本技术要求2011年11月5日提交的美国临时专利申请号61/410,602的优先权，在此全部并入本技术作为参考。
技术领域
本发明涉及3-(4-(氨甲基)-1-(5-甲基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)哌啶-4-甲酰胺基)苯基二甲基氨基甲酸酯及其盐的固体形式、包含它们的组合物、以及它们的使用方法。
背景技术：
相同化合物的不同固体形式可以具有基本上不同的性质。例如，药物的无定形形式可以表现出与其晶体形式不同的溶出特性及不同的生物利用度模式，该性质可影响药物达到最佳效果时所必须采取的施用方式。药物的无定形和晶体形式还可以具有不同的处理特性(例如流动性、可压缩性)、溶出速率、溶解度及稳定性，所有这些性质均可影响剂型的制造。因此，出于多种原因，希望获得药物的多种形式。另外，监管机构(例如美国食品药品监督管理局(U.S.FoodandDrugAdministration))在批准含有新药物质的产品之前，可能要求鉴定新药物物质的所有固体形式。A.Goho，ScienceNews166(8)：122-123(2004)。
化合物可以以一种或多种晶体形式存在，但是不能明确预测这些形式的存在及特性。即使在鉴定到一种多晶型物之后，其他形式的存在及特性也只能通过另外的实验来确定。参见同上。
技术实现要素：
本发明部分涉及LIM激酶2抑制剂3-(4-(氨甲基)-1-(5-甲基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)哌啶-4-甲酰胺基)苯基二甲基氨基甲酸酯及其药学上可接受的盐的固体形式。具体固体形式为晶体。
本发明的一个实施方式包括包含本文所述的固体形式的药物组合物。另一个实施方式包括治疗、管控和/或防止影响患者的视力的疾病或病症(例如青光眼)的方法，该方法包括向患者施用本发明的固体形式。
附图说明
参照附图可理解本发明的某些方面。
图1为晶体1-(5-甲基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)哌啶-4-甲酰胺基)苯基二甲基氨基甲酸酯苯甲酸盐的X-射线衍射(XRPD)图谱。使用具有Kβ滤波器的RigakuMiniFlex仪器：Cu辐射获得衍射谱：起始角3度；终止角45度，0.02度采样；扫描速度2度/分钟。样品材料被分散在零背景样品保持器上。
图2为晶体1-(5-甲基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)哌啶-4-甲酰胺基)苯基二甲基氨基甲酸酯盐酸盐的X-射线衍射(XRPD)图谱。使用具有Kβ滤波器的RigakuMiniFlex仪器：Cu辐射获得衍射谱：起始角3度；终止角45度，0.02度采样；扫描速度2度/分钟。样品材料被分散在零背景样品保持器上。
图3为晶体1-(5-甲基-7H-比咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)哌啶-4-甲酰胺基)苯基二甲基氨基甲酸酯磷酸盐的X-射线衍射(XRPD)图谱。使用具有Kβ滤波器的RigakuMiniFlex仪器：Cu辐射获得衍射谱：起始角3度；终止角45度，0.02度采样；扫描速度2度/分钟。样品材料被分散在零背景样品保持器上。
具体实施方式
本发明部分涉及3-(4-(氨甲基)-1-(5-甲基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)哌啶-4-甲酰胺基)苯基二甲基氨基甲酸酯及其药学上可接受的盐的固体(例如晶体)形式。该化合物为LIM激酶2的抑制剂，在眼科疾病的模型中显示出降低眼内压，并可用于治疗、管控或防止青光眼。参见美国专利申请公布US-2009-0264450-A1。
本发明也涉及包含3-(4-(氨甲基)-1-(5-甲基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)哌啶-4-甲酰胺基)苯基二甲基氨基甲酸酯的固体形式的药物组合物，及其使用方法。
定义
