专利名称:人体胰岛素前体转化为人体胰岛素的方法
几年来人们已经认识到用胰蛋白酶和羧肽酶B使胰岛素原转化为胰岛素的能力〔参阅Kemmler，W.，Clark J.L.，Borg.J.and Steiner，D.F.，Fed.Proc.30 1210页(1971);Kemmler，w.，Peterson，J.D.，and Steiner，D.F.，J.Biol.Chem.，246 6786-6791页(1971)〕。应用这种转化的方法，在进行中迂到的困难是，并且继续是在反应混合物中存在大量难以去除的副产品。更具体来说，在人体胰岛素原转化为人体胰岛素中，形成大量脱苏氨酸(B30)人体胰岛素〔Des-Thr(B30)-hI〕(约4～6%)。这种由于不带单个末端氨基酸而有别于人体胰岛素的副产物，即使真能从反应混合物中分离出来，其分离方法是困难而麻烦的。
随着重组DNA技术的出现，使首次人工合成大量胰岛素原成为现实。在生产胰岛素使用人体胰岛素原作为中间产物时Des-Thr(B30)-hI杂质问题必需解决，人们或是寻求从污染的Des-Thr(B30)-hI中使人体胰岛素纯化的方法或是寻求在转化方法中将Des-Thr(B30)-hI的形成减到最少的条件。本发明指引使人体胰岛素前体转化为有极少的Des-Thr(B30)-hI形成的人体胰岛素的一种新方法。
因此，本发明目的在于提供使人体胰岛素前体转化为人体胰岛素的方法。这种前体具有下面的化学式
式中R是氢、用化学或酶促法可切割的氨基酸残基，或者用化学或酶促法可切割的至少带有两个氨基酸残基的肽部分;
R1是OH、Arg-Y，或Lys-Y，其中Y是OH、氨基酸残基，或者至少含有两个氨基酸残基的肽部分;从A-1至A-21部分是人体胰岛素A链;从B-1至B-30部分是人体胰岛素B链;以及X是胰岛素A-链上A-1的氨基与胰岛素B链上B-30的羧基之间相互连接的部分，这部分可被酶促地从A-链和B-链上裂下而不破坏A链和B链，它包括在水介质中用胰蛋白酶和羧肽酶B处理这种人体胰岛素前体，在该水介质中每摩尔人体胰岛素前体约有0.1至10摩尔的一种或多种金属离子，这些金属具有原子序数21至34、39至52、57至84和89至92。
正如所指出的，本发明的方法显示出增强了公认的用胰蛋白酶和羧肽酶B将胰岛素原转化为胰岛素的作用。该方法用于上述化学式的人体胰岛素前体。尤以人体胰岛素原本身为最佳。
本文所用的“人体胰岛素前体”一词是指下述分子(1)含人体胰岛素A链和人体胰岛素B链，(2)至少具有通过分别在A-链和B-链上的(a)A-6和A-11，(b)A-7和B-7(c)A-20和B-19上的每个Cys部分的硫相连接的三个二硫键，以及(3)具有与胰岛素A链的A-1氨基与胰岛素B链的B-30羧基连接的可除去连接部分。
R是氢、氨基酸残基，或至少具有两个氨基酸残基的肽部分。其中在R是氨基酸残基或肽部分的情况下，R是可从没有损失残余胰岛素完整结构的胰岛素前体产物切割的基。众多氨基酸残基或肽部分之任一种都限制在基团R的定义范围内。可切割的氨基酸残基的实例是碱性氨基酸，如精氨酸(Arg)或赖氨酸(Lys)及由这些氨基酸残基的羧基终止的肽部分。这些氨基酸残基被公认为在用蛋白水解酶胰蛋白酶处理时易于被切下。可切割的氨基酸残基的又一实例是蛋酸(Met)，还有在其羧基末端具有Met的肽部分。通过用溴化氰处理可去除这些残基。再一实例是色氨酸(Trp)或在其羧基末端含Trp的肽部分。用N-溴丁二酰亚胺处理，可去除这种残基。
基团R1是羟基、精氨酸、赖氨酸或在氨基末端具有精氨酸或赖氨酸的肽。当R1是精氨酸、赖氨酸、或在氨基末端具有的任何一个这些残基的肽时，在本发明方法的条件下，氨基酸或肽。会被切下同时形成R1是羟基的产物。
胰岛素前体的连接部分X可以是各种结构之任一种，以X部分是多肽为最佳。多肽一般至少有2个氨基酸残基，更好为约2至35个氨基酸残基，以约6至35个氨基酸残基为最佳。X部分与A链上A-1的氨基和与B链上B-30的羧基相连接。最佳情况是当连接部分X是肽时，是人体胰岛素原的天然连接肽，这种连接肽具有下述化学式
-Arg-Arg-Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-Gln-Val-Gly-Gln-Val-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-Gln-Lys-Arg-.
