本文提供的方法可用于癌症和癌症治疗剂领域，具体地讲可用于确定癌症治疗剂的功效。用于结合抗癌疗法测量循环生物分子(诸如例如核酸和蛋白质)的方法和组合物。
发明背景
术语癌症通常是指特征在于形成恶性肿瘤的不可调节的细胞生长的一类范围较广的疾病。癌症治疗通常杀灭细胞，理想地主要是肿瘤细胞，但也有正常细胞。当前用于确定癌症治疗效果的方法包括侵入性操作，诸如活组织检查，以及成像方法，诸如CT扫描、磁共振成像(MRI)扫描和正电子发射断层显像(PET)扫描。然而，要利用此类非侵入性方法，肿瘤通常必需在尺寸上减小到足以使成像操作可检测到差异。为了帮助确定一种新型抗癌药物或抗肿瘤药物是否具有杀灭癌细胞或肿瘤细胞的功效，或者一种抗癌药物或抗肿瘤药物是否具有针对特定肿瘤或癌症的功效，非侵入性地确定患者体内相对于正常细胞杀灭的肿瘤细胞或癌细胞杀灭量的方法将会非常有用。用于在通过治疗剂或推定治疗剂进行肿瘤细胞或癌细胞杀灭后非侵入性地测定循环生物分子的方法和组合物也是所需的。
微小RNA是主要发现于高等真核生物(植物和多细胞动物)的细胞质中的较小(大约22个核苷酸)的单链RNA。它们的主要功能是通过结合到特异性靶mRNA(通常在3′-非转录区(3′-UTR))并且抑制它们的翻译同时促进它们破坏来调节基因表达。在小鼠体内存在超过1,000种已识别的miRNA，在人体内存在超过2,000种。大多数miRNA被认为具有多个mRNA靶标，这些靶标可数以百计。由miRNA调节的许多mRNA在其3′-UTR处具有针对多个miRNA的结合位点。一些miRNA相当普遍地表达；其它的表现出高度受限的组织特异性表达。
最新研究已发现，存在数百个miRNA的子集并且它们在哺乳动物的血清和血浆中容易被检测到。血清/血浆miRNA的分布在正常健康的动物中非常稳定，但在疾病状态下或响应于药物或化学诱导的毒性时可以是变化的。血清/血浆miRNA分布不同于血液的细胞组分的分布。
越来越多的文献开始揭示血清/血浆miRNA分布的许多实例，这些实例提供了疾病(诸如肝纤维化、心肌失调和各种癌症)的诊断和预后的标志物。另外已显示血清/血浆miRNA表达谱可预测药物功效、毒性和特定的器官和组织损伤。
发明概要
在多个方面，描述了在用抗癌或抗肿瘤药物(或推定药物)治疗患者之前、期间和/或之后用于测定循环生物分子的组合物和方法。还提供了基于本文所述的组合物和方法的治疗方法。不管是否明确陈述，涉及抗癌疗法的方面和实施方案也是可以涉及抗肿瘤治疗的方面和实施方案。相似地，采用抗癌药物的方面和实施方案还可以用抗肿瘤药物实施。
在多个方面，提供了用于评估抗癌疗法杀灭或破坏癌细胞的功效的非侵入性方法和试剂盒。实施方案用于确定抗癌药物在患者体内的癌症杀灭功效，从而优化用于治疗患者的抗癌药物的选择，调整用于治疗患者体内特定癌症的抗癌药物剂量，以及识别可用于任何一种特定类型的癌症的抗癌治疗剂。
本文提供了用于确定经抗癌疗法且具体地讲抗癌药物治疗过的患者体内的癌症杀灭功效的非侵入性方法。在一些实施方案中，方法包括在施用推定的抗癌药物后测量患者的细胞内癌细胞特异性标志物的血液水平。在一些实施方案中，可以在施用抗癌药物之前和之后测量肿瘤细胞特异性标志物的水平。此类肿瘤细胞特异性标志物的水平变化可以指示推定的抗癌药物的功效。患者血液中的细胞内癌细胞特异性标志物的水平相比于对照标志物的升高指示推定的抗癌药物的功效。在其它实施方案中，样品中的细胞内癌细胞特异性标志物的水平相比于对照标志物的降低指示推定的抗癌药物的功效。在某些实施方案中，肿瘤细胞特异性标志物的水平变化与抗肿瘤药物的疗效相关。
如果在施用推定的抗癌药物后患者循环中的细胞内癌细胞特异性标志物的水平关于对照标志物升高，则可以用推定的抗癌药物治疗患者。或者，如果在施用推定的抗癌药物后样品中的癌细胞特异性标志物的水平关于对照标志物降低，则可以用推定的抗癌药物治疗患者。在一些实施方案中，抗癌药物是抗原结合蛋白与药物的抗肿瘤药物缀合物，癌细胞特异性标志物是肿瘤特异性标志物，并且癌症是实体肿瘤或B-细胞相关癌症。在某些实施方案中，癌细胞特异性标志物是微小RNA(miRNA)。
还提供了选择用于治疗有需要的患者的有效抗癌药物的非侵入性方法。在一些实施方案中，方法包括测量来自患有癌症的患者的第一样品中的癌细胞特异性标志物的第一水平，对患者施用推定的抗癌药物，以及测量来自患者的第二样品中的癌细胞特异性标志物的第二水平。第二水平的升高指示推定的抗癌药物的抗癌功效，并且用推定的抗癌药物治疗患者，从而选择用于治疗患者的有效抗癌药物。在一些实施方案中，对患者血液中癌细胞特异性标志物的水平的升高与对照标志物的相应变化进行比较。根椐所选择的标志物，第二水平的降低可指示推定的抗癌药物的功效，使得患者被推定的抗癌药物治疗，从而选择用于治疗患者的有效抗癌药物。在某些实施方案中，为确定抗癌药物的功效而测量的标志物是肿瘤响应性生物标志物。在一些实施方案中，抗癌药物是抗原结合蛋白与药物的抗肿瘤药物缀合物，癌细胞特异性标志物是肿瘤特异性标志物，并且癌症是实体肿瘤或B-细胞相关癌症。在一个实施方案中，对照标志物是来自非癌(或非肿瘤)细胞的标志物。
还提供了调整用于治疗患者体内的癌症的抗癌药物剂量的非侵入性方法。在一些实施方案中，方法包括测量已被施用初始量的抗癌药物的患者的循环中一种或多种癌细胞特异性标志物的水平，以及根据在施用初始量的抗癌药物后患者的循环中一种或多种癌细胞特异性标志物的水平，调整后续给患者施用的抗癌药物的剂量。在一些实施方案中，方法还包括测量循环中的至少一种对照标志物，用于一种或多种癌细胞特异性标志物的水平的归一化。在某些实施方案中，为确定抗癌药物的功效而测量的标志物是肿瘤响应性生物标志物。在一些实施方案中，抗癌药物是抗原结合蛋白与药物的抗肿瘤药物缀合物，癌细胞特异性标志物是肿瘤特异性标志物，并且癌症是实体肿瘤或B-细胞相关癌症。
例如，平均而言，在第一次施用抗肿瘤药物后具有较高水平的肿瘤响应性生物标志物的患者通常可接受比在第一剂量的抗肿瘤药物后具有较低水平的肿瘤响应性生物标志物的患者更大的第二剂量的抗肿瘤药物。或者，取决于个别标志物，平均而言，在第一次施用抗肿瘤药物后具有较低水平的肿瘤响应性生物标志物的患者通常可接受比在第一剂量的抗肿瘤药物后具有较高水平的肿瘤响应性生物标志物的患者更大的第二剂量的抗肿瘤药物。
另外提供了评估抗癌药物在患者体内的疗效的非侵入性方法。在一些实施方案中，方法包括(a)获得来自患者循环的第一基线样品，其中患者患有癌症(或肿瘤)；(b)给患者施用一定剂量的抗癌药物，其中至少一种癌细胞特异性标志物在施用抗癌药物之前隔离到患者的癌细胞内，但在施用抗癌药物后释放到患者循环中；(c)获得来自患者循环的第二样品；(d)测量(i)第一基线样品中和(ii)第二样品中的至少一种癌细胞特异性标志物的量，以及(e)将第一基线样品中癌细胞特异性标志物的量与第二样品中癌细胞特异性标志物的量进行比较。第二样品中至少一种癌细胞特异性标志物的量相对于第一基线样品中至少一种癌细胞特异性标志物的量的升高指示患者体内增加的癌细胞死亡。可以用增加至少一种癌细胞特异性标志物的抗癌药物治疗患者。或者，取决于个别标志物，平均而言，在第一次施用抗肿瘤药物后具有较低水平的生物标志物的患者通常可接受比在第一剂量的抗肿瘤药物后具有较高水平的生物标志物的患者更大的第二剂量的抗肿瘤药物。在一些实施方案中，抗癌药物是抗原结合蛋白和药物的抗癌药物缀合物，癌细胞特异性标志物是肿瘤特异性标志物，并且癌症是实体肿瘤或B-细胞相关癌症。本文还提供了肿瘤响应性生物标志物，该标志物可响应于肿瘤负荷变化，但不一定来源于肿瘤。
另外预期，本文的实施方案可用于鉴定对特定类型癌症具有高功效的抗癌药物。具体地讲，测试受试者(通常为患有预定形式癌症的小鼠或其它啮齿动物)的与预定形式癌症相关联的一种或多种生物分子(例如淋巴瘤的CD20标志物)的基线水平。将用于预定形式癌症的本发明抗癌药物施用给受试者并测定生物分子的水平。生物分子相比于对照标志物的增加或减少用于鉴定具有更大的杀灭或破坏受试者的预定形式癌症的效能的抗癌药物。或者，在施用抗癌药物之前和之后生物分子的增加或减少可用于鉴定具有更大的杀灭或破坏受试者体内的预定形式癌细胞的效能的候选抗癌药物。预期，可使用该方法测试多种抗癌药物，以鉴定和筛选对各种形式的癌症具有增强的功效的抗癌药物。此外，还可鉴定对一种类型的癌症比另一种类型的癌症具有更大功效的抗癌药物，从而使任何一种抗癌药物的癌细胞杀灭和破坏达到最大程度。
在一个方面，提供了用于选择治疗人肿瘤的抗癌药物的方法，其包括向合适的宿主非人动物(例如，任何啮齿动物或小鼠)引入人肿瘤的异种移植物，对异种移植的宿主非人动物(例如小鼠)施用推定的或候选抗癌剂，以及测定从异种移植物的细胞进入小鼠循环的一种或多种细胞内肿瘤标志物的水平，其中选择释放预定水平的来自异种移植物的细胞的一种或多种细胞内肿瘤细胞标志物的推定的抗肿瘤剂作为治疗人肿瘤的合适的治疗剂。在一些实施方案中，可将肿瘤细胞、肿瘤组织或肿瘤器官引入到任何宿主动物(例如任何啮齿动物)，以便通过在施用抗肿瘤药物之前和之后测量肿瘤细胞特异性标志物的水平来确定抗肿瘤药物效果。
在另一个实施方案中，根据对用肿瘤细胞、肿瘤组织或肿瘤器官异种移植的宿主非人动物(例如任何啮齿动物)施用药物之前和之后的细胞特异性标志物的水平选择推定的或候选抗癌药物。例如，在一些实施方案中，选择抗癌药物，其中在对异种移植的宿主非人动物(例如任何啮齿动物)施用推定的抗肿瘤剂后肿瘤细胞特异性标志物的水平相比于在施用抗癌剂之前肿瘤细胞特异性标志物的水平降低。在其它实施方案中，选择抗癌药物，其中在对异种移植的宿主非人动物(例如任何啮齿动物)施用推定的或候选抗肿瘤药物后肿瘤细胞特异性标志物的水平相比于在施用抗癌剂之前肿瘤细胞特异性标志物的水平升高。在某些实施方案中，标志物是miRNA标志物并且肿瘤是肺癌、前列腺癌或结肠癌。
在一个方面，提供了用于选择治疗患有肿瘤的患者的抗癌药物的方法，其包括向合适的小鼠或宿主非人动物(例如任何啮齿动物)引入患者肿瘤的异种移植物，对异种移植的小鼠或宿主非人动物(例如任何啮齿动物)施用推定的或候选抗癌剂，以及测定从异种移植物的细胞进入小鼠循环的一种或多种细胞内肿瘤标志物的水平，其中选择释放预定水平的来自异种移植物的细胞的一种或多种细胞内肿瘤细胞标志物的推定的或候选抗肿瘤剂作为治疗患者的合适的治疗剂。因此，如本文所用，术语“来源于”是指采自人类患者或从采自人类患者的肿瘤细胞或肿瘤组织繁殖的肿瘤细胞、肿瘤组织或肿瘤器官。
本文的实施方案提供了用于定性受试者的癌症状态的试剂盒，其中试剂盒可用于检测本文所述的生物标志物的差异存在。例如，试剂盒可用于检测在暴露于抗癌药物或其它治疗药物之前和之后癌症受试者的肿瘤样品中的生物标志物的任何组合的差异存在。本发明的试剂盒具有许多应用。例如，试剂盒可用于监测治疗药物在癌症受试者体内的功效。试剂盒还可用于鉴定可用于治疗癌症的试剂。
通过以下描述和权利要求，本公开的其它特征和优点将显而易见。
附图简述
图1显示了某些miRNA标志物在A549肺癌肿瘤植入后增加，以及随后在施用抗肿瘤药物顺铂(Cisplatin)后三天miRNA标志物水平降低。
图2显示了特定miRNA标志物水平在对肺肿瘤(A549)施用顺铂和对前列腺肿瘤(PC3M)施用多西他赛(Docetaxel)后降低。
图3显示了某些miRNA标志物在A549肺癌肿瘤植入后降低，以及随后在施用抗肿瘤药物顺铂后三天miRNA标志物水平升高。
图4显示了miR-16-5p、miR-1208、miR-24-3p和miR-588在A549肺癌肿瘤植入后降低，以及随后在施用抗肿瘤药物顺铂后三天miRNA标志物水平升高。
图5显示了某些miRNA标志物在PC3M前列腺癌肿瘤植入后增加，以及随后在施用抗肿瘤药物多西他赛后miRNA标志物水平降低。
图6显示了miR-190、miR-153和miR-92a-1在PC3M前列腺癌肿瘤植入后增加，以及随后在施用抗肿瘤药物多西他赛后miRNA标志物水平降低。
图7显示了某些miRNA标志物在PC3M前列腺癌肿瘤植入后减少，以及随后在施用抗肿瘤药物多西他赛后miRNA标志物水平升高。
图8显示了miR-634和miR-647在PC3M前列腺癌肿瘤植入后减少，以及随后在施用抗肿瘤药物多西他赛后miRNA标志物水平升高。
详细描述
本文提供了确定抗癌药物(或抗肿瘤药物)的癌症杀灭(或肿瘤杀灭)功效(包括在用抗癌药物治疗过的患者体内)的方法，选择用于在有需要的患者体内进行治疗的有效抗癌药物的方法，调整用于治疗患者的癌症的抗癌药物剂量的方法，以及评估抗癌药物在患者体内的疗效的方法。这些方法中的每一个都是非侵入性的，需要患者提供样品，样品可通过简单血液测试或通过得自受试者的血液、血浆、血清、脑脊液、滑液、淋巴液、唾液或尿液获得。这些方法为患者和保健专业人员提供了快速准确的信息，从而提供了依赖于抗癌药物或其它抗癌治疗剂的治疗有效性并使该有效性达到最大程度。还提供了用于筛选和选择针对目标癌症的抗癌治疗剂以及鉴定最适用于治疗任何一种特定类型癌症的目标治疗剂的方法。
就此而论，公开了以下方法，所述方法测量某些癌症特异性生物标志物(诸如微小RNA、细胞游离DNA(cfDNA)以及通常包含于细胞内但在暴露于抗癌药物后从癌细胞释放的其它细胞溶质或细胞核大分子)的水平；以及比较对照标志物从暴露于相同抗癌药物后的正常细胞的释放，以测定在抗癌疗法后被杀灭癌细胞相对于被杀灭正常细胞的程度和比率。在特定实施方案中，生物标志物是响应于肿瘤负荷变化但不一定来源于肿瘤细胞、肿瘤组织或肿瘤器官的肿瘤响应性生物标志物。在一些情况下，在施用抗癌药物后，样品中某些生物标志物(例如miRNA标志物)的水平降低。
在进一步描述本发明的实施方案之前，应当理解本文所述方法不受所述实验条件限制；因为此类方法和条件可以改变。还应当理解，本文所用的术语只是出于描述特定实施方案的目的，不旨在进行限制，因为本发明的范围将由所附权利要求书加以限制。
虽然类似于或等效于本文所述那些的任何方法和材料可用于实践或测试本发明，但现在描述了方法和材料的多个实施方案。本说明书提及的所有专利、专利申请和非专利出版物全文以引用方式并入本文中。
除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语包括本发明所属领域的技术人员通常理解的含义。以下参考文献为技术人员提供了本发明所用的许多术语的一般定义：Lackie和Dow，The Dictionary of Cell&Molecular Biology(第3版，1999)；Singleton等，Dictionary of Microbiology and Molecular Biology(第2版，1994)；The Cambridge Dictionary of Science and Technology(Walker编，1988)；The Glossary of Genetics，第5版，R.Rieger等(编)，Springer Verlag(1991)；以及Hale和Marham，The Harper Collins Dictionary of Biology(1991)。如本文所用，以下术语具有归属于它们的含义，除非另外指明。
