技术领域
本发明涉及一种制备四种天竺葵素衍生物的方法，具体涉及一种从萝卜皮中分离制备四种高纯度酰基化天竺葵素衍生物的方法。
背景技术：
花色苷(Anthocyanidin)是一种天然的水溶性色素，在自然界中广泛存在，属于类黄酮化合物。花色苷是由花色苷苷元与糖通过糖苷键结合而成的多酚类物质，而且在糖苷基或是羟基上还可以与有机酸通过酯键形成酰基化的花色苷。研究表明花色苷具有多种对人体有益的生理活性，如抗氧化活性、抗炎和预防心血管等慢性疾病。因此可以作为天然色素、天然抗氧化剂及功能食品添加因子应用。
萝卜(RaphanussativusL.)系十字花科植物，在我国各地均有大量栽培。萝卜品种繁多，常见的有白皮白心，红皮白心，绿皮红心，红皮红心等，其中富含花色苷的萝卜一般有鲜艳的种皮或/和芯颜色。在鲜红的萝卜品种中富含大量的酰基化的花色苷。目前报道的不同萝卜品种中所含花色苷主要是天竺葵色素的衍生物，而且大多带有酰基化基团，如p-香豆酸、阿魏酸、丙二酸、咖啡酸等。带酰基化基团的萝卜花色苷性质稳定，是一种很好的色素来源。在常见的萝卜品种红皮白心萝卜中，所含花色苷均为带一个或是两个的酰基化花色苷，其四种主要花色苷的分子结构如下所示。
物质R1R2组分1HA组分2HB组分3AA组分4BB
对花色苷粗品的提取最常用的是溶剂提取法，常用溶剂有甲醇、乙醇、丙酮等。对于花色苷类物质的纯化常用的是大孔树脂吸附法，其效率高，操作简单，适合大规模制备。
高纯度花色苷不仅在食品、医药、化妆品领域有着广阔的应用潜力，而且对于单一花色苷的颜色稳定性和生理功能等方面的深入研究有很重要的价值。现在市售的花色苷标品种类少，并且价格昂贵。尤其是酰基化花色苷标准品少之又少。因此以萝卜皮为原料分离制备高纯度的酰基化花色苷单体有着重大的意义。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种从萝卜皮中分离制备4种高纯度酰基化花色苷单体的方法，所述方法以红皮萝卜如红皮红心萝卜或红皮白心萝卜为原料，通过将其削皮，浸提浓缩、除杂、大孔树脂纯化、凝胶纯化、结合半制备色谱的步骤，得到4种酰基化花色苷，分别为3-[(6-p-香豆酰)-D-吡喃葡萄糖基-(2→1)-D-吡喃葡萄糖苷]-5-D-吡喃葡糖苷天竺葵素、3-[(6-阿魏酰)-D-吡喃葡萄糖基-(2→1)-D-吡喃葡萄糖苷]-5-D-吡喃葡糖苷天竺葵素、3-[(6-p-香豆酰)-D-吡喃葡萄糖基-(2→1)-D-吡喃葡萄糖苷]-5-[(6-丙二酰)-D-吡喃葡糖苷]-天竺葵素、3-[(6-阿魏酰)-D-吡喃葡萄糖基-(2→1)-D-吡喃葡萄糖苷]-5-[(6-丙二酰)-D-吡喃葡糖苷]-天竺葵素。该方法操作简单，能有效从萝卜皮中分离得到高纯度的花色苷单体，并且可实现大规模制备。
为实现上述目的，本发明所采用以下方案：
一种从萝卜皮中分离制备四种高纯度酰基化的天竺葵素衍生物的方法，包括以下步骤：
(1)原料预处理：将新鲜萝卜洗净、剥皮，并将萝卜皮切碎；
(2)萝卜皮花色苷粗提浓缩液：将得到的萝卜皮，按照料液比1∶2(w/v，g/mL)的比例加入0.01％盐酸甲醇溶液(v/v)中，常温下，浸提，过滤，反复三次，然后合并滤液，在40-45℃下真空旋转蒸发除去甲醇得到花色苷粗提液，按所述粗提液∶乙酸乙酯的体积比为1∶2的比例加入乙酸乙酯萃取，静置分层，萃取三次，收集合并水相，在40-50℃下真空旋转充分蒸发去除乙酸乙酯，得到花色苷浸膏；将浸膏用少量的0.01％(v/v)盐酸的水溶液溶解，得到花色苷上样液；
(3)大孔树脂吸附：将大孔吸附树脂装入层析柱中，用0.01％(v/v)盐酸的水溶液冲洗；将花色苷上样液以0.5BV/h的流速注入大孔树脂柱中，先用含0.01％的盐酸(v/v)的去离子水以1BV/h冲洗树脂，再用0.01％的盐酸甲醇溶液(v/v)以1BV/h的流速洗脱，收集颜色鲜艳的洗脱液，将收集到的洗脱液在40-45℃下真空旋转蒸发除去甲醇，得到花色苷粗品；
(4)凝胶纯化：将从大孔树脂纯化得到的花色苷粗品注入凝胶柱用50％的甲醇水(v/v)洗脱，按照每10分钟接取一次，收集洗脱液，将收集到的洗脱液，在40-45℃下真空旋转蒸发除去甲醇，得到初步纯化的花色苷提取物；所述大孔吸附树脂为XAD-7HP(比表面积为500m2/g；平均孔径为平均粒径为560μm；偶极距为1.8；均一系数D90/D40为1.7)；所述凝胶柱为SephadexLH-20(分离范围100-4000；颗粒大小为20-150μm)；
