一种获得温敏雄性不育玉米的方法与流程

本发明属于生物技术育种领域，涉及一种获得温敏雄性不育玉米的方法，特别涉及一种利用基因组编辑技术定点突变玉米温敏雄性育性相关基因，获得玉米温敏雄性不育材料的方法。

背景技术：

玉米是一种主要的粮食作物和经济作物，是人类赖以生存的重要谷类作物之一，种植面积遍及世界大部分地区。2010年，玉米是世界上总产量位居第一的粮食作物(8.44亿吨)。

植物通过不同品种间杂交，产生的杂种在生长势，适应性，抗逆性、产量等方面具有优于两个亲本的性状，这种现象就属于杂种优势。玉米属于异花授粉作物，是世界上最早利用杂种优势的作物，杂种优势是提高玉米产量、抗性和品质的重要方法。

玉米生产中利用杂种优势的途径有：一、通过人工去雄或者机械去雄来产生杂交种，该方法消耗大量的人力、物力和财力，而且存在去雄不及时，不彻底的问题；二、利用细胞质雄性不育产生杂交种，例如T型胞质雄性不育的育性稳定且易恢复，因此在美国利用的不育系多数是T型。但是科学家忽略了该T型胞质雄性不育的使用会导致杂交种胞质专一化，从而导致杂交种易受玉米小斑病T小种的专化性侵染。美国在大面积生产中曾使用T型胞质不育系制种，然而1970年，玉米小斑病大面积流行，给美国的玉米生产带来巨大损失，致使玉米雄性不育育种技术的应用在生产上处于停滞状态，如何寻找一种新的可以利用的雄性不育的方法来充分发挥玉米的杂种优势是科研工作者亟待解决的问题。

技术实现要素：

为了解决以上技术问题，本发明提供了一种获得温敏雄性不育玉米的方法。

本发明所提供的获得温敏雄性不育玉米的方法，具体可包括如下步骤：使玉米降低或丧失产生有功能的ZmTMS5蛋白的能力，所得所述ZmTMS5蛋白功能降低或丧失的玉米即为所述温敏雄性不育玉米。

其中，所述ZmTMS5蛋白为如下(a)或(b)：

(a)氨基酸序列为序列表中序列1所示的蛋白；

(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与玉米温敏雄性不育相关的由序列1衍生的蛋白质。

在所述方法中，所述使玉米降低或丧失产生有功能的ZmTMS5蛋白的能力是通过基因组定点编辑技术实现的。

基因组定点编辑技术可在靶序列上产生DNA双链断裂(DSB)，细胞启动修复机制，通过非同源末端连接(NHEJ)这种不精确的修复方式可以产生基因定点突变。相对于传统的突变体创制方法，基因定点编辑技术具有高效率、高精度、高通量等优点。

在本发明中，所述ZmTMS5蛋白的编码基因可为如下(a1)-(a5)中任一所示DNA分子：

(a1)序列表中序列2所示DNA分子；

(a2)序列表中序列3所示DNA分子；

(a3)序列表中序列4所示DNA分子；

(a4)在严格条件下与(a1)-(a3)中任一限定的DNA分子杂交且编码与玉米温敏雄性不育相关蛋白的DNA分子；

(a5)与(a1)-(a4)中任一限定的DNA分子至少具有90％以上同源性且编码与玉米温敏雄性不育相关蛋白的DNA分子。

其中，序列2为ZmTMS5基因在玉米基因组中的序列，共由4962个核苷酸组成，其中第1-2000位为启动子区域，第2001-2290位为5’-UTR，第2291-2270位、第2880-2975位、第3084-3197位、第3375-3443位、第3533-3607位、第4027-4101位为外显子，第2271-2879位、第2976-3083位、第3198-3374位、第3444-3532位、第3608-4026位为内含子，第4102-4413位为3’-UTR，第4414-4962位为终止子区域。

序列3为ZmTMS5基因的cDNA序列，共由1511个核苷酸组成，其中第1-290位为5’-UTR，第291-1199位为ZmTMS5基因的CDS，第1200-1511位为3’-UTR。