如本文所用，当提及特定的所述数值使用时，术语“约”意指可与所述值变化不超过1％的值。例如，如本文所用，表达“约100”包括99和101和两者之间的所有值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。
术语“癌症”和“癌性的”是指活描述哺乳动物的生理条件，其特征通常在于不可调节的细胞生长。癌症的实例包括但不限于淋巴瘤和白血病以及实体肿瘤。所谓“B细胞相关癌症”或“B-细胞谱系的癌症”或“赘生性B-细胞生长”意指其中异常调节或不可调节的细胞生长与B细胞相关联的任何类型的癌症。
如本文所用，“肿瘤”是指所有赘生性细胞生长和增殖(不管恶性或良性)以及所有癌前期和癌性细胞和组织。如本文所用，“赘生性”是指导致异常组织生长的任何形式的异常调节或不可调节的细胞生长(不管恶性或良性)。因此，“赘生性细胞”包括具有异常调节或不可调节的细胞生长的恶性和良性细胞。如本文所述，组合物和方法可用于抗癌和抗肿瘤应用两者。
癌症可来自于(例如)选自皮肤、结肠、甲状腺、卵巢、肺和胰腺的器官。在一个实施方案中，皮肤肿瘤是黑素瘤。在另一个实施方案中，肿瘤选自：前列腺癌瘤、肺癌瘤、乳腺癌瘤、卵巢癌瘤、皮肤癌瘤、结肠癌瘤、膀胱癌瘤、肝脏癌瘤、胃癌瘤、肾细胞癌瘤、鼻咽癌瘤、鳞状细胞癌瘤、甲状腺乳头状癌瘤、宫颈癌瘤、肉瘤、胶质瘤、急性骨髓性白血病、胰腺癌瘤以及头和颈部癌瘤。在另一个实施方案中，癌症是非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin’s lymphoma)、慢性淋巴细胞白血病、多发性骨髓瘤、B细胞淋巴瘤、高度B细胞淋巴瘤、中度B细胞淋巴瘤、低度B细胞淋巴瘤、B细胞急性淋巴细胞白血病、霍奇金病(Hodgkin’s disease)、浆细胞瘤、滤泡性淋巴瘤、滤泡性小裂淋巴瘤(follicular small cleaved lymphoma)、滤泡性大细胞淋巴瘤、滤泡性混合性小裂淋巴瘤、弥漫型小裂细胞性淋巴瘤、弥漫型小淋巴细胞性淋巴瘤、幼淋巴细胞白血病、淋巴浆细胞性淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、粘膜相关的淋巴组织淋巴瘤、单核细胞样B细胞淋巴瘤、脾淋巴瘤、毛发细胞白血病、弥漫型大细胞淋巴瘤、纵隔大B细胞淋巴瘤、淋巴瘤样肉芽肿病、血管内淋巴瘤病、弥漫型混合性细胞淋巴瘤、弥漫型大细胞淋巴瘤、免疫母细胞性淋巴瘤、伯基特淋巴瘤(Burkitt′s lymphoma)、AIDS相关淋巴瘤、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症(Waldenstrom’s Macroglobulinemia)、套细胞淋巴瘤以及重链病。在一些方面，肿瘤的特征在于赘生性B-细胞生长。
词语“标记”用于本文时是指直接或间接缀合到抗原结合蛋白或其抗原结合片段以便生成“带标记的”抗原结合蛋白或其抗原结合片段的可检测化合物或组合物。标记本身可以是可检测的(例如，放射性同位素标记或荧光标记)，或者就酶标记而言，可以催化可检测的底物化合物或组合物的化学变化。
“受试者”是脊椎动物，例如，哺乳动物，并且示例性地是灵长类动物，诸如人。哺乳动物包括但不限于灵长类动物(包括人)、家畜、运动型动物、野生动物以及宠物。“患者”可以是任何受试者但通常是人。“患者”也可以指多个患者，诸如多个人类患者。
“样品”或“生物样品”包括例如得自受试者的血液、血浆、血清、脑脊液、滑液、淋巴液、唾液或尿液。样品可以是任何得自受试者的任何体液或组分，其中可测量细胞特异性标志物的水平。
如本文所用，“肿瘤细胞特异性标志物”包括(特定分子量的)多肽或核酸，其在肿瘤细胞死亡之前(例如，在用抗肿瘤药物治疗之前)隔离到肿瘤细胞内，但在治疗后释放到患者循环中。“肿瘤细胞特异性标志物”还包括在肿瘤细胞破坏或死亡之前(例如，在用抗肿瘤药物治疗之前)由肿瘤细胞释放但保持在细胞内并且在用抗肿瘤药物治疗后不保持在细胞内的标志物。在某些实施方案中，肿瘤细胞特异性标志物是miRNA标志物。多肽生物标志物可通过分子量(单位道尔顿)鉴定，并且包括集中于针对每种标志物所鉴定的分子量的质量。核酸生物标志物可通过序列鉴定。“肿瘤细胞特异性生物标志物”包括例如细胞凋亡细胞、细胞增殖和存活的生物标志物。示例性肿瘤特异性生物标志物包括但不限于CD20、B淋巴酪氨酸激酶(BLK)及其组合。在多个方面，癌症或肿瘤细胞可以自发或出于自然或未知原因死亡，并且在多个实施方案中，特定标志物的水平响应于抗癌或抗肿瘤治疗的变化是抗癌或抗肿瘤治疗在人体内的功效或推定的功效的指示。
如本文所用，术语“生物标志物”包括但不限于核酸、肽、蛋白质、脂质、抗原、碳水化合物或蛋白聚糖，诸如DNA(包括例如细胞游离DNA(cfDNA))或RNA。RNA可以是mRNA、miRNA、snoRNA、snRNA、rRNA、tRNA、siRNA、hnRNA或shRNA、或短链或长链非编码RNA。DNA(例如cfDNA)或RNA(例如mRNA)可包括点突变、DNA超甲基化、微卫星不稳定性，以及杂合性缺失，或其组合。
如本文所用，术语“肿瘤响应性生物标志物”包括响应于肿瘤负荷变化但不一定来源于肿瘤的血清、血浆或其它体液的正常组分。肿瘤响应性生物标志物可与肿瘤负荷成正比例或反比例。也就是说，肿瘤响应性生物标志物的水平可以随着肿瘤负荷降低而升高，或者肿瘤响应性生物标志物的水平可以随着肿瘤负荷降低而降低。如本文所用，术语“肿瘤负荷”是指患者或非人动物体内的肿瘤量。在一些实施方案中，肿瘤响应性生物标志物包括肿瘤细胞特异性标志物。在一个实施方案中，肿瘤响应性生物标志物是肿瘤类型特异性生物标志物。例如，肿瘤响应性生物标志物可以对肺肿瘤、前列腺肿瘤或结肠肿瘤具有特异性。在一个实施方案中，肿瘤响应性生物标志物是肿瘤细胞特异性生物标志物。在一个实施方案中，肿瘤响应性生物标志物是抗癌药物特异性生物标志物。例如，肿瘤响应性生物标志物可以对用某些类型药物的治疗具有特异性。在具体实施方案中，肿瘤响应性生物标志物是miRNA标志物。
特别有用的生物标志物包括通常不为分泌型的那些，例如，mRNA、rRNA、微小RNA、DNA及其组合。在一些实施方案中，生物标志物是细胞内生物标志物，例如一种或多种细胞内蛋白质。在一个实施方案中，细胞内蛋白质是胞质蛋白。在一个实施方案中，生物标志物是跨膜或膜相关蛋白。在一个实施方案中，细胞内蛋白质是存在于细胞器中或与细胞器相关联的细胞器蛋白。在一个实施方案中，细胞内蛋白质是细胞核蛋白。在某些实施方案中，可用于本文所公开的方法的生物标志物在用有效抗肿瘤药物治疗之前由肿瘤细胞释放到细胞外间隙中、血液中或细胞周围的任何其它区域中，但在施用抗肿瘤药物后不会释放。
“非特异性”或“对照”标志物可以是一般细胞毒性标志物、对肿瘤细胞非特异性的标志物。
术语“测量”包括以下方法，所述方法包括测定、检测或观察样品中是否存在标志物，对样品中标志物的量定量，和/或对生物标志物的类型定性(例如，测量表观遗传改变、序列变化等)。可通过本领域已知的方法和本文进一步描述的那些完成测量。可使用任何合适的方法检测和测量本文所述标志物中的一者或多者。这些方法包括但不限于免疫测定、质谱(例如，激光解吸/离子化质谱(SELDI))、荧光(例如夹心免疫测定法)、表面等离子体共振、椭圆光度法、原子力显微镜、PCR(包括定量PCR，例如实时PCR)，以及微阵列分析(例如，用微阵列显著性分析(SAM)软件)。在一个实施方案中，微阵列分析用于检测微小RNA，称为微小RNA或miRNA表达谱。
在一些实施方案中，样品中肿瘤细胞特异性标志物的量相比于对照物或基线的差值表明，推定的抗肿瘤药物具有疗效。例如，样品中的标志物的量相比于对照物的增大(例如，1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍或以上的增大)表明推定的抗肿瘤药物具有功效。也就是说，样品中肿瘤细胞特异性标志物的量的变化可以比对照标志物的量的变化高至少一倍(例如，2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍或以上)。在一些实施方案中，样品中肿瘤细胞特异性标志物的量的变化可以比对照标志物的量的变化低至少一倍(例如，2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍或以上)。在某些实施方案中，标志物是肿瘤响应性生物标志物。
相比于在施用抗肿瘤药物之后获得的样品，在施用抗肿瘤药物之前获得的样品中的肿瘤响应性生物标志物的量的变化可以是至少1倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍或以上。在施用抗肿瘤药物前后肿瘤响应性生物标志物的量的变化可以增大或减小。
在某些实施方案中，在施用抗肿瘤药物之后的生物标志物的量相比于在抗肿瘤药物给药之前的生物标志物的量的增大(例如，1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍或以上的增大)表明推定的抗肿瘤药物具有功效。在其它实施方案中，在施用抗肿瘤药物之后的生物标志物的量相比于在抗肿瘤药物给药之前的生物标志物的量的减小(例如，1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍或以上的减小)表明推定的抗肿瘤药物具有功效。同样，根据所选择的标志物，在施用抗肿瘤药物之后肿瘤响应性生物标志物的水平的未升高或未降低可表明抗癌药物的施用不具有治疗效果。
虽然本文所述实施方案反映出相对于对照物成倍增加，但还可以设想到，某些标志物诸如肿瘤抑制子标志物或抗凋亡标志物可以显示相对于对照标志物的量成倍减小。例如，样品中的标志物的量相比于对照标志物的量的减小(例如，1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍或以上的减小)可表明推定的抗肿瘤药物具有功效。也就是说，样品中的标志物肽的减小量可以比对照标志物的量的减小低至少一倍(例如，2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍或以上)。
“检测”包括鉴定待检测对象的存在、不存在或量。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文可互换使用以包括氨基酸残基的聚合物。所述术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是对应的天然存在的氨基酸的类似物或模拟物的氨基酸聚合物，并且适用于天然存在的氨基酸聚合物。可以通过例如添加糖残基以形成糖蛋白来修饰多肽。术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”包括糖蛋白以及非糖蛋白。
虽然本文所述方法是针对癌症和肿瘤，但本文设想到，所述方法也可用于其它疾病状态，包括例如多发性硬化症和其它自体免疫疾病。
方法
在多个方面，本文提供了用于确定用抗肿瘤药物治疗过的患者体内的肿瘤细胞杀灭功效的非侵入性方法。在一些实施方案中，方法包括在施用推定的抗肿瘤药物后测量患者的细胞内肿瘤细胞特异性标志物的血液水平。例如患者的血液、血浆、血清、脑脊液、滑液、淋巴液、唾液或尿液中的细胞内肿瘤细胞特异性标志物的水平相比于对照标志物的升高指示推定的抗肿瘤药物的功效。在一些实施方案中，在施用推定的抗肿瘤药物之后肿瘤细胞特异性标志物的水平的变化指示推定的抗肿瘤药物的功效。此类变化可以是肿瘤细胞特异性标志物的水平的升高或降低。在具体实施方案中，在施用抗肿瘤药物前后至少一种肿瘤响应性生物标志物的水平的变化与患者体内癌细胞的大小、严重程度和/或患病率相关。
如果在施用推定的抗肿瘤药物后细胞内肿瘤细胞特异性标志物的水平升高，尤其是如果相对于对照标志物升高，则可以用推定的抗肿瘤药物治疗患者。如果在施用推定的抗肿瘤药物后细胞内肿瘤细胞特异性标志物的水平降低，和/或如果相对于对照标志物降低，则也可以用推定的抗肿瘤药物治疗患者。在一些实施方案中，用于确定药物功效的标志物是肿瘤响应性生物标志物。在一些实施方案中，抗肿瘤药物是抗原结合蛋白与药物的抗肿瘤药物缀合物，肿瘤细胞特异性标志物是癌症特异性标志物，并且癌症是实体肿瘤或B-细胞相关癌症。例如，在某些实施方案中，癌症是前列腺癌、肺癌或结肠癌并且标志物是miRNA标志物。
如全篇所述，本文所述方法中的任何一种可包括获得第二标志物(例如，对照(一般)细胞标志物或非特异性标志物，该标志物在存在于样品中或循环中时表现出对正常细胞的破坏)的水平的一个或多个其它步骤。因此，在暴露于抗癌药物之后对照细胞标志物从正常细胞的释放将指示抗癌药物对正常组织造成的破坏程度，并且在一些方面可用于相对于药物对正常组织的毒性提供药物对肿瘤的疗效。
还提供了选择用于治疗有需要的患者的有效抗肿瘤药物的方法。在一些实施方案中，方法包括测量来自患有肿瘤的患者的第一样品中的肿瘤细胞特异性标志物的第一水平，对患者施用推定的抗肿瘤药物，以及测量来自患者的第二样品中的肿瘤细胞特异性标志物的第二水平。在某些实施方案中，标志物是肿瘤响应性生物标志物。第二水平的升高指示推定的抗肿瘤药物的抗肿瘤功效，并且用推定的抗肿瘤药物治疗患者，从而选择用于治疗患者的有效抗肿瘤药物。第二水平的降低还可以指示推定的抗肿瘤药物的功效。同样，肿瘤响应性生物标志物的水平未升高或未降低可表明，抗肿瘤药物的施用不具有治疗效果。在一些实施方案中，肿瘤细胞特异性标志物的选择将决定，在施用抗肿瘤药物后肿瘤细胞特异性标志物的水平是升高或是降低指示了所施用药物的抗肿瘤功效。在一些实施方案中，抗肿瘤药物是抗癌药物，肿瘤细胞特异性标志物是癌症特异性标志物，并且患有肿瘤的患者是患有癌症的患者。
还提供了调整或控制用于治疗患者体内的肿瘤的抗肿瘤药物的剂量的方法。在一些实施方案中，方法包括测量已被施用初始量的抗肿瘤药物的患者的循环中一种或多种肿瘤细胞特异性标志物的水平，以及根据在施用初始量的抗肿瘤药物后患者的循环中一种或多种肿瘤细胞特异性标志物的水平，调整后续施用给患者的抗肿瘤药物的剂量。在一些实施方案中，抗肿瘤药物是抗癌药物，并且肿瘤细胞特异性标志物是癌症特异性标志物或肿瘤响应性生物标志物。
例如，在一些实施方案中，当在第一剂量的抗肿瘤药物之后的肿瘤响应性生物标志物的水平相比于在施用抗肿瘤药物之前的肿瘤响应性生物标志物的水平未升高时，改变施用给患者的抗肿瘤药物的给药方案。在具体实施方案中，当包括miR-335-3p、miR-16-5p、miR-361-5p、miR-27a-5p、miR-24-3p、miR-1260a、miR-192-5p、miR-548h-5p、miR-122-5p、miR-1208、miR-215、miR-30a-3p、miR-588、miR-10a-3p、miR-21-5p、miR-382-3p、miR-15b-3p、miR-19b-3p、miR-543、miR-1271-5p、miR-106a-5p、miR-106b-5p、miR-520h、miR-181-a2、miR-1468、miR-634、miR-647、miR-885-5p、miR-376a、miR-1265、miR-623、miR-15a、miR-629、miR-30d-3p、miR-483-5p、miR-708-3p及其组合的至少一种miRNA标志物的水平在施用抗肿瘤药物之后相比于在抗肿瘤药物给药之前未升高时，改变抗肿瘤药物的给药方案。
