两性载体修饰的聚合物颗粒及在蛋白质样品预处理中应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种两性载体修饰的聚合物颗粒的制备及其在蛋白质样品预处理中的应用，属于分析【技术领域】。所述的颗粒通过化学连接臂将两性载体分子键合于聚合物微球表面，该颗粒可用于降低蛋白质样品中高丰度蛋白质的丰度。该方法是一种新型的蛋白质样品预处理方法，能够有效减小蛋白质样品中高丰度蛋白质与低丰度蛋白质之间的丰度差异，相比于传统的蛋白质预处理方法，具有方便易行、成本低廉等特点。该发明在蛋白质组学有较好的应用前景和实用价值。
【专利说明】两性载体修饰的聚合物颗粒及在蛋白质样品预处理中应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及蛋白质样品预处理，具体地说是一种两性载体修饰的聚合物颗粒的制备及其在蛋白质样品预处理中的应用。
【背景技术】
[0002]蛋白质的组成极其复杂，很多蛋白质样品内蛋白质的动态范围特别宽，浓度差异大(丰度差异大)，比如血浆样品中前10种高丰度蛋白质占到总蛋白数的90%，前22种蛋白质占了 99%，余下几千种蛋白仅占1%，而这些低丰度蛋白质却存在潜在的生物学意义，在疾病标志物的发现与治疗方面可能会发挥重要生物功能(J.Proteome Res.，2011，10，5 -16)。因此降低高丰度与低丰度蛋白质之间的差别，用现有的检测技术能够方便地检测到低丰度蛋白质成为蛋白质预处理的核心问题之一。
[0003]目前降低高低丰度蛋白质差异的方法主要有超速离心过滤法、预分级方法、免疫去除法等。超速离心法是根据蛋白质分子量的大小不同实现分离，从而去除部分高丰度蛋白质，但会对高丰度蛋白质去除不充分，而且可能会同时去除高分子量的低丰度蛋白质(Molecular&Cellular Proteomics, 2003, 2, 1096 - 1103)。预分级方法是根据蛋白质样品的溶解度、分子量、等电点、结构等不同对蛋白质进行分级，从而降低蛋白质样品复杂性，易于检测到低丰度蛋白质，一般使用电泳或色谱的方法实现(J.Proteome Res.，2009，8，1143 - 1155;Electrophoresis,2010，31，3580 - 3585;J.Proteome Res.，2009，8，1143 - 1155; J.Proteome Res.，2010，9，1902-1912)，但是这种方法实验步骤比较繁琐，而且需要相应的仪器设备。免疫去除方法是使用高丰度蛋白质的抗体，去除样品中的高丰度蛋白质，从而缩小样品内蛋白质的动态范围(Mol CellProteomics2008, 7, 1963-1973; J Proteome Res2010, 9 (10)，4982-4991)，但是这种方法还有很多目前不可避免的缺点，如，低丰度蛋白质易与部分高丰度蛋白质非特异性结合，产生共去除现象(Electrophoresis2010, 31` (3)，471-482);已发现的抗体种类少(20种);处理样品的体积有限；去除后的样品被稀释；不同蛋白去除效率有一定差异性等。
【发明内容】
[0004]针对以上方法存在的不足，本发明的目的是提供一种简便高效的方法以缩小蛋白质样品中高低丰度蛋白质的丰度差异。
[0005]为实现上述目的，本发明采用的技术方案为:
[0006]采用两性载体修饰的聚丙烯酸酯颗粒处理蛋白质样品，并采用氯化钠溶液，甘氨酸溶液，乙腈溶液分级洗脱的方法缩小蛋白质样品内高丰度蛋白质与低丰度蛋白质的丰度差异。