尽管最好使用如以上所示的天然连接序列，但短得多的肽序列可用于连接肽，只是要求(1)他们的长度足以使A链和B链间形成合适的二硫键，(2)随着胰岛素的形成它们可以从胰岛素前体上裂下。可使用的典型二肽是-Arg-Arg-。此外，可方便地采用具有式-Arg-X-Arg-的改进的上述二肽，(其中X至少表示1个氨基酸残基)。最佳连接的肽是-Arg-Arg-Lys-Arg-及具有结构-Arg-Arg-X2-Lys-Arg-的较长链的肽，其中X2至少是1个氨基酸残基，最佳为至少2个氨基酸残基。当然，后者包括天然的连接肽。
本发明的方法是在水介质中进行的。水介质一词“要求有水存在，然而不排除有与水易混溶的有机溶剂，如甲醇、乙醇、丙酮、N，N-二甲基甲酰胺等存在。人体胰岛素前体存在于介质中的浓度不超过约20毫克分子。最佳的是人体胰岛素前体的浓度基本上较低，一般约0.1毫克分子至10毫克分子，较好为约0.5至5毫克分子，最佳为约1至3毫克分子。
可在任意温度范围下进行转化，一般在约0℃至40℃，进行反应的较好温度约4℃至25℃，最佳为约10℃至15℃。
反应混合物的pH可在4至12的任意值。然而，通过严格控制pH为6至9，最好在约7至8下进行，当精确控制时，在约7.2至7.6时可得到最好结果。
一般通过使用缓冲剂来帮助控制pH值，可采用任意一种pH范围广的典型的缓冲剂。适宜的缓冲剂的例是TRIS(三羟甲基氨基甲烷)、乙二胺、三乙醇胺、甘氨酸、HEPES(N-2-羟基-乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸)等。
所用胰蛋白酶和羧肽酶B的量一般与这两种酶和人体胰岛素前体的量都有关。这些酶或可加到反应混合物的溶液中，或用已知的技术，可固定在适宜的载体上，从而可在反应介质中起作用。
根据重量∶重量计，通常所存在的羧肽酶B相对于人体胰岛素前体的量约1∶10至约1∶5000，较好为约1∶500至约1∶3500，最佳为约1∶1000至约1∶3000。
根据重量∶重量计，通常所存在的胰蛋白酶相对于人体胰岛素前体的量约1∶20至约1∶250000，较好为约1∶300至1∶20000，最佳为约1∶5000至1∶15000。
在反应混合物中羧肽酶B对胰蛋白酶的比率也是一个重量参数。一般以重量计，羧肽酶B对胰蛋白酶的比率约为1∶1至约10∶1，最好为约2∶1至约5∶1。
构成本发明基础的关键发现在于找到了在一种或多种广泛的一定量的金属离子，显著地减低了在反应中形成Des-Thr(B30)-hI的量。
虽然某些金属离子是非常好的，但业已发现这些金属离子在一个广范围内都是可以应用的。可以采用的是以下金属的离子钪(Sc)、钛(Ti)、钒(V)、铬(Cr)、锰(Mn)、铁(Fe)、钴(Co)、镍(Ni)、铜(Cu)、锌(Zn)、镓(Ga)、锗(Ge)、砷(As)、硒(Se)、钇(Y)、锆(Zr)、铌(Nb)、钼(Mo)、锝(Tc)、钌(Ru)、铑(Rh)、钯(Pd)、银(Ag)、镉(Cd)、铟(In)、锡(Sn)、锑(Sb)、碲(Te)、镧(La)、铈(Ce)、镨(Pr)、钕(Nd)、钷(Pm)、钐(Sm)、铕(Eu)、钆(Gd)、铽(Tb)、镝(Dy)、钬(Ho)、铒(Er)、铥(Tm)、镱(Yd)、镥(Lu)、铪(Hf)、钽(Ta)、钨(W)、铼(Re)、锇(Os)、铱(Ir)、铂(Pt)、金(Au)、汞(Hg)、铊(Tl)、铅(pb)、铋(Bi)、钋(Po)、锕(Ac)、钍(Th)、镤(Pa)和铀(U)。
虽然在本发明方法中可使用上述金属的任何离子，但在缩小的范围内最好的小类并因此而增加的选择机会如下(1)铬、钼、钨、汞、锑、铋、镍、铁、钴、锌、镉、铜、锡、铅、铕、铀、铂和锰。
(2)镍、铁、钴、锌、镉、铜、锡、铅、铕、铀、铂或锰。
(3)镍、锌、钴和镉。
(4)镍和锌。
(5)镍。
