专利名称：急性b淋巴细胞白血病启动细胞表型分类试剂盒及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于细胞表型确认过程中的专用试剂盒结构设计，具体涉及一种检测急性B淋巴细胞白血病启动细胞表型分类的试剂盒及其应用。
背景技术：
急性淋巴细胞白血病(Acute lymphoblastic leukemia, ALL)是全球高发的血液系统恶性肿瘤之一，是严重危害人民身体健康、尤其是儿童和青壮年人群的重大疾病，提高其根治率具有重大意义。近半个世纪以来治疗方案的优化已使儿童ALL的诱导缓解率和长期生存率得到了显著提高，5年无病生存率(Disease-Free Survival，简称DFS)已达到70-80%，但是成人ALL的5年DFS始终在30%左右徘徊。复发是ALL患者治疗失败的主要原因，是影响ALL患者长期生存的重要问题。复发后的长期化疗及造血干细胞移植等巨额的医疗费用给社会和家庭都造成了极其沉重的精神和经济负担，是对医疗行业和国家医疗保障制度的严峻考验。因此，积极探索易于检测并且特异性表达的新标记用于ALL复发预测，对于改善ALL患者的长期预后具有重要意义。越来越多的实验证据表明白血病干细胞(leukemia stem cells,简称LSCs)是白血病启动、复发与耐药的根源。那些能够在免疫缺陷小鼠体内长期重建白血病并且具有自我更新能力的细胞称为白血病启动细胞(leukemia initiating cells, LICs),基本等同于LSCs。在前期工作中，利用新生期N0D/SCID/IL2r Ynul1小鼠异种移植模型首次鉴定出⑶34+CD19+细胞为急性B淋巴细胞白血病(简称B-ALL)患者的LICs。但是，为了将B-ALL患者的LICs与正常B祖细胞鉴定开来并进行分类，找到LICs特异性表面标记及其处理步骤与方法，目前国内外尚未见报道。因此，这是一个关键的课题，涉及到急性B淋巴细胞白血病临床治疗方案的制定是否更加科学、高效与个体化。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种对急性B淋巴细胞白血病启动细胞表型分类试剂盒产品的结构设计及其操作步骤，利用该试剂盒中的专用试剂和配套的使用方法、并借助七色流式细胞仪的辅助，可以快速、准确地测定LICs表型，将对急性B淋巴细胞白血病患者LICs表型的快速、准确分类以及对患者的预后判断和临床治疗方案的制定具有重要的指导意义。为了解决上述技术问题，本发明采取的技术方案I是:
一种急性B淋巴细胞白血病启动细胞表型分类试剂盒，与七色流式细胞仪组成白血病启动细胞表型分类装备，该试剂盒的结构中配置了下述单克隆抗体试剂:CD58、CD10、CD34、CD19、CD45 和 CD38。所述单克隆抗体试剂⑶58、⑶10、⑶34、⑶19、⑶45和⑶38依前后排列顺序依次进行特异性荧光素标记为:FITC、PE、PerCP, APC_Cy7、Pacific Blue 和 APC。本发明还提供了一种借助于上述试剂盒和七色流式细胞仪对急性B淋巴细胞白血病启动细胞进行表型分类的方法，该方法中包括下述步骤:
步骤一、试剂配制
1.1、配制pH为7.2 7.4的1OXPBS缓冲液，并稀释10倍成为1 XPBS缓冲液，
1.2、取溶红细胞液，并用1XPBS缓冲液稀释10倍，
1.3、取小牛血清加入至1 XPBS缓冲液中，制备含0.5wt.9T2wt.%血清的PBS ；
步骤二、对骨髓标本进行荧光标记，制备测试标本
2.1在同一专用试管中，依次分别加入荧光标记的单克隆抗体如下:3μl CD58FITC，10 μ L CD10PE, 1 μ L CD34 PerCP, 2 μ LCD38APC, 5 μ L CD19APC_Cy7 和 1.3 μ L CD45PacificBlue ;然后再加入100 μ L骨髓标本,混匀，室温避光放置15分钟孵育，
2.2、加入步骤1.2中稀释后的溶红细胞液2mL，混匀后避光，室温放置8分钟，溶解红细胞，