除非另有说明，否则术语“管控”包括防止特定疾病或病症在已患有该疾病或病症的患者中复发，和/或延长已患有该疾病或病症的患者处于缓解状态的时间。该术语包括调节疾病或病症的阈值、发展和/或持续时间，或者改变患者对疾病或病症作出响应的方式。
除非另有说明，否则术语“防止”包括在患者开始患上特定疾病或病症之前发生的抑制或降低所述疾病或病症的严重性的行为。换言之，该术语包括预防。
除非另有说明，否则化合物的“预防有效量”是足以防止疾病或病症或与所述疾病或病症相关的一个或多个症状或者防止其复发的量。化合物的预防有效量表示治疗剂单独或与其它药剂组合在防止疾病或病症中提供预防益处的量。术语“预防有效量”可包括改善整体预防或增强另一种预防剂的预防功效的量。
除非另有说明，否则化合物的“治疗有效量”是足以在治疗或管控疾病或病症中提供治疗益处或者使与疾病或病症相关的一个或多个症状延迟或最小化的量。化合物的治疗有效量表示治疗剂单独或与其它疗法组合在治疗或管控疾病或病症中提供治疗益处的量。术语“治疗有效量”可包括改善整体治疗、减少或避免疾病或病症的症状或起因、或增强另一种治疗剂的治疗功效的量。
除非另有说明，否则术语“治疗”包括在患者患有特定疾病或病症时发生的降低所述疾病或病症或其一个或多个症状的严重性或者推迟或减缓所述疾病或病症的进展的行为。
除非另有说明，术语“包括”具有与“包括但不限于”相同的含义。类似地，术语“例如”具有与“例如但不限于”相同的含义。
固体形式
本发明涉及3-(4-(氨甲基)-1-(5-甲基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)哌啶-4-甲酰胺基)苯基二甲基氨基甲酸酯
及其盐的固体形式。具体固体形式为晶体。具体的盐包括乙酸盐、己二酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、延胡索酸盐、盐酸盐、马来酸盐、烟酸盐及磷酸盐。
本发明的一个实施方式包括晶体3-(4-(氨甲基)-1-(5-甲基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)哌啶-4-甲酰胺基)苯基二甲基氨基甲酸酯。该晶体游离碱的具体形式在约177.9℃具有差示扫描量热(DSC)峰。在关于DSC数据(开始和峰)的内容中，本文使用的术语“约”是指±3.5℃。
本发明的另一个实施方式包括晶体3-(4-(氨甲基)-1-(5-甲基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)哌啶-4-甲酰胺基)苯基二甲基氨基甲酸酯乙酸盐。具体形式提供含有在以下一处或多处的峰的X-射线衍射(XRPD)图谱：约5.9、9.1、12.0、16.1、17.2、18.4和/或20.2度2θ。因此，本发明的一个实施方式包括一种晶体乙酸盐，其XRPD图谱具有在5.9、9.1和12.0度2θ处的峰。另一个实施方式包括一种晶体乙酸盐，其XRPD图谱具有在12.0、16.1和17.2度2θ处的峰。另一个实施方式包括一种晶体乙酸盐，其XRPD图谱具有在12.0、16.1和17.2度2θ处的峰。17.2、18.4和20.2度2θ。在关于XRPD数据的内容中，本文使用的术语“约”是指±0.3度2θ。
本发明的另一个实施方式包括晶体3-(4-(氨甲基)-1-(5-甲基-7H-比咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)哌啶-4-甲酰胺基)苯基二甲基氨基甲酸酯己二酸盐。具体形式提供含有在以下一处或多处的峰的XRPD图谱：约5.6、21.5和/或22.5度2θ。
本发明的另一个实施方式包括晶体3-(4-(氨甲基)-1-(5-甲基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)哌啶-4-甲酰胺基)苯基二甲基氨基甲酸酯苯甲酸盐。具体形式具有通过DSC确定的约192.3℃(开始温度)的熔点。具体形式在约194.5℃具有DSC峰。具体形式提供含有在以下一处或多处的峰的XRPD图谱：约6.5、15.6、16.5、18.4、19.2、21.3和/或24.2度2θ。因此，本发明的一个实施方式包括一种晶体苯甲酸盐，其XRPD图谱具有在6.5、15.6和16.5度2θ处的峰。另一个实施方式包括一种晶体苯甲酸盐，其XRPD图谱具有在16.5、18.4和19.2度2θ处的峰。如本领域技术人员所熟知，晶体材料的XRPD图谱中峰的相对强度可根据样品制备方式以及数据收集方式而变化。鉴于此，图1中提供了该晶体形式的XRPD图谱的实例。
