专利名称：一种细菌视紫红质/嵌段共聚物水凝胶复合材料及其制备方法
技术领域：
本发明属高分子材料和信息材料技术领域，涉及利用细菌视紫红质和嵌段共聚物 组成的水凝胶复合材料及其制备方法，本发明复合材料具有长寿命M态，可用于信息存储 和处理。
背景技术：
利用活性蛋白质分子作为活性中心制备功能材料是近年来研究热点之一。其中细 菌视紫红质(bacteriorhodopsin，BR)因其显著的光色/光电响应特性使其在光信息存储 和处理材料领域具有很大的应用前景。现有技术公开了 BR及其突变体与聚合物混合制得 的复合材料可应用于光信息存储(包括两维存储，三维存储和全息存储等)和光信息处理 (包括光转换，光过滤和信号调节等)等方面。(H卿p，N. Chem. Rev. 2000，100，1755 ；Birge, R. R. et. al. J. Phys. Chem. B1999,103，10746)。光激发后，BR产生一个光循环，最终回复至基态。该光循环包含一系列具有不同 最大吸收波长和不同寿命的中间态组成，其中M中间态(最大吸收波长通常在412nm左右) 因其与基态(最大吸收波长通常在570nm左右)具较大的波长位移。基态和M中间态的相 互转换为制备可用于信息存储和处理的功能材料提供了理论基础。然而，由于野生BR在液 态下其M态寿命仅有^is (Hampp，N. Chem. Rev. 2000，100，1755)，限制了其实际应用，且其本 身难以制成可直接应用的材料。因此，有研究将BR进行基因突变，利用化学物质对其进行 改性以延长M态寿命，并与聚合物相混合，然后制备成者复合材料，可直接投入应用。如何 在含水条件下延长细菌视紫红质的M态寿命并得到聚合物为基质的复合材料成为一个重 要的关注点。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有长寿命M态的细菌视紫红质/嵌段共聚物水凝胶 复合材料及其制备方法。本发明的水凝胶复合材料由细菌视紫红质、嵌段共聚物和水组成。本发明将分离纯化得到的细菌视紫红质与嵌段共聚物混合，本发明中，所述嵌段 共聚物与细菌视紫红质水溶液处于直接混合状态。所述的嵌段共聚物(也称嵌段聚合物) 既对细菌视紫红质的功能进行修饰得到长寿命M态，又可包裹细菌视紫红质制备成水凝胶 材料。本发明中，所述嵌段共聚物通过进一步化学交联制备成包裹细菌视紫红质的水凝胶 材料。制得的材料可应用于光信息存储和处理，拓宽BR材料的应用范围。本发明中，所述的细菌视紫红质可以是野生型的，也可是相应的转基因突变体等， 用于改善蛋白质功能或其他用途的转基因突变体丰富多样，如第96位天冬氨酸被天冬酰 胺替换的BR-D96N能延长M中间态的寿命。本发明中，所述的嵌段聚合物一般选择具有良好水溶性的、具有亲水和疏水嵌段的两亲性嵌段共聚物，以及含有可聚合基团的该共聚物的衍生物以及共聚物之间、共聚物 与衍生物之间或衍生物与衍生物之间的混合物。所述的嵌段共聚物衍生物为末端基为双键 的两亲性嵌段共聚物。并且这些聚合物与细菌视紫红质混合后不会引起蛋白质的变性。这 里所述的变性，包括视黄醛的掉落或蛋白质结构的改变，其特征是蛋白质的光循环或质子 泵功能的丧失。本发明中，所述的两亲性嵌段共聚物是由疏水性的聚氧丙烯(PPO)和亲水性的聚 氧乙烯(PEO)组成的嵌段共聚物。本发明中，优选两亲性的三嵌段共聚物。常用的三嵌段共聚物为聚氧乙烯(poly ethylene oxide, PE0)和聚氧丙烯(poly propylene oxide, PP0)组成的三嵌段聚合物， 其中间嵌段为ΡΡ0、两端为ΡΕ0，也可以中间嵌段为ΡΕ0、两端为ΡΡ0(ΡΕ0-ΡΡ0-ΡΕ0，称为 Pluronic ；ΡΡ0-ΡΕ0-ΡΡ0，称为 Pluronic-R，均可购于 BASF)。