2.3、1500转/分离心5分钟，弃上清液，加入步骤1.3中2mL含0.5wt.%"2wt.%血清的PBS，混匀，
2.4、1500转/分离心5分钟，弃上清液，加入步骤1.1中0.3mLl X PBS缓冲液，混匀，制成待测标本；
步骤三、按照七色流式细胞仪的操作要求对待测标本进行处理后检测，获得特异性荧光标记的骨髓细胞数据，借助仪器统计与分析软件确定骨髓样品中白血病启动细胞上CD58的表达比例,作为白血病启动细胞表型分类的主要依据。本发明的试剂盒中配备了 6种带有荧光标记的单克隆抗体，由于每种单克隆抗体可供选择的荧光素具有数种，当选择不同荧光素进行标记时，其检测白血病启动细胞的特异性和敏感性是不同的，而且6种单克隆抗体分别采用不同的荧光素组合进行标记时，流式细胞仪能否有效地检测出白血病启动细胞也是未知的。本发明通过大量的创造性劳动对6种单克隆抗体的最佳荧光标记组合进行探索，并采用七色流式细胞仪一次即可实现对白血病启动细胞的准确、快速分型，从而准确地确定白血病启动细胞上CD58的表达比例。采用本发明的试剂盒、并借助七色流式细胞仪检测初诊B-ALL患者的肝素抗凝骨髓LICs (⑶34+⑶19+细胞)上⑶58的表达，并将⑶58在LICs上表达比例彡20%定义为⑶58+LICs，〈20%定义为⑶58—LICs，通过临床试验和统计学分析，结果表明:139例初诊B-ALL患者中，⑶58_LIC组的完全缓解率明显低于⑶58+LIC组UKQ.0001);两年累积复发率(Cumulative incidence of relapse,简称 CIR)CD58UC 组明显高于 CD58+LIC 组(72.00%土 1.30% vs.18.20% 土 0.15%, /X0.0001);两年无病生存率 CD58UC 组较 CD58+LIC 组明显降低(28.00% ± 10.58% vs.77.95% ± 4.36%, /X0.0001);多因素预后分析提示初诊时⑶58_LICs是B-ALL患者复发和无病生存的独立预后因素。从本发明所测得的⑶58在LICs上表达比例虽然不能够直接得出诊断结果或者健康状况，但其作为中间结果可以作为B-ALL患者的临床治疗方案制定的参考信息之一。采用本发明产生的有益效果在于:(1)采用本发明的试剂盒可快速、准确地检测初诊为B-ALL患者骨髓白血病启动细胞的免疫表型，为白血病启动细胞的表型分类提供了一种可靠的新的荧光标记的单克隆抗体组合；(2)采用本发明的试剂盒所检测的白血病启动细胞上⑶58表达比例可作为B-ALL患者的预后指标之一，对于B-ALL患者的预后判断以及临床治疗方案的制定具有重要的指导意义。
图1Al分别是按照复发、年龄、NCCN危险度分层以及白细胞计数进行亚组分析，初诊时不同亚组B-ALL患者白血病启动细胞上⑶58表达比例的差异；
图2A>分别是所有B-ALL患者以及按照儿童、成人、化疗、异基因造血干细胞移植、NCCN危险度分层进行亚组分析，B-ALL患者累积复发率与白血病启动细胞上⑶58表达状态的相关性结果；
图3A>分别是所有B-ALL患者以及按照儿童、成人、化疗、异基因造血干细胞移植、NCCN危险度分层进行亚组分析，B-ALL患者无病生存率与白血病启动细胞上⑶58表达状态的相关性结果；
图4A>分别是所有B-ALL患者以及按照儿童、成人、化疗、异基因造血干细胞移植、NCCN危险度分层进行亚组分析，B-ALL患者无病生存率与白血病启动细胞上⑶58表达状态的相关性结果。
具体实施例方式本发明提供一种急性B淋巴细胞白血病启动细胞表型分类试剂盒，其包括下列荧光标记的单克隆抗体试剂:⑶58、⑶10、⑶34、⑶19、⑶45和⑶38，分别依次对应下列荧光标记FITC、PE、PerCP, APC_Cy7、Pacific Blue和APC。各单克隆抗体的荧光标记及成分等信息参见表I。表I流式单克隆抗体信息
权利要求