序列4为ZmTMS5基因的CDS，共由909个核苷酸组成。

在所述方法中，所述靶标片段可位于所述ZmTMS5蛋白的编码基因(基因组序列，如序列2)中的任意位置，只要能够使所述核酸酶特异性切割所述靶标片段从而使所述玉米降低或丧失产生有功能的所述ZmTMS5蛋白的能力即可。

所述核酸酶对所述靶标片段进行特异性切割，可能会造成插入突变、和/或缺失突变、和/或替换突变。

在实际操作中，根据需要所述靶标片段既可为一个也可为多个，只要通过所述核酸酶对所述靶标片段的特异性切割使得所述玉米降低或丧失产生有功能的所述ZmTMS5蛋白的能力即可。

在本发明中，所述核酸酶具体为CRISPR/Cas9核酸酶，所述靶标片段为序列表中序列2所示DNA分子序列中符合5’-N_X-NGG-3’或5’-CCN-N_X-3’序列排列规则的片段；N表示A、G、C和T中的任一种，14≤X≤30，且X为整数，N_X表示X个连续的脱氧核糖核苷酸。在本发明的一个实施例中，所述功能区段的序列为序列表中序列5；所述遗传物质为在pBUN411载体的两个限制性内切酶BsaI的切割位点之间插入序列 表中序列5的第1-20位所示DNA片段后得到的重组质粒。

在所述方法中，所述细胞可为任何能作为导入受体并能经过组织培养再生为完整植株的细胞；所述组织可为任何能作为导入受体并能经过组织培养再生为完整植株的组织；具体的，所述细胞为原生质体细胞或悬浮细胞；所述组织为愈伤组织、幼胚或成熟胚。

在所述方法中，向所述玉米的细胞或组织中导入所述遗传物质或所述非遗传物质的方法为基因枪法、农杆菌侵染法、PEG诱导原生质体法击或其他任何导入方法。

在本发明中，所述玉米具体为玉米品种HiII。

在本发明中，所述温敏雄性不育体现为：在30-35℃的高温条件下，花粉败育。具体为：将处于花粉母细胞时期的玉米植株置于30-35℃的高温处理，经此处理所产生的花粉败育。

本发明利用基因组编辑技术定点突变玉米中的育性基因ZmTMS5，获得了玉米温敏雄性不育材料。本发明为充分发挥玉米的杂种优势提供了新的材料。

附图说明

图1为ZmTMS5基因结构示意图及利用CRISPR/Cas9技术的靶点的设定。

图2为ZmTMS5基因靶位点的gRNAs在玉米原生质体中的活性检测。a为原生质体中PCR/RE检测结果；b为测序结果，其中，WT表示野生型基因序列，“-”表示发生了删除突变的序列，“+”表示发生了插入突变的序列，“-/+”后边的数字表示删除或插入的核苷酸的数量(小写字母为插入的核苷酸)，M1-M4表示4种突变类型。

图3为用PCR/RE检测CRISPR介导的玉米品种HiII的ZmTMS5基因突变体以及测序结果。a为突变体的PCR/RE检测结果(其中CK为未做酶切处理的野生型PCR产物)；b为测序结果，其中，WT表示野生型基因序列，“-”表示发生了删除突变的序列，“+”表示发生了插入突变的序列，“-/+”后边的数字表示删除或插入的核苷酸的数量(小写字母为插入的核苷酸)。

图4为玉米ZmTMS5基因的纯合突变体在高温(30-35℃)下不育的照片。a为tms5纯合突变体株系T0-1；b为野生型对照。

图5为玉米ZmTMS5基因的纯合突变体在适温(22-26℃)下可育的照片。a为tms5纯合突变体株系；b为野生型对照。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

pBUN411质粒：在文献“Hui-Li Xing,Li Dong,Zhi-Ping Wang,Hai-Yan Zhang,Chun-Yan Han,Bing Liu,Xue-Chen Wang,Qi-Jun Chen.BMC plant biology.14:327-338 (2014)”中公开过，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。该质粒可同时用于转录向导RNA和表达Cas9蛋白。

玉米品种HiII：在文献“Armstrong,C.L.,Green,C.E.Phillips,R.L.Development and availability of germplasm with high type II culture formation response.Maize Genet.Coop.News Lett.65,92–93(1991)”中公开过，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。

实施例1、玉米ZmTMS5靶位点的选择并构建敲除载体

一、ZmTMS5靶位点的选择

ZmTMS5基因座位号是GRMZM2G147727，位于玉米第4条染色体，包含6个外显子，5个内含子，共编码302个氨基酸，构建敲除载体选择的靶位点位于第1外显子中(图1)。ZmTMS5基因在玉米基因组中的序列如序列表中序列2所示，共由4962个核苷酸组成，其中第1-2000位为启动子区域，第2001-2290位为5’-UTR，第2291-2270位、第2880-2975位、第3084-3197位、第3375-3443位、第3533-3607位、第4027-4101位为外显子，第2271-2879位、第2976-3083位、第3198-3374位、第3444-3532位、第3608-4026位为内含子，第4102-4413位为3’-UTR，第4414-4962位为终止子区域。ZmTMS5基因的cDNA序列如序列表中序列3所示，共由1511个核苷酸组成，其中第1-290位为5’-UTR，第291-1199位为ZmTMS5基因的CDS，第1200-1511位为3’-UTR。ZmTMS5基因的CDS序列如序列表中序列4所示，共由909个核苷酸组成。序列2-4均编码序列表中序列1所示的ZmTMS5蛋白。

利用CRISPR技术敲除的靶标双链中的一条链具有如下结构：5-Nx-NGG-3，PAM(NGG)中的N表示A、T、C和G中的任一种，Nx中的N表示A、T、C和G中的任一种，x＝20。ZmTMS5基因的靶序列如下，带下划线的碱基为PAM(原型间隔序列毗邻基序)。

ZmTMS5-1：TTCCCATGTATGCGCGG(序列5)；

该敲除载体转化玉米后，在gRNA的介导下，Cas9蛋白在靶序列区域切割，形成DNA双链断裂，触发机体内的自我损伤修复机制，细胞自发修复该缺口的过程中会引入突变(本处“突变”指的是广义突变，包括插入、缺失、狭义突变等形式，这些突变中绝大多数为基因功能失活突变)。

上述靶序列ZmTMS5-1含有MscI酶切识别序列(方框内的序列)，可以被MscI限制性内切酶切割。靶序列区域被切割后，如果发生了突变，则MscI酶切识别序列被破坏，将不能被限制性内切酶MscI切割；如果没有发生突变，将可以被限制性内切酶MscI切割。

二、重组载体的构建

1、用限制性内切酶BsaI酶切pBUN411质粒，回收约12.5kb的载体骨架，命名为BUN411。

2、根据设计的靶位点ZmTMS5-1序列，合成如下带有粘性末端(下划线部分)的引物：

ZmTMS5-1F：GGCGTTCCCATGTATGTGGCCACG；

ZmTMS5-1R：AAACCGTGGCCACATACATGGGAA。

3、将ZmTMS5-1F和ZmTMS5-1R进行退火，形成有粘性末端的双链DNA命名为ZmTMS5-1，将其和步骤1中的胶回收产物BUN411连接，得到重组质粒pBUN411-TMS5-1。重组质粒pBUN411-TMS5-1的结构描述为：将pBUN411质粒的两个限制性内切酶BsaI的识别序列之间的片段(约1.2kb)替换为序列表中序列5的第1-20位所示DNA片段后所得的重组质粒。

实施例2、转化玉米原生质体及检测重组载体在原生质体中的活性

将实施例1构建的重组质粒pBUN411-TMS5-1通过PEG介导的方式转入玉米品种HiII的原生质体，然后提取原生质体的基因组DNA，用特异引物通过PCR扩增包含靶位点的ZmTMS5基因，然后将含有靶位点ZmTMS5-1的PCR扩增产物用MscI酶切(如果PCR扩增产物有部分条带不能被切开，说明实施例1中设计的靶位点有活性)，将不能被限制性内切酶切开的PCR扩增产物进行测序。

用于扩增含有靶位点ZmTMS5-1的引物序列如下：

上游引物TMS-1F：CAGCCTAAAGCCCTTCCTCTC(序列2的第2256-2276位)；

下游引物TMS-1R：TGGCTGGGTATGGCGTGATAG(序列2的第2749-2769位的反向互补序列)。

原生质体中检测重组载体活性的酶切结果见图2中a，泳道1为转化后的原生质体，其中含有不能被MscI切开的PCR条带(大小约为514bp，与预期一致)，说明靶位点ZmTMS5-1有活性；泳道2为野生型对照PCR产物经由MscI酶切，可以被MscI完全酶切开；泳道3为未做酶切处理的野生型PCR产物对照。测序(图2中b)结果表明靶位点处产生了少量碱基的插入与缺失，证实重组载体pBUN411-TMS5-1在靶位点处进行了基因定点编辑。

实施例3、转化玉米

将实施例1构建的重组质粒pBUN411-TMS5-1通过基因枪转化的方法导入玉米品种HiII。以HiII的愈伤组织为转化受体，转化后经过组织培养获得完整再生植株。

提取转基因植株基因组DNA，用含有靶位点ZmTMS5-1的特异引物对转化含有pBUN411-TMS5-1的基因组DNA进行PCR扩增，PCR产物用MscI单酶切，具体操作参见实施例2。

经PCR、酶切检测后，T0代共获得30条ZmTMS5-1位点纯合突变的植株。部分酶切结果见图3中a，图3中是部分检测结果：其中共有6株ZmTMS5-1位点纯合突变的植株，如T0-1，T0-4，T0-5，T0-9，T0-12，T0-14(分别对应图3中a的泳道1、4、5、9、12和14，仅检测到大小约为514bp的目的条带)，其余编号植株(分别对应图3中的泳道2、3、6、7、8、10、11、13、15)为野生型。对上述6株ZmTMS5-1位点纯合突变体的测序结果见图3中b，4株(T-1，T-4，T-5，T-9)在设计的靶位点处含有1个碱基的插入，2株(T-12，T-14)含有1bp和27bp碱基的删除，这些突变都最终改变ZmTMS5基因的阅读框，使其失去功能，获得ZmTMS5基因缺失的突变体。

实施例4、tms5纯合突变体的花粉育性鉴定

通过繁殖，我们得到了实施例3中tms5纯合突变体株系的T1代种子。将这些T1代突变体与野生型HiII玉米种植于温室中，所有植物被分为两组，每组中都包含相同数量的各条突变体株系植株及野生型植株。当植株处于对温度敏感的花粉母细胞时期，一组进行高温(30-35℃)处理，另一组进行适温(22-26℃)处理。

花粉粒中淀粉含量是育种中检测花粉育性的主要指标，没有淀粉积累的花粉没有育性。玉米花粉一般在上午十点左右达到最大散粉量，待tms5纯合突变体植株及野生型对照植株扬粉后，用纸袋采集花粉。tms5纯合突变体的花粉和野生型对照花粉分别用碘-碘化钾溶液进行染色，5分钟后用显微镜观察染色结果。

结果显示：经过高温(30-35℃)处理的所有tms5纯合突变体株系所产生的花粉均败育(图4中a是其中T1突变体株系一株植物的花粉染色结果，用碘-碘化钾溶液染色后颜色不发生改变，说明花粉中缺少淀粉积累，花粉败育)，而野生型对照产生的花粉育性正常(图4中b是其中野生型株系一株植物的花粉染色结果，用碘-碘化钾溶液染色后呈蓝黑色，说明有大量淀粉积累，花粉可育)；经适温(22-26℃)处理的所有tms5纯合突变体株系所产生的花粉均为可育花粉(图5中a是其中T1突变体株系另一株植物的花粉染色结果，用碘-碘化钾溶液染色后呈蓝黑色，说明有大量淀粉积累，花粉可育)，其育性与野生型对照无明显差异(图5中b是其中野生型株系另一株植物的花粉染色结果，用碘-碘化钾溶液染色后呈蓝黑色)。