上述嵌段共聚物也包括它们相应的具有可聚合的末端基团的衍生物。上述的嵌段聚合物也包括两亲性嵌段共聚物、其含有可聚合末端基团(如双键基 团)的衍生物以及共聚物之间、共聚物与衍生物之间或衍生物与衍生物之间的混合物。所 述的末端双键衍生物的合成可以参考文献Zhang，Y. et. al. J. Controlled Release, 2005, 105，260 ；Kweon, H. Y. et. al. J. App 1. Polym. Sci. 2003，88，2670。本发明中，上述的细菌视紫红质在水凝胶复合材料中的M态寿命与单纯细菌视紫 红质悬浮液溶液状态下相比延长了 1 4个数量级。本发明中，水凝胶复合材料中，聚合物的质量分数浓度为5 50%，细菌视紫红质 与嵌段聚合物的质量比为1 20 1 1200，568nm处的光密度OD值(OD568J为0. 1 5. 0。本发明所述的细菌视紫红质/嵌段共聚物水凝胶复合材料的通过如下方法制备将细菌视紫红质和嵌段聚合物分散于水溶液中，在低于聚合物溶液的临界凝胶温 度条件下搅拌，超声充分混合形成透明溶液；将该混合溶液连续搅拌一段时间后，过滤去除 未分散的较大颗粒，离心使过滤产生的气泡上浮，然后转移至所需器皿中，在高于聚合物的 临界凝胶温度条件下静置，可形成均勻、透明的物理水凝胶复合材料。上述聚合物溶液的临界凝胶温度可参考文献AleXandridis，P. Hatton,T. Α. 1995， Colloids And Surfaces A :Physicochemical and Engineering Aspects (96), 1-46,及该 文献的参考文献。上述的细菌视紫红质/嵌段共聚物水凝胶复合材料的制备方法中，嵌段聚合物可 采用具有双键的嵌段共聚物衍生物，并进一步加入引发剂聚合，形成均勻、透明的化学交联 的水凝胶复合材料。引发剂的浓度为聚合物浓度的0.05% 0.2% (w/w) 0上述的细菌视紫红质/嵌段共聚物水凝胶复合材料的制备方法中，所述嵌段共聚 物为具有亲水和疏水嵌段的两亲性共聚物、或者含有可聚合基团的衍生物以及共聚物之 间、共聚物与衍生物之间或衍生物与衍生物之间的混合物。上述的水凝胶复合材料的制备方法中，超声是为了降低碎片的尺寸以减少测量时 的光散射，超声后碎片直径一般小于500nm。混合液是利用宁波产JY92-II型超声波细胞粉 碎机，采用Φ 3探头超声处理，超声功率160Hz，每超声k，间隔30s，共超声30次，采用冰水 浴以防止超声产生的热量集中导致BR蛋白变性。4
本发明的特点是将细菌视紫红质与嵌段聚合物混合，利用嵌段聚合物对细菌视紫 红质的化学修饰和直接作为包埋基质的双重功能，得到长寿命M态的水凝胶复合材料，能 拓宽BR材料的应用范围。为了便于理解，以下将通过具体的附图和实施例对本发明的进行详细地描述。需 要特别指出的是，具体实例和附图仅是为了说明，显然本领域的普通技术人员可以根据本 文说明，在本发明的范围内对本发明做出各种各样的修正和改变，这些修正和改变也纳入 本发明的范围内。
图1、本发明实施实例2的水凝胶复合材料M态衰减过程。图2、本发明实施实例2的水凝胶复合材料实物图。