在一些实施方案中，当在第一剂量的抗肿瘤药物之后的当肿瘤响应性生物标志物的水平相比于在施用抗肿瘤药物之前的肿瘤响应性生物标志物的水平未降低时，改变施用给患者的抗肿瘤药物的给药方案。在具体实施方案中，当包括miR-802、miR-30b-3p、miR-510、miR-622、miR-127-3p、miR-373-5p、miR-298、miR-302b-3p、miR-367-3p、miR-181b-5p、miR-518a-3p、miR-155-5p、miR-214-3p、miR-329、let-7f-5p、miR-190b、miR-503-5p、miR-92a-1-5p、miR-647、miR-153、miR-93-5p、miR-20a-5p、miR-221-3p、miR-378a-3p、miR-221-3p、miR-20a5p、miR-93-5p、miR-190、miR-153、miR-26a-2、miR-518c、miR-503、miR-337-3p、miR-518f、miR-370、miR-92a-1、miR-526b、miR-1238、miR-886-3p、miR-887、miR-23a、miR-1267、miR-621、miR-515-3p、miR-424、miR-20b、miR-202、miR-21-3p、miR-101-5p、miR-122-3p、miR-197-3p、miR-429、miR-501-3p、miR-509-3p、miR-598、miR-206、miR-885-5p、miR-1972及其组合的至少一种miRNA标志物的水平在施用抗肿瘤药物之后相比于在抗肿瘤药物给药之前未降低时，改变抗肿瘤药物的给药方案。
根据抗肿瘤药物给药前后的肿瘤响应性生物标志物水平的对比结果，不同患者可以接受第二剂量或后续剂量的抗肿瘤药物。如本文所用，抗肿瘤药物的给药方案的改变或调整可以是抗肿瘤药物的剂量增大或剂量减小。例如，抗肿瘤药物的剂量增大或减小可以是抗肿瘤药物给药量、浓度、持续时间或频次增大或减小。
根据本发明的某些实施方案，可以在限定的时间进程内对受试者施用多个剂量的抗肿瘤药物。此类方法可包括按顺序对患者施用多个剂量的抗肿瘤药物。如本文所用，“按顺序施用”意指在不同的时间点(例如，在由预定间隔(例如，小时、天、周或月)分开的不同的天)将每个剂量的抗肿瘤药物施用给受试者。本公开包括以下方法，所述方法包括对患者按顺序施用单个初始剂量的抗肿瘤药物，然后根椐在施用第一剂量或后续剂量的肿瘤药物前后至少一种肿瘤响应性生物标志物的相对水平，施用一个或多个后续剂量的抗肿瘤药物。
术语“初始剂量”和“后续剂量”是指施用抗肿瘤药物的时间顺序。因此，“初始剂量”或“第一剂量”是在治疗方案开始时施用的剂量；“第二剂量”或“后续剂量”是在初始剂量之后施用的剂量。初始剂量和后续剂量可以全部含有相同量的抗肿瘤药物，但在给药频次方面通常可以彼此不同。然而，在某些实施方案中，在治疗过程中，根椐在施用抗肿瘤药物前后至少一种肿瘤响应性生物标志物的相对水平，初始剂量和后续剂量中含有的抗肿瘤药物量彼此不同(例如，酌情上调或下调)。
如本文所用，术语“给药方案”是指关于制剂、给药途径、药物剂量、给药间隔和治疗持续时间的给药决定。因此，如果响应于在施用抗肿瘤药物后至少肿瘤细胞特异性标志物的水平的升高或降低改变抗肿瘤药物的给药方案，则可以改变制剂、给药途径、药物剂量、给药间隔或治疗持续时间。例如，如果在施用一定剂量的抗肿瘤药物后肿瘤细胞特异性标志物的水平不能表明该剂量具有治疗效果，则可以改变给药方案，以增加抗肿瘤药物的频次、浓度、水平、给药途径或治疗持续时间。在某些实施方案中，改变抗药的给药方案增加了抗肿瘤药物的疗效。
在一个实施方案中，可以在紧接着的前次剂量之后1至26(例如，1、11/2、2、21/2、3、31/2、4、41/2、5、51/2、6、61/2、7、71/2、8、81/2、9、91/2、10、101/2、11、111/2、12、121/2、13、131/2、14、141/2、15、151/2、16、161/2、17、171/2、18、181/2、19、191/2、20、201/2、21、211/2、22、221/2、23、231/2、24、241/2、25、251/2、26、261/2或以上)周施用后续剂量。如本文所用，短语“紧接着的前次剂量”意指在多次施用的顺序中，在施用顺序中没有间隔剂量的下一次剂量之前施用给患者的抗肿瘤药物剂量。
本文所公开的方法可包括对患者施用任何数量的第二剂量或后续剂量的抗肿瘤药物。例如，在某些实施方案中，仅对患者施用单个第二剂量。在其它实施方案中，对患者施用两个或更多个(例如，2、3、4、5、6、7、8或以上)后续剂量。
在涉及多个第二剂量或后续剂量的实施方案中，可以根椐肿瘤细胞特异性标志物的相对水平，以与其它剂量的相同频次或不同频次施用每个剂量。例如，可以在紧接着的前次剂量后1至2周对患者施用每个后续剂量。对患者施用后续剂量的频次在治疗方案的过程中可以是变化的。还可以在治疗过程中，由医师根椐个体患者在临床检查后的需求或根据在施用每次剂量后至少一种肿瘤响应性生物标志物的相对水平，调整给药频次。
因此，可以在抗肿瘤药物的多次施用期间监测肿瘤细胞特异性标志物的水平，以便确定抗肿瘤药物在整个给药过程中的疗效。在每次剂量后，可以根据在施用抗肿瘤药物后的肿瘤响应性生物标志物(例如miRNA标志物)的水平相对于在每次抗肿瘤药物剂量之前的肿瘤响应性生物标志物的水平，改变抗肿瘤药物给药的浓度、水平、持续时间和/或频次。
在标志物比较不能指示抗肿瘤药物的疗效的患者体内，抗肿瘤药物的给药方案可以增加或减小。例如，如果标志物比较表明抗肿瘤药物不具有治疗效果，患者可接受与第一剂量的抗肿瘤药物相同或更大的第二剂量或后续剂量。第二剂量或后续剂量的增大可以是给药方案的变化，使得抗肿瘤药物被以比先前剂量更大的量更频繁地递送，或者递送更长时间。例如，第二剂量或后续剂量的增大可以是两次给药之间的时间减少，或抗肿瘤药物给药量或浓度增大。例如，第二剂量或后续剂量可以增大至少1倍、至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍或以上。第二剂量或后续剂量可与另一种抗肿瘤药物或任何其它治疗剂组合物结合施用。
同样，标志物比较指示抗肿瘤药物的功效的患者的给药方法可以改变或保持不变。在一些实施方案中，给药方案可以减小。例如，第二剂量可以减小至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍或以上。第二剂量或后续剂量的减小可以是两次给药之间的时间增加，或给药量或浓度减小。在某些实施方案中，不以第二剂量施用抗肿瘤药物。例如，第二剂量的抗肿瘤药物可仅包含相比于第一剂量不同的抗肿瘤药物。
在一些实施方案中，可根据任何医学上适当的理由或根据在施用抗肿瘤药物前后多个肿瘤响应性生物标志物的相对水平改变抗肿瘤药物的剂量。因此，在患者群体中平均而言，根据在施用抗肿瘤药物前后至少一种肿瘤响应性生物标志物的相对水平，可增加或减小抗肿瘤药物的第二剂量或后续剂量。由于遗传学、患者特征、环境和个体患者之间的疾病亚型的差别，在一个患者体内有效的方案可能在另一个患者体内无效或者有效程度可能不同。在患者群体中，可对至少一个患者施用低于第一剂量相同的第二剂量的抗肿瘤药物，可对至少一个患者施用高于第一剂量相同的第二剂量的抗肿瘤药物，并且可对至少一个患者施用与第一剂量相同的第二剂量的抗肿瘤药物。
另外提供了用于评估抗肿瘤药物在患者体内的疗效的方法。在一些实施方案中，方法包括(a)获得来自患者循环的第一基线样品，其中患者患有肿瘤；(b)给患者施用一定剂量的抗肿瘤药物，其中至少一种肿瘤细胞特异性标志物在施用抗肿瘤药物之前隔离到患者的肿瘤细胞内，但在施用抗肿瘤药物后释放到患者循环中；(c)获得来自患者循环的第二样品；(d)测量(i)第一基线样品中和(ii)第二样品中的至少一种肿瘤细胞特异性标志物的量，以及(e)将第一基线样品中肿瘤细胞特异性标志物的量与第二样品中肿瘤细胞特异性标志物的量进行比较。第二样品中至少一种肿瘤细胞特异性标志物的量相对于第一基线样品中至少一种肿瘤细胞特异性标志物的量的升高指示患者体内增加的肿瘤细胞死亡。在某些实施方案中，标志物是肿瘤响应性生物标志物，其水平响应于肿瘤负荷变化但不一定来源于肿瘤。在一些实施方案中，选择生物标志物，使得第二样品中肿瘤细胞特异性标志物的量相对于第一基线样品中生物标志物的量的减少指示增加的肿瘤细胞死亡。可以用增加至少一种肿瘤细胞特异性标志物的抗肿瘤药物治疗患者。或者，可以用降低至少一种生物标志物的水平的抗肿瘤药物治疗患者。
在一些实施方案中，抗肿瘤药物是抗癌药物，肿瘤细胞特异性标志物是癌症特异性标志物。在一些实施方案中，对患者施用单剂量的抗肿瘤药物。在其它实施方案中，对患者施用多个剂量的抗肿瘤药物。因此，可以在施用多个剂量的抗肿瘤药物后测定生物标志物的水平，以便监测抗肿瘤药物给药在整个给药过程中的效果。在特定实施方案中，生物标志物是肿瘤响应性生物标志物。
还可以设想到，本文实施方案可用于鉴定对特定类型的癌症或肿瘤具有较高功效的抗癌药物和抗肿瘤药物。具体地讲，测试受试者(通常为患有预定形式癌症的小鼠或其它类似的啮齿动物)的与预定形式癌症相关联的一种或多种生物分子(例如，淋巴瘤的CD20标志物或miRNA)的基线水平。将本发明的用于预定形式癌症的抗癌药物施用给受试者并测定生物分子的水平。生物分子相比于对照标志物的增加或减少用于鉴定具有更大的杀灭或破坏受试者的预定形式癌症的效能的抗癌药物。预期，可使用该方法测试多种抗癌药物，以鉴定和筛选对各种形式的癌症具有增强的功效的抗癌药物。此外，还可鉴定对一种类型的癌症比另一种类型的癌症具有更大功效的抗癌药物，从而使任何一种抗癌药物或治疗剂的癌细胞杀灭和破坏达到最大程度。
通过本文所公开的方法选择的抗肿瘤药物可配制成施用给患者的组合物，诸如药物组合物。在某些实施方案中，本公开提供了药物组合物，该药物组合物包含与药学上可接受的载体一起配制的如本文所公开的一种或多种抗肿瘤药物。该组合物可以任选地含有一种或多种附加药物活性成分，诸如另一种抗肿瘤药物。该药物组合物可包含任何数量的赋形剂。可用的赋形剂包括载体、表面活性剂、增稠剂或乳化剂、固体粘合剂、分散或悬浮助剂、增溶剂、着色剂、调味剂、包衣剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、防腐剂、等渗剂及其组合。合适的赋形剂的选择和应用在Gennaro编，Remington：The Science and Practice of Pharmacy，第20版(Lippincott Williams和Wilkins 2003)中有所教导，该文献的公开内容以引用方式并入本文中。可将药物组合物配制成适用于静脉给药、肌内给药、皮下给药、肠胃外给药、脊柱给药或表皮给药(例如，通过注射或输注)。
本文还提供了以下方法，所述方法测量在肿瘤形成后或在存在肿瘤的情况下、在暴露于抗肿瘤药物之后从特定种类的癌细胞或从正常细胞释放的某些肿瘤特异性生物标志物和肿瘤响应性生物标志物(诸如mRNA、rRNA、微小RNA、细胞游离DNA(cfDNA)以及细胞内通常含有的其它细胞溶质、细胞器或细胞核大分子)相比于在暴露于相同抗肿瘤药物之后从正常细胞释放的类似标志物的水平，从而确定在用抗肿瘤药物治疗后被杀灭的肿瘤细胞相对于被杀灭的正常细胞的程度和比率，即疗效。在一些实施方案中，在暴露于抗肿瘤药物之后某些生物标志物(诸如某些miRNA)的释放减少，使得当在施用抗肿瘤药物之后细胞外miRNA的水平降低时，发现抗肿瘤药物的疗效。在其它实施方案中，标志物是肿瘤响应性生物标志物，该标志物是响应于肿瘤负荷变化但不一定来源于肿瘤的血清、血浆或其它体液的正常组分。肿瘤响应性生物标志物可与肿瘤负荷成正比例或反比例。
本文所述的生物标志物可用于鉴定治疗药物在癌症受试者体内的功效(即，疗效或治疗指数)的方法。可测定用抗癌药物治疗过的患者体内的一种或多种生物标志物的水平，并且生物标志物的差异存在可以指示疗效。例如，在对人类受试者或非人动物施用抗肿瘤药物之前和之后miRNA的差异存在可以指示用抗肿瘤药物治疗的功效。
可以使用采用本文所述生物标志物的方法鉴定可用于给定受试者的癌症治疗的治疗剂(例如，抗肿瘤药物或抗癌药物)。例如，可以用抗癌药物治疗患有癌症的患者或其它受试者，以测定该抗癌药物在该患者体内的治疗指数。术语“功效”、“药物功效”、“抗肿瘤功效”或“疗效”是指抗肿瘤药物减缓生长、抑制生长、杀灭或破坏肿瘤细胞的能力。通过在用抗癌药物治疗之前测量存在于生物样品中的一种或多种生物标志物(例如，肿瘤特异性生物标志物和非特异性生物标志物或肿瘤响应性生物标志物)的量以及在用抗癌药物治疗之后测量相同的一种或多种生物标志物，来确定疗效。受试者体内的一种或多种生物标志物的差异存在表明，抗癌药物可以是可用于该受试者的治疗剂，即，考虑到癌症类型和阶段等，治疗指数对于受试者是可接受的。
在具体实施方案中，肿瘤响应性生物标志物的相对水平可与抗肿瘤药物的疗效相关。因此，本文公开了通过测定在施用一定剂量的抗肿瘤药物前后至少一种肿瘤响应性生物标志物的相对水平来预测施用抗肿瘤药物的疗效的方法，其中肿瘤响应性生物标志物的水平变化与抗肿瘤药物减缓生长、抑制生长、杀灭或破坏肿瘤细胞的能力相关。可以在单剂量后，或者在至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10个或以上剂量的抗肿瘤药物后确定疗效。
在某些实施方案中，在施用推定的抗肿瘤药物之前和之后测定肿瘤响应性生物标志物(例如miRNA标志物)的相对水平可以在传统的非侵入性技术(例如，CT扫描、MRI扫描、PET扫描)之前预测推定的抗肿瘤药物的功效。因此，如本文所用，术语“预测性功效”是指根据在施用推定的抗肿瘤药物前后肿瘤响应性生物标志物的相对水平选择药物，然后可以通过成像技术(诸如CT扫描、MRI扫描和PET扫描)测定药物功效。
在一些实施方案中，抗肿瘤药物是抗原结合蛋白或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗原结合蛋白是双特异性抗原结合蛋白或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗肿瘤药物是抗原结合蛋白和药物的缀合物。
