专利名称:生物的冷冻保护的制作方法
本发明是关于生物样品的冷冻保护。用于本说明书中的“生物样品”这个术语，包括(真核生物和原核生物两种的)细胞，由细胞构成的器官和组织、病毒，所有这些可以是天然的或者是遗传变异或其他变异，以及生物活性分子，包括核酸、蛋白质、糖蛋白、类脂物，脂蛋白这些大分子。本发明在冷冻保护人胚和其他哺乳动物胚方面具有特殊的应用。
冷冻状态(冷冻保存)细胞的贮藏是用在长期维持细胞活力和遗传稳定性的一种通用的技术。然而，在冷冻保存样品的冷却期间所遇到的一个主要问题是含有生物样品的介质会导致过冷，此后，在低于介质的冰点时发生冰的成核。
冷冻保存介质一般含有一种冷冻保护剂，如甘油或二甲基亚砜(DMSO或Me2SO)。冷却期间，含有生物样品的介质的冰点随着冷冻保护剂的浓度而改变。例如，含有1.0、1.5和2.0MDMSO的介质(PBI)，其冰点分别约为-2.5、-3.5和-4.5℃。当这些介质，在为保存许多生物样品，包括胚胎，所需的慢速率冷却时，在介质的冰点很少发生冰的成核作用。样品可以过冷到-21℃这样低的温度。当结冰后，样品在同一容器中继续冷却时，过度的过冷对某些生物样品的存活是具有有害的效应。例如，在低于-7℃的悬浮介质中冰形成时，8-细胞的鼠胚以每分钟0.5℃的速率冷却，存活量显著下降，没有一个能在过冷到-12℃或更低的温度下存活〔参见D.G.Whittingham“哺乳动物胚的冷冻”(The Freezing of Mammalian Embryos)Elsevier(1977)第99页〕。
据信这种存活率低的原因如下在冰形成时，潜在的熔解热使样品的温度上升到近于介质的熔点。同时，水浴的温度(或其他环境)继续以一定的速率下降，因此过冷的程度越大，则结冰后立即使冷却的容器和样品之间的温差也就越大。同样，使样品冷却的速率增加而高于样品能存活的正常适宜的速率(特别是在胚胎的情况下)，直到与环境建立了热平衡为止。由实验发现〔D.G.Whittingham，在“药物和生物的低温保存”中的“胚胎保存的原理”(M.J.Ashwood-Smith和J.Farrant编辑)Pitman药物出版社，Tunbridge Wells(1980)第71页〕，加有-5℃的冰和-12℃的冰的胚胎，在达到冷却浴或其他环境温度前，分别以每分钟小于2℃和每分钟大于6℃的速率冷却。当达到冷却浴的温度后进行融化时，加有-12℃冰的胚胎仍能存活，但是在胚胎继续缓慢冷却到-80℃并转移到液氮中后，则不能存活，除非胚胎在加入冰后立即转移到另一个冷却浴以防止迅速地降温，才能存活。
在胚胎这种特殊情况下，存活取决于因脱水而收缩的量，脱水是根据冷却时，悬浮介质的水结冰而析出，使溶质浓度增加所引起的。过冷的样品直到冰形成也不会脱水，随后，生物样品(如胚胎)在达到细胞内冰形成的温度前，没有足够的时间充分脱水，即，如果在冰引入后，样品仍保留在同一个冷却浴中。
已证明，当细胞内冰的形成不变而过冷，则许多类型的细胞，不仅哺乳动物胚(虽然它们需要特别当心)都是危险的，一般来说，细胞在融化时都死亡。
目前一般有四种方法用于避免过冷的问题。样品一般立即冷却到系统冰点以下约1～2℃的温度，然后，使用以下任何一种方法使冰开始成核(a)机械振荡，(b)热电振动，(c)热振动或(d)直接加入冰晶。
机械振荡是一种消耗时间和麻烦的方法，最好尽可能避免。热电振动可以通过对含有生物样品的容器(例如，安瓿)通以电流而实现这种技术采用了Peltier热电偶效应的逆向。热振动的实施或者通过一个冷得多的表面，例如冷的金属棒，与容器的外部接触，或者通过插入一个予冷的表面，例如金属丝或玻璃棒。或者本方法最粗的是直接加入冰晶。然而，如果要冷冻许多分开的样品，则不能用这种方法。此外，因人工加入冰晶会使消毒失效。
如果将自动实现的装置加到生物冷冻器中，则所有这些方法都是昂贵的。在现有技术的人工计数部分(manual Counterparts)的情况下，冷却方法的直接调停和中断都是需要的。因此需要一种改进方法以避免过冷的严重后果及随后的成核作用。