[0007]所述两性载体修饰聚丙烯酸酯颗粒的制备与蛋白质样品处理的具体步骤如下，
[0008](I)聚合物颗粒活化:颗粒分别经过有机溶剂和磷酸缓冲液洗涤后，采用质量-体积百分比(溶质质量(g)与溶液体积(ml)的百分比)浓度为10-15%的戊二醛活化3-9小时。
[0009](2)修饰两性载体:将步骤(1)活化的聚合物颗粒采用磷酸缓冲液洗涤数遍后，与质量分数为30-45%的两性载体反应12-24小时。
[0010](3)颗粒表面的封尾和还原:颗粒与两性载体反应之后，与质量-体积百分比(溶质质量(g)与溶液体积(ml)的百分比)浓度为10-15%甘氨酸和质量-体积百分比(溶质质量(g)与溶液体积(ml)的百分比)浓度为5-10%的氰基硼氢化钠溶液反应6-9h。
[0011](4)处理蛋白质样品:制备的颗粒采用磷酸盐缓冲液洗涤数遍后，与蛋白质样品在室温条件下孵育1-4小时。
[0012](5)蛋白质洗脱:颗粒离心，去除上清液。采用磷酸盐缓冲液洗涤颗粒，去除上清液。采用氯化钠溶液(NaCl)，甘氨酸溶液(Gly-HCl)，乙腈溶液(ACN，含有0.1%三氟乙酸(TFA))分别进行洗涤，收集洗脱液。其中氯化钠溶液的浓度为0.5-2M，甘氨酸溶液的浓度为50-300mM, pH为1-3.5，乙腈溶液中乙腈与水的体积比为0.2-0.3，pH=2_4 ；
[0013]本发明中所述质量-体积百分比浓度是指溶质质量(g)与溶液体积(ml)的百分比。
[0014]本发明具有如下优点:
[0015](I)本发明制备的两性载体修饰的聚合物微球与三种洗脱试剂的应用能够有效缩小蛋白质样品内高丰度蛋白质与低丰度蛋白质的丰度差异；(2)制备的微球稳定，制备方法重现性好；(3)样品处理方法操作简便，成本低，仅需小型离心机即可实现，无需配备液相仪、电泳仪等辅助仪器，无需使用抗体柱等。`【专利附图】
【附图说明】
[0016]图1凝胶电泳分析蛋白质样品。
[0017]图2蛋白质样品中(血清，HS)前十种高丰度蛋白质丰度变化。前十种高丰度蛋白质分别为:1，血清白蛋白(Albumin) ；2, α-2-巨球蛋白质(Alpha-2-macroglobulin)；
3,免疫球蛋白G(IgG) ;4,纤维素蛋白原(Fibrinogen) ;5，血清补体蛋白C3 (ComplementC3) ；6,转铁蛋白质(Serotransferrin) ;7，免疫球蛋白M(IgM) ;8，α-1-抗胰蛋白酶(Alpha-1-anti trypsin) ；9,免疫球蛋白 A(IgA) ； 10,触珠蛋白(HPR Haptoglobin)。
[0018]图3 (a)蛋白质样品中(血清，HS)蛋白质丰度变化情况之一；
图3 (b)蛋白质样品中(血清，HS)蛋白质丰度变化情况之二。
【具体实施方式】
[0019]下面采用具体实施例对本发明的技术方案做进一步说明。
[0020]两性载体(又名:两性电解质载体,载体两性电解质；CAS号为:37348-94-0 ;英文商品名称:Ampholine (Sigma-Aldrich 公司))
[0021]实施例1
[0022]1.两性载体修饰的聚合物微球的制备与Zeta电势测定
[0023]称取30mg聚丙烯酸酯颗粒，并采用乙醇、磷酸缓冲液(pH8.0)分别清洗三次，在室温条件下与lmL10%戊二醛溶液反应6h后，用水及磷酸缓冲液分别清洗颗粒。