具体实施例方式实施例1称取1. 2mg野生型BR粉末和1. 05g三嵌段聚合物poly (ethylene oxide) (99)-b-poly(propylene oxide) (65)-b-poly(ethylene oxide) (99)(缩写为 EO99-PO65-EO99，又称Pluronic F127，可购于BASF)加入到1. 95mL去离子水中，在4°C下搅 拌至完全溶解，得到浓度为0. 4mg/mL BR和35wt% F127的混合溶液，细菌视紫红质与嵌段 聚合物的质量比为1 1170，并调节溶液的pH至10.0。利用宁波产JY92-II型超声波细 胞粉碎机，采用Φ 3探头超声处理，超声功率160Hz，每超声5s，间隔30s，共超声30次，采 用冰水浴以防止超声产生的热量集中导致BR蛋白变性。将超声后的混合液在4°C下搅拌7 天。然后采用8μπι的纤维素过滤膜过滤，以去除未分散的较大颗粒；过滤后以2000rpm转 速4°C下离心5min，以使过滤产生的气泡上浮；小心从底部吸取离心后溶液，转移至清洁的 石英比色皿中。在室温(约25°C )下静置约IOmin后形成均勻、透明的物理水凝胶复合材 料，OD568nm约为0. 2，M态寿命可达15s，与野生BR在悬浮液中M态寿命^is相比较延长约4 个数量级。实施例2将40g三嵌段聚合物Pluronic F127和1. OOmL三乙胺加入到500mL圆底烧瓶中， 再加入200mL 二氯甲烷中。当F127和三乙胺完全溶解后，逐滴加入0.5mL丙烯酰氯。所得 混合物先在0°C下搅拌M小时，再在室温下搅拌M小时。然后加入过量乙醚使沉淀产物， 反复操作3次以提纯产物。将产物置于真空烘箱中60°C干燥M小时。最终得到末端为双 键的嵌段聚合物(F127-DA)，所得产物储存于氩气瓶中，并置于4°C保存。称取转基因突变体BR-D96N粉末2. 4mg和上述合成的F127-DA粉末0. 3g加入到 2. 7mL去离子水中，室温下(约25°C )搅拌至完全溶解，得到浓度为0. 8mg/mL BR和IOwt^ F127-DA的混合溶液，细菌视紫红质与嵌段聚合物的质量比为1 170，并调节溶液的pH至 10.0。利用宁波产JY92-II型超声波细胞粉碎机，采用Φ3探头超声处理，超声功率160Hz， 每超声5s，间隔30s，共超声30次，采用冰水浴以防止超声产生的热量集中导致BR蛋白变 性。将超声后的混合液在室温下搅拌7天。然后采用8μπι的纤维素过滤膜过滤，以去除未 分散的较大颗粒；过滤后以2000rpm转速常温离心5min，以使过滤产生的气泡上浮；小心从5底部吸取离心后溶液，转移至事先加入30 μ L浓度为8mg/mL的紫外光引发剂2-hydroxy-4 ，一(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone(D2959)(购于 Aldrich Chemical CO.)于 石英比色皿中。最后将样品置于离紫外光源(上海康和光电仪厂，功率100W)约IOcm处， 进行紫外光照射。紫外光每照射样品30s，间隔5min，重复3次，防止长时间光照引起热量 过于集中而导致BR变性，聚合后形成均勻、透明的化学交联水凝胶复合材料。OD568nm约为 0. 6，M态的衰减时间超过30分钟(见附图1)，与基因突变体BR-D96N悬浮液M态寿命1. 2s 相比较延长3个数量级，实物照片见附图2。
实施例3
20g H ft g ^ ^ ^ poly (ethylene oxide) (20) -b-poly (propylene oxide) (65)-b-poly (ethylene oxide) (20)(缩写为 EO2q-PO65-EO2q，又称 Pluronic P123，可购于 BASF)和l.OOmL三乙胺加入到500mL圆底烧瓶中，再加入200mL 二氯甲烷中。当P123和三 乙胺完全溶解后，逐滴加入0. 5mL丙烯酰氯。所得混合物先在0°C下搅拌M小时，再在室 温下(约25°C )搅拌M小时。然后加入过量乙醚使沉淀产物，反复操作3次以提纯产物。 