根据本发明的第一个方面，是提供一种冷冻保存生物样品的方法，该方法包括在水溶液介质中样品与一种固体相接触而冷却，该固体不是冰也不是金属，该固体能使水在水溶液介质中，在介质的冰点或非常接近冰点时，进行成核而对样品没有明显的损害。
虽然某些损害在冷冻时必然发生，但防止过冷将尽可能减少与冰冻和其后的融化有关的损害。
虽然在实验室冰箱温度(0℃～4℃或5℃)下是固体的材料，在实际中很方便，但为了易于处理，最好的固体是在室温(20°或25℃)下为固体。这种固体可以是一种有机化合物，但在任何情况下，对生物样品来说，它一般是完全无毒的。类固醇，特别是3-羟基类固醇是最好，以及氨基酸和低聚的和多聚的氨基酸。孕烯醇酮、胆固醇、雄固醇、甲基雄固醇、17-α-雌二醇、薯蓣皂苷元是固醇中较好的，胆固醇是最好的。L-缬氨酸、L-亮氨酸、L-丙氨酸、L-脯氨酸和L-色氨酸是优选的氨基酸。从这些可以看到，优选的氨基酸具有非极性侧链。最好的多聚氨基酸包括聚-L-亮氨酸(分子量3000～15000)和聚-L-缬氨酸(分子量5000～10000)。多羟基化的芳族化合物，如间苯三酚也是很适用的。
样品一般是在有冷冻保护剂存在时进行冷却，冷冻保护剂如二甲基亚砜(DMSO)或甘油或者他们单独的或与其他冷冻保护剂相结合的混合物。
知道冰成核剂已有多年，或作为物理-化学的特殊用品或在气象学中用作凝结的引发剂。对云层凝聚的气象学目的，研究得最多的可能是无机物如碘化银，虽然在25年前Head讨论了在云层凝结操作中，使用类固醇作为冰的成核剂(Head，Nature，9th，September，1961，1058;和J.Phys.Chem.Solids，23(1962)1371)。Fukuta和Mason研究了在有机晶体上冰的外延生长〔J.Phys.Chem.Solids 24(1963)715〕，但对他们观察到的没有提出任何有价值的应用。应该指出，用有机化合物使冰成核在为气象学目的而使冰成核方面的工作中是占很小的比例。例如。由Hobbs编著的教科书“冰物理”(Clarendon Press，Oxford，1974)，几乎有1000页，而关于有机冰核的只有1或2页。在任何情况下，上述文献中甚至没有间接提出冰成核的物质，尤其是能在生物样品的冷冻保存中用于克服困难问题的有机物质。
虽然在低于冰点10℃以上的温度下能引起冰成核的固体一般能满足要求，但在本发明中所选用的固体是在低于含有生物样品的液体介质的冰点7℃以上的温度下能引起冰成核的固体。在低于冰点5℃以上或甚至低于冰点3℃或2.5℃的温度下能引起冰成核的固体更好。
一般来说，必要的或适合使用的是非毒性固体。
分散晶体状的固体，虽然最好是将固体放在惰性载体上，可以与介质(或样品本身)接触。一个非常好的实例是将固体至少部分涂在一种合适的容器，如安瓿、冷冻保存管或冷冻保存细管(straw)的内表面。用于整个冷冻保存器或至少冷冻保存器内表面的合适介质是玻璃或生物适用的聚合物，例如，诸如聚丙烯或聚氯乙烯的塑性材料。另外还有，固体可以至少部分地涂在一种颗粒状载体上，该载体可以是玻璃的或生物适用的聚合物的小球。这种小球可以用改良的葡聚糖，如CYTODEX(由Pharmacia公司购得)制成。将涂层小球加到冷冻保存介质中。在基质上固体的涂层密度一般为至少0.0007毫克/毫米2，其上限可以方便地用实践来测定。最好至少是0.001毫克/毫米2，例如，小于0.1毫克/毫米2。约0.0035毫克/毫米2是适宜的。
使固体与生物样品或其介质接触的另一个方法是在非水溶剂中以溶液状态按下方式供给固体当溶液与含有生物样品的介质混合时，固体由溶液中析出。对于某些有机化合物来说，适用的非水溶剂是乙醇或其他的醇。
然而，一般最好的供给固体的方法是将固体至少部分地涂在基质上，因此，根据本发明的第二个方面，提供一种至少部分地涂有固体的基质，该固体不是水，也不是金属，而是能使水在水溶液介质中，在介质的冰点或非常接近冰点时成核的固体，而对样品没有明显的损害。最好的基质至少是安瓿、管子、细管的内表面和玻璃或聚合物的小球。本发明第二方面的其他好的特性如第一方面一样，已作必要的修正。