[0024]量取400 μ L两性载体(一种脂肪族多胺基多羧基的混合物，由异构物和同系物组成，pl=3-10)液体，用8mg氰基硼氢化钠与600 μ L磷酸缓冲液的混合液溶解，将该液体与上述颗粒室温反应24h。弃上清，采用磷酸盐缓冲液(PH7.4)清洗7次，即制得两性载体修饰的聚丙烯酸酯微球。
[0025]Zeta电势测定结果如表1所示。两性载体分子是一种多氨基多羧基的混合物，其等电点分布在3-10之间。在不同pH缓冲液中，两性载体表面的氨基和羧基功能基团会存在不同的解离模式。在pH=5的磷酸缓冲液中，表面电势是+3.63，说明颗粒表面带正电荷；在pH=9的磷酸缓冲液中，表面电势是-5.05，说明颗粒表面带负电荷；在pH=7的磷酸缓冲液中，表面电势几乎为零，说明颗粒表面几乎不带电。证明聚合物颗粒表面两性载体的存在。
[0026]表1不同pH条件下，两性载体修饰的聚合物颗粒表面Zeta电势。
[0027]
【权利要求】
1.两性载体修饰的聚合物颗粒，其特征在于:颗粒为聚丙烯酸酯类聚合物颗粒，通过表面的功能基团修饰两性载体分子，修饰的两性载体等电点在2-14之间，颗粒粒径为3-8 μ m0
2.按照权利要求1所述的颗粒，其特征在于:颗粒孔径为6001200人，其并可用于蛋白质样品的预处理； 所述聚丙烯酸酯类聚合物为以丙烯酸甲酯、丙烯酸乙酯、丙烯酸丙酯、丙烯酸丁酯其中一种或多种为单体的聚合物。
3.按照权利要求1或2所述的颗粒，其特征在于:颗粒表面含有氨基功能基团，通过戊二醛活化后，将两性载体分子修饰在颗粒表面，并对颗粒表面进行封尾与还原。
4.按照权利要求3所述的颗粒，其制备过程包括以下具体步骤: (1)聚合物颗粒活化:颗粒分别经过有机溶剂和磷酸缓冲液洗涤后，采用质量-体积百分比浓度为5%-15%的戊二醛活化3-9小时； (2)步骤(1)活化的颗粒修饰两性载体:将步骤(1)活化的聚合物颗粒采用磷酸缓冲液洗涤后，与两性载体反应12-24小时； (3)步骤(2)之后对颗粒表面封尾和还原:与两性载体反应之后，分别使用质量-体积百分比浓度为10-15%的甘氨酸和质量-体积百分比浓度为5-10%的氰基硼氢化钠溶液反应6-9小时。
5.按照权利要求4所述的颗粒，其特征在于:所述两性载体为一种脂肪族多胺基多羧基的混合物，由异构物和同系物组成。
6.一种权利要求1所述修饰两性载体的聚合物颗粒可用于蛋白质样品预处理。`
7.按照权利要求6所述的用于血清或血浆样品预处理，其特征在于: (1)两性载体修饰的聚合物颗粒与样品孵育:将两性载体修饰的聚合物颗粒采用磷酸缓冲液洗涤，与蛋白质样品在室温条件下孵育1-4小时； (2)孵育后，对颗粒上的蛋白质进行洗脱:离心颗粒，去除上清液；采用磷酸缓冲液洗涤颗粒，去除上清液后，分别采用氯化钠溶液，甘氨酸溶液，乙腈溶液进行洗涤，收集洗脱液。
8.按照权利要求6或7所述的用于血清或血浆样品预处理，其特征在于:所述蛋白质样品为血清或血浆样品。
9.按照权利要求7所述的用于血清或血浆样品预处理，其特征在于:所述氯化钠溶液的浓度为0.5-2M，甘氨酸溶液的浓度为50-300mM，pH为1-3.5，乙腈溶液中乙腈与水的体积比为 0.2-0.3，pH=2-4。
【文档编号】C08F20/18GK103864967SQ201210531884
【公开日】2014年6月18日 申请日期:2012年12月11日 优先权日:2012年12月11日
【发明者】张丽华, 邓楠, 朱贵杰, 梁振, 杨开广, 张玉奎 申请人:中国科学院大连化学物理研究所