3烷基C-Lys-NH2基团，其中C是Phe或Mrp，以及所述任一种多肽与药物学上可接受的有机或无机酸形成的加合盐。2．根据权利要求1的肽，其中Mrp选自2-甲基色氨酸，2-乙基色氨酸，2-丙基色氨酸，2-异丙基色氨酸。3．根据权利要求1的肽，其中Mrp是2-甲基色氨酸。4．根据权利要求1的肽，其中A是2-氨基异丁酰基，4-氨基丁酰基。5．根据权利要求1的肽，其中B是C-LysNH2，其中C定义如上。6．根据权利要求1的肽，结构式为GAB-D-Mrp-D-Mrp-Phe-Lys-NH2。7．根据权利要求1的肽，结构式为GAB-D-Mrp-D-Mrp-Mrp-Lys-NH2。8．根据权利要求1的肽，结构式为Aib-D-Mrp-D-Mrp-NH2。9．根据权利要求1的肽，结构式为Aib-D-Mrp-Mrp-NH2。10．根据权利要求1的肽，结构式为Aib-D-Ser(Bzl)-D-Mrp-NH2。11．根据权利要求6-10的肽，其中Mrp是2-甲基色氨酸。12．权利要求1-11中的肽在制备能用于促进动物生长激素释放的药物中的应用。13．根据权利要求12的应用，其中的药物可用于人药。14．药物组合物，它包括作为活性成分的有效量的至少一种权利要求1-11的肽，该肽任选与载体和赋形剂混合。15．根据权利要求14的药物组合物，呈用于非肠道、鼻内、经口、控释给药、皮下植入的组合物形式。16．根据权利要求14的药物组合物，呈用于口服的组合物形式。全文摘要下式的肽:A－D－X－D－Mrp－B,其中A是氢,2－氨基异丁酰基,4－氨基丁酰基,D代表右旋异构体,X是Mrp,其中Mrp表示2－烷基色氨酸或X是一个被保护了的丝氨酸残基,即Ser(Y),其中Y可以是苄基,对氯苄基,4－甲氧苄基,2,4,6－三甲氧苄基,叔丁基;B是NR文档编号C07K5/00GK1204341SQ96199086公开日1999年1月6日申请日期1996年12月4日优先权日1995年12月20日发明者R·德根格希申请人:R·德根格希