本发明的另一个实施方式包括晶体3-(4-(氨甲基)-1-(5-甲基-7H-比咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)哌啶-4-甲酰胺基)苯基二甲基氨基甲酸酯苯磺酸盐。具体形式提供含有在以下一处或多处的峰的XRPD图谱：约5.6、9.8、15.0、17.0、19.6、20.4、22.7和/或24.8度2θ。因此，本发明的一个实施方式包括一种晶体苯磺酸盐，其XRPD图谱具有在5.6、9.8和15.0度2θ处的峰。另一个实施方式包括一种晶体苯磺酸盐，其XRPD图谱具有在15.0、17.0和19.6度2θ处的峰。另一个实施方式包括一种晶体苯磺酸盐，其XRPD图谱具有在20.4、22.7和24.8度2θ处的峰。
本发明的另一个实施方式包括晶体3-(4-(氨甲基)-1-(5-甲基-7H-比咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)哌啶-4-甲酰胺基)苯基二甲基氨基甲酸酯延胡索酸盐。具体形式提供含有在以下一处或多处的峰的XRPD图谱：约6.4、10.5、15.6、20.5和/或25.4度2θ。因此，本发明的一个实施方式包括一种晶体延胡索酸盐，其XRPD图谱具有在6.4、10.5和15.6度2θ处的峰。
本发明的另一个实施方式包括晶体3-(4-(氨甲基)-1-(5-甲基-7H-比咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)哌啶-4-甲酰胺基)苯基二甲基氨基甲酸酯盐酸盐。具体形式为无水的。具体形式具有通过DSC确定的约245.8℃(开始温度)的熔点。具体形式在约248.9℃具有DSC峰。具体形式提供含有在以下一处或多处的峰的XRPD图谱：约6.4、11.7、17.0、19.2、23.0和/或25.7度2θ。因此，本发明的一个实施方式包括一种晶体盐酸盐，其XRPD图谱具有在6.4、11.7和17.0度2θ处的峰。另一个实施方式包括一种晶体盐酸盐，其XRPD图谱具有在17.0、19.2和23.0度2θ处的峰。另一个实施方式包括一种晶体盐酸盐，其XRPD图谱具有在23.0和25.7度2θ处的峰。图2中提供了晶体3-(4-(氨甲基)-1-(5-甲基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)哌啶-4-甲酰胺基)苯基二甲基氨基甲酸酯盐酸盐的XRPD图谱的实例。
本发明的另一个实施方式包括晶体3-(4-(氨甲基)-1-(5-甲基-7H-比咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)哌啶-4-甲酰胺基)苯基二甲基氨基甲酸酯马来酸盐。具体形式提供含有在以下一处或多处的峰的XRPD图谱：约7.9、15.9、20.2、24.0、26.1和/或32.2度2θ。因此，本发明的一个实施方式包括一种晶体马来酸盐，其XRPD图谱具有在7.9、15.9和20.2度2θ处的峰。另一个实施方式包括一种晶体马来酸盐，其XRPD图谱具有在24.0、26.1和32.2度2θ处的峰。
本发明的另一个实施方式包括晶体3-(4-(氨甲基)-1-(5-甲基-7H-比咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)哌啶-4-甲酰胺基)苯基二甲基氨基甲酸酯烟酸盐。具体形式提供含有在以下一处或多处的峰的XRPD图谱：约8.3、18.4、25.1、26.4和/或29.6度2θ。因此，本发明的一个实施方式包括一种晶体烟酸盐，其XRPD图谱具有在8.3、18.4和25.1度2θ处的峰。
