一种利用连续克隆技术生产孤雌生殖克隆猪的方法与流程

本发明涉及一种利用连续克隆技术生产孤雌生殖克隆猪的方法，以孤雌胎儿成纤维细胞为最初供体细胞，利用体细胞核移植技术进行连续克隆获得成活的孤雌生殖的猪个体的技术，属于繁殖生物学领域。

背景技术：
孤雌生殖是指无雄性配子的任何作用，由雌性配子产生的胚胎，不论其是否发生成个体的无性生殖过程。孤雌生殖的对于阐明哺乳动物卵激活过程的信号偶联过程、细胞周期阻滞的恢复、受精机制和发育机理具有重要的应用价值。加之由于父系基因的缺失，孤雌生殖对研究哺乳动物的胚胎、胎盘的生长发育和印记基因有重要意义。经孤雌生殖而产生的单倍体和纯合双倍体细胞系在各种遗传学和动物育种中都具有重要的价值。但是猪的孤雌生殖在自然条件下是无法自发进行的。通常是通过人工体外激活，猪的成熟的卵母细胞转化为二倍体的孤雌胚胎，其在体内最多发育至30天便停止发育。因此，怎样促使猪的孤雌胚胎在体内发育时间延长并最终获得孤雌生殖个体一直是技术难点和热点。

技术实现要素：
针对上述问题，本发明提供一种利用连续克隆技术生产孤雌生殖克隆猪的方法，针对猪的孤雌生殖的胚胎在体内发育至30天便停止发育的情况，利用体细胞核移植技术，延长猪的孤雌胚胎在体内的发育时间，并最终获得存活的孤雌克隆猪。为解决技术问题，本发明采用的技术方案：一种利用连续克隆技术生产孤雌生殖克隆猪的方法按照下面步骤进行：第一步、获得猪孤雌胎儿成纤维细胞对猪成熟卵母细胞进行高速离心，使脂肪颗粒与细胞质分离，并用显微操作技术去除脂肪颗粒，然后对其进行孤雌激活获得孤雌胚胎，移植到代孕母猪体内，取25－29日龄成活孤雌胎儿，建立猪孤雌胎儿成纤维细胞系；第二步、通过第一代克隆获得猪孤雌生殖的克隆胎儿成纤维细胞首先，将分离的猪孤雌胎儿成纤维细胞作为供体细胞，通过体细胞核移植技术进行第一代体细胞核移植，将重构胚移植到代孕母猪体内发育，手术获取能发育超过成活35日龄的第一代孤雌生殖的克隆胎儿，并分离培养猪孤雌生殖的克隆胎儿成纤维细胞；第三步、通过第二代甚至第三代、第四代克隆最终获得成活的孤雌生殖克隆猪将第一代克隆获得的猪孤雌生殖的克隆胎儿成纤维细胞作为供体细胞，通过体细胞核移植技术进行第二代体细胞核移植，将重构胚胎移植到代孕母猪体内发育，获得第二代孤雌生殖的克隆猪。在第三步中，当第二代克隆不能获得成活的孤雌生殖克隆猪，则取比第一代孤雌克隆胎儿更进一步发育的胎儿或出生后因畸形等原因死亡的孤雌生殖克隆猪组织，建立成纤维细胞系，进行第三代克隆，以此类推甚至进行第四代克隆，直至最终获得成活的孤雌生殖克隆猪。在第一步中的高速离心，转速为13000rmp，时间为20min。本发明中的卵母细胞的去脂、孤雌激活、胎儿成纤维细胞系的建立、体细胞核移植技术均采用现有技术完成。本发明的有益效果：本发明利用体细胞核移植技术的基因组重组原理，使孤雌胎儿的成纤维细胞的基因组重组，实现了孤雌胎儿在体内发育时间的延长直至出生。本方法都基于成熟的技术，可控性高，实用性强。附图说明图1为本发明的流程示意图；图2为本发明的流程框图。具体实施方式下面结合附图和具体实施例对本发明的作进一步详述，以方便技术人员理解。如图1、2所示：一种利用连续克隆技术生产孤雌生殖克隆猪的方法按照下面步骤进行：第一步、获得猪孤雌胎儿成纤维细胞；对猪成熟卵母细胞进行高速离心，使其脂肪颗粒与细胞质分离，并用显微操作技术去除脂肪颗粒，然后对其进行孤雌激活获得孤雌胚胎，移植到代孕母猪体内，取25－29日龄成活孤雌胎儿，建立猪孤雌胎儿成纤维细胞系；第二步、通过第一代克隆获得猪孤雌生殖的克隆胎儿成纤维细胞；首先，将分离的猪孤雌胎儿成纤维细胞作为供体细胞，通过体细胞核移植技术进行第一代体细胞核移植，将重构胚移植到代孕母猪体内发育，手术获取能发育超过成活35日龄的第一代孤雌生殖的克隆胎儿，并分离培养猪孤雌生殖的克隆胎儿成纤维细胞；第三步、通过第二代甚至第三代、第四代克隆最终获得成活的孤雌生殖克隆猪；将第一代克隆获得的猪孤雌生殖的克隆胎儿成纤维细胞作为供体细胞，通过体细胞核移植技术进行第二代体细胞核移植，将重构胚胎移植到代孕母猪体内发育，大约114天获得第二代孤雌生殖的克隆猪。在第三步中，当第二代克隆不能获得成活的孤雌生殖克隆猪，则取比第一代孤雌克隆胎儿更进一步发育的胎儿或出生后因畸形等原因死亡的孤雌生殖克隆猪组织，建立成纤维细胞系，进行第三代克隆，以此类推甚至进行第四代克隆，直至最终获得成活的孤雌生殖克隆猪。在第一步中的高速离心，转速为13000rmp，时间为20min。本发明中的猪成熟卵母细胞的去脂、孤雌激活、胎儿成纤维细胞的分离、体细胞核移植技术均采用现有技术完成。实施例1利用体细胞核移植技术连续克隆猪胎儿成纤维细胞，并最终获得存活的猪个体，具体实施方法如下：第一步、获得猪孤雌胎儿成纤维细胞；从屠宰场收集猪的卵巢，保存在生理盐水内运送回实验室，挑取猪的卵母细胞并进行体外成熟培养。对成熟的卵母细胞进行高速离心（13000rmp，20min），使其脂肪颗粒聚集成团并用显微操作技术去除脂肪颗粒。然后对其进行孤雌激活获得孤雌胚胎，并将孤雌胚胎移植到当天发情的代孕母猪体内继续发育。在第23天对母猪进行怀孕诊断，对怀孕25日龄的代孕母猪进行剖腹手术，获取25日龄的孤雌胚胎，把存活的孤雌胚胎去头、尾、四肢、内脏，剪碎剩余部分组织，用含有0.1%胶原酶进行消化，分离胎儿成纤维细胞；待细胞生长汇集达到90%以上时进行传代、冷冻保存。第二步、通过第一代克隆获得猪孤雌生殖的克隆胎儿成纤维细胞；首先，将分离的25日龄的猪孤雌胎儿成纤维细胞作为供体细胞，通过体细胞核移植技术进行第一代体细胞核移植构建重构胚，并进行电激活和电融合，将重构胚移植到代孕母猪体内继续发育。在第23天对母猪进行怀孕诊断，对怀孕43日龄的代孕母猪进行剖腹手术，获取43日龄的孤雌克隆胚胎，把存活的孤雌胚胎去头、尾、四肢、内脏，剪碎剩余部分组织，用含有0.1%胶原酶进行消化，分离胎儿成纤维细胞；待细胞生长汇集达到90%以上时进行传代、冷冻保存。第三步、通过第二代克隆获得孤雌生殖克隆猪；将分离的43日龄的猪孤雌胎儿成纤维细胞作为供体细胞，通过体细胞核移植技术进行第二代体细胞核移植构建重构胚，并进行电激活和电融合，将重构胚移植到代孕母猪体内继续发育。在第23天对代孕母猪进行怀孕诊断，约114天后获得第二代孤雌生殖的克隆猪。实施例2利用体细胞核移植技术连续克隆猪胎儿成纤维细胞，并最终获得存活的猪个体，具体实施方法如下：第一步、获得猪孤雌胎儿成纤维细胞；从屠宰场收集猪的卵巢，保存在生理盐水内运送回实验室，挑取猪的卵母细胞并进行体外成熟培养。对成熟的卵母细胞进行高速离心（13000rmp，20min），使其脂肪颗粒聚集成团并用显微操作技术去除脂肪颗粒。然后对其进行孤雌激活获得孤雌胚胎，并将孤雌胚胎移植到当天发情的代孕母猪体内继续发育。在第23天对母猪进行怀孕诊断，对怀孕25日龄的代孕母猪进行剖腹手术，获取25日龄的孤雌胚胎，把存活的孤雌胚胎去头、尾、四肢、内脏，剪碎剩余部分组织，用含有0.1%胶原酶进行消化，分离胎儿成纤维细胞；待细胞生长汇集达到90%以上时进行传代、冷冻保存。第二步、通过第一代克隆获得猪孤雌生殖的克隆胎儿成纤维细胞；首先，将分离的25日龄的猪孤雌胎儿成纤维细胞作为供体细胞，通过体细胞核移植技术进行第一代体细胞核移植构建重构胚，并进行电激活和电融合，将重构胚移植到代孕母猪体内继续发育。在第23天对母猪进行怀孕诊断，对怀孕43日龄的代孕母猪进行剖腹手术，获取43日龄的孤雌克隆胚胎，把存活的孤雌胚胎去头、尾、四肢、内脏，剪碎剩余部分组织，用含有0.1%胶原酶进行消化，分离胎儿成纤维细胞；待细胞生长汇集达到90%以上时进行传代、冷冻保存。第三步、通过第二代克隆获得孤雌生殖克隆猪；将分离的43日龄的猪孤雌胎儿成纤维细胞作为供体细胞，通过体细胞核移植技术进行第二代体细胞核移植构建重构胚，并进行电激活和电融合，将重构胚移植到代孕母猪体内继续发育。在第23天对代孕母猪进行怀孕诊断，约114天后获得第二代孤雌生殖的克隆猪，但是此孤雌个体有畸形，在体外存活很短时间便死亡。取此孤雌克隆猪的耳朵组织，剪碎并用含有0.1%胶原酶进行消化，分离新生儿成纤维细胞；待细胞生长汇集达到90%以上时进行传代、冷冻保存。第四步、通过第三代克隆获得存活的孤雌生殖克隆猪；将分离孤雌生殖的克隆猪新生儿成纤维细胞作为供体细胞，通过体细胞核移植技术进行第三代体细胞核移植构建重构胚，并进行电激活和电融合，将重构胚移植到代孕母猪体内继续发育。在第23天对代孕母猪进行怀孕诊断，约114天获得存活的第三代孤雌生殖的克隆猪。本发明以孤雌胎儿成纤维细胞为最初供体细胞，利用体细胞核移植技术进行连续克隆获得猪的孤雌生殖的个体的技术，克服了猪的孤雌生殖的胚胎在体内发育至30天便停止发育的情况，延长猪的孤雌胚胎在体内的发育时间，并最终获得出生的孤雌克隆猪，实现了孤雌胎儿在体内发育时间的延长直至出生。本发明通过实施例进行说明的内容，在不脱离本发明范围的情况下，还可以对本发明专利进行各种变换及等同代替，因此，本发明专利不局限于所公开的具体实施过程，而应当包括落入本发明专利权利要求范围内的全部实施方案。