在实际中，作为固体常用于冷冻保存介质中，在第三个方面，本发明也提出了用于生物样品的一种水溶液的冷冻保存介质，这种介质包括一种固体源，该固体不是冰也不是金属，该固体在水溶液介质中能使水在介质的冰点或非常接近冰点时成核，而对样品没有明显的损害。如果冷冻保存介质含有血清，则选用的固体不是L-亮氨酸。本发明第三方面的其他好的特性如第一和第二方面一样，已作必要的修正。
为了说明本发明，给出下列实施例。
实例系列Ⅰ-用有机化学药品使冰成核。
所有的化学药品来自Sigma化学药品公司。为了初始筛选使冰成核的活性，将全部化学药品都配制成5毫克/毫升，将标有星号的试剂溶于乙醇而所有其他的都溶于蒸馏水。在塑料的安瓿(Eppendorf)中加入0.1毫升溶液。将安瓿放入水浴中，对乙醇为70℃(对蒸馏水为90℃)以除去溶剂。然后将安瓿在48℃的炉上彻底干燥。在每个安瓿中加入蒸馏水(0.5毫升)，然后将安瓿放在一个保持在0℃的低温浴(Fryka kB 300)中。五分钟后达到热平衡，将该浴以每分钟0.75℃的速率冷却，用数字温度计(Comark 5000)测量浴温。在不同的浴温(-2.5°、-5°、-7.5°、和-10℃)小心地取出安瓿并用光学测定冰晶的存在。对每个测定都有5个重复样品。
结果列于表Ⅰ，其中的数据表示在任何温度下成核管数/保持液体数。
表Ⅰ例 固体 浴温(℃)-2.5 -5 -7.5 -101.1 孕烯醇酮＊0/5 0/5 4/1 5/01.2 胆固醇＊0/5 5/0 - -1.3 甲基雄固醇＊0/5 0/5 2/3 5/01.4 17-α-雌二醇＊0/5 0/5 0/5 2/31.5 雄固醇＊0/5 1/4 5/0 -1.6 睾酮＊0/5 0/5 1/4 5/01.7 薯蓣皂苷元 0/5 0/5 2/3 3/21.8 L-缬氨酸 0/5 0/5 1/4 5/01.9 L-亮氨酸 0/5 5/0 - -1.10 L-丙氨酸 0/5 0/5 2/3 5/01.11 L-脯氨酸 0/5 0/5 4/1 5/01.12 聚L-亮氨酸(分子量3000～15000) 0/5 0/5 0/5 5/01.13 聚缬氨酸(分子量5000～10000) 0/5 0/5 0/5 5/01.14 间苯三酚＊0/5 0/5 5/0 -
1.对照 未处理的对照样 0/60 0/60 1/60 17/43可以看到，上述有机化合物在蒸馏水冷却期间诱导冰的形成是有效的，并且冰的成核是在比蒸馏水中观察到的要高很多的温度下产生。还可看到，胆固醇和L-亮氨酸(实验2和9)是优选的化合物。
实例系列2-剂量反应研究。
这组实例是要说明在安瓿中对成核有效的胆固醇或亮氨酸的最小用量。除了安瓿涂有不同量的胆固醇或亮氨酸以外，全部实验细节都与第一组实例相同。结果列于表Ⅱ。
表Ⅱ例 处理 浴温(℃)-2.5 -5 -7.5 -102.1 胆固醇0 5mg 0/5 5/02.2 胆固醇0 2mg/O 0/5 2/3 5/02.3 胆固醇0 1mg 0/5 0/5 4/1 5/02.4 胆固醇0.05mg 0/5 0/5 0/5 2/32.5 亮氨酸0.5mg 0/5 5/02.6 亮氨酸0.2mg 0/5 2/3 4/1 4/12.7 亮氨酸0.1mg 0/5 3/2 5/02.8 亮氨酸0.05mg 0/5 2/3 3/2 5/02.对照 未处理的对照样 0/20 0/20 2/18 6/14可以看到，0.5毫克的亮氨酸或胆固醇在低于冰点仅5℃时，对在安瓿的蒸馏水成核凝固就有效。
实例系列3-在一般用于冷冻保存的溶液的冰成核中，胆固醇和亮氨酸的作用。
在这实例系列中，研究了在哺乳动物细胞的冷冻保存中所用的不同溶液中有机的冰成核剂对引发冰晶形成的效能。将等分溶液(0.5毫升)加到涂有胆固醇(0.5毫克)或亮氨酸(0.5毫克)的安瓿中。在0℃平衡五分钟后，将安瓿按实例Ⅰ中所述进行冷却。结果示于表Ⅲ。