本发明的另一个实施方式包括晶体3-(4-(氨甲基)-1-(5-甲基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)哌啶-4-甲酰胺基)苯基二甲基氨基甲酸酯磷酸盐。具体形式为单水合物。具体形式具有通过DSC确定的约164.6℃(开始温度)的熔点。具体形式在约170.9℃具有DSC峰。具体形式提供含有在以下一处或多处的峰的XRPD图谱：约4.5、12.9、16.0、18.5、20.3、21.4和/或23.0度2θ。图3中提供了该晶体形式的XRPD图谱的实例。因此，本发明的一个实施方式包括一种晶体磷酸盐，其XRPD图谱具有在4.5、12.9和16.0度2θ处的峰。另一个实施方式包括一种晶体磷酸盐，其XRPD图谱具有在16.0、18.5和20.3度2θ处的峰。另一个实施方式包括一种晶体磷酸盐，其XRPD图谱具有在20.3、21.4和23.0度2θ处的峰。
本发明包括固体，该固体为无定形和晶体形式二者的混合物。某些这样的固体包含晶体3-(4-(氨甲基)-1-(5-甲基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)哌啶-4-甲酰胺基)苯基二甲基氨基甲酸酯或其药学上可接受的盐，其量为至少约50重量％、75重量％、80重量％、85重量％、90重量％、95重量％或99重量％。
3-(4-(氨甲基)-1-(5-甲基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)哌啶-4-甲酰胺基)苯基二甲基氨基甲酸酯的晶体形式可以从无定形的游离碱制得，美国专利申请公开号US-2009-0264450-A1中描述了该晶体形式的合成。通常，可以通过以下方式来获得晶体盐：选择游离碱可溶于其中的溶剂，向该溶剂添加所需盐的适合的酸，以及搅拌并加热该混合物。蒸发、冷却和/或添加反溶剂至混合物可以得到所需盐，该盐可通过过滤来收集。
治疗方法
本发明包括降低患者眼内压的方法，该方法包括向有需要的患者施用治疗有效量或预防有效量的本发明的化合物。
另一个实施方式包括治疗、管控或防止影响患者的视力的疾病或病症的方法，该方法包括将患者的眼睛与本发明的化合物相接触。影响视力的疾病和病症包括青光眼、神经退行性疾病和感染性疾病。
药物组合物
可以利用水溶液、水性混悬剂、和软膏剂将本发明的化合物递送至眼睛(例如局部递送)。正如本领域技术人员已知的，眼用产品在其最终容器中必须是无菌的，以防止眼睛的微生物污染。一旦打开了容器，防腐剂可用于维持无菌。眼用制剂还要求控制制剂的pH、缓冲容量、粘度、和渗透压。优选的制剂具有约6.5至8.5的pH和约0.01至0.1的缓冲容量。具体制剂是等渗的。具体制剂具有约25至50cps的粘度。
可用于提供将活性药物成分(API)有效递送至其作用部位的安全介质的成分是公知的，但将根据API的物理和化学特性而异。
可使用适当缓冲的水溶液来递送水溶性化合物。在溶液组合物中，聚合物成分通常被用于提高组合物的粘度。适合的聚合物的实例包括纤维素聚合物(例如羟丙基甲基纤维素、羟乙基纤维素、乙基羟乙基纤维素)、合成的纤维素(例如羧乙烯聚合物、聚乙烯醇)、多糖(例如黄原胶、瓜尔胶、和葡聚糖)、及其混合物。参见例如美国专利号4,136,173和7,244,440。还可以使用混悬剂来递送化合物。在混悬剂组合物中，聚合物成分通常被用作物理稳定性助剂，帮助保持不溶性成分为悬浮的或可容易地再分散的。参见同上
可使用防腐剂来确保制剂的无菌。适合的防腐剂包括苯扎氯铵、苄索氯铵、氯丁醇、乙酸苯汞、硝酸苯汞、硫柳汞、对羟苯甲酸甲酯、和对羟苯甲酸丙酯。并且可使用抗氧化剂来确保易受氧化影响的制剂的稳定性。适合的抗氧化剂包括乙二胺四乙酸、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、和硫脲。
本发明的具体药物组合物包含3-(4-(氨甲基)-1-(5-甲基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)哌啶-4-甲酰胺基)苯基二甲基氨基甲酸酯的固体形式，并适合于与一种或多种液体介质组合以得到适合于局部施用至眼睛的最终组合物。
实施例
晶体苯甲酸盐的制备
