一种利用露地菊脚芽为外植体的非组培转化法的制作方法

本发明属于植物基因工程技术领域，涉及一种露地菊‘火焰’的非组培遗传转化方法。

背景技术：

植物基因工程研究的核心是植物遗传转化，即使用一定的转基因方法如农杆菌介导法、基因枪法等将外源基因(包括目的基因片段、质粒DNA及植株总DNA)转入植物受体细胞内，并稳定遗传给后代。研究人员不断研发新的植物遗传转化方法以提高转化效率和简化转化程序。目前，应用到农业转基因中的遗传转化方法概括来说主要分两大类：基于组织培养的遗传转化方法和非组培转化方法。基于组织培养的遗传转化方法有农杆菌介导法、基因枪法、电击法、PEG法等，但组织培养中容易出现污染、褐变、玻璃化等问题，增加了组织培养难度，从而影响遗传转化效率。因此对植物非组培转化方法的研究工作正在成为植物基因工程领域的一个热点，非组培转化方法的进一步研究将有可能极大提高植物转化效率，对植物分子育种及后期基因转录表达的研究工作都具有重要意义。

露地菊(Chrysanthemum)是一类新型菊花品种群，为菊科菊属、多年生草本植物，其株型矮壮，具有抗寒，抗旱，抗瘠薄，抗病虫，开花繁盛和管理粗放等特性，在园林绿化中占有重要地位。我国现有菊花品种多达3000多个。菊花主要应用于公园、庭院、花坛以及室内观赏,随着经济的发展,人民生活水平的提高,菊花已成为国内花市的一个消费热点。

技术实现要素：

本发明目的是为了建立一种以露地菊根部脚芽为外植体的非组培遗传转化方法，通过利用农杆菌菌液的液体培养基对外源基因受体进行真空渗透来完成植株的遗传转化，这种非组培转化法不仅速度快，转化效率高，无需进行复杂的组织培养工作，更重要的是不易产生变异，无病毒污染，能保持母本的优良性状。

在目前露地菊转基因过程中，组织培养工作需要花费大量的人力和物力，在试验成本中占有相当大比重，并且在操作过程中，病毒不可避免的会侵染植株，这也是使转化效益下降的原因。通过本发明简化露地菊转基因过程，缩短转化周期，不仅操作简便，而且在繁殖过程中出现变异的危险性少，并且无病毒污染。

由于露地菊遗传背景十分复杂，基因型高度杂合，传统的基因遗传转化方法往往受到染色体的多倍性和非整倍性的影响，带来基因沉默、转化效率低等问题。此外，露地菊传统遗传转化方法存在着转化周期太长的问题。在目前露地菊新品种的遗传转化特别是抗性培育方面，利用非组培转基因技术可以克服以上种种不利条件。然而成功的基因转化首先依赖于良好的受体系统的建立，本发明所建立的以露地菊脚芽为外植体是理想的基因转化受体系统。

附图说明

图1为露地菊‘火焰’根部脚芽；图2为露地菊‘火焰’菌液真空渗透转化处理后的根部脚芽；图3为露地菊‘火焰’转化植株的PCR检测电泳图(特异引物：PMI-F/R M：D2000+：阳性对照wt:阴性对照)；图4为露地菊‘火焰’转化植株的GUS染色图(A.野生型植株；B和C.菌液真空渗透植株；bar＝5mm)。

具体实施方式

具体实施方式以露地菊‘火焰’非组培转化方法为例，按以下步骤进行：

(一)露地菊‘火焰’根部脚芽的选取

挖取苗圃地种植的露地菊‘火焰’基部萌发的健壮脚芽，去掉已经长出的叶片，流水冲洗30min。

(二)非组培转化法处理试验脚芽

利用农杆菌菌液的LB液体培养基对脚芽进行非组培法转化处理，处理的方法如下：农杆菌菌液生长到OD值为0.4时，将脚芽放入菌液中(放入脚芽的量与菌液比例为50颗脚芽：50mL菌液)，真空渗透2次(液体沸腾为标准算完成一次渗透，一次时长为3min，两次时长约为7min)。

(三)对非组培转化法处理后的脚芽扦插繁殖

将真空渗透处理后的试验脚芽于沙盆中扦插繁殖，在黑暗环境培养1d后在正常光照条件下生长。

(四)对转化后的植株进行分子生物学鉴定

长根后移栽土中，待生长1-2个月后，采取CTAB法提取新长出的露地菊‘火焰’叶片的总DNA，然后对DNA产物进行特异基因的PCR检测的初步筛选，检测结果显示转化效率能达到10％-15％；生长3-4个月后，再次进行特异基因的PCR检测，检测结果显示转化效率能达到2％-3％。对PCR检测的阳性植株进行GUS染色，结果表明转化的基因在露地菊火焰体内有明显的表达。