可用于本文所公开的方法的抗肿瘤药物包括但不限于甲氨蝶呤(abitrexate)、阿霉素(adriamycin)、尿嘧啶(adrucil)、安吖啶(amsacrine)、门冬酰胺酶(asparaginase)、蒽环霉素(anthracycline)、阿扎胞苷(azacitidine)、硫唑嘌呤(azathioprine)、卡莫司汀(bicnu)、博莱霉素(blenoxane)、白消安(busulfan)、博来霉素(bleomycin)、伊立替康(camptosar)、喜树碱(camptothecin)、卡铂(carboplatin)、卡莫司汀(carmustine)、柔红霉素(cerubidine)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、顺铂、克拉屈滨(cladribine)、更生霉素(cosmegen)、阿糖胞苷(cytarabine)、赛德萨(cytosar)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、环磷氮芥(cytoxan)、放线菌素(dactinomycin)、多西他赛、多柔比星(doxorubicin)、道诺霉素(daunorubicin)、表阿霉素(ellence)、左旋门冬酰胺酶(elspar)、表柔比星(epirubicin)、依托泊苷(etoposide)、氟达拉滨(fludarabine)、氟尿嘧啶(fluorouracil)、福达华(fludara)、吉西他滨(gemcitabine)、健择(gemzar)、托泊替康(hycamtin)、羟基脲(hydroxyurea)、羟基脲(hydrea)、力达霉素(idamycin)、伊达比星(idarubicin)、异环磷酰胺(ifosfamide)、异环磷酰胺(ifex)、伊立替康(irinotecan)、鸟嘌呤片(lanvis)、瘤可宁(leukeran)、克拉立平(leustatin)、甲基苄肼(matulane)、二氯甲基二乙胺(mechlorethamine)、巯嘌呤(mercaptopurine)、甲氨蝶呤(methotrexate)、丝裂霉素(mitomycin)、米托蒽醌(mitoxantrone)、光神霉索(mithramycin)、突变霉索(mutamycin)、马勒兰(myleran)、氮杂胞苷(mylosar)、诺维本(navelbine)、尼喷提(nipent)、诺安托(novantrone)、长春新碱(oncovin)、奥沙利铂(oxaliplatin)、紫杉醇(paclitaxel)、卡波铂(paraplatin)、喷司他丁(pentostatin)、顺氯氨铂(platinol)、普卡霉素(plicamycin)、丙卡巴肼(procarbazine)、巯基嘌呤(purinethol)、雷替曲塞(ralitrexed)、泰素帝(taxotere)、紫杉酚(taxol)、替尼泊苷(teniposide)、硫鸟嘌呤(thioguanine)、拓优得(tomudex)、托泊替康(topotecan)、戊柔比星(valrubicin)、长春花碱(velban)、凡毕士(vepesid)、长春碱(vinblastine)、长春地辛(vindesine)、长春新碱(vincristine)、长春瑞滨(vinorelbine)、VP-16以及威猛(vumon)。在某些实施方案中，使用顺铂治疗肺癌肿瘤，使用多西他赛治疗前列腺癌肿瘤，并且使用伊立替康治疗结肠癌肿瘤。
用于确定患者(例如，哺乳动物，诸如人)体内的肿瘤杀灭功效的方法可包括检测来自患者的样品中的一种或多种肿瘤细胞特异性标志物的存在和量的一者或两者(或测量其量)的步骤。在一些实施方案中，样品中的肿瘤细胞特异性标志物的存在或量指示推定的抗肿瘤药物具有功效。在一些实施方案中，用于确定肿瘤杀灭功效的方法可包括在施用抗肿瘤药物前后测定至少一种肿瘤响应性生物标志物的水平的步骤。根椐所选择的肿瘤响应性生物标志物，在给药后肿瘤响应性生物标志物的水平的升高或降低可以指示功效。
在一些实施方案中，来自患者的样品中的一种或多种肿瘤细胞特异性标志物的存在表明推定的抗肿瘤药物具有功效。
在一些实施方案中，来自患者的样品中的一种或多种肿瘤细胞特异性标志物的量相比于标志物的基线量的差值表明推定的抗肿瘤药物具有功效。样品中的肿瘤细胞特异性标志物的量相比于标志物的基线量的增大(例如，1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍或以上的增大)可以表明推定的抗肿瘤药物具有功效。相似地，样品中的生物标志物的量相比于生物标志物的基线量的减小(例如，1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍或以上的减小)可以表明推定的抗肿瘤药物具有功效。同样，样品中的肿瘤响应性生物标志物的水平相比于标志物的基线量未升高或未降低可以表明施用推定的抗肿瘤药物不具有功效。
可使用多种熟知方法中的任何一种测定基线量(例如，在用推定的抗肿瘤药物治疗之前从患者获得的量或水平，或者在用任何抗肿瘤药物治疗之前从一个或多个受试者获得的量或水平)。例如，在用任何抗肿瘤药物治疗之前，来自一组已知患有给定癌症的个体的样品可平均含有量X的肿瘤细胞特异性标志物，而来自一组用给定抗肿瘤药物治疗后的个体的样品可平均含有平均比X高两倍或比X低两倍的量的肿瘤细胞特异性标志物。在一些实施方案中，基于肿瘤响应性生物标志物测定基线量。
可通过单方或通过分开的各方执行本文所公开的方法。例如，测定肿瘤响应性生物标志物水平的一方可与施用第一剂量和后续剂量的抗肿瘤药物的一方不同。在一些实施方案中，测定肿瘤响应性生物标志物的水平的一方是施用抗肿瘤药物剂量的相同一方。
样品采集
可以使用本领域中任何可接受的程序采集生物样品，例如，通过针吸体液、移除组织样品(例如活组织检查，例如，细针抽吸活组织检查、芯针活组织检查或切除活组织检查)等。典型的采集本质上是非侵入性的，采用容易获得的体液。然而，可从例如来自受试者的血液、血浆、血清、脑脊液、滑液、淋巴液、唾液或尿液获得样品。在某些实施方案中，样品是通过任何常规方法从个体或一组个体提取或抽取的血液样品。可以从个体或一组个体的静脉或动脉抽取血液。如果生物样品在测定之前必须贮存，则在测定之前可以将生物样品转移到载玻片或者可以冷冻以备稍后制备或立即置于固定液中。在分析之前可以将通过如上文所公开的任何手段从个体提取的样品转移到管或容器。容器可以是空的，或者可以包含各种采集介质。
可以在施用抗肿瘤药物之前和在施用抗肿瘤药物之后的任何时间采集样品。例如，可以在施用抗肿瘤药物前紧随其前、6小时前、12小时前、1天前、2天前、3天前、4天前、5天前、6天前、8天前、10天前、2周前、1个月前、1-3个月前、3-6个月前、6-12个月前或更久之前采集样品。还可以在施用抗肿瘤药物后紧随其后、6小时后、12小时后、1天后、2天后、3天后、4天后、5天后、10天后、2周后、1个月后、1-3个月后、3-6个月后或6-12个月后或更久之后采集样品。在具体实施方案中，在施用抗肿瘤药物之后3天采集样品。
标志物
本文提供的方法使用多个水平的各种生物标志物以实现所述目标。具体地讲，本文的可用的标志物通常隔离到肿瘤细胞(肿瘤特异性生物标志物)或正常细胞(对照标志物)的任一者内。肿瘤特异性生物标志物或对照标志物的任一者向患者循环的释放表明，相应细胞类型(肿瘤细胞或正常细胞)已被破坏或杀灭。这样，患者循环中的对照标志物的存在(特别是升高到基线水平以上时)指示细胞破坏，并且由肿瘤细胞释放的水平与由正常细胞释放的水平的比较指示或表明癌细胞和正常细胞是否响应于抗肿瘤药物被杀灭或破坏及其程度。在用本发明的抗肿瘤药物治疗前后这些标志物的非侵入性检测和测量可用于鉴定、调整剂量，以及确定任何一种抗肿瘤药物对任何一个患者和任何一类肿瘤的功效。在一些实施方案中，标志物是响应于肿瘤负荷变化但不一定来源于肿瘤的肿瘤响应性生物标志物。
本文的生物标志物可以是核酸、肽、蛋白质、脂质、抗原、碳水化合物或蛋白聚糖，诸如DNA(包括例如细胞游离DNA(cfDNA))或RNA。RNA可以是mRNA、miRNA、snoRNA、snRNA、rRNA、tRNA、siRNA、hnRNA或shRNA。cfDNA变化可包括点突变、DNA超甲基化、微卫星不稳定性以及杂合性缺失。检测多个生物标志物在一些实施方案中可提供相比于检测少于多个生物标志物更大的灵敏度或特异性。
示例性肿瘤细胞特异性miRNA包括但不限于miR-9、miR-15b、miR-15a/miR-16-1、miR-17-3、miR-20a、miR-21、miR-24、miR-25、miR-26a、miR-27、miR-28、miR-30c、miR-92、miR-96-5p、miR-107、miR-122、miR-125a、miR-125a-3p、miR-126、miR-141、miR-145、miR-145-5p、miR-148b、miR-155、miR-182、miR-183-5p、miR-192、miR-194、miR-195、miR-199a、miR-200家族、miR-200a、miR-200b、miR-210、miR-221、miR-221-5p、miR-222、miR-223、miR-298、miR-324-5p、miR-346、miR-375、miR-378、miR-409-3p、miR-423-5p、miR-491、miR-574-3p、miR-622、miR-629、miR-671-3p、miR-1285、let-7c和let-7e。示例性肿瘤响应性miRNA生物标志物还包括但不限于miR-802、miR-30b-3p、miR-510、miR-622、miR-127-3p、miR-373-5p、miR-298、miR-302b-3p、miR-367-3p、miR-181b-5p、miR-518a-3p、miR-155-5p、miR-214-3p、miR-329、let-7f-5p、miR-190b、miR-503-5p、miR-92a-1-5p、miR-647、miR-153、miR-93-5p、miR-20a-5p、miR-221-3p、miR-378a-3p、miR-221-3p、miR-20a5p、miR-93-5p、miR-190、miR-153、miR-26a-2、miR-518c、miR-503、miR-337-3p、miR-518f、miR-370、miR-92a-1、miR-526b、miR-1238、miR-886-3p、miR-887、miR-23a、miR-1267、miR-621、miR-515-3p、miR-424、miR-20b、miR-202、miR-21-3p、miR-101-5p、miR-122-3p、miR-197-3p、miR-429、miR-501-3p、miR-509-3p、miR-598、miR-206、miR-885-5p、miR-1972、miR-335-3p、miR-16-5p、miR-361-5p、miR-27a-5p、miR-24-3p、miR-1260a、miR-192-5p、miR-548h-5p、miR-122-5p、miR-1208、miR-215、miR-30a-3p、miR-588、miR-10a-3p、miR-21-5p、miR-382-3p、miR-15b-3p、miR-19b-3p、miR-543、miR-1271-5p、miR-106a-5p、miR-106b-5p、miR-520h、miR-181-a2、miR-1468、miR-634、miR-885-5p、miR-376a、miR-1265、miR-623、miR-15a、miR-629、miR-30d-3p、miR-483-5p、miR-708-3p。
在一些实施方案中，在施用抗肿瘤药物后得自癌症患者的样品中的肿瘤响应性miRNA生物标志物的水平的升高指示抗肿瘤药物的功效。在施用有效抗肿瘤药物后增加的示例性肿瘤响应性miRNA生物标志物包括但不限于miR-335-3p、miR-16-5p、miR-361-5p、miR-27a-5p、miR-24-3p、miR-1260a、miR-192-5p、miR-548h-5p、miR-122-5p、miR-1208、miR-215、miR-30a-3p、miR-588、miR-10a-3p、miR-21-5p、miR-382-3p、miR-15b-3p、miR-19b-3p、miR-543、miR-1271-5p、miR-106a-5p、miR-106b-5p、miR-520h、miR-181-a2、miR-1468、miR-634、miR-647、miR-885-5p、miR-376a、miR-1265、miR-623、miR-15a、miR-629、miR-30d-3p、miR-483-5p、miR-708-3p及其组合。
在某些实施方案中，在施用抗肿瘤药物后得自肺癌患者的样品中的肺肿瘤生物标志物miRNA的水平的升高指示抗肿瘤药物对抗肺肿瘤的功效。在施用有效抗肿瘤药物后增加的示例性肺肿瘤响应性miRNA生物标志物包括但不限于miR-335-3p、miR-16-5p、miR-361-5p、miR-27a-5p、miR-24-3p、miR-1260a、miR-192-5p、miR-548h-5p、miR-122-5p、miR-1208、miR-215、miR-30a-3p、miR-588、miR-10a-3p、miR-21-5p、miR-382-3p、miR-15b-3p、miR-19b-3p、miR-543、miR-1271-5p、miR-106a-5p、miR-106b-5p、miR-520h及其组合。
在某些实施方案中，在施用抗肿瘤药物后得自前列腺癌患者的样品中的前列腺肿瘤miRNA生物标志物的水平的升高指示抗肿瘤药物对抗前列腺肿瘤的功效。在施用有效抗肿瘤药物后增加的示例性前列腺肿瘤响应性miRNA生物标志物包括但不限于miR-181-a2、miR-1468、miR-634、miR-647、miR-885-5p、miR-376a、miR-1265、miR-623、miR-15a、miR-629及其组合。
在某些实施方案中，在施用抗肿瘤药物后得自结肠癌患者的样品中的结肠肿瘤miRNA生物标志物的水平的升高指示抗肿瘤药物对抗结肠肿瘤的功效。在施用有效抗肿瘤药物后增加的示例性结肠肿瘤响应性miRNA生物标志物包括但不限于miR-30d-3p、miR-483-5p、miR-708-3p及其组合。