方法A.向烧瓶中添加3-(4-(氨甲基)-1-(5-甲基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)哌啶-4-甲酰胺基)苯基二甲基氨基甲酸酯游离碱(99.9mg，0.221mmol，1当量)和乙腈(2.3mL)，然后添加苯甲酸(33.1mg，0.271mmol，1.23当量)。将反应混合物在室温下搅拌30分钟之后，添加甲醇(0.5mL)。将浆料加热至65℃并搅拌30分钟，然后蒸发甲醇。将反应混合物冷却至室温并搅拌2小时。通过过滤收集固体，使用MTBE(1mL)进行洗涤，并在40-45℃和真空下干燥过夜，以得到类白色固体3-(4-(氨甲基)-1-(5-甲基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)哌啶-4-甲酰胺基)苯基二甲基氨基甲酸酯苯甲酸盐(104.1mg，82.1％)。
方法B.将3-(4-(氨甲基)-1-(5-甲基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)哌啶-4-甲酰胺基)苯基二甲基氨基甲酸酯游离碱(101.1mg，0.224mmol，1当量)和MeOH(1mL)加入反应器。向该透明溶液中添加苯甲酸(33.9mg，0.278mmol，1.24当量)并将所得混合物在室温下搅拌5分钟以得到浆料。添加乙腈(2mL)并将浆料加热至70-73℃并搅拌5分钟以得到溶液。在冷却至室温之后，将反应混合物搅拌2小时。通过过滤收集沉淀物，使用MTBE(1mL)洗涤滤饼，并在40-45℃和真空下干燥过夜，以提供类白色固体3-(4-(氨甲基)-1-(5-甲基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)哌啶-4-甲酰胺基)苯基二甲基氨基甲酸酯苯甲酸盐(94.8mg，75％)。
晶体磷酸盐的制备
将3-(4-(氨甲基)-1-(5-甲基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)哌啶-4-甲酰胺基)苯基二甲基氨基甲酸酯游离碱(101.1mg，0.224mmol，1当量)和甲醇(2.3mL)加入烧瓶。向该溶液中逐滴添加在IPA中的磷酸(0.246mL1M，0.246mmol，1.1当量)。将反应混合物在室温下搅拌10分钟以得到粘性沉淀物，在65℃下加热并搅拌1小时，然后冷却至室温并搅拌2小时。通过过滤收集沉淀的固体。使用MTBE(1mL)洗涤滤饼并在45℃和真空下干燥过夜以提供类白色固体磷酸盐(103.7mg，85.4％)。
晶体盐酸盐的制备
3-(4-((((苄氧基)羰基)氨基)甲基)-1-(5-甲基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)哌啶-4-甲酰胺基)苯基二甲基氨基甲酸酯：在20℃下向氮气惰性环境下的300L不锈钢反应器中加入53kg甲醇和4.5kg(26.8mol，1.1当量)4-氯-5-甲基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶。将该混合物在13℃下搅拌10-30分钟，然后添加12.0kgLP-911510(24.4mol，1.0当量)，在13℃下再次搅拌10-30分钟，然后添加9.6kgN，N-二异丙基乙胺(74.3mol，3.0当量)。然后将反应混合物加热至80-90℃，维持在该温度20-22小时。在冷却至30-35℃之后，将混合物转移至500L的搪玻璃反应器，然后用异丙醇(40kg)清洗。向混合物中添加额外的57kg异丙醇，然后向混合物中加入0.0116kg3-(4-((((苄氧基)羰基)氨基)甲基)-1-(5-甲基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)哌啶-4-甲酰胺基)苯基二甲基氨基甲酸酯晶种。将混合物在45-50℃下加热2-3小时，然后在批料温度≤50℃下将混合物减压浓缩至约96-108L。加入异丙醇(40kg)，并在批料温度≤50℃下将混合物减压浓缩至84-96L。