根据本发明方法，将上述金属中的一种或多种离子加到人体胰岛素前体反应混合物中，上述金属的离子聚集于反应混合物中的量为每摩尔人体胰岛素前体约0.1至约10摩尔。所用的实际量最好是上述范围的较低值，一般为每摩尔人体胰岛素前体约0.1至2摩尔，最好为每摩尔人体胰岛素前体0.3至1摩尔，理想量为每摩尔人体胰岛素前体约0.33至0.6摩尔。
转化反应一般进行约2至48小时，通常约为8至16小时。可用高效液相色谱法监测该反应，注意使反应时间与人体胰岛素的产生相协调。
本发明另一方面完全意想不到的发现，是将另一类金属之一种或多种金属离子加入反应混合物中，可进一步减少产生Des-Thr(B30)-hI的量。当第一类金属离子的量为每摩尔人体胰岛素前体约0.1至0.6摩尔时，这种进一步的改进特别明显。加入选自铍、镁、钙、锶、钡和镭等金属的一定量的离子是非常有利的。以钙、钡、锶或镁离子为好，尤以钙为最佳。
第二类金属离子的量为每摩尔人体胰岛素前体约0.5至5摩尔，而以每摩尔人体胰岛素前体约1至3摩尔为最佳。
以上所述的第二类金属离子的用途最意想不到的是已知第二类的离子特别是钙使胰蛋白酶稳定，但当它在无第一类金属离子的情况下使用时，值得注意的是确实增加了Des-Thr(B30)的产量。
典型的是在水介质中溶解人体胰岛素前体来实施本发明方法。最终混合物浓度一般约1毫克分子至3毫克分子，约pH8。然后加入第二类金属离子(如果采用的话)。当采用上述人体胰岛素前体的浓度时，典型的是将氯化钙加至约5毫克分子浓度。然后将第一类金属的离子〔典型的是Ni(Ⅱ)的离子〕加至浓度为每摩尔人体胰岛素前体约0.5摩尔，调节混合物pH至7.3～7.5，加入羧肽酶B(约1∶2500重量/重量人体胰岛素前体)，再加上胰蛋白酶(约1∶12500重量/重量人体胰岛素前体)。该混合物维持在约12℃条件下，可进行反应，通过高效液相色谱法严格监测该反应的进程。
下面提供的实施例说明本发明方法的效能，但并不限制本发明范围。
实施例1各种浓度的胰蛋白酶和羧肽酶B的效能将人体胰岛素原(hPI)溶于20毫摩尔乙二胺(EDA)缓冲液中，pH7.0，浓度为10.85克/升，将该混合物分成两份，把猪胰羧肽酶B(CpB)加到第一份中至最终浓度为3.74毫克/升。这份溶液被分成6份，每份1毫升，分别加入用甲苯磺酰基苯丙氨酰氯甲基酮(胰蛋白酶-TPCK)预处理过的牛胰胰蛋白酶1.0、1.4、1.8、2.8、3.6和5.4毫克/升，每份样品在23℃保温8小时。用高效液相色谱法(HPLC)测定Des-Thr(B30)-hI含量，结果示于表1。
第二份hPI溶液被分成5份，每份1毫升，将CpB分别加至浓度1.1、1.5、2.2、3.7和5.4毫克/升。然后，将胰蛋白酶-TPCK加到每一份至浓度为2.71毫克/升，每份样品在23℃保温8小时，结果示于表2。
在表1和表2中，用HPLC测定Des-Thr(B30)-hI的量用hI百分率表示。如数据显示，在CpB的固定含量下，Des-Thr(B30)-hI由于胰蛋白酶含量的降低而减少。相反，在胰蛋白酶的固定含量下，增加CpB的含量导致Des-Thr(B30)-hI含量的降低。
表1胰蛋白酶含量增加对hPI转化作用的影响CpB，毫克/升 胰蛋白酶，毫克/升 Des-Thr(B30)-hI%(以hI%计)3.7 1.0 2.43.7 1.4 2.63.7 1.8 2.73.7 2.8 3.33.7 3.6 3.93.7 5.4 5.1表2CpB含量增加对hPI转化作用的影响CpB，毫克/升 胰蛋白酶，毫克/升 Des-Thr(B30)-hI%(以hI%计)1.1 2.71 4.81.5 2.71 4.02.2 2.71 4.13.7 2.71 3.45.4 2.71 2.6
实施例2温度对Des-Thr(B30)-hI生成的影响将hPI(60毫克)溶于20毫克分子乙二胺(6.0毫升)中，pH7.5～8.0，依次加入猪羧肽酶B和牛胰蛋白酶-TPCK，以提供底物(hPI)与酶比率即hPI∶CpB∶胰蛋白酶-TPCK为5000∶1∶1(重量/重量)。2毫升为一份，在12、24和37℃保温，通过HPLC测量达到最高hI产率所需的保温时间分别为14、6和4小时。如表3中所示结果，温度较低有利于较少的Des-Thr(B30)-hI形成。