在一些实施方案中，在施用抗肿瘤药物后得自癌症患者的样品中的肿瘤响应性miRNA生物标志物的水平的降低指示抗肿瘤药物的功效。在施用有效抗肿瘤药物后降低的示例性肿瘤响应性miRNA生物标志物包括但不限于miR-802、miR-30b-3p、miR-510、miR-622、miR-127-3p、miR-373-5p、miR-298、miR-302b-3p、miR-367-3p、miR-181b-5p、miR-518a-3p、miR-155-5p、miR-214-3p、miR-329、let-7f-5p、miR-190b、miR-503-5p、miR-92a-1-5p、miR-647、miR-153、miR-93-5p、miR-20a-5p、miR-221-3p、miR-378a-3p、miR-221-3p、miR-20a5p、miR-93-5p、miR-190、miR-153、miR-26a-2、miR-518c、miR-503、miR-337-3p、miR-518f、miR-370、miR-92a-1、miR-526b、miR-1238、miR-886-3p、miR-887、miR-23a、miR-1267、miR-621、miR-515-3p、miR-424、miR-20b、miR-202、miR-21-3p、miR-101-5p、miR-122-3p、miR-197-3p、miR-429、miR-501-3p、miR-509-3p、miR-598、miR-206、miR-885-5p、miR-1972及其组合。
在某些实施方案中，在施用抗肿瘤药物后得自肺癌患者的品中的肺肿瘤miRNA生物标志物的水平的降低指示抗肿瘤药物对抗肺肿瘤的功效。在施用有效抗肿瘤药物后减少的示例性肺肿瘤响应性miRNA生物标志物包括但不限于miR-802、miR-30b-3p、miR-510、miR-622、miR-127-3p、miR-373-5p、miR-298、miR-302b-3p、miR-367-3p、miR-181b-5p、miR-518a-3p、miR-155-5p、miR-214-3p、miR-329、let-7f-5p、miR-190b、miR-503-5p、miR-92a-1-5p、miR-647、miR-153、miR-93-5p、miR-20a-5p、miR-221-3p、miR-378a-3p、miR-221-3p、miR-20a5p、miR-93-5p及其组合。
在某些实施方案中，在施用抗肿瘤药物后得自前列腺癌患者的样品中的前列腺肿瘤miRNA生物标志物的水平的降低指示抗肿瘤药物对抗前列腺肿瘤的功效。在施用有效抗肿瘤药物后减少的示例性前列腺肿瘤响应性miRNA生物标志物包括但不限于miR-190、miR-153、miR-26a-2、miR-518c、miR-503、miR-337-3p、miR-518f、miR-370、miR-92a-1、miR-526b、miR-1238、miR-886-3p、miR-887、miR-23a、miR-1267、miR-621、miR-515-3p、miR-424、miR-20b、miR-202及其组合。
在某些实施方案中，在施用抗肿瘤药物后得自结肠癌患者的样品中的结肠肿瘤miRNA生物标志物的水平的降低指示抗肿瘤药物对抗结肠肿瘤的功效。在施用有效抗肿瘤药物后减少的示例性结肠肿瘤响应性miRNA生物标志物包括但不限于miR-21-3p、miR-101-5p、miR-122-3p、miR-197-3p、miR-429、miR-501-3p、miR-509-3p、miR-598、miR-206、miR-885-5p、miR-1972及其组合。
示例性癌细胞特异性蛋白包括但不限于BLK、转谷氨酰胺酶4(TGM4)、酸性磷酸酶(ACPP)、CD20、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、B淋巴酪氨酸激酶(BLK)、癌胚抗原、细胞角蛋白19片段、癌抗原125、癌抗原15-3、癌抗原19-9、BRCA-1、BRCA-2、hCG、甲状腺球蛋白、Hsp27、Hsp70、TGFβ以及甲胎蛋白。
示例性癌细胞特异性细胞游离DNA分子包括具有EGFR、TP53、KRAS、CD98、组织蛋白酶D和BRAF的突变、谷胱甘肽S-转移酶P1和septin 9基因的表观遗传改变以及CDKN2a和APC基因的超甲基化的DNA。
其它miRNA、细胞游离DNA和蛋白质是本领域的技术人员已知的并且本文可以设想到。
在一些实施方案中，核酸序列(例如，DNA、RNA、mRNA、miRNA、细胞游离DNA)可用作生物标志物，但由此编码的任何相关的多肽序列也可用作生物标志物。因此，提及检测或测量生物标志物时可指检测或测量多核苷酸或多肽序列中的任一者或两者。生物标志物还包括表观遗传改变(诸如DNA甲基化、mRNA甲基化、组蛋白修饰、微小RNA、siRNA、不同拼接形式的RNA或双链RNA)的指示物。
示例性非特异性或对照标志物包括例如乳酸脱氢酶(LDH)、谷胱甘肽还原酶(GR)和脂肪酸结合蛋白(FABP，包括L-FABP和I-FABP)、肾损伤分子-1(Kim-1)、S-100B以及神经元特异性烯醇化酶(NSE)。指示急性组织损伤的微小RNA包括miR-208、miR-133、miR-192、miR-1、miR-122和miR-124。本文可以设想到本领域的技术人员已知的其它非特异性或对照标志物。
可以在蛋白或核酸水平上进行监测、测量、检测、测定或观察。因此，生物标志物包括这些蛋白质和编码这些蛋白质的基因。如果在蛋白水平上进行检测，生物标志物蛋白包含全长多肽或其任何可检测的片段，并且可包括这些蛋白序列的变体。相似地，如果在核苷酸水平上进行检测，生物标志物核酸包括DNA，其包含全长编码序列、全长编码序列的片段、这些序列的变体(例如天然存在的变体或拼接变体)或此类序列的互补序列。生物标志物核酸还包括RNA，例如，mRNA，其包含编码所关注生物标志物蛋白的全长序列、所关注的全长RNA序列的片段、或这些序列的变体。生物标志物蛋白和生物标志物核酸还包括这些序列的变体。所谓“片段”是指多核苷酸的一部分或氨基酸序列并因而编码的蛋白质的一部分。为生物标志物核苷酸序列的片段的多核苷酸通常包含至少10、15、20、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、800、900、1,000、1,100、1,200、1,300或1,400个连续的核苷酸，或最多存在于本文所公开的全长生物标志物多核苷酸中的核苷酸个数。生物标志物多核苷酸的片段将通常编码至少15、25、30、50、100、150、200或250个连续氨基酸，或最多存在于本发明的全长生物标志物蛋白中的氨基酸的总数。“变体”欲指基本上相似的序列。一般来讲，如通过本领域已知的序列比对程序测定，本发明的特定生物标志物的变体将具有与生物标志物至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大的序列同一性。这些标志物的每一种的蛋白质和对应编码序列在本领域中是已知的。
可以根据功能对生物标志物进行分类。例如，生物标志物可参与DNA复制、细胞存活/死亡、核糖体生物合成、信号转导的调节、和细胞周期中的进展调节、MAP激酶磷酸酶活性、转录因子活性、细胞增殖、细胞间信号传导以及PolII启动子的调节。因此，可以设想到，落入这些功能分类的另外的基因和被编码的蛋白可以是根据本文所述方法的可用的生物标志物。
本文提供的方法相比于对正常细胞特异性的类似标志物的释放测量来自特定类别的肿瘤细胞的微小RNA(和细胞内通常含有的其它细胞溶质或细胞核大分子)的释放，从而确定肿瘤杀灭与正常细胞杀灭的程度和比率。本文还提供了相比于对正常细胞特异性的类似标志物的保留量测量来自特定类别的肿瘤细胞的微小RNA的保留量的方法，从而确定肿瘤杀灭与正常细胞杀灭的程度和比率。还提供了测量标志物对抗肿瘤药物的一般响应的方法，其中标志物不一定来自肿瘤。
在一些方面，肿瘤是前列腺癌，并且肿瘤细胞特异性标志物是选自miR-96-5p、miR-183-5p、miR-145-5p和miR-221-5p的微小RNA。对前列腺癌特异性的肿瘤响应性miRNA生物标志物也可包括miR-181-a2、miR-1468、miR-634、miR-647、miR-885-5p、miR-376a、miR-1265、miR-623、miR-15a、miR-629、miR-190、miR-153、miR-26a-2、miR-518c、miR-503、miR-337-3p、miR-518f、miR-370、miR-92a-1、miR-526b、miR-1238、miR-886-3p、miR-887、miR-23a、miR-1267、miR-621、miR-515-3p、miR-424、miR-20b、miR-202及其组合。在一些方面，肿瘤细胞特异性标志物是前列腺特异性膜抗原(PSMA)。
在某些方面，肿瘤是肺癌并且肿瘤响应性生物标志物是微小RNA，包括miR-335-3p、miR-16-5p、miR-361-5p、miR-27a-5p、miR-24-3p、miR-1260a、miR-192-5p、miR-548h-5p、miR-122-5p、miR-1208、miR-215、miR-30a-3p、miR-588、miR-10a-3p、miR-21-5p、miR-382-3p、miR-15b-3p、miR-19b-3p、miR-543、miR-1271-5p、miR-106a-5p、miR-106b-5p、miR-520h、miR-802、miR-30b-3p、miR-510、miR-622、miR-127-3p、miR-373-5p、miR-298、miR-302b-3p、miR-367-3p、miR-181b-5p、miR-518a-3p、miR-155-5p、miR-214-3p、miR-329、let-7f-5p、miR-190b、miR-503-5p、miR-92a-1-5p、miR-647、miR-153、miR-93-5p、miR-20a-5p、miR-221-3p、miR-378a-3p、miR-221-3p、miR-20a5p、miR-93-5p及其组合。
在某些方面，肿瘤是结肠癌并且肿瘤响应性生物标志物是微小RNA，包括miR-30d-3p、miR-483-5p、miR-708-3p、miR-21-3p、miR-101-5p、miR-122-3p、miR-197-3p、miR-429、miR-501-3p、miR-509-3p、miR-598、miR-206、miR-885-5p、miR-1972及其组合。
在一些方面，测量样品中的生物标志物并与对照物或一般细胞毒性标志物(诸如乳酸脱氢酶或谷胱甘肽还原酶)的水平进行比较。
本文可用的一些生物标志物代表已知基因，所述基因的序列可通过本领域的技术人员已知的公共数据库获得。
在一些实施方案中，本文所述方法使用生物分子(诸如RNA、微小RNA、蛋白质或DNA)，所述生物分子通常隔离到癌细胞内(例如，细胞溶质结合、细胞核结合、细胞器结合、膜结合等)并且对肿瘤细胞是特异性的，但是在被治疗剂破坏或杀灭时从肿瘤细胞释放。此类生物分子将包括但不限于：包含对癌细胞特异性的突变的RNA或DNA或蛋白质；肿瘤细胞的特征性的一种或多种微小RNA；或对产生癌症的细胞系特异性的RNA、DNA或蛋白质。此类生物标志物的增加指示肿瘤细胞杀灭，并且在一些方面可以将其与一般细胞毒性标志物(即，对肿瘤细胞不是特异性的)(诸如乳酸脱氢酶(LDH)或谷胱甘肽还原酶(GR))的水平进行比较。在一些方面，可以将在施用抗肿瘤药物后此类生物标志物的水平与在施用抗肿瘤药物之前的生物标志物水平进行比较，以便确定抗肿瘤药物的功效。
在某些实施方案中，本文所述方法使用生物分子(诸如miRNA)，所述生物分子通常由癌细胞释放并且对肿瘤细胞或特定类型的肿瘤细胞是特异性的，但当其被治疗剂破坏或杀灭时隔离到癌细胞内。此类生物分子包括肿瘤细胞或特定类型的肿瘤细胞(例如，肺癌或前列腺癌)的特征性的一种或多种微小RNA。此类生物标志物的减少指示肿瘤细胞杀灭或破坏，并且在一些方面可以将其与一般细胞毒性标志物(即，对肿瘤细胞不是特异性的)(诸如乳酸脱氢酶(LDH)或谷胱甘肽还原酶(GR))的水平进行比较。在一些方面，可以将在施用抗肿瘤药物后此类生物标志物的水平与在施用抗肿瘤药物之前的生物标志物水平进行比较，以便确定抗肿瘤药物的功效。在具体实施方案中，肿瘤响应性生物标志物不是由肿瘤细胞释放，而是响应于肿瘤的存在由肿瘤宿主释放。因此，肿瘤响应性生物标志物可与肿瘤负荷成正比例或反比例。
生物标志物的检测和定量
可以使用任何合适的方法检测本文所述的生物标志物中的一者或多者(的差异存在)。可以用检测和/或定量生物标志物的方法的一者或组合实现本发明的成功实践。这些方法包括但不限于基于杂交的方法，包括生物芯片阵列、质谱(例如，激光解吸/离子化质谱)、荧光(例如，夹心免疫测定法)、表面等离子共振、椭圆光度法和原子力显微镜中采用的那些。就核酸生物标志物而言，用于检测和定量的方法包括PCR、定量PCR、RNA印迹分析、DNA印迹分析、质谱等。
其它方法是本领域熟知的并且包括但不限于蛋白质印迹、ELISA、免疫沉淀、免疫荧光、流式细胞术和免疫组织化学。在特定的实施方案中，使用例如抗特异性生物标志物蛋白的抗体在蛋白水平上检测生物标志物的表达。这些抗体可用于多种方法，诸如蛋白质印迹、ELISA、多路复用(multiplexing)技术、免疫沉淀或免疫组织化学技术。在一些实施方案中，通过电化学发光(ECL)完成某些标志物的检测。
方法还可以包括电喷雾离子化质谱(ESI-MS)、ESI-MS/MS、ESI-MS/(MS)n、基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)、表面增强激光解吸/离子化飞行时间质谱(SELDI-TOF-MS)、硅表面解吸/离子化(DIOS)、二次离子质谱(SIMS)、四极杆飞行时间质谱(Q-TOF)、大气压化学电离质谱(APCI-MS)、APCI-MS/MS、APCI-(MS)n、大气压光电电离质谱(APPI-MS)、APPI-MS/MS和APPI-(MS)n、四极杆质谱、傅立叶变换质谱(FTMS)以及离子阱质谱中的一者或多者，其中n为大于0的整数。
在一个实施方案中，微阵列分析用于检测微小RNA，称为微小RNA或miRNA表达谱。用于检测微小RNA的微阵列可以是微阵列平台，其中微阵列的探针可以由反义miRNA或DNA寡核苷酸构成。在第一种情况中，靶标是带标记的有义miRNA序列，且在后一种情况中，miRNA被反转录为cDNA并且带标记。
用于检测微小RNA的微阵列可以是市售的阵列平台，诸如NCode.TM.miRNA微阵列表达谱(Invitrogen)、miRCURY LNA.TM.微小RNA阵列(Exiqon)、微小RNA阵列(Agilent)、.mu.Paraflo.RTM.微流体生物芯片技术(LC Sciences)、微小RNA表达谱面板(Illumina)、Geniom.RTM.生物芯片(Febit Inc.)、微小RNA阵列(Oxford Gene Technology)、定制的AdmiRNA.TM.表达谱服务(Applied Biological Materials Inc.)、微小RNA阵列(Dharmacon--Thermo Scientific)、LDA TaqMan分析(Applied Biosystems)、Taqman微小RNA阵列(Applied Biosystems)或任何其它的市售的阵列。
微阵列分析可以包括RNA分离、RNA扩增、逆转录、靶标标记、杂交到微阵列芯片上、图象分析和归一化和后续的数据分析的所有步骤或步骤子集；可以根据制造商规程执行这些步骤中的每一个。
由此结论，如上文所公开的方法中的任何一种(例如，用于诊断个体的方法)还可以包括以下步骤中的一者或多者：[0286]i)从样品分离miRNA，[0287]ii)标记所述miRNA，[0288]iii)使所述标记的miRNA杂交到包括miRNA特异性探针的徽阵列，从而得到样品的杂交谱，[0289]iv)执行数据分析以获得所述样品的miRNA表达谱的量度。
在另一个实施方案中，用于检测微小RNA的微阵列是定制的。
探针或杂交探针是具有可变长度的DNA或RNA片段，其用于在DNA或RNA样品中检测与探针中的序列互补的核苷酸序列(靶标)的存在。一个实例是样品(靶标)中的有义miRNA序列和反义miRNA探针。探针由此杂交到单链核酸(DNA或RNA)，由于探针和靶标之间的互补性，所述单链核酸的碱基序列允许探针-靶标碱基配对。
要检测探针与其靶序列的杂交，用分子标志物标志(或标记)探针或样品。具有中度或高度相似性的序列的检测取决于应用杂交条件的严格程度——杂交缓冲液中的高严格性(诸如高杂交温度和低盐)仅允许高度相似的核酸序列之间杂交，而低严格性(诸如低温和高盐)允许在序列相似性较低时进行杂交。用于微阵列的杂交探针是指共价附接到惰性表面(诸如镀膜载玻片)并且与移动靶标杂交的的核苷酸序列。根椐该方法，可以通过亚磷酰胺技术合成探针或通过PCR扩增或克隆(更老的方法)生成探针。要设计探针序列，可以使用探针设计算法确保最大特异性(辨别紧密相关的靶标)、灵敏度(最大杂交强度)和针对均匀杂交归一化的熔解温度。
系统
在本发明的另一个实施方案中，可随后对检测设备的输出处理、存储和使用生物信息学系统进一步分析或测定。生物信息学系统可以包括但不限于以下一者或多者：计算机；连接至网络的多个计算机；信号处理工具；图案识别工具；针对样品制备、分离和检测控制流速的工具。
数据处理采用数学基础。在本发明的另一个实施方案中，使用动态编程使分离轴与标准分离谱一致。可以例如通过将大致90％的强度值拟合到标准光谱中来使强度归一化。然后可使用为分离而设计的小波和质谱仪数据拟合数据集。在本发明的另一个实施方案中，数据处理过滤掉一些噪声并且降低光谱维数，从而可能允许图案识别。
在数据处理后，可利用图案识别工具鉴定表型状态之间的细微差异。图案识别工具基于提供降维的统计和计算机科学方法的组合。此类工具是可测量的。因此获得的数据可以存储到计算机可读介质上。
试剂盒
在一个方面，本发明提供了用于定性受试者体内的癌症状态的试剂盒，其中试剂盒可用于检测本文所述生物标志物的差异存在。例如，试剂盒可用于检测在暴露于治疗药物前后受试者的肿瘤样品中的生物标志物的任何组合的差异存在。本发明的试剂盒具有许多应用。例如，试剂盒可用于监测治疗药物在癌症受试者体内的功效。试剂盒还可用于鉴定可用于治疗癌症的试剂。
在具体实施方案中，本发明的试剂盒包含生物标志物的测定，该生物标志物任选地为同位素标记或荧光标记的。
本发明的试剂盒可以包括说明、试剂、测试设备(试管、反应器、针、注射器等)、用于校准的标准物和/或设备。试剂可以包括酸、碱、氧化剂和标志物质。根据本发明的试剂盒中提供的说明可以标签或单独的说明书形式涉及合适的操作参数。
试剂盒还可以包括吸附剂，其中吸附剂保留本文所述的一种或多种生物标志物(多核苷酸或多肽)，以及用于定性受试者体内的癌症状态的试剂盒的书面使用说明。此类试剂盒可例如包括：(a)基底，其上包含吸附剂，其中吸附剂适用于结合生物标志物，以及(b)通过使样品与吸附剂接触并且检测被吸附剂保留的产物来检测生物标志物的说明。因此，试剂盒可包括(a)特异性地结合到生物标志物的DNA探针；和(b)检测试剂。此类试剂盒还可包含洗脱液(作为替代品或与说明的组合)或用于制备洗脱液的说明，其中吸附剂和洗脱液的组合允许使用例如气相离子光谱检测生物标志物。
虽然结合多个实施方案具体示出和描述本发明，但本领域的技术人员将理解到，在不脱离发明的实质和范围的情况下，可以对本文所公开的各种实施方案做出形式和细节的变化，并且本文所公开的各种实施方案不旨在对权利要求的范围进行限制。
制品
本文所述的方法和材料可用于例如确定推定的抗癌药物的功效以及帮助执业医生为受试者选择适当的疗法。为有助于该选择，可能有用的是用于治疗给定癌症的药剂(诸如包括本文所述抗癌剂的疗法中的任一种)包含信息或适当的标签，所述信息或适当的标签表明，应当对在推定的抗肿瘤药物首次给药(或测试给药)后给定肿瘤细胞特异性标志物的水平升高的受试者开具(和/或施用)药剂。因此，本公开的特征还在于制品，其包括：容器；和容器内含有的组合物，其中组合物包含用于治疗受试者的给定癌症的活性剂，并且其中容器具有标签，该标签表明，如果在首次给药后得自受试者的样品含有大于相同标志物的对照物量的肿瘤细胞特异性标志物量，则组合物用于治疗受试者体内的癌症。该制品还可包含用于对受试者施用活性剂的说明。
带编号的实施方案
1.一种控制施用给癌症患者的抗肿瘤药物剂量的方法，其包括：
测定该患者的第一生物样品中至少一种肿瘤响应性生物标志物的第一水平，其中第一样品是在施用给患者第一剂量的抗肿瘤药物之前获得的；
测定该患者的后续生物样品中所述至少一种肿瘤响应性生物标志物的第二水平，其中该后续样品是在施用给患者第一剂量的抗肿瘤药物之后获得的；
其中在此之后，该患者接受第二剂量的抗肿瘤药物，其中第二剂量的给药方案取决于在施用第一剂量的抗肿瘤药物后在患者的后续生物样品中鉴定的肿瘤响应性生物标志物的水平是降低或是升高。
2.根据实施方案1所述的方法，其中所述至少一种肿瘤响应性生物标志物包括选自以下的miRNA标志物：miR-802、miR-30b-3p、miR-510、miR-622、miR-127-3p、miR-373-5p、miR-298、miR-302b-3p、miR-367-3p、miR-181b-5p、miR-518a-3p、miR-155-5p、miR-214-3p、miR-329、let-7f-5p、miR-190b、miR-503-5p、miR-92a-1-5p、miR-647、miR-153、miR-93-5p、miR-20a-5p、miR-221-3p、miR-378a-3p、miR-221-3p、miR-20a5p、miR-93-5p、miR-190、miR-153、miR-26a-2、miR-518c、miR-503、miR-337-3p、miR-518f、miR-370、miR-92a-1、miR-526b、miR-1238、miR-886-3p、miR-887、miR-23a、miR-1267、miR-621、miR-515-3p、miR-424、miR-20b、miR-202、miR-21-3p、miR-101-5p、miR-122-3p、miR-197-3p、miR-429、miR-501-3p、miR-509-3p、miR-598、miR-206、miR-885-5p、miR-1972、miR-335-3p、miR-16-5p、miR-361-5p、miR-27a-5p、miR-24-3p、miR-1260a、miR-192-5p、miR-548h-5p、miR-122-5p、miR-1208、miR-215、miR-30a-3p、miR-588、miR-10a-3p、miR-21-5p、miR-382-3p、miR-15b-3p、miR-19b-3p、miR-543、miR-1271-5p、miR-106a-5p、miR-106b-5p、miR-520h、miR-181-a2、miR-1468、miR-634、miR-885-5p、miR-376a、miR-1265、miR-623、miR-15a、miR-629、miR-30d-3p、miR-483-5p、miR-708-3p及其组合。
3.根据实施方案1或2中任一项所述的方法，其中如果至少一种肿瘤响应性生物标志物的水平未升高，则改变抗肿瘤药物的给药方案。
4.根据实施方案1-3中任一项所述的方法，其中至少一种肿瘤响应性生物标志物包括至少一种选自以下的miRNA标志物：miR-335-3p、miR-16-5p、miR-361-5p、miR-27a-5p、miR-24-3p、miR-1260a、miR-192-5p、miR-548h-5p、miR-122-5p、miR-1208、miR-215、miR-30a-3p、miR-588、miR-10a-3p、miR-21-5p、miR-382-3p、miR-15b-3p、miR-19b-3p、miR-543、miR-1271-5p、miR-106a-5p、miR-106b-5p、miR-520h、miR-181-a2、miR-1468、miR-634、miR-647、miR-885-5p、miR-376a、miR-1265、miR-623、miR-15a、miR-629、miR-30d-3p、miR-483-5p、miR-708-3p及其组合。
5.根据实施方案1-4中任一项所述的方法，其中癌症是肺癌并且至少一种肿瘤响应性生物标志物包括至少一种选自以下的miRNA标志物：miR-335-3p、miR-16-5p、miR-361-5p、miR-27a-5p、miR-24-3p、miR-1260a、miR-192-5p、miR-548h-5p、miR-122-5p、miR-1208、miR-215、miR-30a-3p、miR-588、miR-10a-3p、miR-21-5p、miR-382-3p、miR-15b-3p、miR-19b-3p、miR-543、miR-1271-5p、miR-106a-5p、miR-106b-5p、miR-520h及其组合。
6.根据实施方案1-4中任一项所述的方法，其中癌症是前列腺癌并且至少一种肿瘤响应性生物标志物包括至少一种选自以下的miRNA标志物：miR-181-a2、miR-1468、miR-634、miR-647、miR-885-5p、miR-376a、miR-1265、miR-623、miR-15a、miR-629及其组合。
7.根据实施方案1-4中任一项所述的方法，其中癌症是结肠癌并且至少一种肿瘤响应性生物标志物包括至少一种选自以下的miRNA标志物：miR-30d-3p、miR483--5p、miR-708-3p及其组合。
8.根据实施方案1或2中任一项所述的方法，其中如果至少一种肿瘤响应性生物标志物的水平未降低，则改变抗肿瘤药物的给药方案。
9.根据实施方案1、2或8所述的方法，其中至少一种肿瘤响应性生物标志物包括至少一种选自以下的miRNA标志物：miR-802、miR-30b-3p、miR-510、miR-622、miR-127-3p、miR-373-5p、miR-298、miR-302b-3p、miR-367-3p、miR-181b-5p、miR-518a-3p、miR-155-5p、miR-214-3p、miR-329、let-7f-5p、miR-190b、miR-503-5p、miR-92a-1-5p、miR-647、miR-153、miR-93-5p、miR-20a-5p、miR-221-3p、miR-378a-3p、miR-221-3p、miR-20a5p、miR-93-5p、miR-190、miR-153、miR-26a-2、miR-518c、miR-503、miR-337-3p、miR-518f、miR-370、miR-92a-1、miR-526b、miR-1238、miR-886-3p、miR-887、miR-23a、miR-1267、miR-621、miR-515-3p、miR-424、miR-20b、miR-202、miR-21-3p、miR-101-5p、miR-122-3p、miR-197-3p、miR-429、miR-501-3p、miR-509-3p、miR-598、miR-206、miR-885-5p、miR-1972及其组合。
10.根据实施方案1、2、8或9所述的方法，其中所述癌症是肺癌，并且至少一种肿瘤响应性生物标志物包括至少一种选自以下的miRNA标志物：miR-802、miR-30b-3p、miR-510、miR-622、miR-127-3p、miR-373-5p、miR-298、miR-302b-3p、miR-367-3p、miR-181b-5p、miR-518a-3p、miR-155-5p、miR-214-3p、miR-329、let-7f-5p、miR-190b、miR-503-5p、miR-92a-1-5p、miR-647、miR-153、miR-93-5p、miR-20a-5p、miR-221-3p、miR-378a-3p、miR-221-3p、miR-20a5p、miR-93-5p及其组合。
11.根据实施方案1、2、8或9所述的方法，其中癌症是前列腺癌，并且至少一种肿瘤响应性生物标志物包括至少一种选自以下的miRNA标志物：miR-190、miR-153、miR-26a-2、miR-518c、miR-503、miR-337-3p、miR-518f、miR-370、miR-92a-1、miR-526b、miR-1238、miR-886-3p、miR-887、miR-23a、miR-1267、miR-621、miR-515-3p、miR-424、miR-20b、miR-202及其组合。
12.根据实施方案1、2、8或9所述的方法，其中癌症是结肠癌，并且至少一种肿瘤响应性生物标志物包括至少一种选自以下的miRNA标志物：miR-21-3p、miR-101-5p、miR-122-3p、miR-197-3p、miR-429、miR-501-3p、miR-509-3p、miR-598、miR-206、miR-885-5p、miR-1972及其组合。
13.根据实施方案1-12中任一项所述的方法，其还包括：
在施用给患者第一剂量的抗肿瘤药物之前和之后测定对照标志物的量，其中根据测定步骤中肿瘤响应性生物标志物的水平相比于对照标志物的水平的变化，调整抗肿瘤药物的第二剂量。
其中对照标志物不同于肿瘤响应性生物标志物。
14.根据实施方案1-13中任一项所述的方法，其中肿瘤选自非霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、多发性骨髓瘤、B细胞淋巴瘤、高度B细胞淋巴瘤、中度B细胞淋巴瘤、低度B细胞淋巴瘤、B细胞急性淋巴细胞白血病、霍奇金病、浆细胞瘤、滤泡性淋巴瘤、滤泡性小裂淋巴瘤、滤泡性大细胞淋巴瘤、滤泡性混合性小裂淋巴瘤、弥漫型小裂细胞性淋巴瘤、弥漫型小淋巴细胞性淋巴瘤、幼淋巴细胞白血病、淋巴浆细胞性淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、粘膜相关的淋巴组织淋巴瘤、单核细胞样B细胞淋巴瘤、脾淋巴瘤、毛发细胞白血病、弥漫型大细胞淋巴瘤、纵隔大B细胞淋巴瘤、淋巴瘤样肉芽肿病、血管内淋巴瘤病、弥漫型混合性细胞淋巴瘤、弥漫型大细胞淋巴瘤、免疫母细胞性淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、AIDS相关淋巴瘤、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症、套细胞淋巴瘤、重链病、肺癌瘤、乳腺癌瘤、卵巢癌瘤、皮肤癌瘤、结肠癌瘤、膀胱癌瘤、肝脏癌瘤、胃癌瘤、前列腺癌、肾细胞癌瘤、鼻咽癌瘤、鳞状细胞癌瘤、甲状腺乳头状癌瘤、宫颈癌瘤以及肉瘤。
15.根据实施方案1-14中任一项所述的方法，其中第一生物样品和第二生物样品是得自患者的血液、血浆、血清、脑脊液、滑液、淋巴液、唾液或尿液的流体样品。
16.根据实施方案1-15中任一项所述的方法，其中第二生物样品在施用第一剂量的抗肿瘤药物后紧随其后、6小时后、12小时后、1天后、2天后、3天后、4天后、5天后、10天后、2周后、1个月后、1-3个月后、3-6个月后或6-12个月后得自患者。
17.根据实施方案1-16中任一项所述的方法，其中在施用第二剂量的抗肿瘤药物后抗肿瘤药物的疗效增大。
18.根据实施方案1-17中任一项所述的方法，其中抗肿瘤药物包括顺铂、多西他赛或伊立替康。
19.根据实施方案1-18中任一项所述的方法，其中将第二剂量的抗肿瘤药物与不同的抗肿瘤药物一起施用。
20.一种将至少一种抗肿瘤药物以两个单独的剂量施用给癌症患者的方法，其包括：
(a)获得来自患者的第一生物样品；
(b)测定第一生物样品中的至少一种肿瘤响应性生物标志物的基线水平；
(c)对患者施用第一剂量的抗肿瘤药物；
(d)获得来自患者的第二生物样品；
(e)测定第二生物样品中的至少一种肿瘤响应性生物标志物的第一水平；
(f)将肿瘤响应性生物标志物的基线水平与第一水平进行比较，以鉴定患者的至少一种肿瘤响应性生物标志物的水平是降低或是升高；以及
(g)对患者施用第二剂量的抗肿瘤药物，
其中如果患者的至少一种肿瘤响应性生物标志物的水平降低或升高，则改变第二剂量的给药方案。
21.根据实施方案20所述的方法，其中所述至少一种肿瘤响应性生物标志物包括至少一种选自以下的miRNA标志物：miR-802、miR-30b-3p、miR-510、miR-622、miR-127-3p、miR-373-5p、miR-298、miR-302b-3p、miR-367-3p、miR-181b-5p、miR-518a-3p、miR-155-5p、miR-214-3p、miR-329、let-7f-5p、miR-190b、miR-503-5p、miR-92a-1-5p、miR-647、miR-153、miR-93-5p、miR-20a-5p、miR-221-3p、miR-378a-3p、miR-221-3p、miR-20a5p、miR-93-5p、miR-190、miR-153、miR-26a-2、miR-518c、miR-503、miR-337-3p、miR-518f、miR-370、miR-92a-1、miR-526b、miR-1238、miR-886-3p、miR-887、miR-23a、miR-1267、miR-621、miR-515-3p、miR-424、miR-20b、miR-202、miR-21-3p、miR-101-5p、miR-122-3p、miR-197-3p、miR-429、miR-501-3p、miR-509-3p、miR-598、miR-206、miR-885-5p、miR-1972、miR-335-3p、miR-16-5p、miR-361-5p、miR-27a-5p、miR-24-3p、miR-1260a、miR-192-5p、miR-548h-5p、miR-122-5p、miR-1208、miR-215、miR-30a-3p、miR-588、miR-10a-3p、miR-21-5p、miR-382-3p、miR-15b-3p、miR-19b-3p、miR-543、miR-1271-5p、miR-106a-5p、miR-106b-5p、miR-520h、miR-181-a2、miR-1468、miR-634、miR-885-5p、miR-376a、miR-1265、miR-623、miR-15a、miR-629、miR-30d-3p、miR-483-5p、miR-708-3p及其组合。
22.根据实施方案20或21所述的方法，其中如果至少一种肿瘤响应性生物标志物的水平未升高，则改变抗肿瘤药物的给药方案。
23.根据实施方案20-22中任一项所述的方法，其中至少一种肿瘤响应性生物标志物包括至少一种选自以下的miRNA标志物：miR-335-3p、miR-16-5p、miR-361-5p、miR-27a-5p、miR-24-3p、miR-1260a、miR-192-5p、miR-548h-5p、miR-122-5p、miR-1208、miR-215、miR-30a-3p、miR-588、miR-10a-3p、miR-21-5p、miR-382-3p、miR-15b-3p、miR-19b-3p、miR-543、miR-1271-5p、miR-106a-5p、miR-106b-5p、miR-520h、miR-181-a2、miR-1468、miR-634、miR-647、miR-885-5p、miR-376a、miR-1265、miR-623、miR-15a、miR-629、miR-30d-3p、miR-483-5p、miR-708-3p及其组合。
24.根据实施方案20-23中任一项所述的方法，其中癌症是肺癌并且至少一种肿瘤响应性生物标志物包括至少一种选自以下的miRNA标志物：miR-335-3p、miR-16-5p、miR-361-5p、miR-27a-5p、miR-24-3p、miR-1260a、miR-192-5p、miR-548h-5p、miR-122-5p、miR-1208、miR-215、miR-30a-3p、miR-588、miR-10a-3p、miR-21-5p、miR-382-3p、miR-15b-3p、miR-19b-3p、miR-543、miR-1271-5p、miR-106a-5p、miR-106b-5p、miR-520h及其组合。
25.根据实施方案20-23中任一项所述的方法，其中癌症是前列腺癌并且至少一种肿瘤响应性生物标志物包括至少一种选自以下的miRNA标志物：miR-181-a2、miR-1468、miR-634、miR-647、miR-885-5p、miR-376a、miR-1265、miR-623、miR-15a、miR-629及其组合。
26.根据实施方案20-23中任一项所述的方法，其中癌症是结肠癌并且至少一种肿瘤响应性生物标志物包括至少一种选自以下的miRNA标志物：miR-30d-3p、miR-483-5p、miR-708-3p及其组合。
27.根据实施方案20或21所述的方法，其中如果至少一种肿瘤响应性生物标志物的水平未降低，则改变抗肿瘤药物的给药方案。
28.根据实施方案20、21或27所述的方法，其中至少一种肿瘤响应性生物标志物包括至少一种选自以下的miRNA标志物：miR-802、miR-30b-3p、miR-510、miR-622、miR-127-3p、miR-373-5p、miR-298、miR-302b-3p、miR-367-3p、miR-181b-5p、miR-518a-3p、miR-155-5p、miR-214-3p、miR-329、let-7f-5p、miR-190b、miR-503-5p、miR-92a-1-5p、miR-647、miR-153、miR-93-5p、miR-20a-5p、miR-221-3p、miR-378a-3p、miR-221-3p、miR-20a5p、miR-93-5p、miR-190、miR-153、miR-26a-2、miR-518c、miR-503、miR-337-3p、miR-518f、miR-370、miR-92a-1、miR-526b、miR-1238、miR-886-3p、miR-887、miR-23a、miR-1267、miR-621、miR-515-3p、miR-424、miR-20b、miR-202、miR-21-3p、miR-101-5p、miR-122-3p、miR-197-3p、miR-429、miR-501-3p、miR-509-3p、miR-598、miR-206、miR-885-5p、miR-1972及其组合。
29.根据实施方案20、21、27或28所述的方法，其中癌症是肺癌，并且至少一种肿瘤响应性生物标志物包括至少一种选自以下的miRNA标志物：miR-802、miR-30b-3p、miR-510、miR-622、miR-127-3p、miR-373-5p、miR-298、miR-302b-3p、miR-367-3p、miR-181b-5p、miR-518a-3p、miR-155-5p、miR-214-3p、miR-329、let-7f-5p、miR-190b、miR-503-5p、miR-92a-1-5p、miR-647、miR-153、miR-93-5p、miR-20a-5p、miR-221-3p、miR-378a-3p、miR-221-3p、miR-20a5p、miR-93-5p及其组合。
30.根据实施方案20、21、27或28所述的方法，其中癌症是前列腺癌，并且至少一种肿瘤响应性生物标志物包括选自以下的至少miRNA标志物：miR-190、miR-153、miR-26a-2、miR-518c、miR-503、miR-337-3p、miR-518f、miR-370、miR-92a-1、miR-526b、miR-1238、miR-886-3p、miR-887、miR-23a、miR-1267、miR-621、miR-515-3p、miR-424、miR-20b、miR-202及其组合。
31.根据实施方案20、21、27或28所述的方法，其中癌症是结肠癌，并且至少一种肿瘤响应性生物标志物包括至少一种选自以下的miRNA标志物：miR-21-3p、miR-101-5p、miR-122-3p、miR-197-3p、miR-429、miR-501-3p、miR-509-3p、miR-598、miR-206、miR-885-5p、miR-1972及其组合。
32.根据实施方案20-31中任一项所述的方法，其中肿瘤选自非霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、多发性骨髓瘤、B细胞淋巴瘤、高度B细胞淋巴瘤、中度B细胞淋巴瘤、低度B细胞淋巴瘤、B细胞急性淋巴细胞白血病、霍奇金病、浆细胞瘤、滤泡性淋巴瘤、滤泡性小裂淋巴瘤、滤泡性大细胞淋巴瘤、滤泡性混合性小裂淋巴瘤、弥漫型小裂细胞性淋巴瘤、弥漫型小淋巴细胞性淋巴瘤、幼淋巴细胞白血病、淋巴浆细胞性淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、粘膜相关的淋巴组织淋巴瘤、单核细胞样B细胞淋巴瘤、脾淋巴瘤、毛发细胞白血病、弥漫型大细胞淋巴瘤、纵隔大B细胞淋巴瘤、淋巴瘤样肉芽肿病、血管内淋巴瘤病、弥漫型混合性细胞淋巴瘤、弥漫型大细胞淋巴瘤、免疫母细胞性淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、AIDS相关淋巴瘤、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症、套细胞淋巴瘤、重链病、肺癌瘤、乳腺癌瘤、卵巢癌瘤、皮肤癌瘤、结肠癌瘤、膀胱癌瘤、肝脏癌瘤、胃癌瘤、前列腺癌、肾细胞癌瘤、鼻咽癌瘤、鳞状细胞癌瘤、甲状腺乳头状癌瘤、宫颈癌瘤以及肉瘤。
33.根据实施方案20-32中任一项所述的方法，其中第一生物样品和第二生物样品是得自患者的血液、血浆、血清、脑脊液、滑液、淋巴液、唾液或尿液的流体样品。
34.根据实施方案20-33中任一项所述的方法，其中第二生物样品在施用第一剂量的抗肿瘤药物后紧随其后、6小时后、12小时后、1天后、2天后、3天后、4天后、5天后、10天后、2周后、1个月后、1-3个月后、3-6个月后或6-12个月后得自患者。
35.根据实施方案20-34中任一项所述的方法，其中在施用第二剂量的抗肿瘤药物后抗肿瘤药物的疗效增大。
36.根据实施方案20-35中任一项所述的方法，其中抗肿瘤药物包括顺铂、多西他赛或伊立替康。
37.根据实施方案20-36中任一项所述的方法，其中将第二剂量的抗肿瘤药物与不同的抗肿瘤药物一起施用。
38.一种选择至少一种抗肿瘤药物的方法，该方法包括：
在对患有肿瘤的宿主非人动物施用候选抗肿瘤药物之前和之后测定至少一种肿瘤响应性生物标志物的水平；以及
如果候选抗肿瘤药物使宿主非人动物体内的至少一种肿瘤响应性生物标志物的水平升高或降低，则选择抗肿瘤药物。
39.根据实施方案38所述的方法，其中将至少一种所选择的抗肿瘤药物配制成组合物。
40.根据实施方案38所述的方法，其还包括：
(a)提供患有肿瘤的宿主非人动物；
(b)获得来自宿主非人动物的第一生物样品；
(c)测定第一生物样品中的至少一种肿瘤响应性生物标志物的基线水平；
(d)对宿主非人动物施用候选抗肿瘤药物；
(e)获得来自宿主非人动物的第二生物样品；
(f)测定第二生物样品中的至少一种肿瘤响应性生物标志物的第一水平；
(g)将肿瘤特异性miRNA标志物的基线水平与第一水平进行比较，以鉴定患者的至少一种肿瘤响应性生物标志物的水平是降低或是升高；以及
(h)如果施用候选抗肿瘤药物导致宿主非人动物体内肿瘤响应性生物标志物的水平升高或降低，则选择候选抗肿瘤药物作为抗肿瘤药物。
41.根据实施方案38-40中任一项所述的方法，其中至少一种肿瘤响应性生物标志物包括至少一种选自以下的miRNA标志物：miR-802、miR-30b-3p、miR-510、miR-622、miR-127-3p、miR-373-5p、miR-298、miR-302b-3p、miR-367-3p、miR-181b-5p、miR-518a-3p、miR-155-5p、miR-214-3p、miR-329、let-7f-5p、miR-190b、miR-503-5p、miR-92a-1-5p、miR-647、miR-153、miR-93-5p、miR-20a-5p、miR-221-3p、miR-378a-3p、miR-221-3p、miR-20a5p、miR-93-5p、miR-190、miR-153、miR-26a-2、miR-518c、miR-503、miR-337-3p、miR-518f、miR-370、miR-92a-1、miR-526b、miR-1238、miR-886-3p、miR-887、miR-23a、miR-1267、miR-621、miR-515-3p、miR-424、miR-20b、miR-202、miR-21-3p、miR-101-5p、miR-122-3p、miR-197-3p、miR-429、miR-501-3p、miR-509-3p、miR-598、miR-206、miR-885-5p、miR-1972、miR-335-3p、miR-16-5p、miR-361-5p、miR-27a-5p、miR-24-3p、miR-1260a、miR-192-5p、miR-548h-5p、miR-122-5p、miR-1208、miR-215、miR-30a-3p、miR-588、miR-10a-3p、miR-21-5p、miR-382-3p、miR-15b-3p、miR-19b-3p、miR-543、miR-1271-5p、miR-106a-5p、miR-106b-5p、miR-520h、miR-181-a2、miR-1468、miR-634、miR-885-5p、miR-376a、miR-1265、miR-623、miR-15a、miR-629、miR-30d-3p、miR-483-5p、miR-708-3p及其组合。
42.根据实施方案38-41中任一项所述的方法，其中如果至少一种肿瘤响应性生物标志物的水平升高，则选择候选抗肿瘤药物。
43.根据实施方案38-42中任一项所述的方法，其中至少一种肿瘤响应性生物标志物包括至少一种选自以下的miRNA标志物：miR-335-3p、miR-16-5p、miR-361-5p、miR-27a-5p、miR-24-3p、miR-1260a、miR-192-5p、miR-548h-5p、miR-122-5p、miR-1208、miR-215、miR-30a-3p、miR-588、miR-10a-3p、miR-21-5p、miR-382-3p、miR-15b-3p、miR-19b-3p、miR-543、miR-1271-5p、miR-106a-5p、miR-106b-5p、miR-520h、miR-181-a2、miR-1468、miR-634、miR-647、miR-885-5p、miR-376a、miR-1265、miR-623、miR-15a、miR-629、miR-30d-3p、miR-483-5p、miR-708-3p及其组合。
44.根据实施方案38-42中任一项所述的方法，其中癌症是肺癌并且至少一种肿瘤响应性生物标志物包括至少一种选自以下的miRNA标志物：miR-335-3p、miR-16-5p、miR-361-5p、miR-27a-5p、miR-24-3p、miR-1260a、miR-192-5p、miR-548h-5p、miR-122-5p、miR-1208、miR-215、miR-30a-3p、miR-588、miR-10a-3p、miR-21-5p、miR-382-3p、miR-15b-3p、miR-19b-3p、miR-543、miR-1271-5p、miR-106a-5p、miR-106b-5p、miR-520h及其组合。
45.根据实施方案38-42中任一项所述的方法，其中癌症是前列腺癌并且至少一种肿瘤响应性生物标志物包括至少一种选自以下的miRNA标志物：miR-181-a2、miR-1468、miR-634、miR-647、miR-885-5p、miR-376a、miR-1265、miR-623、miR-15a、miR-629及其组合。
46.根据实施方案38-42中任一项所述的方法，其中癌症是结肠癌并且至少一种肿瘤响应性生物标志物包括至少一种选自以下的miRNA标志物：miR-30d-3p、miR-483-5p、miR-708-3p及其组合。
47.根据实施方案38-41中任一项所述的方法，其中如果至少一种肿瘤响应性生物标志物的水平降低，则选择候选抗肿瘤药物。
48.根据实施方案38-41或47中任一项所述的方法，其中至少一种肿瘤响应性生物标志物包括至少一种选自以下的miRNA标志物：miR-802、miR-30b-3p、miR-510、miR-622、miR-127-3p、miR-373-5p、miR-298、miR-302b-3p、miR-367-3p、miR-181b-5p、miR-518a-3p、miR-155-5p、miR-214-3p、miR-329、let-7f-5p、miR-190b、miR-503-5p、miR-92a-1-5p、miR-647、miR-153、miR-93-5p、miR-20a-5p、miR-221-3p、miR-378a-3p、miR-221-3p、miR-20a5p、miR-93-5p、miR-190、miR-153、miR-26a-2、miR-518c、miR-503、miR-337-3p、miR-518f、miR-370、miR-92a-1、miR-526b、miR-1238、miR-886-3p、miR-887、miR-23a、miR-1267、miR-621、miR-515-3p、miR-424、miR-20b、miR-202、miR-21-3p、miR-101-5p、miR-122-3p、miR-197-3p、miR-429、miR-501-3p、miR-509-3p、miR-598、miR-206、miR-885-5p、miR-1972及其组合。
49根据实施方案38-41、47或48中任一项所述的方法，其中癌症是肺癌，并且至少一种肿瘤响应性生物标志物包括至少一种选自以下的miRNA标志物：miR-802、miR-30b-3p、miR-510、miR-622、miR-127-3p、miR-373-5p、miR-298、miR-302b-3p、miR-367-3p、miR-181b-5p、miR-518a-3p、miR-155-5p、miR-214-3p、miR-329、let-7f-5p、miR-190b、miR-503-5p、miR-92a-1-5p、miR-647、miR-153、miR-93-5p、miR-20a-5p、miR-221-3p、miR-378a-3p、miR-221-3p、miR-20a5p、miR-93-5p及其组合。
50.根据实施方案38-41、47或48中任一项所述的方法，其中癌症是前列腺癌，并且至少一种肿瘤响应性生物标志物包括至少一种选自以下的miRNA标志物：miR-190、miR-153、miR-26a-2、miR-518c、miR-503、miR-337-3p、miR-518f、miR-370、miR-92a-1、miR-526b、miR-1238、miR-886-3p、miR-887、miR-23a、miR-1267、miR-621、miR-515-3p、miR-424、miR-20b、miR-202及其组合。
51.根据实施方案38-41、47或48中任一项所述的方法，其中癌症是结肠癌，并且至少一种肿瘤响应性生物标志物包括至少一种选自以下的miRNA标志物：miR-21-3p、miR-101-5p、miR-122-3p、miR-197-3p、miR-429、miR-501-3p、miR-509-3p、miR-598、miR-206、miR-885-5p、miR-1972及其组合。
52.根据实施方案38-51中任一项所述的方法，其还包括向宿主非人动物中引入肿瘤细胞、肿瘤组织或肿瘤器官，从而得到患有肿瘤的宿主非人动物。
53.根据实施方案38-52中任一项所述的方法，其中肿瘤来源于患有癌症的人类患者，并且其中非人动物是啮齿动物。
实施例
以下提供的实施例仅为了进行示意性的说明，而不旨在限制本发明的范围。
实施例1
被靶向的肿瘤细胞是表达细胞表面蛋白CD20(也称为MS4A1)的B-细胞淋巴瘤。靶向表达CD20的细胞的药物(诸如常规的抗体、增强的抗体、或接合其它效应细胞(诸如T细胞)的双特异性抗体)导致B-细胞淋巴瘤肿瘤细胞破坏并由此释放可在循环中检测到的特异性生物分子。
在该实施例中，用含有CD20结合臂和CD3结合臂的双特异性抗体(其接合效应T细胞并激活Raji细胞的杀灭)治疗患有Raji细胞肿瘤(B-细胞淋巴瘤肿瘤细胞系)的小鼠。由于用该CD20xCD3双特异性试剂治疗小鼠，在小鼠循环中发现对Raji细胞特异性的生物分子的水平升高。这些生物分子包括细胞溶质蛋白(诸如B淋巴酪氨酸激酶(BLK))和DNA(诸如来自Raji细胞的特异性重排免疫球蛋白基因)。
实施例2
被靶向的肿瘤细胞是表达前列腺特异性细胞表面蛋白(诸如FOLH1(也称为PSMA)、Steap1或Steap2)的前列腺癌细胞。靶向表达FOLH1的细胞的药物(诸如常规的抗体、增强的抗体或与毒素连接的抗体药物缀合物)导致前列腺肿瘤细胞破坏并由此释放可在循环中检测到的特异性生物分子。
在该实施例中，用抗体药物缀合物(ADC)治疗患有LnCAP肿瘤(前列腺癌肿瘤细胞系)的小鼠，该缀合物由涉及经由不可裂解接头缀合到美登木素生物碱毒性药物的FOLH1的抗体组成。由于用该FOLH1定向的ADC治疗小鼠，在小鼠循环中发现对LnCAP细胞特异性的生物分子的水平升高。这些生物分子包括细胞溶质蛋白(诸如转谷氨酰胺酶4(TGM4)和酸性磷酸酶(ACPP))和DNA(诸如前列腺癌中常见的TMPRSS2-ERG基因融合)。另外，治疗还改变了存在于循环中的某些微小RNA的图案；这些微小RNA包括miR 96-5p、183-5p、145-5p和221-5p。
实施例3：miRNA表达谱分析的方法
在接收血浆样品(50uL)后将其贮存在-80℃下。将样品在冰上解冻，并且根据所提供的规程(在RNA分离之前将1uL Exiqon内标UniRT RNA混合物加入每个样品)，用针对生物流体的miRCURY RNA分离试剂盒(Exiqon)分离全部RNA。将RNA洗脱到50uL无核酸酶的水中，然后直接进行cDNA合成处理或在此之前贮存在-80℃下。根据所提供的规程，用通用的cDNA合成试剂盒II(Exiqon)，使用来自每个样品的RNA在40uL反应体积中形成cDNA。血浆样品的RNA浓度未定量；在不调整浓度的情况下使用8uL每个RNA样品。然后使用40uL cDNA/样品直接设置qPCR或者在使用前贮存在-20℃下。将40uL cDNA洗脱到4mL无核酸酶的水中，然后根据所提供的规程，用miRNome面板(Exiqon)，将其与4mL 2X ExiLENT SYBR绿色主混合物(Exiqon)混合，以形成8mL qPCR混合物。然后根据所提供的规程，将8ml主混合物用移液管吸取到两个384孔板(Exiqon微小RNA即用型PCR，人类面板I+II，V3.M)中，每个孔10ul。将板短暂离心、密封，然后在ABI Viia7实时PCR热循环仪上使用由Exiqon提供的PCR模板程序运行。将结果导出为文本文件，然后导入GenEx软件(Exiqon)进行分析。根据Exiqon数据分析指南的建议，执行数据预处理和分析步骤。简而言之，将生物重复样分组，自动检测并去除异常值，高于37的Ct值视为背景并去除，通过GenEx软件以基于组平均值的估算值填充缺失数据。将每个样品的Ct归一化为所有以Ct＜34表达的miRNA的整体平均值。可以在GenEx中进行各种分析，包括不同样品组之间的聚类分析和t检验，以确定组间显著改变的miRNA。
实施例4：用伊立替康治疗COLO 205肿瘤的药物功效
用COLO 205人结肠直肠癌细胞注射免疫低下小鼠并且使肿瘤发展，然后用伊立替康或媒介物中任一者治疗小鼠14天。在第二对照组中，用伊立替康或媒介物中任一者治疗平行维持但没有患肿瘤的正常小鼠。第三对照组由未接受任何治疗的患有肿瘤的小鼠或正常的无肿瘤小鼠组成。
在药物治疗过程中，从第3至第14天以规定间隔从所有小鼠采集血浆样品。从血浆样品制备RNA，并且通过定量PCR测定面板分析约700个miRNA的miRNA含量。将每个被测定miRNA的相对量归一化为每个样品的整体平均值，然后在成对的组之间进行比较：患有肿瘤的小鼠中的药物治疗对媒介物治疗；无肿瘤小鼠中的药物对媒介物；以及患有肿瘤的小鼠对无肿瘤小鼠。在每个分类中针对每个时间点从六个重复样小鼠采集样品。进一步检查微小RNA，其对于六个重复样的平均值在对比分类之间相差至少两倍，并且具有小于0.05的P值(Student T检验)。
在药物治疗14天后，药物治疗过的小鼠中存在比媒介物治疗过的对照组中显著更低的肿瘤负荷。在14天时间点的药物治疗组和媒介物对照组之间的血浆miRNA分布比较显示出许多差异，其中与对照物相比，在药物治疗过的小鼠中一些miRNA更丰富而其它的不那么丰富。为消除那些miRNA差异(这是单独用药物治疗的结果)，我们检查了伊立替康治疗的正常无肿瘤小鼠中与用媒介物治疗的相同类型小鼠相比的miRNA分布。表现出在患有肿瘤的试验组中观察到的相同定向差异(例如，在药物治疗组中比在媒介物治疗对照物中更高)的所有miRNA不考虑作为药物功效特征图的一部分。
在来自用药物或媒介物治疗仅三天的患有肿瘤的小鼠的血浆样品中检查miRNA分布，观察到药物治疗过程中肿瘤负荷无显著差异的一段时间。我们找出检测图案与用药物治疗14天的小鼠的检测图案匹配的miRNA。结果是表1中示出的14种miRNA。这些miRNA的定量图案-在药物治疗的小鼠中相比于媒介物治疗对照物较高或较低-与14天时间点的miRNA匹配。我们发现三种miRNA：miR-30d-3p、miR-483-5p和miR-708-3p，它们在药物治疗过的患有肿瘤的小鼠中与媒介物对照物相比升高，以及11种miRNA：miR-21-3p、miR-101-5p、miR-122-3p、miR-197-3p、miR-429、miR-501-3p、miR-509-3p、miR-598、miR-206、miR-885-5p和miR-1972，它们在药物治疗过的小鼠中与对照物相比降低。这14种miRNA形成与药物治疗过程后期的药物功效相关的血浆miRNA含量的特征图，并且在可以检测到伊立替康对肿瘤负荷的任何影响之前预测药物治疗方案早期的功效。
为更好地理解和验证药物功效特征图，我们观察未治疗过的患有肿瘤的小鼠中的14种特征miRNA相比于正常的无肿瘤对照物的含量。列出的在药物治疗过的小鼠中与对照物相比具有较低血浆含量的11种miRNA(表1第2列)实际上在未治疗的患有肿瘤的小鼠中具有相反的图案-它们在患有肿瘤的小鼠中检出但在正常对照物中低于检测限。血浆中的这些miRNA的检测与肿瘤负荷相关。伊立替康治疗使该图案相反-11种miRNA从媒介物治疗过的小鼠中的可检测变为药物治疗过的小鼠中的不可检测，反映了伊立替康在减小肿瘤负荷下的功效。列出的在药物治疗过的小鼠中与对照物相比具有较高血浆含量的三种miRNA(表1左侧)表现出镜像图案-它们在正常小鼠中被检出但在患有肿瘤的小鼠中减少(miR-483-5p)或完全未检出(miR-30d-3p和miR-708-3p)，而在患有肿瘤的小鼠中进行伊立替康治疗使该图案相反；它们从未检出变为检出，或者就miR-483-5p而言增加。
表1.
*相对于媒介物治疗过的对照物
因此，COLO 205药物功效特征图中的14种miRNA用作伊立替康抗肿瘤药物功效的敏感早期预测因子。同时，它们形成肿瘤负荷的诊断特征图。本文所述用于衍生COLO 205肿瘤的药物功效特征图的方法可应用于其它药物治疗和其它人异种移植肿瘤模型以及基因诱导的肿瘤。另外可以对任何疾病情况应用相同方法，所述疾病情况的有效疗法存在或正在开发中。
虽然本发明以典型的实施方案重点描述，但本领域的普通技术人员将理解到，可以使用典型的实施方案的变型形式并且其旨在可以不同于本文具体所述的其它方式来实践本发明。因此，本发明包括如以下权利要求所定义的本发明的精神和范围内涵盖的所有修改形式。