(5)单体制备：利用半制备色谱分离花色苷单体，将从凝胶柱中纯化得到的花色苷提取物，用半制备色谱分离，使用程序1制备分离；所述程序1中的流动相分别为A相：4％磷酸纯水(v/v)，B相：100％乙腈，色谱纯，v/v；采用梯度洗脱条件(v/v)为0-30min：5％-30％(v/v)B相；30-35min：30％(v/v)B相；35-37min：30％-5％(v/v)B相；流速3mL/min。采用常规的C18制备色谱柱，柱温20-40℃；DAD检测器：检测波长为520nm；根据出峰时间，依次收集到3-[(6-p-香豆酰)-D-吡喃葡萄糖基-(2→1)-D-吡喃葡萄糖苷]-5-D-吡喃葡糖苷天竺葵素、3-[(6-阿魏酰)-D-吡喃葡萄糖基-(2→1)-D-吡喃葡萄糖苷]-5-D-吡喃葡糖苷天竺葵素、3-[(6-p-香豆酰)-D-吡喃葡萄糖基-(2→1)-D-吡喃葡萄糖苷]-5-[(6-丙二酰)-D-吡喃葡糖苷]-天竺葵素、3-[(6-阿魏酰)-D-吡喃葡萄糖基-(2→1)-D-吡喃葡萄糖苷]-5-[(6-丙二酰)-D-吡喃葡糖苷]-天竺葵素4种花色苷单体；对首次分离得到的纯度较低的组分1和组分2采用程序2分别进行再分离；所述程序2中的流动相分别为A相：0.5％(v/v)甲酸的纯水，B相：0.5％(v/v)甲酸的甲醇，(色谱纯)；梯度洗脱条件为0-10min：25％-45％B相；10-15min：45％B相，进行二次分离得到纯度较高的花色苷3-[(6-p-香豆酰)-D-吡喃葡萄糖基-(2→1)-D-吡喃葡萄糖苷]-5-D-吡喃葡糖苷天竺葵素、3-[(6-阿魏酰)-D-吡喃葡萄糖基-(2→1)-D-吡喃葡萄糖苷]-5-D-吡喃葡糖苷天竺葵素，进一步浓缩，在40-45℃下，真空旋转蒸发浓缩，得到所述四种花色苷单体制品；四种花色苷单体结构由质谱和核磁分析并根据参考文献报道而确定。
所述盐酸的浓度为12M，所述甲醇、所述乙酸乙酯、所述磷酸、所述甲酸和所述乙腈均为色谱纯。
本发明的优点是：
1、本发明采用大孔树脂，结合凝胶，分离纯化花色苷单体，最后采用半制备色谱制备，其操作简单，易实施。
2、制备的花色苷为高纯度单体，可以选作标样，用于生理活性、花色苷稳定性和颜色机理等的研究，采用本发明的制备方法得到的4种萝卜花色苷单体的纯度分别为96.40％、97.80％、97.00％、98.34％。
3、在半制备液相分离花色苷单体的阶段，仅仅使用一根色谱分离制备柱，通过不同的洗脱条件即可得到四种萝卜花色苷的单体。
附图说明
图1为萝卜花色苷单体制备流程图。
图2为四种花色苷单体的高效液相色谱图(520nm)，按时间顺序分别记为1，2，3，4。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行具体描述，但是本发明技术方案不局限于以下所列举的实施方式。
以下实施例的制备流程如图1所示。
实施例1：
新鲜红皮白心萝卜10kg，清洗，整理，将皮肉分离，得到萝卜皮500g，切碎；与1.0L，0.01％盐酸甲醇溶液(v/v)混合，在室温下浸提1h；浸提后经布氏漏斗抽滤，滤液在45℃下旋转蒸发除去甲醇，得到花色苷提取液100mL；加入200mL乙酸乙酯萃取，萃取三次，每次用量为200mL，得到的萃取液在45℃下旋转蒸发浓缩得到花色苷浸膏；将浸膏用10-25mL的0.01％(v/v)盐酸的水溶液溶解，得到花色苷上样液；
用0.01％(v/v)盐酸的水溶液冲洗XAD-7HP大孔树脂柱(比表面积为500m2/g；平均孔径为平均粒径为560μm；偶极距为1.8；均一系数D90/D40为1.7；预先酸化，以流速为0.5BV/h注入花色苷上样液，待吸附结束后，用含0.01％(v/v)的盐酸的去离子水以1BV/h冲洗树脂除杂；用0.01％(v/v)的盐酸甲醇溶液以1BV/h的流速洗脱，将花色苷成分从树脂上解析下来；收集解析液于45℃下旋转蒸发至无甲醇，得到花色苷浓缩液；经过预先用50％甲醇-水溶液(v/v)处理的SephadexLH-20凝胶柱(分离范围100-4000；颗粒大小为20-150μm，用50％的甲醇水溶液(v/v)洗脱，按照每10分钟接取一次，收集洗脱液，将收集到的洗脱液，在40-45℃下旋转蒸发，得到初步纯化的花色苷提取物；使用半制备色谱分离单体，色谱柱为AgilentEclipseXDB-C18(9.4×250mmi.d.