1.一种急性B淋巴细胞白血病启动细胞表型分类试剂盒，与七色流式细胞仪组成白血病启动细胞表型分类装备，其特征在于该试剂盒的结构中配置了下述单克隆抗体试剂:CD58、CD10、CD34、CD19、CD45 和 CD38。
2.根据权利要求1所述的急性B淋巴细胞白血病启动细胞表型分类试剂盒，其特征在于所述单克隆抗体试剂⑶58、⑶10、⑶34、⑶19、⑶45和⑶38依前后排列顺序依次进行特异性荧光素标记为:FITC、PE、PerCP, APC_Cy7、Pacific Blue 和 APC。
3.根据权利要求2所述的急性B淋巴细胞白血病启动细胞表型分类试剂盒，其特征在于所述试剂盒中还设置了溶红细胞液和PH为7.2 .4的.10XPBS缓冲液。
4.根据权利要求2所述的急性B淋巴细胞白血病启动细胞表型分类试剂盒，其特征在于所述 10 X PBS 缓冲液的配制方法:称取 Na2HPO4.12H20 26.3g,NaH2PO4.2H203.0g 和 NaCl.85.0g于容量瓶中，加蒸馏水至IOOOmL:取配套容量的缓冲剂封装后装入试剂盒待用。
5.根据权利要求2所述的急性B淋巴细胞白血病启动细胞表型分类试剂盒，其特征在于所述试剂盒中还设置了配套计量的小牛血清试剂。
6.根据权利要求2所述的急性B淋巴细胞白血病启动细胞表型分类试剂盒，其特征在于所述试剂盒中还设置了与七色流式细胞仪配套使用的专用试管、使用该试管与借助七色流式细胞仪配合完成急性B淋巴细胞白血病启动细胞表型分类的步骤与注意事项的说明书。
7.借助于权利要求1所述的试剂盒和七色流式细胞仪对急性B淋巴细胞白血病启动细胞进行表型分类的方法，其特征在于该方法中包括下述步骤: 步骤一、试剂配制 .1.1、配制pH为7.2 7.4的10XPBS缓冲液，并稀释10倍成为I XPBS缓冲液， .1.2、取溶红细胞液，并用IXPBS缓冲液稀释10倍， .1.3、取小牛血清加入至I XPBS缓冲液中，制备含.0.5wt.9T2wt.%血清的PBS ； 步骤二、对骨髓标本进行荧光标记，制备测试标本 .2.1在同一专用试管中，依次分别加入荧光标记的单克隆抗体如下:3yL⑶58FITC，.10 μ L CD10PE, I μ L CD34 PerCP, 2 μ LCD38APC, 5 μ L CD19APC_Cy7 和 1.3 μ L CD45PacificBlue ;然后再加入100 μ L骨髓标本,混匀，室温避光放置15分钟孵育， .2.2、加入步骤1.2中稀释后的溶红细胞液2mL，混匀后避光，室温放置8分钟，溶解红细胞， .2.3、1500转/分离心5分钟，弃上清液，加入步骤1.3中2mL含0.5wt.%"2wt.%血清的PBS，混匀， .2.4、1500转/分离心5分钟，弃上清液，加入步骤1.1中.0.3mLl X PBS缓冲液，混匀，制成待测标本； 步骤三、按照七色流式细胞仪的操作要求对待测标本进行处理后检测，获得特异性荧光标记的骨髓细胞数据，借助仪器统计与分析软件确定骨髓样品中白血病启动细胞上CD58的表达比例,作为白血病启动细胞表型分类的主要依据。
全文摘要
本发明公开了一种急性B淋巴细胞白血病启动细胞表型分类试剂盒，与七色流式细胞仪配合使用，该试剂盒的结构中配备了下述荧光标记的单克隆抗体CD58FITC，CD10PE，CD34PerCP，CD38APC，CD19APC-Cy7和CD45PacificBlue。本发明的试剂盒可快速、准确地检测初诊B-ALL患者白血病启动细胞的免疫表型；采用本发明的试剂盒所测定的白血病启动细胞上CD58表达比例可作为B-ALL患者的预后指标之一，对于B-ALL患者的预后判断以及临床治疗方案的制定具有重要的指导意义。
文档编号G01N33/577GK103175966SQ201210425968
公开日2013年6月26日 申请日期2012年10月31日 优先权日2012年10月31日
发明者黄晓军, 孔圆, 刘艳荣, 江倩, 江浩, 王亚哲, 主鸿鹄, 郝乐, 常艳, 刘代红, 许兰平, 刘开彦 申请人:北京大学人民医院