1.一种在细胞中提高RNA引导的基因组编辑的特异性的方法,所述方法包括将所述细胞与引导RNA接触,所述引导RNA包括与选定的靶基因组序列的互补链的17-18个连续核苷酸互补的由17-18个核苷酸组成的互补区,其中所述选定的靶基因组序列紧接前间区序列邻近基序(PAM)的5’,并且其中所述引导RNA选自由以下组成的组:
(X17-18)GUUUUAGAGCUA(SEQ ID NO:2404);
(X17-18)GUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG(SEQ ID NO:2407);或
(X17-18)GUUUUAGAGCUAUGCU(SEQ ID NO:2408);
(X17-18)GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCG(SEQ ID NO:1)、
(X17-18)GUUUUAGAGCUAUGCUGAAAAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUC(SEQ ID NO:2)、
(X17-18)GUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUGGAAACAAAACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUC(SEQ ID NO:3)、
(X17-18)GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(SEQ ID NO:4)、
(X17-18)GUUUAAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(SEQ ID NO:5);
(X17-18)GUUUUAGAGCUAUGCUGGAAACAGCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(SEQ ID NO:6);和
(X17-18)GUUUAAGAGCUAUGCUGGAAACAGCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(SEQ ID NO:7);
其中X17-18是与选定的靶基因组序列的互补链的17-18个连续核苷酸互补的互补区;
(i)单一引导RNA,其包括与选定的靶基因组序列的互补链的17-18个连续核苷酸互补的由17-18个核苷酸组成的互补区,或
(ii)crRNA,其包括与选定的靶基因组序列的互补链的17-18个连续核苷酸互补的由17-18个核苷酸组成的互补区,以及tracrRNA,
由此在细胞中提高RNA引导的基因组编辑的特异性。
2.一种在细胞中诱导双链DNA分子的靶区域中的断裂的方法,所述方法包括在细胞中表达如下物质或将所述物质引入细胞:
Cas9核酸酶或Cas9切口酶;和
引导RNA,其包括与双链DNA分子的互补链的17-18个连续核苷酸互补的由17-18个核苷酸组成的互补区,所述双链DNA分子含有靶基因组序列,其中所述靶基因组序列紧接前间区序列邻近基序(PAM)的5’,并且所述引导RNA互补区将Cas9核酸酶或Cas9切口酶结合并导向至双链DNA分子的靶区域,
并且其中所述引导RNA选自由以下组成的组:
(X17-18)GUUUUAGAGCUA(SEQ ID NO:2404);
(X17-18)GUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG(SEQ ID NO:2407);或
(X17-18)GUUUUAGAGCUAUGCU(SEQ ID NO:2408);
(X17-18)GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCG(SEQ ID NO:1)、
(X17-18)GUUUUAGAGCUAUGCUGAAAAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUC(SEQ ID NO:2)、
(X17-18)GUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUGGAAACAAAACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUC(SEQ ID NO:3)、
(X17-18)GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(SEQ ID NO:4)、
(X17-18)GUUUAAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(SEQ ID NO:5);
(X17-18)GUUUUAGAGCUAUGCUGGAAACAGCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(SEQ ID NO:6);和
(X17-18)GUUUAAGAGCUAUGCUGGAAACAGCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(SEQ ID NO:7);
其中X17-18是与选定的靶基因组序列的互补链的17-18个连续核苷酸互补的互补区;
由此在细胞中提高RNA引导的基因组编辑的特异性。
3.根据权利要求1-2任一项所述的方法,其中所述互补区与双链DNA分子的选定靶区域的互补链的17个连续核苷酸互补。
4.根据权利要求1-2任一项所述的方法,其中所述互补区与双链DNA分子的选定靶区域的互补链的18个连续核苷酸互补。
5.根据权利要求1-2任一项所述的方法,其中所述引导RNA为crRNA,其包括与选定的靶基因组序列的互补链的17-18个连续核苷酸互补的由17-18个核苷酸组成的互补区,并且所述tracrRNA由如下序列组成:
GGAACCAUUCAAAACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(SEQ ID NO:8);
UAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(SEQ ID NO:2405);
AGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(SEQ ID NO:2406);
CAAAACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(SEQ ID NO:2409);
UAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUG(SEQ ID NO:2410);
UAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCA(SEQ ID NO:2411);或
UAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCG(SEQ ID NO:2412)。
6.根据权利要求1-2任一项所述的方法,其中所述引导RNA为crRNA,其包括与选定的靶基因组序列的互补链的17-18个连续核苷酸互补的由17-18个核苷酸组成的互补区,并且所述crRNA为(X17-18)GUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG(SEQ ID NO:2407)并且所述tracrRNA为GGAACCAUUCAAAACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(SEQ ID NO:8);所述crRNA为(X17-18)GUUUUAGAGCUA(SEQ ID NO:2404)并且所述tracrRNA为UAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(SEQ ID NO:2405);或所述crRNA为(X17-18)GUUUUAGAGCUAUGCU(SEQ ID NO:2408)并且所述tracrRNA为AGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(SEQ ID NO:2406)。
7.根据权利要求1-2中任一项所述的方法,其在所述选定的靶基因组序列中导致序列改变。
8.根据权利要求1-2中任一项所述的方法,其中所述细胞为真核细胞。
9.根据权利要求8所述的方法,其中所述细胞是哺乳动物细胞。
10.权利要求1-2任一项所述的方法,其中所述的互补区与选定的靶基因组序列的互补链的17个连续核苷酸互补。
11.权利要求1-2任一项所述的方法,其中所述的互补区与选定的靶基因组序列的互补链的18个连续核苷酸互补。
12.权利要求7所述的方法,其中所述序列改变为插入缺失突变。