，5μm)；程序1的流动相分别为A相：4％磷酸纯水(v/v)，B相：100％乙腈，色谱纯；采用的梯度洗脱条件(v/v)：0-30min：5％-30％(v/v)B相；30-35min：30％(v/v)B相；35-37min：30％-5％(v/v)B相；流速3mL/min；柱温20-40℃；DAD检测器：检测波长为520nm；按照时间顺序收集相同保留时间的吸收峰，得到12mg组分1，15mg组分2，63mg组分3和7mg组分4。程序2的流动相分别为A相：0.5％甲酸纯水(v/v)，B相：0.5％甲酸的甲醇(色谱纯，v/v)；采用的梯度洗脱条件(v/v)：0-10min：25％-45％B相；10-15min：45％B相；其他条件同程序1。制得的4种花色苷单体的得率分别为2.4mg/100g鲜重萝卜皮、3mg/100g鲜重萝卜皮、12.6mg/100g鲜重萝卜皮、1.4mg/100g鲜重萝卜皮。根据天竺葵素在520nm的最大吸收峰面积与全部物质在280-600nm范围内最大吸收峰面积总和的比值，可计算四个组分的纯度分别为96.40％、97.80％、97.00％、98.34％。
实施例2：
新鲜红皮红心萝卜20kg，清洗，整理，将皮肉分离，得到萝卜皮1000g，切碎；与2L，0.01％盐酸甲醇溶液(v/v)混合，在室温下浸提2h；浸提后经布氏漏斗抽滤，滤液在45℃下旋转蒸发除去甲醇，得到花色苷提取液500mL；加入1000mL乙酸乙酯萃取，萃取三次，每次乙酸乙酯的用量为1000mL，得到的萃取液在47℃下旋转蒸发浓缩得到花色苷浸膏；将浸膏用50-100mL的0.01％(v/v)盐酸的水溶液溶解，得到花色苷上样液；用0.01％(v/v)盐酸的水溶液冲洗XAD-7HP大孔树脂柱(比表面积为500m2/g；平均孔径为平均粒径为560μm；偶极距为1.8；均一系数D90/D40为1.7；进行预先酸化，以流速为0.5BV/h注入花色苷上样液，待吸附结束后，先用含0.01％(v/v)的盐酸的去离子水2L，以1BV/h冲洗树脂除杂；用0.01％(v/v)的盐酸甲醇溶液以1BV/h的流速洗脱，将花色苷成分从树脂上解析下来；收集洗脱液于45℃下旋转蒸发至无甲醇得到花色苷浓缩液；经过预先用50％(v/v)甲醇-水溶液处理的SephadexLH-20凝胶柱(分离范围100-4000；颗粒大小为20-150μm，)，用50％(v/v)的甲醇水洗脱，按照每10分钟接取一次，收集洗脱液，将收集到的洗脱液，在40-45℃下旋转蒸发，得到初步纯化的花色苷提取物；使用半制备色谱分离单体，步骤同实施例1。最后得到25mg组分1，32mg组分2，134mg组分3和10mg组分4，即得到的四种花色苷单体3-[(6-p-香豆酰)-D-吡喃葡萄糖基-(2→1)-D-吡喃葡萄糖苷]-5-D-吡喃葡糖苷天竺葵素、3-[(6-阿魏酰)-D-吡喃葡萄糖基-(2→1)-D-吡喃葡萄糖苷]-5-D-吡喃葡糖苷天竺葵素、3-[(6-p-香豆酰)-D-吡喃葡萄糖基-(2→1)-D-吡喃葡萄糖苷]-5-[(6-丙二酰)-D-吡喃葡糖苷]-天竺葵素、3-[(6-阿魏酰)-D-吡喃葡萄糖基-(2→1)-D-吡喃葡萄糖苷]-5-[(6-丙二酰)-D-吡喃葡糖苷]-天竺葵素的得率分别为2.5mg/100g鲜重萝卜皮，3.2mg/100g鲜重萝卜皮，13.4mg/100g鲜重萝卜皮，1mg/100g鲜重萝卜皮。根据天竺葵素在520nm的最大吸收峰面积与全部物质在280-600nm范围内最大吸收峰面积总和的比值，可计算四个组分的纯度分别为96.40％、97.80％、97.00％、98.34％。
本发明的一种从萝卜皮中分离制备高纯度的酰基化的天竺葵素衍生物的方法已经通过具体的实例进行了描述，本领域技术人员可借鉴本发明内容，适当改变原料、工艺条件等环节来实现相应的其它目的，其相关改变都没有脱离本发明的内容，所有类似的替换和改动对于本领域技术人员来说是显而易见的，都被视为包括在本发明的范围之内。