将产物置于真空烘箱中60°C干燥M小时。最终得到末端为双键的嵌段聚合物(P123-DA)。称取3mg转基因突变体BR-D96N粉末和0. 3g P123-DA加入到2. 7mL去离子水中， 室温下搅拌至完全溶解，得到浓度为lmg/mL BR和10wt% P123-DA的混合溶液，细菌视紫 红质与嵌段聚合物的质量比为1 130，并调节溶液的pH至10.0。利用宁波产JY92-II 型超声波细胞粉碎机，采用Φ 3探头超声处理，超声功率160Hz，每超声5s，间隔30s，共超 声30次，采用冰水浴以防止超声产生的热量集中导致BR蛋白变性。将超声后的混合液在 室温下搅拌7天。然后采用8 μ m的纤维素过滤膜过滤，以去除未分散的较大颗粒；过滤后 以2000rpm转速常温离心5min，以使过滤产生的气泡上浮；小心从底部吸取离心后溶液，转 移至事先加入30 μ L浓度为8mg/mL的D2959引发剂的石英比色皿中。最后将样品置于离 光源约IOcm处，进行紫外光照射。紫外光每照射样品30s，间隔5min，重复3次，防止长时 间光照引起热量过于集中而导致BR变性，聚合后形成均勻、透明的化学交联水凝胶复合材 料，OD568rai 约为 1.2。实施例4称取3mg转基因突变体BR-D96N粉末、0. 15g P123和实施例2中合成的F127-DA 粉末0. 3g加入到2. 55mL去离子水中，室温下(约25°C )搅拌至完全溶解，得到浓度为Img/ mL BR,5wt% P123和10wt% F127-DA的混合溶液，细菌视紫红质与嵌段聚合物的质量比为 1 200，并调节溶液的pH为8.0。利用宁波产JY92-II型超声波细胞粉碎机，采用Φ3探 头超声处理，超声功率160Hz，每超声5s，间隔30s，共超声30次，采用冰水浴以防止超声产 生的热量集中导致BR蛋白变性。将超声后的混合液在室温下搅拌5天。然后采用8μπι的 纤维素过滤膜过滤，以去除未分散的较大颗粒；过滤后以2000rpm转速常温离心5min，以使 过滤产生的气泡上浮；小心从底部吸取离心后溶液，转移至事先加入30 μ L浓度为8mg/mL 的D2959引发剂的石英比色皿中。最后将样品置于离光源约IOcm处，进行紫外光照射。紫 外光每照射样品30s，间隔5min，重复3次，防止长时间光照引起热量过于集中而导致BR变 性，聚合后形成均勻、透明的化学交联水凝胶复合材料，OD568nm约为1. 2。实施例5称取45mg野生型BR粉末和0. 9g P123-DA加入到2. ImL去离子水中，在4°C下搅拌至完全溶解，得到浓度为15mg/mL BR和30Wt% P123-DA的混合溶液，细菌视紫红质与嵌 段聚合物的质量比为1 27，并调节溶液的pH至10.0。利用宁波产JY92-II型超声波细胞 粉碎机，采用Φ 3探头超声处理，超声功率160Hz，每超声k，间隔30s，共超声30次，采用冰 水浴以防止超声产生的热量集中导致BR蛋白变性。将超声后的混合液在4°C搅拌5天。然 后采用8μπι的纤维素过滤膜过滤，以去除未分散的较大颗粒；过滤后以2000rpm转速4°C 离心5min，以使过滤产生的气泡上浮；小心从底部吸取离心后溶液，转移至事先加入20 μ L 浓度为8mg/mL的拟959弓丨发剂的石英比色皿中。最后在常温下将样品置于离光源约IOcm 处，进行紫外光照射。紫外光每照射样品30s，间隔5min，重复3次，防止长时间光照引起热 量过于集中而导致BR变性，聚合后形成均勻、透明的化学交联水凝胶复合材料，OD568nm约为 4.0, M态寿命为ls，与野生BR在悬浮液中M态寿命^is相比较延长近3个数量级。
权利要求
1.一种细菌视紫红质/嵌段共聚物水凝胶复合材料，其特征在于，由细菌视紫红质、嵌 段共聚物和水组成。
2.根据权利要求1所述的细菌视紫红质/嵌段共聚物水凝胶复合材料，其特征在于，所 述嵌段共聚物为具有亲水和疏水嵌段的两亲性嵌段共聚物，以及含有可聚合基团的该共聚 物的衍生物以及共聚物之间、共聚物与衍生物之间或衍生物与衍生物之间的混合物。
3.根据权利要求2所述的细菌视紫红质/嵌段共聚物水凝胶复合材料，其特征在于，所 述的共聚物是由疏水性的聚氧丙烯和亲水性的聚氧乙烯组成的嵌段共聚物。
4.根据权利要求3所述的细菌视紫红质/嵌段共聚物水凝胶复合材料，其特征在于，所 述的共聚物是由聚氧丙烯和聚氧乙烯组成的三嵌段共聚物，中间嵌段为ΡΕ0、两端为ΡΡ0， 或中间嵌段为ΡΡ0、两端为ΡΕ0。
5.根据权利要求2所述的细菌视紫红质/嵌段共聚物水凝胶复合材料，其特征在于，所 述的嵌段共聚物衍生物为末端基为双键的两亲性嵌段共聚物。
6.根据权利要求5所述的细菌视紫红质/嵌段共聚物水凝胶复合材料，其特征在于，所 述的嵌段共聚物衍生物是由聚氧丙烯和聚氧乙烯组成的三嵌段共聚物，中间嵌段为ΡΕ0、两 端为ΡΡ0，或中间嵌段为ΡΡ0、两端为ΡΕ0，末端基为双键的共聚物。
7.根据权利要求1所述的细菌视紫红质/嵌段共聚物水凝胶复合材料，其特征在于，所 述嵌段共聚物与细菌视紫红质水溶液处于直接混合状态。
8.根据权利要求1所述的水凝胶复合材料，其特征是所述嵌段共聚物通过进一步化学 交联制备成包裹细菌视紫红质的水凝胶材料。
9.根据权利要求1所述的水凝胶复合材料，其特征是所述细菌视紫红质包括野生型细 菌视紫红质及其转基因突变体。
10.根据权利要求1所述的水凝胶复合材料，其特征是细菌视紫红质的M态寿命与单纯 细菌视紫红质悬浮液相比较延长了 1 4个数量级。
11.根据权利要求1所述的细菌视紫红质/嵌段共聚物水凝胶复合材料，其特征在于， 其中共聚物的质量分数浓度为5 50%，细菌视紫红质与嵌段共聚物的质量比为1 20 1 1200，568nm处的光密度OD值为0. 1 5. 0。
12.—种制备权利要求1的细菌视紫红质/嵌段共聚物水凝胶复合材料的方法，其特征 是包括下述步骤，将细菌视紫红质和嵌段共聚物分散于水溶液中，在低于共聚物溶液的临界凝胶温度的 条件下搅拌，超声充分混合形成透明溶液；将该混合溶液连续搅拌后，过滤去除未分散的较 大颗粒，离心使过滤产生的气泡上浮，然后转移至所需器皿中，在高于共聚物溶液的临界凝 胶温度的条件下静置，形成均勻、透明的物理水凝胶复合材料。
13.根据权利要求12所述的的制备方法，其特征是，所述嵌段共聚物为含有双键的嵌 段共聚物衍生物，并进一步加入引发剂聚合，形成均勻、透明的化学交联的水凝胶复合材 料；所述引发剂浓度为聚合物浓度的0. 05% 0. 2% w/w。
14.根据权利要求12所述的制备方法，其特征是，所述嵌段共聚物为具有亲水和疏水 嵌段的两亲性共聚物、或者含有可聚合基团的衍生物以及共聚物之间、共聚物与衍生物之 间或衍生物与衍生物之间的混合物。
全文摘要
本发明属高分子材料和信息材料技术领域，涉及一种利用细菌视紫红质和嵌段共聚物组成的水凝胶复合材料及其制备方法，本发明将分离纯化得到的细菌视紫红质与嵌段共聚物混合，所述嵌段共聚物与细菌视紫红质水溶液处于直接混合状态；所述的嵌段共聚物既对细菌视紫红质的功能进行修饰得到长寿命M态，又可包裹细菌视紫红质制备成水凝胶材料。本发明中制得的材料可应用于光信息存储和处理，能拓宽BR材料的应用范围。
文档编号C08L89/00GK102040822SQ20091019698
公开日2011年5月4日 申请日期2009年10月10日 优先权日2009年10月10日
发明者丁建东, 马德旺 申请人:复旦大学