表Ⅲ3.1)组织培养介质(Hanks 199×1，Flow实验室)浴温(℃)处理 -2.5 -5 -7.5 -10未处理的安瓿 0/5 0/5 0/5 1/4+胆固醇 0/5 4/1 5/0+亮氨酸 0/5 4/1 5/03.2)组织培养介质+胎牛血清(10% v/v)浴温(℃)处理 -2.5 -5 -7.5 -10 -12.5未处理的安瓿 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5+胆固醇 0/5 5/0+亮氨酸 0/5 1/4 3/2 4/1 5/03.3)组织培养介质+血清(10%v/v)+二甲亚砜(10%v/v)浴温(℃)处理 -2.5 -5 -7 5 -10 -12.5 -15未处理的安瓿 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5+胆固醇 0/5 0/5 5/0
+亮氨酸 0/5 0/5 0/5 2/3 4/1 5/03.4)组织培养介质+二甲亚砜(10% v/v)+无血清的NB。
浴温(℃)处理 -2.5 -5 -7.5 -10 -12.5未处理的安瓿 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5+胆固醇 0/5 0/5 5/0+亮氨酸 0/5 0/5 0/5 3/2 5/03.5)组织培养介质+血清(10% v/v)+甘油(10%v/v)浴温(℃)处理 -2.5 -5 -7.5 -10未处理的安瓿 0/5 0/5 0/5 0/5+胆固醇 0/5 0/5 5/0+亮氨酸 0/5 0/5 0/5 5/03.6)组织培养介质+血清(10% v/v)+甲醇(10% v/v)浴温(℃)处理 -2.5 -5 -7.5 -10 -12.5 -15未处理的安瓿 0/5 0/5 0/5 0/5 0/50 0/5+胆固醇 0/5 0/5 0/5 5/0+亮氨酸 0/5 0/5 0/5 0/5 4/1 5/03.7)组织培养介质+血清(10% v/v)+丙二醇(10% v/v)
浴温(℃)处理 -2 5 -5 -7.5 -10 -12.5 -15未处理的安瓿 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 1/4+胆固醇 0/5 0/5 3/2 5/0+亮氨酸 0/5 0/5 2/3 4/1 5/03.8)组织培养介质+血清(10% v/v)+聚乙烯吡咯烷酮(10% w/v)浴温(℃)处理 -2.5 -5 -7.5 -10未处理的安瓿 0/5 0/5 0/5 0/5+胆固醇 0/5 5/0+亮氨酸 0/5 0/5 4/1 5/0可以看到，有胎牛血清存在时，似手对亮氨酸的效用具有掩蔽作用，由于这种原因，胆固醇是优选的固体。冷冻保护剂是现有技术中常规使用的，而胆固醇在所有情况下都是有效的。
实例系列Ⅳ-在其他冷冻保存容器中的效能。
除了在聚丙烯管(Eppendorf)中有效外，在冷冻保存中普遍使用的下列其他容器的内壁涂层后，胆固醇和亮氨酸两者都将在蒸馏水中使冰成核冷冻管(NUNC，丹麦、哥本哈根)法国细管(French Straws)(法国L′Aigle，IMV)玻璃安瓿涂层一次，这样的容器可以用高压灭菌或在炉内加热干燥而灭菌。它们仍保留在冷却期间使蒸馏水和其他水溶液成核的效能。数据与在聚丙烯管中用胆固醇得到的(实例系列Ⅰ-Ⅲ)没有明显的不同。
实例系列Ⅴ-加入涂层颗粒的效能可以将胆固醇和亮氨酸两者涂层在用于细胞培养中的玻璃小球或微载体小球上面如CYTODEX(医药公司)。当将这种涂层小球加到生物溶液中，在冷却期间，它们在使冰成核中是有效的。
实例系列Ⅵ-用或不用冷冻保护剂对酵母的效果。