使用39kg异丙醇将该异丙醇添加/浓缩过程再重复一次。将混合物的温度降低至15-20℃并在该温度下搅拌约12小时。然后添加异丙醇(11kg)并将混合物在15-20℃下搅拌约3小时。通过离心机过滤浆料。使用28kg异丙醇洗涤反应器和离心机中的湿滤饼。在45-50℃和真空下将产物干燥24小时。通过将产物在76kg水中搅拌10-30分钟，将残余的N，N-二异丙基乙胺大部分去除。通过离心机过滤产物，并使用26kg水进行洗涤。在45-50℃和真空下将产物干燥24小时以得到12.1kg(83％产率)纯度为98.8％的3-(4-((((苄氧基)羰基)氨基)甲基)-1-(5-甲基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)哌啶-4-甲酰胺基)苯基二甲基氨基甲酸酯。
3-(4-(氨甲基)-1-(5-甲基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)哌啶-4-甲酰胺基)苯基二甲基氨基甲酸酯盐酸盐：在室温下向氮气惰性环境下的300L不锈钢反应器中加入96kg甲醇、12kg3-(4-((((苄氧基)羰基)氨基)甲基)-1-(5-甲基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)哌啶-4-甲酰胺基)苯基二甲基氨基甲酸酯、2.3kg在碳上的湿的10％钯(50％水)和8.0kg甲醇清洗剂。将混合物冷却至0-10℃，然后在0-10C下添加17.2kg氨气。将反应器系统抽真空至≤-0.06MPa，然后用氮气填充至大气压。使用氮气将该循环再重复两次。然后将反应器抽真空至≤-0.06MPa，并用氢气填充至0.5MPa。将该循环再重复两次。在最后一个循环之后，将混合物在25-30℃下搅拌15小时，同时通过调节氢气阀和减压阀将压力维持在0.5-0.6MPa。释放出氢气并使用氮气进行吹扫。使混合物通过硅藻土垫，然后通过内联式精制过滤器(inlinepolishfilter)，并将滤液收集在筒中。用24kg甲醇将反应器和过滤器洗涤两次。合并滤液，IPC分析显示，残余的钯为10ppm，而NMT规范为15ppm。通过内联式过滤器将过滤后的溶液转移至500L搪玻璃反应器中。使用18kg甲醇清洗筒和内联式过滤器并将洗液与溶液合并。在批料温度≤45℃下将溶液减压浓缩至84-96L。加入甲醇(44kg)，并再次在批料温度≤45℃下将溶液减压浓缩至84-96L。添加另一份46kg甲醇，并在批料温度≤45℃下将溶液减压浓缩至108-120L，然后添加15kg甲醇。在55-60℃下，在1.5小时内慢慢添加在乙醇中的氯化氢(9.0kg，用9.6kg纯乙醇和1.9kg乙酰氯制备得到)，然后添加50kg纯乙醇。添加3-(4-(氨甲基)-1-(5-甲基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)哌啶-4-甲酰胺基)苯基二甲基氨基甲酸酯盐酸盐晶种(0.018kg)。将混合物在55-60℃下搅拌1-2小时并冷却至20-40℃。然后在批料温度≤45℃下将混合物减压浓缩至60-72L。添加无水乙醇(46kg)，并再次在批料温度≤45℃下将混合物减压浓缩至60-72L。将乙醇添加/浓缩循环再重复两次。将混合物加热至50-60℃并搅拌1-2小时，然后冷却至0-5℃并搅拌2-3小时。使用离心机过滤浆料，并使用24kg过滤后的冷(-5-0℃)无水乙醇洗涤浆料。将湿滤饼加入500L搪玻璃反应器容器中，然后添加77kg乙腈。将混合物加热至65-70℃并搅拌4-5小时，然后冷却至15-20℃并搅拌2-3小时。通过离心机过滤浆料，并使用24kg乙腈洗涤湿滤饼。在烘箱中将产物在45-50℃下干燥约20小时，并使用筛子去除块状物以得到9.01kg(91％产率)纯度为99.8％的晶体无水3-(4-(氨甲基)-1-(5-甲基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)哌啶-4-甲酰胺基)苯基二甲基氨基甲酸酯盐酸盐。
上面所引用的所有参考文献(例如专利和专利申请)通过参考以其全文并入本文。