专利名称：：鲎-阳性糖脂的生产方法，鲎-阳性糖脂以及含鲎-阳性糖脂的组合物的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种适合于黄原胶鲎-P日性糖脂的生产方法，所述鲎-阳性糖脂是一种免疫增强剂并且在用于植物和动物如包括人在内的哺乳动物(特别是家畜、宠物动物等)、鸟类(特别是家禽、宠物乌等)、两牺动物、爬虫类、鱼(特别是宠物鱼等)和无脊推动物的药物、准药物、化妆品、功能性食品、饲料、肥料以及沐浴剂中添加时是安全的，本发明还涉及一种含鲎-阳性糖脂的组合物。
背景技术：
：现在有一个急迫的问题是，制定疾病预防和治疗的方法包括感染预防技术，用于包括人类在内的哺乳动物(特别是家畜、宠物动物等)、乌类(特别是家禽、宠物鸟等)、两牺动物、爬虫类、鱼(特别是宠物鱼等)和无脊推动物。此外，为了达到此目的，强烈要求决不使用化学品，没有环境污染，不产生耐性菌并且不在人体内积累的方法。本发明人早已发现由天然产物衍生的免疫增强剂能安全地实现疾病的预防和治疗效果的上述问题(非专利文献1)。作为它的一个例子，有可能使用由在小麦粉的情况下是常有微生物的稻谷病原细菌(Pantoeaagglomerans)获得的脂多糖(非专利文献1)。已知鲎-阳性糖脂具有潜在的免疫增强活性(非专利文献2)。这种鲎-阳性糖脂包括所谓的脂多糖。早已了解脂多糖是革兰氏阴性菌细胞外壁的主要成分同时是Coley，s疫苗的主要成分且具有潜在的免疫增强活性(非专利文献3)。本发明人已经发现鲎-阳性糖脂存在于小麦粉中，其部分在小麦情况下是共生的常有微生物的脂多糖，它们强烈地增强先天性免疫(非3专利文献4)。加之，上述两种安全而有效地增效先天性免疫并且对于包括传染性疾病的各种疾病通过经皮或口服给药能显示防护和治疗的效果(非专利文献5)。此外，本发明人报道了一种新型的免疫增强剂的发酵小麦提取物，不仅使该提取物中来源于稻谷病原细胞的脂多糖含量提高了，而且使该提取物还含有通过在稻谷病原细胞情况下发酵小麦粉来源于小麦的成分，稻谷病原细胞是在小麦情况下共生的常有微生物，对预防感染行使安全的作用和代替抗菌素物质的无麻烦的天然物质或在动物产业和水产养殖领域内化学品的作用。脂多糖的基本结构包含称作类脂A的脂类以及与之共价键结合的各种糖(多糖)。在类脂A之后的部分包含就相关种类而言具有比较均匀结构的R核心和具有依据种类而定的不同结构的0-抗原多糖部分(非专利文献7)。0-抗原具有与LPS(脂多糖)相同的低聚糖特征的重复结构(非专利文献1)。此外，脂多糖通常形成具有多个分子量的混合物。还已知脂多糖具有依据其来源微生物而不同的结构。例如，来源于沙门氏菌的脂多糖和来源于大肠杆菌的脂多糖不仅在结构上而且在生物活性上都不同。然而，一般说来，不容易确定脂多糖的结构。因此，对在许多革兰氏阴性细菌中的脂多糖结构和功能的细节至今并不了解。因此，已被说明的是脂多糖基于其功能差异而具有的新型结构。此外，在近来的研究中证实了脂多糖是通过TLR4激活先天性免疫的(非专利文献6)。现已发现脂多糖的类脂A部分对与TLR4的结合是重要的而且多糖部分极大地影响TLR4细胞内信号传导的效率。从上，可以推测脂多糖细胞应答的差异被认为是结构差异所造成的。重要的是制定能证实脂多糖经皮或口服给药是安全且无麻烦的脂多糖有用性。在古代用于生产和发酵食品的革兰氏阴性细菌就已得到了注意。也就是说，当鲎-阳性糖脂，特别是用来生产食物或为人类消耗提供发酵产品的脂多糖存在于革兰氏阴性细菌中时，这一事实证实了食用鲎-阳性糖脂或脂多糖的经验。这是一种发现，既强有力地证明脂多糖经皮或口服给药是安全的且无麻烦，又促进了新型健康护理产4品如化妆品和食物，以及使用这些物质的药品的发展。ChieKohchi等人，"发酵小麦提取物的先天性免疫调节作用，，("InnateImmunityRegulatoryActionofFermentedWheatExtract")，NewFoodIndustry(2006)Vol.48，p.19-27。Ulmer，A.J.等人，"脂多糖结构、生物活性、受体和信号传导，，("Lipopolysaccharide:Structure,Bioactivity，Receptors,andSignalTransduction，，)，TrendsinGlycoscienceandGlycotechnology，(2000)Vol.14,p.53-68。Star腦，C.0.，"Coley，sToxinsinPerspective"，Nature,(1992)Vol.357，p.11-12。Nishizawa,T.等人，Chem.Pharm.Bull.,(1992)Vol40，p479-483。HiroyukiInagawa等人，"具有巨噬细胞活性作用且来源于小麦的脂多糖(LPSw)的各种病害治疗与预防效果"，Biotherapy，(1991)Vol.5，p.617-621。KiyoshiTakeda等人，"Toll-likeReceptorsinInnateImmunity"，InternationalImmunology,Vol.17,p.1-14。生化学事典第二版(1990)，东京化学同人，p.1949。
发明内容本发明拟解决的问题为了对人或动物口服或经皮给药，安全性必须得到食用经验的支持。例如，用于制造醋的醋酸菌是革兰氏阴性细菌，其微生物细胞成分被包括在其发酵产物中，因此可以说已经食用多年。稻谷病原细胞提供黑面面包乳酸生长所需的叶酸，当黑面面包被吃下时其相当数量的微生物细胞成分被消化。黄原胶是由来自革兰氏阴性细菌的野油菜黄单胞菌(Xanthomonascampestris)产生的多糖，并且包會^露糖、葡萄糖和葡糖醛酸。在黄原胶中，P-1，4-结合的葡萄糖是主链，而在侧链中相对于主链中的每隔l个葡萄糖残基，甘露糖两个分子和葡糖醛酸结合。黄原肢具有很高的粘度，对于酸、盐和加热来说是稳定的，广泛用作食品的增稠剂。日本大约在30年前引入，目前年消耗黄原胶1300吨或更多。以此，黄原胶是用革兰氏阴性细菌发酵的产物，已食用多年。在本申请中，发现直到现在尚未了解的鲎-阳性糖脂存在于来源于黄单胞菌属的黄原胶中，从市场上可以买到并已食用多年，经过提纯，可以发现这种鲎-阳性糖脂具有免疫增强作用。用于解决问题的手段本发明鲎-阳性糖脂的生产方法包括从黄原胶提取鲎-阳性糖脂。本发明的鲎-阳性糖脂是通过上述生产鲎-阳性糖脂的方法获得的。本发明的鲎-阳性糖脂组合物含有上述鲎-阳性糖脂。鲎-阳性糖脂组合物是药物、动物用药物、准药物、化妆品、食品、功能性食品、饲料或沐浴剂。本发明的效果按照本发明，有可能获得无麻烦且安全的鲎-阳性糖脂，因为已经发现鲎-阳性糖脂存在于可从市场上买到且已食用多年的黄原胶中。这种鲎-阳性糖脂可以用于各种用途如健康护理产品和含有该糖脂的药物，因为该鲎-阳性糖脂已被提純且被发现其具有免疫增强的效果。本说明书引入了作为本申请优先权基础的日本专利申请号2006-194965说明书和附图中所公开的内容。具体实施例方式鲎-阳性糖脂从黄原胶中的提取实施例1)鲎-阳性糖脂从黄原胶中的提取把黄原胶(1.00g)(大日本住友制药)加到l升的磷酸盐緩沖生理盐水(PBS)中，以10分钟在规格6使，ol:ttron匀化。把多粘菌素B(polymyxinB)固化树脂(5ml)(由加利弗尼亚的BI0-RAD提供Affipreppolymyxin载体)加到所得到的0.1%(w/v%)黄原胶的PBS溶液中，该溶液用电磁搅拌器搅拌4小时。现已知道多粘菌素B与分子如具有高脂质-溶解度的类脂A结合。搅拌后，把溶液转移至50ml的离心管中，该管再于室温下以2000rpm离心10分钟。在完成离心之后，弃掉上清液，并收集作为沉淀的Affipreppolymyxin载体。往沉淀中添加10ml的PBS，搅拌，再于室温下以2000rpm的离心收集沉淀。往沉淀中添加5ml的0.02N氢氧化钠水溶液，搅拌1分钟，再于室温下以2000rpm离心10分钟。完成离心后，把上清液收集到另外一个容器中。再次往沉淀中添加0.02N氢氧化钠水溶液5ml，搅拌l分钟，并于室温下以2000rpm离心10分钟。完成离心后，把两份上清液合并。立即加入lml的l摩尔/升(M)三羟基甲基氨基曱烷盐酸盐(Trishydrochloride),pH7.0以中和上清液。借助于苯酚-硫酸法鉴定所获得的溶液含糖。这样，使该溶液制成从黄原胶提取的含鲎-阳性糖脂的溶液。使用Endospecy(由生化学工业供应的；3-葡聚糖反应的鲎试验)测定鲎-阳性糖脂，并且大约有4mg的鲎-阳性糖脂存在。因为在黄原胶中含有约5mg的鲎-阳性糖脂，所以收率大约为80%。2)鲎-阳性糖脂免疫增强作用的测量把鲎-阳性糖脂加入培养的小鼠巨噬细胞谱系细胞林的RAW264.7中，并测量从细胞中产生的一氧化氮。因为RAW264.7细胞是弱粘性的细胞，所以细胞通过移液从培养瓶收集并使用培养液调节细胞浓度在8xl()5细胞/毫升。将细胞悬浮液(lOOpl)转移至96-孔平底板的各孔中，当细胞几乎附着的6小时后用来检验。调节鲎-阳性糖脂浓度相当于脂多糖在稻谷病原细胞中的浓度为4000ng/ral。进一步完成以10倍5种比例的系列稀释。用所述培养液把各个稀释过的溶液再稀释两倍，并且使各##溶液用含40pg/ml多粘菌素B的介质进一步稀释两倍。把所获得的溶液作为加入已加入细胞的孔的标品使用。同时，还检验从野油茱黄单胞菌提纯的脂多糖(LPSx)，把100ju1的各种标品加到预先已在96-孔平底板中加了细胞的每一个孔中。于37。C下在5%二氧化碳气体培养器中培养细胞20小时。培养完成后，收集50nm的培养悬浮液。按照标准方法使用Griess试剂测量培养液中的一氧化氮代谢物的亚硝酸量。测量结果列于表1和2中。来自100ng/ml或更高浓度的黄原胶的鲎-阳性糖脂提取溶液显示NO由RAW264.7细胞的产生。LPSx的NO产生能力当在7.OjaM下对比时高于鲎-阳性糖脂22倍(为获得7.0juM的亚硝酸浓度需要加入的鲎-阳性糖脂的数量为2.8ng/ml，由此LPSx的数量为61.2ng/ml，61.2/2.8=22)。在添加多粘菌素B组中，通过两种100ng/ml的样品未观察到NO的产生。因此，可以鉴定它们具有与多粘菌素B结合的结构。来源于黄原胶的鲎-阳性糖脂诱导RAW264.7细胞产生NO的能力。<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>各测量值皆用4例的平均值±标准偏差表示。[表2]来自用多粘菌素B预处理过的黄原胶的鲎-阳性糖脂诱导RAW264.7细胞产生NO的能力。添加浓度(ng/ml)亚硝酸浓度(^M)LPSX来源于黄原胶的鲎-阳性糖脂01.91±0.361.98±0.340.12.28±0.292.21±0.2112.06±0.26L76±0.27101.84±0.221.76±0.331003.47±0.252,43±0.1510005.84±0.459.17±0.50各个测量值皆用4例的平均值土标准偏差表示。根据上述结果，可以发现来自黄原胶的鲎-阳性糖脂具有诱导巨噬细胞产生NO的作用，但是生物活性不同于来自黄单胞菌属微生物细胞所获得的脂多糖(LPSx)。这些结果表示在它们之间存在着结构的差异。3)测量从黄原胶提取的鲎-阳性糖脂的分子量检测从黄原胶提取的鲎-阳性糖脂的分子量。于是，使4jug的鲎-阳性糖脂与样品緩冲液混合，再使用三(鞋甲基)甲基甘氨酸(tricin)完成十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。电泳后，为了用肉目艮观测脂多糖的分子通过Sil-BestStainKit(Cat.No.30642-41,NacalaiTesque,Japan)完成银着色。把PrestainedProteinMarker,BroadRange(PremixedFormat)(Cat.No.7708L,NEWENGLANDBiolabs)作为分子量大小标记器使用。结果，LPSx样品在2000~4500道尔顿(Da)和30~80kDa中显示许多梯形带。在从黄原胶提取^鲎-阳性糖脂中，检测出2000-4000Da中的带。从黄原胶提取的鲎-阳性糖脂的分子量是2000-4000Da而LPSx的分子量是2000~4000Da和30~80kDa。这一结果证明了在它们之间存在结构的差异。4)在从黄原胶提取的鲎-阳性糖脂和LPSx之间的抗原性差异当从黄原胶提取的鲎-阳性糖脂与从黄单胞菌属微生物细胞获得的脂多糖(LPSx)之间存在结构差异时，抗原性差异出现并且抗体的反应性好象不同。于是，将从黄原胶提取的鲎-阳性糖脂对照LPSx用单克隆抗体染色。将鲎-阳性糖脂滴在聚偏氟乙烯(PVDF)膜(由BIO-RAD提供)上，接着于室温下通过使PVDF膜在含3%牛血清白蛋白(BSA)的PBS中培育来阻断非-特异反应30分钟(阻断)。接着，用含0.05%吐温20(Tween20)的Tris緩沖生理盐水(TBS:20mMTrisHC1，pH7.5,150mMNaCl)。洗涤之后，把含有对从黄单胞菌属微生物细胞获得的脂多糖特异的抗体的培养液5ml作为初级抗体加入并于室温下反应60分钟。(如下制作对黄单胞菌属脂多糖特异的单克隆抗体。使加热并杀死的黄单胞菌属细胞与完全Freund，s调节剂混合，再按每只小鼠lx108细菌经腹腔内引入至BALB/c鼠。以两周的时间间隔重复经腹腔内引入三次。在最终引入后的三天，收集脾脏的细胞，使用50%聚乙二醇(平均分子量1000)与骨髓瘤细胞(P3U1)融合。把融合的细胞悬浮于含有10%FBS(牛胎儿血清)的HAT培养基中，并于37。C下的5%C02中在96-孔底平板上培养并静置7天。通过公众已知的并且通用的ELISA(酶联免疫吸附试验法)使用黄单胞菌属脂多糖作为抗原检测取自菌落已形成的各孔中的培养上清液。通过公众已知且通用的限制稀释法克隆上面获得的生产单克隆抗体的细胞。结果，抗黄单胞菌属脂多糖获得了21种鼠性单克隆IgG抗体。)接着，用含有O.05%吐温20的Tris緩沖生理盐水(TBS:20mMTrisHC1，pH7,5，150MmNaCl)清洗PVDF膜5遍。洗涤后，使用含1MBSA的PBS稀释1000倍的5ml碱性磷酸酶-标识的抗鼠IgM山羊免疫球蛋白(A9688,Sig歸)，使膜于室温下反应60分钟。随后，用含0.05%吐温20的TBS洗涤膜5次，洗涤之后，加入含有产色物质，0.0165%5-溴-4-氯-3吲咮磷酸酯(025-08651，和光纯药，日本)10和0.033%氮蓝四唑(N-6876，Sigma)的碱性磷酸酶緩冲液(50mMTrisHC1，pH9.5，IraMMgCl2)5ml，在此之后将PDVF膜转移至蒸馏水中以终止反应。结果，通过所有21种抗体检测LPSx,然而来自黄原胶的鲎-阳性糖脂与所述20种抗体不起反应，而只与一种抗体起反应。用这种方法，发现了从黄原胶提取的鲎-阳性糖脂具有与来自黄单胞菌属的脂多糖不同的抗原性。根据这一结果，证明了从黄原胶提取的鲎-阳性糖脂的结构与来自黄单胞菌属的脂多糖(LPSx)结构是不同的。5)从黄原胶提取的鲎-阳性糖脂的功能性食品实施例生产含有从黄原胶提取的鲎-阳性糖脂的糖果在砂糖、淀粉糖浆和水中通过把l)中生产的从黄原胶提取的鲎-阳性糖脂以5:5:5:1的比例添加所获得的混合物作为原料加热并于12014(TC下蒸稠，之后于不锈钢板上冷却，拉长成为棒状再模铸成小圆形约lg以便产生含有从黄原胶提取的鲎-阳性糖脂的糖果。把适量的这种糖果加入20ml的水中借助加热使其溶解。测量在这种溶液中从黄原胶提取的鲎-阳性糖脂质量，其量为6jLlg/g。这种糖果为已感冒咽喉疼痛的6名男人和女人摄取。之后马上就进行针对咽喉疼痛征求意见。所有6名成员都感觉他们的有关疼痛已减退(一种样品试验信号p<0.03)。本说明书引证的所有出版物、专利和专利说明书都作为参考直接引入本说明书。ii权利要求1.鲎-阳性糖脂的生产方法，包括从黄原胶提取鲎-阳性糖脂。2.根据权利要求1的鲎-阳性糖脂的生产方法获得的鲎-阳性糖脂。3.鲎-阳性糖脂组合物，含有权利要求2的鲎-阳性糖脂。4.根据权利要求3的鲎-阳性糖脂组合物，其中所述鲎-阳性糖脂组合物是药物、动物用药物、准药物、化妆品、食品、功能性食品、饲料或沐浴剂。全文摘要现已发现鲎-阳性糖脂存在于来源于黄单胞菌属的黄原胶中，可从市场上买到并已食用多年，经过提纯，发现这种鲎-阳性糖脂具有免疫增强作用。本申请提供一种安全且廉价生产含高浓度免疫增强剂的鲎-阳性糖脂的方法。用于生产本发明的鲎-阳性糖脂的方法，包括从黄原胶提取鲎-阳性糖脂。含有鲎-阳性糖脂的鲎-阳性糖脂组合物可用于各种用途如药物、动物用药物、准药物、化妆品、食品、功能性食品、饲料以及沐浴剂。文档编号C08B37/00GK101490092SQ20078002682公开日2009年7月22日申请日期2007年2月28日优先权日2006年7月14日发明者杣源一郎,河内千惠,稻川裕之,西泽孝志申请人:生物医学研究集团有限公司;自然免疫应用技研株式会社;杣源一郎