对啤酒酵母，使用以胆固醇处理的安瓿(每个安瓿用0.5毫克)。在每个安瓿中加入0.5毫升的24小时的细胞悬浮液，并且在不加入冰时迅速冷却到液氮的温度。在融化时，稀释细胞悬浮液，并通过在琼脂上形成菌落的能力测定存活力，每个实验用5个安瓿，由每个安瓿的5个重复样品的平均值测定存活力。回收率(%)是a)不加冷冻保护剂未处理的安瓿 5.2+/-0.7%处理的安瓿 10.4+/-1.2%b)有甘油存在时 (1% v/v)未处理的安瓿 35.5+/-4.4%处理的安瓿 55.7+/-3.7%实例系列Ⅶ-对人胚的效果。
使用多原核人胚(Multipronucleate)，并在有冷冻保护剂丙二醇存在时，冷冻到液氮的温度。每管用1胚，不加入冰。在融化时通过在组织培养中分成4个细胞的能力来测定存活力。当使用没有处理的安瓿时，6个中有2个能回收，当使用处理的安瓿时，则12个中有10个能回收。所用的安瓿与实例系列Ⅵ的一样。
权利要求
1.一种冷冻保存生物样品的方法，包括在水溶液介质中与一种固体相接触而冷却样品，该固体不是冰也不是金属，该固体在水溶液介质中能使水在介质的冰点或非常接近冰点时成核，而对样品没有明显损害。
2.如权利要求
1所要求的方法，其中的固体，在室温(20°或25℃)时是固体，或者在实验室冰箱温度(0°～4或5℃)时是固体。
3.如权利要求
1或2所要求的方法，其中的固体是对生物样品完全无毒的一种有机化合物。
4.如权利要求
1.2或3中所要求的方法，其中的固体是一种类固醇、氨基酸或一种低聚或多聚的氨基酸，或者多羟基化的芳族化合物。
5.如权利要求
1.2.3或4中所要求的方法，其中的固体是孕烯醇酮、雄固醇、甲基雄固醇、17-α-雌二醇或薯蓣皂苷元、L-缬氨酸、L-亮氨酸、L-丙氨酸、L-脯氨酸或L-色氨酸、聚-L-亮氨酸(分子量3000～15000)和聚-L-缬氨酸(分子量5000～10000)或间苯三酚。
6.如权利要求
1至4中任一项所要求的方法，其中固体是胆固醇。
7.如权利要求
1至6中任一项所要求的方法，其中样品是在有主要的冷冻保护剂，或其单独的或与其他的冷冻保护剂相结合的混合物存在时进行冷却。
8.如权利要求
7所要求的方法，其中主要冷冻保护剂是二甲基亚砜或甘油。
9.如权利要求
1至8中任一项所要求的方法，其中的固体是能在含有生物样品的水溶液介质冰点下10℃以上的温度时使冰成核。
10.如权利要求
1至9的任一项所要求的方法，其中的固体是载在基质上而与介质(或样品本身)进行接触。
11.如权利要求
1至10的任一项所要求的方法，其中的固体至少部分地涂在一种合适于冷冻的容器的内表面。
12.如权利要求
11所要求的方法，其中容器是一种安瓿，一种冷冻保存管或一种冷冻保存细管。
13.如权利要求
1至12的任一项所要求的方法，其中固体是至少部分地涂在一种颗粒载体上。
14.如权利要求
13所要求的方法，其中载体是玻璃的或生物适用的聚合物小球。
15.如权利要求
10至14中任一项所要求的方法，其中在基质上的固体涂层密度至少是0.0007毫克/平方毫米。
16.如权利要求
15中所要求的方法，其中涂层的密度是0.001毫克/平方毫米～小于0.1毫克/平方毫米。
17.一种至少部分涂有固体的基质，该固体不是冰也不是金属，该固体在水溶液介质中能使水在介质的冰点或非常接近冰点时成核，而对样品没有明显损害。
18.一种用于生物样品的水溶液冷冻保存介质，该介质包括一种固体源，它不是冰也不是金属，该固体源在水溶液介质中能使水在介质冰点或非常接近冰点时成核，而对样品没有明显的损害。
专利摘要
在一种有特殊的有机固体，理想的是胆固醇，存在的水溶液介质中进行冷冻，生物样品特别是哺乳动物的细胞能够冷冻、贮存和溶化，并能增加生存百分率。这种有机固体在介质的冰点或接近冰点时能引起成核作用，从而减少损伤。理想的介质也含有一种冷冻保护剂，如二甲基亚砜或甘油。
文档编号C12N1/04GK87104158SQ87104158
公开日1988年2月17日 申请日期1987年5月15日
发明者乔治·约翰·莫里斯, 米歇尔·约翰·阿什伍德·史密斯 申请人:赛尔系统有限公司, 布恩霍尔有限公司导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan