一种制备依诺肝素钠的工艺的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种制备依诺肝素钠的工艺，包括：S1：肝素-苄索氯铵盐的制备；S2：肝素苄基酯的制备；S3：肝素苄基酯的裂解；S4：依诺肝素钠的脱色；S5：阴离子交换层析：收集洗脱液，检测分子量分布为重均分子量4000～4600，2000～8000分子量的比例为72-78％；S6：冻干：酒精沉淀，除菌，冻干，得到所述的依诺肝素钠。该方法通过采用阴离子交换树脂层析等得到收率高、高纯度的依诺肝素钠产品，且该工艺自动化程度高，操作便捷，为提升产能提供了有力保障，适合大规模生产。
【专利说明】一种制备依诺肝素钠的工艺
【技术领域】
[0001] 本发明涉及医药和化学领域中的一种药用化学药品的制备，具体涉及一种制备依 诺肝素钠的工艺。
【背景技术】
[0002] 肝素自上世纪80年代以来一直是预防和治疗血栓类药物的首选药物，低分子肝 素（包括达肝素钠、依诺肝素、那屈肝素）是由普通肝素通过特异性的化学切割和纯化分离 制成，自上个世纪末，赛诺菲公司的依诺肝素被美国FDA批准在美国上市以来，低分子肝素 由于其疗效确切，副作用小而且可预测等优点，逐步取代了传统肝素的市场地位。依诺肝素 可有效预防静脉血栓栓塞症和肺栓塞症，可用于矫形外科、神经外科术前和术后血栓形成， 可大大降低患中风风险，能更有效减少不稳定性冠状动脉综合症患者的死亡、心力衰竭、复 发性心绞痛等，并可降低高甘油三脂血症，能有效解决普通未分级肝素及其衍生物长期使 用后的出血、骨质疏松、诱导血小板减少等副作用。
[0003] 由于低分子肝素类多糖药物由一系列未能完全鉴别的寡糖混合物组成，结构及其 复杂，无法依靠单一方法对其进行结构确定，技术难度很高，所以对国内企业来说，形成了 进入欧美高附加值终端市场特别是美国市场的一个技术壁垒。
[0004] 目前，国内有采用酒精分级沉淀、超滤膜分离、分子筛和凝胶过滤层析的方法来控 制依诺肝素的分子量，这些方法有个共同的特点就是收率很低，一般只有20%以下，分子量 控制精度低，且不同程度的具有费时、费力，自动化程度低的缺点，不适合大规模生产，限制 了产能的提升。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种制备依诺肝素钠的工艺，该方法通过采用阴离子交换树 脂层析等得到收率高、高纯度的依诺肝素钠产品，且该工艺自动化程度高，操作便捷，为提 升产能提供了有力保障，适合大规模生产；克服了现有技术中的费时、费力，自动化程度低， 不适合大规模生产，并限制了产能的提升的不足。
[0006] 本发明的目的是通过以下技术方案来实现：
[0007] -种制备依诺肝素钠的工艺，该制备方法包括以下步骤：
[0008] S1 :肝素-苄索氯铵盐的制备：将肝素钠和苄索氯铵分别溶解于纯化水中，得肝素 钠溶解液和苄索氯铵溶解液，室温搅拌下将肝素钠溶解液缓慢加入到苄索氯铵溶解液中， 加入完毕后继续室温下搅拌，收集沉淀物，即为肝素-苄索氯铵盐，并将其在50°C?60°C真 空干燥，得到含水量低于5 %的肝素-苄索氯铵盐；
[0009] S2 :肝素苄基酯的制备：将步骤S1中得到的肝素-苄索氯铵盐溶解于二氯甲烷 中，在25?45°C下搅拌至充分溶解，加入氯化苄，继续搅拌反应24?48小时，再将反应液 压入过滤器内，加入醋酸钠甲醇溶液，析出沉淀，静置，利用压缩空气压滤，甲醇洗涤，沉淀 冷冻干燥，得到含水量低于5%、酯化率大于9的肝素苄基酯；
[0010] S3 :肝素苄基酯的裂解：将步骤S2中得到的肝素苄基酯充分溶解于纯化水中，搅 拌，并在35?65°C下加入氢氧化钠，反应1?3小时，冷却到室温，调pH到中性，加入氯化 钠，析出油状物，板框过滤，过膜，加入甲醇析出沉淀，滤板过滤，乙醇洗涤，空气压干，得沉 淀物；
[0011] S4 :依诺肝素钠的脱色：将步骤S3中所述的沉淀物用水充分溶解，调pH到碱性， 室温脱色10?20分钟，pH调回到中性，准备进行阴离子交换层析；
[0012] S5 :阴离子交换层析：采用阴离子交换树脂，按25-35mg低分子肝素钠/ml-resin 上样，温度为室温，检测波长为UV232nm，上样结束后先用350?550mmol/L的氯化钠溶液洗 涤，再用1?2mol/L的氯化钠溶液洗脱，洗脱终点为232nm紫外吸收降至基线平稳，收集洗 脱液，检测分子量分布为重均分子量4000?4600,2000?8000分子量的比例为72-78% ;
[0013] S6 :冻干：酒精沉淀，除菌，冻干，得到所述的依诺肝素钠。
[0014] 进一步优选地，步骤S1中，所述肝素-苄索氯铵盐的获得方法为：将肝素钠溶解 液缓慢加入到苄索氯铵溶解液中后继续室温下搅拌1?5小时，将初步得到的沉淀物离心， 反复用纯化水洗涤，再离心，直到滤液遇10%的硝酸银溶液不显浑浊的沉淀物为所述的肝 素-苄索氯铵盐，然后将其真空干燥，得到最终含水量低于5%的肝素苄索氯铵盐。
[0015] 进一步优选地，步骤S2中，肝素苄基酯的具体制备方法为：将步骤S1中得到的肝 素-苄索氯铵盐按1 : 1?5溶解于二氯甲烷中，开启机械搅拌，在25?45°C下搅拌至充 分溶解，加入1?5倍量的氯化苄，继续保持25?45°C，搅拌反应24?48小时，将反应液 压入三合一滤器，边搅拌边加入醋酸钠甲醇溶液，析出沉淀，静置，利用压缩空气压滤，甲醇 洗涤，反复几次直至滤液遇水无乳化现象，沉淀冷冻干燥24小时，得到肝素苄基酯，含水量 低于5%，酯化率大于9。
[0016] 进一步优选地，加入等体积的10%醋酸钠甲醇溶液。
[0017] 进一步优选地，在步骤S3中，将肝素苄基酯按1 : 1?30的重量比加入至纯化水 中并充分溶解。
[0018] 进一步优选地，将步骤S3中充分溶解于纯化水中的肝素苄基酯在35?65 °C的 搅拌条件下加入5%?12%氢氧化钠固体的溶解液，反应完毕后接上冷媒管迅速冷却到室 温。
[0019] 进一步优选地，所述过膜为过0. 45 μ m的膜。
[0020] 进一步优选地，步骤S4中，通过加入0. 5?1. 5%的双氧水在室温下进行脱色。
[0021] 进一步优选地，步骤S6中所述酒精沉淀是向洗脱液中加入两倍酒精进行沉淀，开 启冷媒，静置过夜，第二天弃去上清液，沉淀再加一倍酒精进行脱水，弃去上清，加入一定量 的纯化水进行溶解。
[0022] 进一步优选地，步骤S6中所述的除菌为通过除菌膜进行除菌。
[0023] 本发明提供了一种制备依诺肝素钠的工艺，其主要具有的有益效果为：该工艺通 过阴离子交换层析来控制低分子肝素钙的分子量，使得分子量能在1 %以内精确控制，同时 收率能提高至50%以上，且该方法能够制备出高纯度、高活性的依诺肝素钠产品，产品质量 明显高于EP现行版药典标准；并且自动化程度高，操作便捷，为提升产能提供了有力保障； 故该方法具有重要的工业应用前景。
【具体实施方式】
[0024] 本发明实施例所述的一种制备依诺肝素钠的工艺，下面以具体实验案例为例来说 明【具体实施方式】，应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定 本发明。
[0025] 实施例1 :制备依诺肝素钠的工艺
[0026] ①肝素-苄索氯铵盐的制备：将4kg肝素钠溶解于40kg的纯化水中，将4?6kg苄 索氯铵溶解在50L纯化水中，室温搅拌下将肝素钠溶解液缓慢加入到苄索氯铵溶解液中， 加入完毕后继续室温下搅拌1?5小时，沉淀物离心，反复用纯化水洗涤，离心，直到滤液遇 10%的硝酸银溶液不显浑浊，沉淀50°C?60°C真空干燥24小时，得到含水量低于5%的肝 素苄索氯铵盐。
[0027] ②肝素苄基酯的制备：将上步得到的肝素钠苄索氯铵盐按重量比1 : 1(肝素钠 苄索氯铵盐：二氯甲烷）溶解于二氯甲烷中，开启机械搅拌，保持水浴夹套温度25?45°C 搅拌至充分溶解，加入肝素钠苄索氯铵盐1?2倍重量的氯化苄，保持夹套水温搅拌反应 24?48小时，将反应液压入三合一过滤器，边搅拌边加入等体积的10%醋酸钠甲醇溶液， 析出沉淀，静置，利用压缩空气压滤，甲醇洗涤，反复几次直至滤液遇水无乳化现象，沉淀冷 冻干燥24小时，得到肝素苄基酯，含水量低于5%，酯化率大于9。
[0028] ③肝素苄基酯的裂解：将上步得到的肝素苄基酯按重量比1 : 1?5(肝素苄基 酯：纯化水）溶解于纯化水中，反应罐水浴夹套保持35?65°C，开启机械搅拌，待肝素苄基 酯充分溶解后加入8%?12%氢氧化钠固体的溶解液，反应1?3小时，接上冷媒管迅速冷 却到室温，用HC1调pH到中性，加入氯化钠（10% )，析出油状物，板框过滤，过0. 45 μ m膜， 加入溶液3倍体积的甲醇析出沉淀物，10 μ m滤板过滤，乙醇洗涤，空气压干，得到肝素苄基 酯裂解后的沉淀物。
[0029] ④依诺肝素钠的脱色：将上述沉淀物用1?4倍重量的水溶解，溶解完全后放入容 器中，调pH到碱性，加入0. 5?1%的双氧水室温脱色10?20分钟，pH调回到中性，准备 上柱层析。
[0030] ⑤阴离子交换层析调节分子量：采用GE healthcare公司生产的Q Sepharose FF阴离子交换树脂，按25-35mg低分子肝素钠/ml-resin上样，温度为室温，检测波长为 UV232nm，上样结束后先用350?550mmol/L的氯化钠溶液洗涤，再用1?2mol/L的氯化 钠溶液洗脱，洗脱终点为232nm紫外吸收降至基线平稳，收集洗脱液，检测分子量分布为重 均分子量4000-4600,小于2000分子量的比例为15-17%，2000?8000分子量的比例为 72-78 %，完全符合依诺肝素钠的质量标准。
[0031] ⑥冻干：向洗脱液中加入两倍酒精进行沉淀，开启冷媒，静置过夜，第二天弃去上 清液，沉淀再加一倍酒精进行脱水，弃去上清，加入一定量的纯化水溶解，溶解液过除菌膜， 放入冰箱冻干，收得最终产品依诺肝素钠2. 15kg，收率为53. 75%。
[0032] 实施例2 :制备依诺肝素钠的工艺
[0033] ①肝素-苄索氯铵盐的制备：将4kg肝素钠溶解于40kg的纯化水中，将5?8kg苄 索氯铵溶解在50L纯化水中，室温搅拌下将肝素钠溶解液缓慢加入到苄索氯铵溶解液中， 加入完毕后继续室温下搅拌1?5小时，沉淀物离心，反复用纯化水洗涤，离心，直到滤液遇 10%的硝酸银溶液不显浑浊，沉淀50°C?60°C真空干燥24小时，得到含水量低于5%的肝 素苄索氯铵盐。
[0034] ②肝素苄基酯的制备：将上步得到的肝素钠苄索氯铵盐按重量比1 : 2?3(肝 素钠苄索氯铵盐：二氯甲烷）溶解于二氯甲烷中，开启机械搅拌，保持水浴夹套温度25? 45°C搅拌至充分溶解，加入肝素钠苄索氯铵盐3倍重量的氯化苄，保持夹套水温搅拌反应 24?48小时，将反应液压入三合一过滤器，边搅拌边加入等体积的10 %醋酸钠甲醇溶液， 析出沉淀，静置，利用压缩空气压滤，甲醇洗涤，反复几次直至滤液遇水无乳化现象，沉淀冷 冻干燥24小时，得到肝素苄基酯，含水量低于5%，酯化率大于9。
[0035] ③肝素苄基酯的裂解：将上步得到的肝素苄基酯按重量比1 : 6?10 (肝素苄基 酯：纯化水）溶解于纯化水中，反应罐水浴夹套保持35?65°C，开启机械搅拌，待肝素苄基 酯充分溶解后加入5%?7%氢氧化钠固体的溶解液，反应1?3小时，接上冷媒管迅速冷 却到室温，用HC1调pH到中性，加入氯化钠（10% )，析出油状物，板框过滤，过0. 45 μ m膜， 加入溶液3倍体积的甲醇析出沉淀物，10 μ m滤板过滤，乙醇洗涤，空气压干，得到肝素苄基 酯裂解后的沉淀物。
[0036] ④依诺肝素钠的脱色：将上述沉淀物用5?7倍重量的水溶解，溶解完全后放入容 器中，调pH到碱性，加入1. 1?1. 5%的双氧水室温脱色10?20分钟，pH调回到中性，准 备上柱层析。
[0037] ⑤阴离子交换层析调节分子量：采用GE healthcare公司生产的Q Sepharose FF阴离子交换树脂，按25-35mg低分子肝素钠/ml-resin上样，温度为室温，检测波长为 UV232nm，上样结束后先用350?550mmol/L的氯化钠溶液洗涤，再用1?2mol/L的氯化 钠溶液洗脱，洗脱终点为232nm紫外吸收降至基线平稳，收集洗脱液，检测分子量分布为重 均分子量4000-4600,小于2000分子量的比例为15-17%，2000?8000分子量的比例为 72-78 %，完全符合依诺肝素钠的质量标准。
[0038] ⑥冻干：向洗脱液中加入两倍酒精进行沉淀，开启冷媒，静置过夜，第二天弃去上 清液，沉淀再加一倍酒精进行脱水，弃去上清，加入一定量的纯化水溶解，溶解液过除菌膜， 放入冰箱冻干，收得最终产品依诺肝素钠2. 5kg。
[0039] 实施例3
[0040] 本发明创造了一种通过阴离子交换层析技术制备依诺肝素钠的工艺。肝素钠依次 经过苄索氯铵盐化、苄基酯化、碱性降解、氧化脱色、过滤除杂、滤液再经阴离子交换层析处 理，得到平均分子量分布范围符合要求的依诺肝素钠产品。本发明采用阴离子交换树脂，分 布洗脱收集液，制备出质量稳定可控，高纯度、高活性的依诺肝素产品，质量明显高于EP现 行版药典标准（见下表）。
[0041]
【权利要求】
1. 一种制备依诺肝素钠的工艺，其特征在于：该制备方法包括以下步骤： S1:肝素-苄索氯铵盐的制备：将肝素钠和苄索氯铵分别溶解于纯化水中，得肝素钠溶 解液和苄索氯铵溶解液，室温搅拌下将肝素钠溶解液缓慢加入到苄索氯铵溶解液中，加入 完毕后继续室温下搅拌，收集沉淀物，即为肝素-苄索氯铵盐，并将其在50°c?60°C真空干 燥，得到含水量低于5%的肝素-苄索氯铵盐； 52 :肝素苄基酯的制备：将步骤S1中得到的肝素-苄索氯铵盐溶解于二氯甲烷中，在 25?45°C下搅拌至充分溶解，加入氯化苄，继续搅拌反应24?48小时，再将反应液压入过 滤器内，加入醋酸钠甲醇溶液，析出沉淀，静置，利用压缩空气压滤，甲醇洗涤，沉淀冷冻干 燥，得到含水量低于5%、酯化率大于9的肝素苄基酯； 53 :肝素苄基酯的裂解：将步骤S2中得到的肝素苄基酯充分溶解于纯化水中，搅拌，并 在35?65°C下加入氢氧化钠，反应1?3小时，冷却到室温，调pH到中性，加入氯化钠，析 出油状物，板框过滤，过膜，加入甲醇析出沉淀，滤板过滤，乙醇洗涤，空气压干，得沉淀物； 54 :依诺肝素钠的脱色：将步骤S3中所述的沉淀物用水充分溶解，调pH到碱性，室温 脱色10?20分钟，pH调回到中性，准备进行阴离子交换层析； 55 :阴离子交换层析：采用阴离子交换树脂，按25-35mg低分子肝素钠/ml-resin上 样，温度为室温，检测波长为UV232nm，上样结束后先用350?550mmol/L的氯化钠溶液洗 涤，再用1?2mol/L的氯化钠溶液洗脱，洗脱终点为232nm紫外吸收降至基线平稳，收集洗 脱液，检测分子量分布为重均分子量4000?4600,2000?8000分子量的比例为72-78% ; 56 :冻干：酒精沉淀，除菌，冻干，得到所述的依诺肝素钠。
2. 根据权利要求1所述的制备依诺肝素钠的工艺，其特征在于：步骤S1中，所述肝 素-苄索氯铵盐的获得方法为：将肝素钠溶解液缓慢加入到苄索氯铵溶解液中后继续室温 下搅拌1?5小时，将初步得到的沉淀物离心，反复用纯化水洗涤，再离心，直到滤液遇10% 的硝酸银溶液不显浑浊的沉淀物为所述的肝素-苄索氯铵盐，然后将其真空干燥，得到最 终含水量低于5%的肝素节索氯铵盐。
3. 根据权利要求1所述的制备依诺肝素钠的工艺，其特征在于：步骤S2中，肝素苄基 酯的具体制备方法为：将步骤S1中得到的肝素-苄索氯铵盐按1 : 1?5溶解于二氯甲 烷中，开启机械搅拌，在25?45°C下搅拌至充分溶解，加入1?5倍量的氯化苄，继续保持 25?45°C，搅拌反应24?48小时，将反应液压入三合一滤器，边搅拌边加入醋酸钠甲醇溶 液，析出沉淀，静置，利用压缩空气压滤，甲醇洗涤，反复几次直至滤液遇水无乳化现象，沉 淀冷冻干燥24小时，得到肝素苄基酯，含水量低于5%，酯化率大于9。
4. 根据权利要求3所述的制备依诺肝素钠的工艺，其特征在于：加入等体积的10%醋 酸钠甲醇溶液。
5. 根据权利要求1所述的制备依诺肝素钠的工艺，其特征在于：在步骤S3中，将肝素 苄基酯按1 : 1?30的重量比加入至纯化水中并充分溶解。
6. 根据权利要求1所述的制备依诺肝素钠的工艺，其特征在于：将步骤S3中充分溶解 于纯化水中的肝素苄基酯在35?65°C的搅拌条件下加入5%?12%氢氧化钠固体的溶解 液，反应完毕后接上冷媒管迅速冷却到室温。
7. 根据权利要求1所述的制备依诺肝素钠的工艺，其特征在于：所述过膜为过0. 45 μ m 的膜。
8. 根据权利要求1所述的制备依诺肝素钠的工艺，其特征在于：步骤S4中，通过加入 0. 5?1. 5%的双氧水在室温下进行脱色。
9. 根据权利要求1所述的制备依诺肝素钠的工艺，其特征在于：步骤S6中所述酒精沉 淀是向洗脱液中加入两倍酒精进行沉淀，开启冷媒，静置过夜，第二天弃去上清液，沉淀再 加一倍酒精进行脱水，弃去上清，加入一定量的纯化水进行溶解。
10. 根据权利要求1所述的制备依诺肝素钠的工艺，其特征在于：步骤S6中所述的除 菌为通过除菌膜进行除菌。
【文档编号】C08B37/10GK104086674SQ201410361424
【公开日】2014年10月8日 申请日期:2014年7月28日 优先权日:2014年7月28日
【发明者】周翔, 金晶, 陶翎, 费清清 申请人:常州千红生化制药股份有限公司