表3温度影响保温温度℃ Des-Thr(B30)-hI%(以hI%计)12 4.424 ＞737 ＞9实施例3金属对衍生物形成的影响将hPI(360毫克)溶于20毫升20毫克分子甘氨酸中，pH7.65。该溶液分成两份，每份10.0毫升，将5毫克分子钙离子加到1份中，每一份再分成3部分，按下述处理含钙离子部分和无钙离子部分对一组，加入锌离子，得到相对于hPI的0.33摩尔比。对另一组，加入镍离子，得到相对于hPI为0.36摩尔比。将酶加到全部混合物中，得到下述重量比hPI∶CpB∶胰蛋白酶-TPCK为13500∶5∶1。每种混合物的pH调至7.65～7.7，在12℃保温16小时，其结果示于表4，说明镍和锌对减少Des-Thr(B30)-hI形成的影响。他们进一步说明用钙能增加这种影响。
表4
金属对hPI转化作用的影响金属离子 Des-Thr(B30)-hI%，以hI%计无 4.0Ca 7.6Zn 1.6Ni 1.7Zn+Ca 0.7Ni+Ca ＜0.2＊＊分析少于0.20%hI可测出的极限。
实施例4各种Ni(Ⅲ)浓度对hPI转化反应中衍生物形成的影响将hPI(245毫克)溶于12.0毫升50毫克分子甘氨酸，pH7.4。加入1克分子CaCl2储液的钙离子，得到最终的Ca(Ⅱ)浓度为5毫克分子。把0.11克分子NiCl2储液的镍(Ⅱ)加到2毫升的各等份中，得到的样品对hPI的各个摩尔比为0、0.24、0.37、0.44、0.51和0.58。将CpB加到每个管内，得到7.4微克/毫升(4.87毫克/毫升储液)，接着加入胰蛋白酶-TPCK，得到最终浓度为2.96微克/毫升(1.0毫克/毫升储液)。全部样品的pH调至7.40，每个样品都在12℃保温，在12小时后停止反应，测定Des-Thr(B30)-hI和hI的含量，结果示于表5，说明镍的增加导致Des-Thr(B30)-hI的生成减少。
表5各种Ni(Ⅱ)浓度的影响摩尔比 Des-Thr(B30)-hI%Ni(Ⅱ)/hPI (以hI%计)0 7.6
0.24 1.90.37 0.610.44 0.720.51 0.330.58 0.28实施例5各种金属阳离子对hPI转化反应中衍生物生成的影响hPI(936毫克)溶于36毫升5毫克分子甘氨酸，并调至pH7.8～8.0，加入CaCl2(1克分子储液)的钙离子至5毫克分子。每份除去3毫升，在表6所示浓度下加入各种金属离子。在12℃下平衡以后，加入酶得到hPI∶CpB∶胰蛋白酶-TPCK的重量比为13500∶5∶1。
这些样品在12℃保温12小时，测定hI和Des-Thr(B30)-hI，示于表6的结果表示各种金属离子之任一种都能减少Des-Thr(B30)-hI的形成。
表6各种二价阳离子的影响二价金属离子 摩尔比M(Ⅱ)/hPI Des-Thr(B30)-hI%(以hI%计)Zn 0.3 1.02Zn 0.5 0.78Ni 0.22 2.29Ni 0.37 0.72Co 0.26 2.35Co 0.43 0.89Cd 0.19 1.63Cd 0.31 0.88
Cu 0.14 3.23Cu 0.23 1.34实施例6用Ni(Ⅱ)和Ca(Ⅱ)大量转化hPI冷却溶于15毫克分子甘氨酸缓冲液，pH7.4(33.0升)的hPI(448.5克)，并保持在12℃。加入1.0克分子CaCl2储液(0.165升)使钙(Ⅱ)加入至5毫克分子。搅拌10分钟后，加入固体NiCl2·6H2O(5.0克)使加入的镍(Ⅱ)达Ni(Ⅱ)∶hpI摩尔比为0.44∶1。再缓慢搅拌该溶液10分钟，加入4.87毫克/毫升储液的CpB(36.8毫升，179.4毫克)。然后，加入1.0毫克/毫升储液的胰蛋白酶-TPCK(35.9毫升，35.9毫克)，按测量hI的最大产量，10小时内完成该反应。在最高含量时，该混合物含约0.29% Des-Thr(B30)-hI，接近测定本化合物方法的测定极限。
权利要求
1.一种使人体胰岛素前体转化为人体胰岛素的方法，这种前体的化学式为
式中R是氢、用化学的或酶促的方法可切开的氨基酸残基，或者用化学的或酶促的方法可切开的至少含有两个氨基酸残基的肽部分；R1是OH、Arg-Y，或Lys-Y，其中Y是OH、氨基酸残基，或者至少含有两个氨基酸残基的肽部分；从A-1至A-21部分是人体胰岛素A链；从B-1至B-30部分是人体胰岛素A链；从B-1至B-30部分是人体胰岛素B链；以及X是与胰岛素A链上A-1的氨基和胰岛素B链上B-30的羧基相连接的部分，这部分可以被酶促地从A链或B链上切开而且不破坏A链和B链，它包括在水介质中用胰蛋白酶和羧肽酶B处理这种人体胰岛素前体，该水介质含每摩尔人体胰岛素前体约0.1至10摩尔1种或多种具有原子序数21至34、39至52、57至84和89至92的金属离子。
2.根据权利要求
1的方法，其中金属离子是选自金属铬、钼、钨、汞、锑、铋、镍、铁、钴、锌、镉、铜、锡、铅、铕、铀、铂和锰的金属离子。
3.根据权利要求
2的方法，其中金属离子是选自金属镍、铁、钴、锌、镉、铜、锡、铅、铕、铀、铂或锰的金属离子。
4.根据权利要求
3的方法，其中金属离子是选自金属镍、锌、钴和镉的金属离子。
5.根据权利要求
1至4之任一项所述方法，其中人体胰岛素前体在水介质中的浓度可高达20毫克分子左右。
6.根据权利要求
5的方法，其中人体胰岛素前体在水介质中的浓度约为1毫克分子至3毫克分子。
7.根据权利要求
1至6的任一项所述方法，其中金属离子的含量是每摩尔人体胰岛素前体约0.1至2摩尔。
8.根据权利要求
7的方法，其中金属离子的含量是每摩尔人体胰岛素前体约0.33至0.6摩尔。
9.根据权利要求
1至8的任一项所述方法，其中羧肽酶B含量以重量计，与人体胰岛素前体之比约1∶10至1∶5000。
10.根据权利要求
1至9的任一项所述方法，其中胰蛋白酶含量以重量计，与人体胰岛素前体之比约1∶20至1∶250000。
11.根据权利要求
1至10的任一项所述方法，其中羧肽酶B对胰蛋白酶的重量比约1∶1至10∶1。
12.根据权利要求
1至11的任一项所述方法，其中金属离子是选自金属镍和锌的金属离子。
13.根据权利要求
12的方法，其中金属离子是镍离子。
14.根据权利要求
1至13的任一项所述方法，其中将选自铍、镁、钙、锶、钡和镭等金属的第二类金属离子加入该混合物中。
15.根据权利要求
14的方法，其中第二类金属离子是选自金属钙、钡、锶和镁的一种的金属离子。
16.根据权利要求
15的方法，其中第二类金属离子是钙离子。
17.根据权利要求
14至16的任一项所述方法，其中第二类金属的含量是每摩尔人体胰岛素前体约0.5至5摩尔。
18.根据权利要求
17的方法，其中第二类金属离子的含量是每摩尔人体胰岛素前体约1至3摩尔。
19.根据权利要求
1至18之任一项所述方法，其中人体胰岛素前体是胰岛素原。
20.根据权利要求
1至19的任一项定义的方法所制备的人体胰岛素。
专利摘要
本说明书介绍了一种人体胰岛素前体转化为人体胰岛素的方法，包括在水介质中用胰蛋白酶和羧肽酶B处理该种人体胰岛素前体。该水介质中含每摩尔人体胰岛素前体约0.1至10摩尔的1种或多种具有原子序数为21至34、39至52、57至84和89至92的金属的金属离子。
文档编号C07K14/62GK87107019SQ87107019
公开日1988年4月27日 申请日期1987年10月13日
发明者布鲁斯·希尔·弗兰克, 里查德·尤金·海尼, 沃尔特·弗朗西斯·普劳蒂, 马克·罗伯特·沃尔登 申请人:伊莱利利公司导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan