程序性死亡-1(PD-1)的人单克隆抗体及使用抗PD-1抗体来治疗癌症的方法与流程

技术领域：
一般而言，本发明涉及治疗人类疾病和减少相关不良事件的免疫疗法。更具体的说，本发明涉及使用抗PD-1抗体和使用包括抗CTLA-4抗体与抗PD-1抗体组合的联合免疫疗法来治疗癌症和/或减少与单独使用此类抗体进行的治疗有关的不良事件的发生率或程度。本申请是申请日为2006年05月02日、中国申请号为200680023860.0、发明名称为“程序性死亡-1(PD-1)的人单克隆抗体及单独使用或与其它免疫治疗剂联合使用抗PD-1抗体来治疗癌症的方法”的发明申请的分案申请。发明背景蛋白质程序性死亡1(PD-1)是CD28受体家族的抑制性成员，该家族还包括CD28、CTLA-4、ICOS和BTLA。PD-1在活化的B细胞、T细胞和髓样细胞上表达(Agata等人，同下；Okazaki等人(2002)Curr.Opin.Immunol.14:391779-82；Bennett等人(2003)JImmunol170:711-8)。根据加入单克隆抗体后对提升T细胞增殖的功能性影响发现了家族最初的成员，CD28和ICOS(Hutloff等人(1999)Nature397:263-266；Hansen等人(1980)Immunogenics10:247-260)。通过在凋亡细胞中筛选差异表达发现了PD-1(Ishida等人(1992)EMBOJ11:3887-95)。通过分别在细胞毒性T淋巴细胞和TH1细胞中筛选差异表达发现了家族的其它成员，CTLA-4和BTLA。CD28、ICOS和CTLA-4都具有能够同型二聚化的不成对半胱氨酸残基。相反，认为PD-1以单体形式存在，其缺少其它CD28家族成员中特有的不成对半胱氨酸残基。PD-1基因是55kDa的I型跨膜蛋白，其为Ig基因超家族的一部分(Agata等人(1996)IntImmunol8:765-72)。PD-1含有接近膜的免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM)和远离膜的基于酪氨酸的转换基序(ITSM)(Thomas,M.L.(1995)JExpMed181:1953-6；Vivier,E和Daeron,M(1997)ImmunolToday18:286-91)。虽然与CTLA-4结构类似，但PD-1缺少结合B7-1和B7-2所必需的MYPPPY基序。现已鉴定了PD-1的两种配体，PD-L1和PD-L2，其显示出在结合PD-1后下调T细胞活化(Freeman等人(2000)JExpMed192:1027-34；Latchman等人(2001)NatImmunol2:261-8；Carter等人(2002)EurJImmunol32:634-43)。PD-L1和PD-L2都是B7同源物，其与PD-1结合，但不与其它CD28家族成员结合。PD-1的一种配体，PD-L1在多种人癌瘤中都很丰富(Dong等人(2002)Nat.Med.8:787-9)。PD-1和PD-L1之间的相互作用导致渗入肿瘤的淋巴细胞减少、T细胞受体介导的增殖减少、及癌性细胞的免疫逃避(Dong等人(2003)J.Mol.Med.81:281-7；Blank等人(2005)CancerImmunol.Immunother.54:307-314；Konishi等人(2004)Clin.CancerRes.10:5094-100)。可以通过抑制PD-1与PD-L1的局部相互作用来逆转免疫抑制，而且当PD-1与PD-L2的相互作用也被阻断时效果累加(Iwai等人(2002)Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA99:12293-7；Brown等人(2003)J.Immunol.170:1257-66)。PD-1是在活化的B细胞、T细胞和髓样细胞上表达的CD28家族的抑制性成员(Agata等人，同上；Okazaki等人(2002)CurrOpinImmunol14:391779-82；Bennett等人(2003)JImmunol170:711-8)。PD-1缺陷型动物形成多种自身免疫表型，包括自身免疫性心肌病及伴有关节炎和肾炎的狼疮样综合征(Nishimura等人(1999)Immunity11:141-51；Nishimura等人(2001)Science291:319-22)。此外，发现PD-1在自身免疫性脑脊髓炎、系统性红斑狼疮、移植物抗宿主病(GVHD)、I型糖尿病和类风湿性关节炎中起作用(Salama等人(2003)JExpMed198:71-78；Prokunina和Alarcon-Riquelme(2004)HumMolGenet13:R143；Nielsen等人(2004)Lupus13:510)。在鼠B细胞肿瘤系中，PD-1的ITSM显示出是阻断BCR介导的Ca2+流通和下游效应器分子的酪氨酸磷酸化所必需的(Okazaki等人(2001)PNAS98:13866-71)。因此，需要识别PD-1的试剂和使用此类试剂的方法。发明概述本发明提供了分离的单克隆抗体，特别是人单克隆抗体，其与PD-1结合并表现出许多优良特性。这些特性包括例如与人PD-1高亲和力结合，但缺少与人CD28、CTLA-4或ICOS的基本的交叉反应性。此外，本发明的抗体显示出可调控免疫应答。因此，本发明的另一方面涉及使用抗PD-1抗体调控免疫应答的方法。具体而言，本发明提供了使用抗PD-1抗体在体内抑制肿瘤细胞生长的方法。在一方面，本发明涉及分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体表现出至少一项下列性质：(a)以1x10-7M或更小的KD与人PD-1结合；(b)不显著与CD28、CTLA-4或ICOS结合；(c)在混合淋巴细胞反应(MLR)测定法中增加T细胞增殖；(d)在MLR测定法中增加干扰素γ的产量；(e)在MLR测定法中增加IL-2的分泌；(f)与人PD-1和猕猴PD-1结合；(g)抑制PD-L1和/或PD-L2与PD-1的结合；(h)刺激抗原特异性记忆应答；(i)刺激抗体应答；(j)抑制体内肿瘤细胞生长。所述抗体优选为人抗体，虽然在可选的实施方式中抗体可以为例如鼠抗体、嵌合抗体或人源化抗体。在更优选的实施方式中，抗体以5x10-8或更小的KD与人PD-1结合，以1x10-8M或更小的KD与人PD-1结合，以5x10-9M或更小的KD与人PD-1结合，或以1x10-8M和1x10-10M之间的KD与人PD-1结合。在另一实施方式中，本发明提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体与参照抗体交叉竞争与PD-1的结合，该参照抗体包含：(a)人重链可变区，其包含选自SEQIDNOs:1、2、3、4、5、6和7的氨基酸序列；和(b)人轻链可变区，其包含选自SEQIDNOs:8、9、10、11、12、13和14的氨基酸序列。在多种实施方式中，所述参照抗体包含：(a)重链可变区，其包含SEQIDNO:1的氨基酸序列；和(b)轻链可变区，其包含SEQIDNO:8的氨基酸序列；或所述参照抗体包含：(a)重链可变区，其包含SEQIDNO:2的氨基酸序列；和(b)轻链可变区，其包含SEQIDNO:9的氨基酸序列；或所述参照抗体包含：(a)重链可变区，其包含SEQIDNO:3的氨基酸序列；和(b)轻链可变区，其包含SEQIDNO:10的氨基酸序列；或所述参照抗体包含：(a)重链可变区，其包含SEQIDNO:4的氨基酸序列；和(b)轻链可变区，其包含SEQIDNO:11的氨基酸序列；或所述参照抗体包含：(a)重链可变区，其包含SEQIDNO:5的氨基酸序列；和(b)轻链可变区，其包含SEQIDNO:12的氨基酸序列，或所述参照抗体包含：(a)重链可变区，其包含SEQIDNO:6的氨基酸序列；和(b)轻链可变区，其包含SEQIDNO:13的氨基酸序列，或所述参照抗体包含：(a)重链可变区，其包含SEQIDNO:7的氨基酸序列；和(b)轻链可变区，其包含SEQIDNO:14的氨基酸序列。在另一方面，本发明涉及分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含产自或源自人VH3-33基因的重链可变区，其中所述抗体与PD-1特异性结合。本发明进一步提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含产自或源自人VH4-39基因的重链可变区，其中所述抗体与PD-1特异性结合。本发明进一步提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含产自或源自人VKL6基因的轻链可变区，其中所述抗体与PD-1特异性结合。本发明进一步提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含产自或源自人VKL15基因的轻链可变区，其中所述抗体与PD-1特异性结合。在一优选的实施方式中，本发明提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含：(a)人VH3-33基因的重链可变区；和(b)人VKL6基因的轻链可变区；其中所述抗体与PD-1特异性结合。在另一优选的实施方式中，本发明提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含：(a)人VH4-39基因的重链可变区；和(b)人VKL15基因的轻链可变区；其中所述抗体与PD-1特异性结合。在另一方面，本发明提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含：重链可变区，其包含CDR1、CDR2和CDR3序列；和轻链可变区，其包含CDR1、CDR2和CDR3序列，其中：(a)所述重链可变区CDR3序列包含选自SEQIDNOs:29、30、31、32、33、34和35及其保守修饰的氨基酸序列；(b)所述轻链可变区CDR3序列包含选自SEQIDNOs:50、51、52、53、54、55和56及其保守修饰的氨基酸序列；且(c)所述抗体与人PD-1特异性结合。优选的是，所述重链可变区CDR2序列包含选自SEQIDNOs:22、23、24、25、26、27和28所示氨基酸序列及其保守修饰的氨基酸序列；所述轻链可变区CDR2序列包含选自SEQIDNOs:43、44、45、46、47、48和49所示氨基酸序列及其保守修饰的氨基酸序列。优选的是，所述重链可变区CDR1序列包含选自SEQIDNOs:15、16、17、18、19、20和21所示氨基酸序列及其保守修饰的氨基酸序列；所述轻链可变区CDR1序列包含选自SEQIDNOs:36、37、38、39、40、41和42所示氨基酸序列及其保守修饰的氨基酸序列。在又一方面，本发明提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含重链可变区和轻链可变区，其中：(a)所述重链可变区包含与选自SEQIDNOs:1、2、3、4、5、6和7的氨基酸序列至少80％同源的氨基酸序列；(b)所述轻链可变区包含与选自SEQIDNOs:8、9、10、11、12、13和14的氨基酸至少80％同源的氨基酸序列；(c)所述抗体以1x10-7M或更小的KD与人PD-1结合；且(d)所述抗体不显著与人CD28、CTLA-4或ICOS结合。在一优选的实施方式中，所述抗体另外还包含至少一项下列性质：(a)所述抗体在MLR测定法中增加T细胞的增殖；(b)所述抗体在MLR测定法中增加干扰素-γ的产量；或(c)所述抗体在MLR测定法中增加IL-2的分泌。另外/或者，所述抗体可以包含一种或多种其它的上述特征。在优选的实施方式中，本发明提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含：(a)重链可变区CDR1，其包含选自SEQIDNOs:15、16、17、18、19、20和21的氨基酸序列；(b)重链可变区CDR2，其包含选自SEQIDNOs:22、23、24、25、26、27和28的氨基酸序列；(c)重链可变区CDR3，其包含选自SEQIDNOs:29、30、31、32、33、34和35的氨基酸序列；(d)轻链可变区CDR1，其包含选自SEQIDNOs:36、37、38、39、40、41和42的氨基酸序列；(e)轻链可变区CDR2，其包含选自SEQIDNOs:43、44、45、46、47、48和49的氨基酸序列；和(f)轻链可变区CDR3，其包含选自SEQIDNOs:50、51、52、53、54、55和56的氨基酸序列；其中所述抗体与PD-1特异性结合。一优选的组合包括：(a)重链可变区CDR1，其包含SEQIDNO:15；(b)重链可变区CDR2，其包含SEQIDNO:22；(c)重链可变区CDR3，其包含SEQIDNO:29；(d)轻链可变区CDR1，其包含SEQIDNO:36；(e)轻链可变区CDR2，其包含SEQIDNO:43；和(f)轻链可变区CDR3，其包含SEQIDNO:50。另一优选的组合包括：(a)重链可变区CDR1，其包含SEQIDNO:16；(b)重链可变区CDR2，其包含SEQIDNO:23；(c)重链可变区CDR3，其包含SEQIDNO:30；(d)轻链可变区CDR1，其包含SEQIDNO:37；(e)轻链可变区CDR2，其包含SEQIDNO:44；和(f)轻链可变区CDR3，其包含SEQIDNO:51。另一优选的组合包括：(a)重链可变区CDR1，其包含SEQIDNO:17；(b)重链可变区CDR2，其包含SEQIDNO:24；(c)重链可变区CDR3，其包含SEQIDNO:31；(d)轻链可变区CDR1，其包含SEQIDNO:38；(e)轻链可变区CDR2，其包含SEQIDNO:45；和(f)轻链可变区CDR3，其包含SEQIDNO:52。另一优选的组合包括：(a)重链可变区CDR1，其包含SEQIDNO:18；(b)重链可变区CDR2，其包含SEQIDNO:25；(c)重链可变区CDR3，其包含SEQIDNO:32；(d)轻链可变区CDR1，其包含SEQIDNO:39；(e)轻链可变区CDR2，其包含SEQIDNO:46；和(f)轻链可变区CDR3，其包含SEQIDNO:53。另一优选的组合包括：(a)重链可变区CDR1，其包含SEQIDNO:19；(b)重链可变区CDR2，其包含SEQIDNO:26；(c)重链可变区CDR3，其包含SEQIDNO:33；(d)轻链可变区CDR1，其包含SEQIDNO:40；(e)轻链可变区CDR2，其包含SEQIDNO:47；和(f)轻链可变区CDR3，其包含SEQIDNO:54。另一优选的组合包括：(a)重链可变区CDR1，其包含SEQIDNO:20；(b)重链可变区CDR2，其包含SEQIDNO:27；(c)重链可变区CDR3，其包含SEQIDNO:34；(d)轻链可变区CDR1，其包含SEQIDNO:41；(e)轻链可变区CDR2，其包含SEQIDNO:48；和(f)轻链可变区CDR3，其包含SEQIDNO:55。另一优选的组合包括：(a)重链可变区CDR1，其包含SEQIDNO:21；(b)重链可变区CDR2，其包含SEQIDNO:28；(c)重链可变区CDR3，其包含SEQIDNO:35；(d)轻链可变区CDR1，其包含SEQIDNO:42；(e)轻链可变区CDR2，其包含SEQIDNO:49；和(f)轻链可变区CDR3，其包含SEQIDNO:56。本发明其它优选的抗体或其抗原结合部分包含：(a)重链可变区，其包含选自SEQIDNOs:1、2、3、4、5、6和7的氨基酸序列；和(b)轻链可变区，其包含选自SEQIDNOs:8、9、10、11、12、13和14的氨基酸序列；其中所述抗体与PD-1特异性结合。一优选的组合包括：(a)重链可变区，其包含SEQIDNO:1的氨基酸序列；和(b)轻链可变区，其包含SEQIDNO:8的氨基酸序列。另一优选的组合包括：(a)重链可变区，其包含SEQIDNO:2的氨基酸序列；和(b)轻链可变区，其包含SEQIDNO:9的氨基酸序列。另一优选的组合包括：(a)重链可变区，其包含SEQIDNO:3的氨基酸序列；和(b)轻链可变区，其包含SEQIDNO:10的氨基酸序列。另一优选的组合包括：(a)重链可变区，其包含SEQIDNO:4的氨基酸序列；和(b)轻链可变区，其包含SEQIDNO:11的氨基酸序列。另一优选的组合包括：(a)重链可变区，其包含SEQIDNO:5的氨基酸序列；和(b)轻链可变区，其包含SEQIDNO:12的氨基酸序列。另一优选的组合包括：(a)重链可变区，其包含SEQIDNO:6的氨基酸序列；和(b)轻链可变区，其包含SEQIDNO:13的氨基酸序列。另一优选的组合包括：(a)重链可变区，其包含SEQIDNO:7的氨基酸序列；和(b)轻链可变区，其包含SEQIDNO:14的氨基酸序列。本发明的抗体可以为例如全长抗体，例如IgG1或IgG4同种型的全长抗体。或者，所述抗体可以为抗体片段，诸如Fab或Fab’2片段，或单链抗体。本发明还提供了免疫偶联物，其包含与治疗剂，诸如细胞毒素或放射性同位素连接的本发明抗体或其抗原结合部分。本发明还提供了双特异性分子，其包含与第二功能性模块连接的本发明抗体或其抗原结合部分，该第二功能性模块具有与所述抗体或其抗原结合部分不同的结合特异性。还提供了组合物，其含有本发明的抗体或其抗原结合部分，或免疫偶联物，或双特异性分子，及药学可接受载体。本发明还涵盖编码本发明抗体或其抗原结合部分的核酸分子，以及包含此类核酸的表达载体和包含此类表达载体的宿主细胞。此外，本发明提供了包含人免疫球蛋白重链和轻链转基因的转基因小鼠，其中所述小鼠表达本发明的抗体，以及从这样的小鼠制备的杂交瘤，其中所述杂交瘤产生本发明的抗体。在又一方面，本发明提供了调控受试者中免疫应答的方法，其包括给受试者施用本发明的抗体或其抗原结合部分，使得受试者中的免疫应答得到调控。优选的是，本发明的抗体增强、刺激或增加受试者中的免疫应答。在另一方面，本发明提供了抑制受试者中肿瘤细胞生长的方法，其包括给受试者施用治疗有效量的抗PD-1抗体或其抗原结合部分。在该方法中优选使用本发明的抗体，虽然其它抗PD-1抗体也能够替代(或与本发明的抗PD-1抗体联合)使用。例如，在抑制肿瘤生长的方法中可以使用嵌合的、人源化的或完全人的抗PD-1抗体。在另一方面，本发明提供了治疗受试者中传染病的方法，其包括给受试者施用治疗有效量的抗PD-1抗体或其抗原结合部分。在该方法中优选使用本发明的抗体，虽然其它抗PD-1抗体也能够替代(或与本发明的抗PD-1抗体联合)使用。例如，在治疗传染病的方法中可以使用嵌合的、人源化的或完全人的抗PD-1抗体。此外，本发明提供了增强受试者中对抗原的免疫应答的方法，其包括给受试者施用：(i)抗原；和(ii)抗PD-1抗体或其抗原结合部分，使得受试者中对抗原的免疫应答得到增强。抗原可以是例如肿瘤抗原、病毒抗原、细菌抗原或来自病原体的抗原。在该方法中优选使用本发明的抗体，虽然其它抗PD-1抗体也能够替代(或与本发明的抗PD-1抗体联合)使用。例如，在增强受试者中对抗原的免疫应答的方法中可以使用嵌合的、人源化的或完全人的抗PD-1抗体。本发明还提供了根据本文所提供的抗PD-1抗体的序列制备“二代”抗PD-1抗体的方法。例如，本发明提供了制备抗PD-1抗体的方法，其包括：(a)提供：(i)重链可变区抗体序列，其包含选自SEQIDNOs:15、16、17、18、19、20和21的CDR1序列，和/或选自SEQIDNOs:22、23、24、25、26、27和28的CDR2序列；和/或选自SEQIDNOs:29、30、31、32、33、34和35的CDR3序列；或(ii)轻链可变区抗体序列，其包含选自SEQIDNOs:36、37、38、39、40、41和42的CDR1序列，和/或选自SEQIDNOs:43、44、45、46、47、48和49的CDR2序列，和/或选自SEQIDNOs:50、51、52、53、54、55和56的CDR3序列；(b)改变选自重链可变区抗体序列和轻链可变区抗体序列的至少一个可变区抗体序列中的至少一个氨基酸残基以创建至少一个经改变的抗体序列；和(c)将经改变的抗体序列表达成蛋白质。下面的详述和实例用于表明本发明的其它特征和优点，不应作为限制。本申请中所引用的所有参考文献、GenBank条目、专利和已公开的专利申请都通过参考清楚的引入。本发明涉及下述各项。1.分离的人单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体与PD-1结合且其中所述抗体展现出至少一种下述性质：a)以1x10-7M或更小的KD与人PD-1结合；b)不显著与CD28、CTLA-4或ICOS结合；c)在混合淋巴细胞反应(MLR)测定法中增加T细胞增殖；d)在MLR测定法中增加干扰素γ的产量；或e)在MLR测定法中增加白介素-2(IL-2)的分泌。2.项1的抗体，其为IgG1或IgG4同种型的全长抗体。3.项1的抗体，其为抗体片段或单链抗体。4.项1的抗体，其中所述抗体以5x10-8M或更小的KD与人PD-1结合。5.项1的抗体，其中所述抗体以1x10-8M或更小的KD与人PD-1结合。6.项1的抗体，其中所述抗体以5x10-9M或更小的KD与人PD-1结合。7.项1的抗体，其中所述抗体以1x10-8M至1x10-10M的KD与人PD-1结合。8.分离的人单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体与参照抗体交叉竞争与PD-1的结合，该参照抗体包含：a)包含选自SEQIDNO:1、2、3、4、5、6和7的氨基酸序列的人重链可变区；和b)包含选自SEQIDNO:8、9、10、11、12、13和14的氨基酸序列的人轻链可变区。9.项8的抗体，其中所述人重链可变区包含SEQIDNO:1的氨基酸序列，所述人轻链可变区包含SEQIDNO:8的氨基酸序列。10.项8的抗体，其中所述人重链可变区包含SEQIDNO:2的氨基酸序列，所述人轻链可变区包含SEQIDNO:9的氨基酸序列。11.项8的抗体，其中所述人重链可变区包含SEQIDNO:3的氨基酸序列，所述人轻链可变区包含SEQIDNO:10的氨基酸序列。12.项8的抗体，其中所述人重链可变区包含SEQIDNO:4的氨基酸序列，所述人轻链可变区包含SEQIDNO:11的氨基酸序列。13.项8的抗体，其中所述人重链可变区包含SEQIDNO:5的氨基酸序列，所述人轻链可变区包含SEQIDNO:12的氨基酸序列。14.项8的抗体，其中所述人重链可变区包含SEQIDNO:6的氨基酸序列，所述人轻链可变区包含SEQIDNO:13的氨基酸序列。15.项8的抗体，其中所述人重链可变区包含SEQIDNO:7的氨基酸序列，所述人轻链可变区包含SEQIDNO:14的氨基酸序列。16.分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含产自或源自人VH3-33基因的重链可变区，其中所述抗体与PD-1特异性结合。17.分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含产自或源自人VH4-39基因的重链可变区，其中所述抗体与PD-1特异性结合。18.分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含产自或源自人VKL6基因的轻链可变区，其中所述抗体与PD-1特异性结合。19.分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含产自或源自人VKL15基因的轻链可变区，其中所述抗体与PD-1特异性结合。20.分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含：a)人VH3-33基因的重链可变区；和b)人VKL6基因的轻链可变区；其中所述抗体与PD-1特异性结合。21.分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含：a)人VH4-39基因的重链可变区；和b)人VKL15基因的轻链可变区；其中所述抗体与PD-1特异性结合。22.分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含含CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区；及含CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区，其中：a)所述重链可变区CDR3序列包含选自SEQIDNO:29、30、31、32、33、34和35及其保守修饰形式的氨基酸序列；b)所述轻链可变区CDR3序列包含选自SEQIDNO:50、51、52、53、54、55和56及其保守修饰形式的氨基酸序列；且c)所述抗体与PD-1特异性结合。23.项22的抗体，其中所述重链可变区CDR2序列包含选自SEQIDNO:22、23、24、25、26、27和28所示氨基酸序列及其保守修饰形式的氨基酸序列；所述轻链可变区CDR2序列包含选自SEQIDNO:43、44、45、46、47、48和49所示氨基酸序列及其保守修饰的氨基酸序列。24.项23的抗体，其中所述重链可变区CDR1序列包含选自SEQIDNO:15、16、17、18、19、20和21所示氨基酸序列及其保守修饰的氨基酸序列；所述轻链可变区CDR1序列包含选自SEQIDNO:36、37、38、39、40、41和42所示氨基酸序列及其保守修饰的氨基酸序列。25.分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含重链可变区和轻链可变区，其中：a)所述重链可变区包含与选自SEQIDNO:1、2、3、4、5、6和7的氨基酸序列至少80％同源的氨基酸序列；b)所述轻链可变区包含与选自SEQIDNO:8、9、10、11、12、13和14的氨基酸至少80％同源的氨基酸序列；c)所述抗体以1x10-7M或更小的KD与人PD-1结合；且d)所述抗体不显著与人CD28、CTLA-4或ICOS结合。26.项25的抗体，其中所述抗体进一步包含至少一种下述性质：a)所述抗体在混合淋巴细胞反应(MLR)测定法中增加T细胞的增殖；b)所述抗体在MLR测定法中增加干扰素-γ的产量；或c)所述抗体在MLR测定法中增加白介素-2(IL-2)的分泌。27.分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含：a)包含选自SEQIDNO:15、16、17、18、19、20和21的氨基酸序列的重链可变区CDR1；b)包含选自SEQIDNO:22、23、24、25、26、27和28的氨基酸序列的重链可变区CDR2；c)包含选自SEQIDNO:29、30、31、32、33、34和35的氨基酸序列的重链可变区CDR3；d)包含选自SEQIDNO:36、37、38、39、40、41和42的氨基酸序列的轻链可变区CDR1；e)包含选自SEQIDNO:43、44、45、46、47、48和49的氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和f)包含选自SEQIDNO:50、51、52、53、54、55和56的氨基酸序列的轻链可变区CDR3；其中所述抗体与PD-1特异性结合。28.项27的抗体，其包含：a)包含SEQIDNO:15的重链可变区CDR1；b)包含SEQIDNO:22的重链可变区CDR2；c)包含SEQIDNO:29的重链可变区CDR3；d)包含SEQIDNO:36的轻链可变区CDR1；e)包含SEQIDNO:43的轻链可变区CDR2；和f)包含SEQIDNO:50的轻链可变区CDR3。29.项27的抗体，其包含：a)包含SEQIDNO:16的重链可变区CDR1；b)包含SEQIDNO:23的重链可变区CDR2；c)包含SEQIDNO:30的重链可变区CDR3；d)包含SEQIDNO:37的轻链可变区CDR1；e)包含SEQIDNO:44的轻链可变区CDR2；和f)包含SEQIDNO:51的轻链可变区CDR3。30.项27的抗体，其包含：a)包含SEQIDNO:17的重链可变区CDR1；b)包含SEQIDNO:24的重链可变区CDR2；c)包含SEQIDNO:31的重链可变区CDR3；d)包含SEQIDNO:38的轻链可变区CDR1；e)包含SEQIDNO:45的轻链可变区CDR2；和f)包含SEQIDNO:52的轻链可变区CDR3。31.项27的抗体，其包含：a)包含SEQIDNO:18的重链可变区CDR1；b)包含SEQIDNO:25的重链可变区CDR2；c)包含SEQIDNO:32的重链可变区CDR3；d)包含SEQIDNO:39的轻链可变区CDR1；e)包含SEQIDNO:46的轻链可变区CDR2；和f)包含SEQIDNO:53的轻链可变区CDR3。32.项27的抗体，其包含：a)包含SEQIDNO:19的重链可变区CDR1；b)包含SEQIDNO:26的重链可变区CDR2；c)包含SEQIDNO:33的重链可变区CDR3；d)包含SEQIDNO:40的轻链可变区CDR1；e)包含SEQIDNO:47的轻链可变区CDR2；和f)包含SEQIDNO:54的轻链可变区CDR3。33.项27的抗体，其包含：a)包含SEQIDNO:20的重链可变区CDR1；b)包含SEQIDNO:27的重链可变区CDR2；c)包含SEQIDNO:34的重链可变区CDR3；d)包含SEQIDNO:41的轻链可变区CDR1；e)包含SEQIDNO:48的轻链可变区CDR2；和f)包含SEQIDNO:55的轻链可变区CDR3。34.项27的抗体，其包含：a)包含SEQIDNO:21的重链可变区CDR1；b)包含SEQIDNO:28的重链可变区CDR2；c)包含SEQIDNO:35的重链可变区CDR3；d)包含SEQIDNO:42的轻链可变区CDR1；e)包含SEQIDNO:49的轻链可变区CDR2；和f)包含SEQIDNO:56的轻链可变区CDR3。35.分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含：a)包含选自SEQIDNO:1、2、3、4、5、6和7的氨基酸序列的重链可变区；和b)包含选自SEQIDNO:8、9、10、11、12、13和14的氨基酸序列的轻链可变区；其中所述抗体与PD-1特异性结合。36.项35的抗体，其包含：a)包含SEQIDNO:1的氨基酸序列的重链可变区；和b)包含SEQIDNO:8的氨基酸序列的轻链可变区。37.项35的抗体，其包含：a)包含SEQIDNO:2的氨基酸序列的重链可变区；和b)包含SEQIDNO:9的氨基酸序列的轻链可变区。38.项35的抗体，其包含：a)包含SEQIDNO:3的氨基酸序列的重链可变区；和b)包含SEQIDNO:10的氨基酸序列的轻链可变区。39.项35的抗体，其包含：a)包含SEQIDNO:4的氨基酸序列的重链可变区；和b)包含SEQIDNO:11的氨基酸序列的轻链可变区。40.项35的抗体，其包含：a)包含SEQIDNO:5的氨基酸序列的重链可变区；和b)包含SEQIDNO:12的氨基酸序列的轻链可变区。41.项35的抗体，其包含：a)包含SEQIDNO:6的氨基酸序列的重链可变区；和b)包含SEQIDNO:13的氨基酸序列的轻链可变区。42.项35的抗体，其包含：a)包含SEQIDNO:7的氨基酸序列的重链可变区；和b)包含SEQIDNO:14的氨基酸序列的轻链可变区。43.组合物，其包含项1－36任一项的抗体或其抗原结合部分，及药学可接受的载体。44.免疫偶联物，其包含与治疗剂相连的项1－36任一项的抗体或其抗原结合部分。45.组合物，其包含项44的免疫偶联物及药学可接受的载体。46.项44的免疫偶联物，其中所述治疗剂是细胞毒素。47.组合物，其包含项46的免疫偶联物及药学可接受的载体。48.项44的免疫偶联物，其中所述治疗剂是放射性同位素。49.组合物，其包含项48的免疫偶联物及药学可接受的载体。50.双特异性分子，其包含与第二功能性模块相连的项1－36任一项的抗体或其抗原结合部分，该第二功能性模块具有与所述抗体或其抗原结合部分不同的结合特异性。51.组合物，其包含项50的双特异性分子及药学可接受的载体。52.分离的核酸分子，其编码项1－36任一项的抗体或其抗原结合部分。53.包含项52的核酸分子的表达载体。54.包含项53的表达载体的宿主细胞。55.包含人免疫球蛋白重链和轻链转基因的转基因小鼠，其中所述小鼠表达项1－36任一项的抗体。56.从项55的小鼠制备的杂交瘤，其中该杂交瘤产生所述抗体。57.调控受试者中免疫应答的方法，其包括给受试者施用项1－36任一项的抗体或其抗原结合部分，使得受试者中的免疫应答得到调控。58.抑制受试者中肿瘤细胞生长的方法，其包括给受试者施用治疗有效量的抗PD-1抗体或其抗原结合部分。59.项58的方法，其中所述抗体是嵌合抗体。60.项58的方法，其中所述抗体是人源化抗体。61.项58的方法，其中所述抗体是完全人的抗体。62.项58的方法，其中所述肿瘤细胞是选自黑素瘤、肾癌、前列腺癌、乳癌、结肠癌和肺癌的癌症的肿瘤细胞。63.项58的方法，其中所述肿瘤细胞是选自骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头或颈癌、皮肤或眼内恶性黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛区癌、胃癌、睾丸癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、阴户癌、何杰金氏病、非何杰金氏淋巴瘤、食道癌、小肠癌、内分泌系统的癌症、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、慢性或急性白血病，其包括急性髓细胞样白血病、慢性髓细胞样白血病、急性成淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、儿童期实体瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)的赘生物、原发性CNS淋巴瘤、肿瘤血管发生、脊髓轴肿瘤、脑干胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西氏肉瘤、表皮样癌、鳞状细胞癌、T细胞淋巴瘤、环境诱发的癌症，其包括石棉所诱发的那些、和所述癌症的组合的癌症的肿瘤细胞。64.抑制受试者中肿瘤细胞生长的方法，其包括以有效抑制肿瘤细胞生长的量给受试者施用项1－36任一项的抗体或其抗原结合部分。65.治疗受试者中传染病的方法，其包括给受试者施用项1－36任一项的抗体或其抗原结合部分，使得受试者中的传染病得到治疗。66.项65的方法，其中所述传染病选自HIV、流行性感冒、疱疹、贾第虫病、疟疾、利什曼病、以下病毒引起的致病感染：肝炎病毒(甲型、乙型和丙型)、疱疹病毒(例如VZV、HSV-1、HAV-6、HSV-II和CMV、埃巴二氏病毒)、腺病毒、流感病毒、黄病毒、艾柯病毒、鼻病毒、柯萨奇病毒、冠状病毒、呼吸道合胞病毒、腮腺炎病毒、轮状病毒、麻疹病毒、风疹病毒、细小病毒、牛痘病毒、HTLV病毒、登革热病毒、乳头瘤病毒、软疣病毒、脊髓灰质炎病毒、狂犬病病毒、JC病毒和虫媒病毒性脑炎病毒，以下细菌引起的致病感染：衣原体、立克次氏体、分枝杆菌、葡萄球菌、链球菌、肺炎球菌、脑膜炎球菌和conococci、克雷伯氏菌、变形菌、沙雷氏菌、假单胞菌、军团菌、白喉、沙门氏菌、杆菌、霍乱、破伤风、肉毒中毒、炭疽、鼠疫、钩端螺旋体病和莱姆氏病细菌，以下真菌引起的致病感染：假丝酵母(白色假丝酵母、克鲁斯假丝酵母、光滑假丝酵母、热带假丝酵母等)、新型隐球酵母、曲霉(烟曲霉、黑曲霉等)、毛霉目的属(毛霉属、犁头霉属、根霉属)、申克氏孢子丝菌、皮炎芽酵母、巴西副球孢子菌、粗球孢菌和荚膜组织胞浆菌，及以下寄生虫引起的致病感染：痢疾内变形虫、结肠肠袋虫、福纳氏虫、棘变形虫、吸吮贾第虫、隐孢子虫、卡氏肺囊虫、间日疟原虫、田鼠巴贝虫、布鲁斯锥虫、克鲁兹锥虫、多氏利什曼虫、鼠弓浆虫和巴西日圆线虫。67.增强受试者中对抗原的免疫应答的方法，其包括给受试者施用：(i)抗原；和(ii)项1－36任一项的抗体或其抗原结合部分，使得受试者中对抗原的免疫应答得到增强。68.项67的方法，其中所述抗原是肿瘤抗原、病毒抗原、细菌抗原或来自病原体的抗原。69.治疗过度增殖性疾病的方法，该方法包括：a)给受试者施用抗PD-1抗体，和b)给受试者施用抗CTLA-4抗体。70.项69的方法，其中所述抗PD-1抗体以亚治疗剂量施用。71.项69的方法，其中所述抗CTLA-4抗体以亚治疗剂量施用。72.项69的方法，其中所述抗PD-1抗体和所述抗CTLA-4抗体各自以亚治疗剂量施用。73.项69的方法，其中所述抗PD-1抗体和所述抗CTLA-4抗体序贯施用。74.项73的方法，其中先施用所述抗PD-1抗体后施用所述抗CTLA-4抗体。75.项73的方法，其中先施用所述抗CTLA-4抗体后施用所述抗PD-1抗体。76.项73的方法，其中所述抗PD-1抗体和所述抗CTLA-4抗体同时施用。77.项73的方法，其中将所述抗PD-1抗体和所述抗CTLA-4抗体混合成单一组合物并同时施用。78.项73的方法，其包括给受试者施用：(a)含有抗PD-1抗体和药学可接受载体的组合物及(b)含有抗CTLA-4抗体和药学可接受载体的组合物。79.项69至78任一项的方法，其中所述过度增殖性疾病是癌症。80.项79的方法，其中所述癌症是结肠癌。81.项68至79任一项的方法，其中所述受试者是人。82.项68至79任一项的方法，其中所述抗PD-1抗体是人序列抗体。83.项82的方法，其中所述抗PD-1人序列抗体是单克隆抗体。84.项83的方法，其中所述抗PD-1人序列单克隆抗体是17D8、2D3、4H1、5C4、4A11、7D3或5F4。85.项68至79任一项的方法，其中所述抗CTLA-4抗体是人序列抗体。86.项85的方法，其中所述抗CTLA-4人序列抗体是单克隆抗体。87.项86的方法，其中所述抗CTLA-4人序列单克隆抗体是10D1(MDX-010)。88.改变与用免疫刺激剂治疗过度增殖性疾病有关的不良事件的方法，该方法包括：(a)给受试者施用抗PD-1抗体，和(b)给受试者施用亚治疗剂量的抗CTLA-4抗体。89.项86的方法，其中所述抗PD-1抗体以亚治疗剂量施用。90.项88的方法，其中所述抗PD-1抗体和所述抗CTLA-4抗体序贯施用。91.项90的方法，其中先施用所述抗PD-1抗体后施用所述抗CTLA-4抗体。92.项90的方法，其中先施用所述抗CTLA-4抗体后施用所述抗PD-1抗体。93.项88的方法，其中所述抗PD-1抗体和所述抗CTLA-4抗体同时施用。94.项88的方法，其中将所述抗PD-1抗体和所述抗CTLA-4抗体混合成单一组合物并同时施用。95.项88的方法，其包括给受试者施用：(a)含有抗PD-1抗体和药学可接受载体的组合物及(b)含有抗CTLA-4抗体和药学可接受载体的组合物。96.项88至95任一项的方法，其中所述过度增殖性疾病是癌症。97.项96的方法，其中所述癌症是结肠癌。98.项88至95任一项的方法，其中所述受试者是人。99.项88至95任一项的方法，其中所述抗PD-1抗体是人序列抗体。100.项99的方法，其中所述抗PD-1人序列抗体是单克隆抗体。101.项100的方法，其中所述抗PD-1人序列单克隆抗体是17D8、2D3、4H1、5C4、4A11、7D3或5F4。102.项88至95任一项的方法，其中所述抗CTLA-4抗体是人序列抗体。103.项102的方法，其中所述抗CTLA-4人序列抗体是单克隆抗体。104.项103的方法，其中所述抗CTLA-4人序列单克隆抗体是10D1(MDX-010)。105.制备抗PD-1抗体的方法，其包括：(a)提供：(i)重链可变区抗体序列，其包含选自SEQIDNO:15、16、17、18、19、20和21的CDR1序列，选自SEQIDNO:22、23、24、25、26、27和28的CDR2序列，和选自SEQIDNO:29、30、31、32、33、34和35的CDR3序列；或(ii)轻链可变区抗体序列，其包含选自SEQIDNO:36、37、38、39、40、41和42的CDR1序列，选自SEQIDNO:43、44、45、46、47、48和49的CDR2序列，和选自SEQIDNO:50、51、52、53、54、55和56的CDR3序列；(b)改变至少一个可变区抗体序列中的至少一个氨基酸残基，所述序列选自重链可变区抗体序列和轻链可变区抗体序列，以创造至少一个经改变的抗体序列；和(c)将经改变的抗体序列表达成蛋白质。附图简述图1A显示17D8人单克隆抗体的重链可变区的核苷酸序列(SEQIDNO:57)和氨基酸序列(SEQIDNO:1)。其中标示出CDR1(SEQIDNO:15)、CDR2(SEQIDNO:22)和CDR3(SEQIDNO:29)区域，并且指出V、D和J种系衍生化。图1B显示17D8人单克隆抗体的轻链可变区的核苷酸序列(SEQIDNO:64)和氨基酸序列(SEQIDNO:8)。其中标示出CDR1(SEQIDNO:36)、CDR2(SEQIDNO:43)和CDR3(SEQIDNO:50)区域，并且指出V和J种系衍生化。图2A显示2D3人单克隆抗体的重链可变区的核苷酸序列(SEQIDNO:58)和氨基酸序列(SEQIDNO:2)。其中标示出CDR1(SEQIDNO:16)、CDR2(SEQIDNO:23)和CDR3(SEQIDNO:30)区域，并且指出V和J种系衍生化。图2B显示2D3人单克隆抗体的轻链可变区的核苷酸序列(SEQIDNO:65)和氨基酸序列(SEQIDNO:9)。其中标示出CDR1(SEQIDNO:37)、CDR2(SEQIDNO:44)和CDR3(SEQIDNO:51)区域，并且指出V和J种系衍生化。图3A显示4H1人单克隆抗体的重链可变区的核苷酸序列(SEQIDNO:59)和氨基酸序列(SEQIDNO:3)。其中标示出CDR1(SEQIDNO:17)、CDR2(SEQIDNO:24)和CDR3(SEQIDNO:31)区域，并且指出V和J种系衍生化。图3B显示4H1人单克隆抗体的轻链可变区的核苷酸序列(SEQIDNO:66)和氨基酸序列(SEQIDNO:10)。其中标示出CDR1(SEQIDNO:38)、CDR2(SEQIDNO:45)和CDR3(SEQIDNO:52)区域，并且指出V和J种系衍生化。图4A显示5C4人单克隆抗体的重链可变区的核苷酸序列(SEQIDNO:60)和氨基酸序列(SEQIDNO:4)。其中标示出CDR1(SEQIDNO:18)、CDR2(SEQIDNO:25)和CDR3(SEQIDNO:32)区域，并且指出V和J种系衍生化。图4B显示5C4人单克隆抗体的轻链可变区的核苷酸序列(SEQIDNO:67)和氨基酸序列(SEQIDNO:11)。其中标示出CDR1(SEQIDNO:39)、CDR2(SEQIDNO:46)和CDR3(SEQIDNO:53)区域，并且指出V和J种系衍生化。图5A显示4A11人单克隆抗体的重链可变区的核苷酸序列(SEQIDNO:61)和氨基酸序列(SEQIDNO:5)。其中标示出CDR1(SEQIDNO:19)、CDR2(SEQIDNO:26)和CDR3(SEQIDNO:33)区域，并且指出V和J种系衍生化。图5B显示4A11人单克隆抗体的轻链可变区的核苷酸序列(SEQIDNO:68)和氨基酸序列(SEQIDNO:12)。其中标示出CDR1(SEQIDNO:40)、CDR2(SEQIDNO:47)和CDR3(SEQIDNO:54)区域，并且指出V和J种系衍生化。图6A显示7D3人单克隆抗体的重链可变区的核苷酸序列(SEQIDNO:62)和氨基酸序列(SEQIDNO:6)。其中标示出CDR1(SEQIDNO:20)、CDR2(SEQIDNO:27)和CDR3(SEQIDNO:34)区域，并且指出V和J种系衍生化。图6B显示7D3人单克隆抗体的轻链可变区的核苷酸序列(SEQIDNO:69)和氨基酸序列(SEQIDNO:13)。其中标示出CDR1(SEQIDNO:41)、CDR2(SEQIDNO:48)和CDR3(SEQIDNO:55)区域，并且指出V和J种系衍生化。图7A显示5F4人单克隆抗体的重链可变区的核苷酸序列(SEQIDNO:63)和氨基酸序列(SEQIDNO:7)。其中标示出CDR1(SEQIDNO:21)、CDR2(SEQIDNO:28)和CDR3(SEQIDNO:35)区域，并且指出V和J种系衍生化。图7B显示5F4人单克隆抗体的轻链可变区的核苷酸序列(SEQIDNO:70)和氨基酸序列(SEQIDNO:14)。其中标示出CDR1(SEQIDNO:42)、CDR2(SEQIDNO:49)和CDR3(SEQIDNO:56)区域，并且指出V和J种系衍生化。图8显示17D8、2D3、4H1、5C4和7D3的重链可变区的氨基酸序列与人种系VH3-33氨基酸序列(SEQIDNO:71)的比对结果。图9显示17D8、2D3和7D3的轻链可变区的氨基酸序列与人种系VKL6氨基酸序列(SEQIDNO:73)的比对结果。图10显示4H1和5C4的轻链可变区的氨基酸序列与人种系VKL6氨基酸序列(SEQIDNO:73)的比对结果。图11显示4A11和5F4的重链可变区的氨基酸序列与人种系VH4-39氨基酸序列(SEQIDNO:72)的比对结果。图12显示4A11和5F4的轻链可变区的氨基酸序列与人种系VKL15氨基酸序列(SEQIDNO:74)的比对结果。图13A－13B显示流式细胞计量术实验的结果，其证明针对人PD-1的人单克隆抗体5C4和4H1与用全长人PD-1转染的CHO细胞的细胞表面结合。图13A显示5C4的流式细胞计量术绘图。图13B显示4H1的流式细胞计量术绘图。细线表示与CHO细胞的结合，粗线表示与CHOhPD-1细胞的结合。图14显示的图表证明针对人PD-1的人单克隆抗体17D8、2D3、4H1、5C4和4A11与PD-1特异性结合，但不与CD28家族其它成员结合。图15A－15C显示流式细胞计量术实验的结果，其证明针对人PD-1的人单克隆抗体4H1和5C4与细胞表面上的PD-1结合。图15A显示与活化的人T细胞的结合。图15B显示与猕猴T细胞的结合。图15C显示与表达PD-1的CHO转染细胞的结合。图16A－16C显示的实验结果证明针对人PD-1的人单克隆抗体在混合淋巴细胞反应测定法中促进T细胞增殖、IFN-γ分泌和IL-2分泌。图16A的条线图显示浓度依赖性的T细胞增殖。图16B的条线图显示浓度依赖性的IFN-γ分泌。图16C的条线图显示浓度依赖性的IL-2分泌。图17A－17B显示流式细胞计量术实验的结果，其证明针对人PD-1的人单克隆抗体阻断了PD-L1和PD-L2与表达PD-1的CHO转染细胞的结合。图17A的图表显示对PD-L1结合的抑制。图17B的图表显示对PD-L2结合的抑制。图18显示流式细胞计量术实验的结果，其证明针对人PD-1的人单克隆抗体不促进T细胞凋亡。图19显示的实验结果证明在用CMV溶胞物和抗PD-1刺激PBMC时，抗PD-1HuMab对来自CMV阳性供体的PBMC的IFNγ分泌的浓度依赖性影响。图20显示小鼠模型系统中肿瘤生长实验的结果，其证明用抗PD-1抗体在体内治疗小鼠肿瘤可抑制肿瘤生长。图21A－21D显示有植入MC38结肠肿瘤细胞(PD-L1-)并在同一天用下述疗法之一进行治疗的小鼠个体中各时间的肿瘤体积：(A)小鼠IgG(对照)，(B)抗CTLA-4抗体，(C)抗PD-1抗体，和(D)抗CTLA-4抗体及抗PD-1抗体。如实施例13中所述，小鼠在第3、6和10天接受后续抗体治疗，监控肿瘤体积达60天。图22显示图21中所示小鼠肿瘤体积的平均值。图23显示图21中所示小鼠肿瘤体积的中间值。图24A－24D显示有植入MC38结肠肿瘤细胞(PD-L1-)并在一周后用下述疗法之一进行治疗的小鼠个体中各时间的肿瘤体积：(A)小鼠IgG(对照)，(B)抗CTLA-4抗体，(C)抗PD-1抗体，和(D)抗CTLA-4抗体及抗PD-1抗体。在进行治疗的第一天，肿瘤体积为大约315mm3。如实施例14中所述，小鼠在第3、6和10天接受后续抗体治疗。图25显示图24中所示小鼠肿瘤体积的平均值。图26显示图24中所示小鼠肿瘤体积的中间值。图27A－27H显示有植入MC38结肠肿瘤细胞(PD-L1-)(第-7天)然后在植入后第0、3、6和10天(如实施例15所述)用下述疗法之一进行治疗的小鼠个体中各时间的肿瘤体积均值：(A)小鼠IgG作为对照(20mg/kg,X20)，(B)抗PD-1抗体(10mg/kg)及小鼠IgG(10mg/kg)(P10X10)，(C)抗CTLA-4抗体(10mg/kg)及小鼠IgG(10mg/kg)(C10X10)，(D)抗CTLA-4抗体及抗PD-1抗体(各10mg/kg)(C10P10)，(E)抗CTLA-4抗体及抗PD-1抗体(各3mg/kg)(C3P3)，和(F)抗CTLA-4抗体及抗PD-1抗体(各1mg/kg)(C1P1)。两组小鼠如下所述用各抗体依次进行治疗：(G)抗CTLA-4抗体(10mg/kg，第0天)、抗CTLA-4抗体(10mg/kg，第3天)、抗PD-1抗体(10mg/kg，第6天)及抗PD-1抗体(10mg/kg，第10天)(C10C10P10P10)，和(H)抗PD-1抗体(10mg/kg，第0天)、抗PD-1抗体(10mg/kg，第3天)、抗CTLA-4抗体(10mg/kg，第6天)及抗CTLA-4抗体(10mg/kg，第10天)(P10P10C10C10)。图28显示图27A－27H中所示小鼠肿瘤体积的平均值。图29显示图27A－27H中所示小鼠肿瘤体积的中间值。图30A－30F显示有植入SA1/N纤维肉瘤细胞(PD-L1-)并在一天后用下述疗法之一进行治疗的小鼠个体中各时间的肿瘤体积：(A)PBS(媒介对照)，(B)小鼠IgG(抗体对照，10mg/kg),(C)抗PD-1抗体(10mg/kg)，(D)抗CTLA-4抗体(10mg/kg)，(E)抗CTLA-4抗体(0.2mg/kg)，和(F)抗PD-1抗体(10mg/kg)及抗CTLA-4抗体(0.2mg/kg)。如实施例16中所述，小鼠在第4、7和11天接受后续抗体治疗，监控肿瘤体积达41天。图31显示图29中所示小鼠肿瘤体积的平均值。图32显示图29中所示小鼠肿瘤体积的中间值。图33A－33J显示有植入SA1/N纤维肉瘤细胞(PD-L1-)然后在植入后第7、10、13和17天(如实施例17中所述)用下述疗法之一进行治疗的小鼠个体中各时间的肿瘤体积：(A)PBS(媒介对照),(B)小鼠IgG(抗体对照，10mg/kg)，(C)抗CTLA-4抗体(0.25mg/kg)，(D)抗CTLA-4抗体(0.5mg/kg)，(E)抗CTLA-4抗体(5mg/kg)，(F)抗PD-1抗体(3mg/kg)，(G)抗PD-1抗体(10mg/kg)，(H)抗PD-1抗体(10mg/kg)及抗CTLA-4抗体(0.25mg/kg)，(I)抗PD-1抗体(10mg/kg)及抗CTLA-4抗体(0.5mg/kg)，和(F)抗PD-1抗体(3mg/kg)及抗CTLA-4抗体(0.5mg/kg)。进行治疗的第一天，肿瘤体积为约110mm3。图34显示图33A－33J中所示小鼠肿瘤体积的平均值。图35显示图33A－33J中所示小鼠肿瘤体积的中间值。图36A－36B显示有植入SA1/N纤维肉瘤细胞(PD-L1-)然后在植入后第10、13、16和19天(如实施例17中所述)用下述疗法之一进行治疗的小鼠个体中各时间的肿瘤体积：(A)小鼠IgG(抗体对照，10mg/kg)或(B)抗PD-1抗体(10mg/kg)及抗CTLA-4抗体(1mg/kg)。在进行治疗的第一天，肿瘤体积为约250mm3。图37显示图36A－36B中所示小鼠肿瘤体积的平均值。图38显示图36A－36B中所示小鼠肿瘤体积的中间值。图39显示从图33A－33J和36A－36B所示肿瘤体积计算得出的肿瘤抑制百分比的平均值和中间值。图40A－40D显示有皮下植入RENCA肾脏腺癌细胞(PD-L1+)(Murphy和Hrushesky(1973)J.Nat’l.CancerRes.50:1013-1025)(第-12天)然后在植入后第0、3、6和9天用下述疗法之一进行腹膜内治疗的BALB/c小鼠中的肿瘤体积：(A)小鼠IgG(抗体对照，20mg/kg)，(B)抗PD-1抗体(10mg/kg)，(C)抗CTLA-4抗体(10mg/kg)，和(D)抗PD-1抗体(10mg/kg)与抗CTLA-4抗体(10mg/kg)的组合。在进行治疗的第一天，肿瘤体积为约115mm3。图41显示抗mPD-1抗体4H2以剂量依赖的方式阻断小鼠PD-L2-Fc融合蛋白与小鼠PD-1(mPD-1)的结合。通过ELISA测量FITC标记的驴抗大鼠IgG的荧光来检测结合。MFI(平均荧光强度)越强，结合越多。图42显示通过ELISA测定的抗mPD-1抗体对固定化mPD-1-Fc融合蛋白的结合曲线。图43显示大鼠抗mPD-1抗体4H2.B3对表达mPD-1的CHO细胞的结合曲线。采用偶联有FITC的驴抗大鼠IgG检测结合，通过FACS测量(MFI)。图44显示在抗mPD-1抗体4H2.B3的浓度逐渐增加时mPD-L1-hFc融合蛋白对表达mPD-1的CHO细胞的结合曲线。采用偶联有FITC的山羊抗人IgG检测结合，通过FACS测量(MFI)。图45显示与嵌合大鼠:小鼠抗mPD-1抗体4H2相比，大鼠抗mPD-1抗体4H2.B3对表达mPD-1的CHO细胞的结合曲线。图46显示在大鼠抗mPD-1抗体4H2.B3或嵌合大鼠:小鼠抗mPD-1抗体4H2的浓度逐渐增加时mPD-L1-hFc融合蛋白对表达mPD-1的CHO细胞的结合曲线。图47显示先用抗PD1抗体治疗然后用SA1/N纤维肉瘤细胞(PD-L1-)再次刺激的无肿瘤小鼠的平均肿瘤体积。还显示有植入SA1/N纤维肉瘤细胞的未实验小鼠(对照，没有先刺激或治疗)的平均肿瘤体积。图48显示无肿瘤的存活小鼠个体中各时间的肿瘤体积，该小鼠在植入MC38结肠肿瘤细胞(PD-L1-)并用抗PD-1抗体或抗PD1与抗CTLA-4抗体的组合治疗后，用超过最初处理10倍的MC38结肠肿瘤细胞再次刺激。还显示有植入MC38结肠肿瘤细胞的未实验小鼠(对照，没有先刺激或治疗)的平均肿瘤体积。图49显示图48中所示小鼠肿瘤体积的平均值。图50显示有植入CT26结肠肿瘤细胞的小鼠个体中各时间的平均肿瘤体积。图51A－51B显示的实验结果证明针对人PD-1的人单克隆抗体促进含有T调节细胞的培养物中T细胞的增殖和IFNγ的分泌。图51A的条线图显示浓度依赖性的T细胞增殖，其使用HuMAb5C4；图51B的条线图显示浓度依赖性的IFNγ分泌，其使用HuMAb5C4。图52A－52B显示的实验结果证明针对人PD-1的人单克隆抗体促进含有活化的T细胞的培养物中T细胞的增殖和IFNγ的分泌。图52A的条线图显示浓度依赖性的T细胞增殖，其使用HuMAb5C4；图52B的条线图显示浓度依赖性的IFNγ分泌，其使用HuMAb5C4。图53显示抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)测定法的结果，其证明人单克隆抗PD-1抗体以ADCC浓度依赖性的方式杀死活化的人T细胞，其与抗PD-1抗体的Fc区有关。图54显示补体依赖性细胞毒性(CDC)测定法的结果，其证明人单克隆抗PD-1抗体不以CDC浓度依赖性的方式杀死活化的人T细胞。实施本发明的最佳模式在一方面，本发明涉及分离的单克隆抗体，特别是人单克隆抗体，其与PD-1特异性结合。在某些实施方式中，本发明的抗体展现出一种或多种优良的功能特性，诸如与人PD-1高亲和力结合，缺少与CD28家族其它成员的交叉反应性，在混合淋巴细胞反应中刺激T细胞增殖、IFN-γ和/或IL-2分泌的能够，抑制一种或多种PD-1配体(例如PD-L1和/或PD-L2)结合的能力，与猕猴PD-1交叉反应的能力，刺激抗原特异性记忆应答的能力，刺激抗体应答的能力和/或抑制体内肿瘤细胞生长的能力。另外/或者，本发明的抗体源自特定的重链和轻链种系序列和/或包含特定的结构特征，诸如包含特定氨基酸序列的CDR区。在另一方面，本发明涉及特异性结合PD-1的单克隆抗体与特异性结合CTLA-4的单克隆抗体的联合使用。本发明提供了例如分离的抗体、制备此类抗体的方法、包含此类抗体的免疫偶联物和双特异性分子、及含有本发明的抗体、免疫偶联物或双特异性分子的药用组合物。在另一方面，本发明涉及使用抗PD-1抗体抑制受试者中肿瘤细胞生长的方法。如本文所证明的，抗PD-1抗体能够抑制体内肿瘤细胞生长。本发明还涉及使用所述抗体调节免疫应答以及治疗诸如癌症或传染病的疾病，或者刺激保护性自身免疫应答或刺激抗原特异性免疫应答(例如通过共施用抗PD-1和目标抗原)的方法。为使本发明更易于理解，首先定义某些术语。别的定义将在整个详述中阐明。术语“程序性死亡1”、“程序性细胞死亡1”、“蛋白PD-1”、“PD-1”、“PD1”、“PDCD1”、“hPD-1”和“hPD-1”可互换使用，包括人PD-1的变体、同种型(isoform)、物种同系物，及与PD-1具有至少一个共同表位的类似物。完整的PD-1序列可以根据GenBank编号U64863查到。术语“细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4”、“CTLA-4”、“CTLA4”、“CTLA-4抗原”和“CD152”(参见例如Murata(1999)Am.J.Pathol.155:453-460)可互换使用，包括人CTLA-4的变体、同种型、物种同系物，及与CTLA-4具有至少一个共同表位的类似物(参见例如Balzano(1992)Int.J.CancerSuppl.7:28-32)。完整的CTLA-4核酸序列可以根据GenBank编号L15006查到。术语“免疫应答”指例如淋巴细胞、抗原呈递细胞、吞噬细胞、粒细胞，和由上述细胞或肝脏产生的可溶性大分子(包括抗体、细胞因子和补体)的作用，其导致损害、破坏或消除侵袭人体的病原体、感染病原体的细胞或组织、癌性细胞，或在自身免疫或病理性炎症时的正常人细胞或组织。“信号转导途径”指在信号从细胞的一部分到细胞的另一部分的传送过程中起作用的各种信号转导分子之间的生物化学关系。在用于本文时，短语“细胞表面受体”包括例如能够接收信号并将该信号传送穿过细胞质膜的分子和分子复合物。本发明的“细胞表面受体”的实例为PD-1受体。术语“抗体”在用于本文时包括完整的抗体及其任何抗原结合片段(即“抗原结合部分”)或单链。“抗体”指包含通过二硫键相互连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链的糖蛋白，或其抗原结合部分。每条重链由重链可变区(本文中简写为VH)和重链恒定区构成。重链恒定区由三个结构域，CH1、CH2和CH3构成。每条轻链由轻链可变区(本文中简写为VL)和轻链恒定区构成。轻链恒定区由一个结构域，CL构成。VH和VL区可以进一步细分为高变性区域，称为互补决定区(CDR)，其散布在更保守的区域中，称为框架区(FR)。每条VH和VL由三个CDR和四个FR构成，其从氨基端到羧基端以下列顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白对宿主组织或因子的结合，其包括免疫系统的各种细胞(例如效应细胞)和经典补体系统的第一组分(Clq)。术语抗体的“抗原结合部分”(或简称为“抗体部分”)在用于本文时指一个或多个保留了与抗原(例如PD-1)特异性结合的能力的抗体片段。已显示抗体的抗原结合功能可以由全长抗体的片段行使。术语抗体的“抗原结合部分”所涵盖的结合片段的实例包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')2片段，包含通过铰链区二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)Fd片段，由VH和CH1结构域组成；(iv)Fv片段，由抗体单臂的VL和VH结构域组成；(v)dAb片段(Ward等人(1989)Nature341:544-546)，由VH结构域组成；和(vi)分离的互补决定区(CDR)。此外，虽然Fv片段的两个结构域，VL和VH由分开的基因编码，但是可以使用重组方法通过合成的接头将它们连接，从而使它们能够制备成单个蛋白链，其中VL和VH区配对形成单价分子(称为单链Fv(scFv)；参见例如Bird等人(1988)Science242:423-426；和Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879-5883)。此类单链抗体也意图涵盖在术语抗体的“抗原结合部分”中。这些抗体片段可使用本领域技术人员公知的常规技术获得，可以以与完整抗体相同的方式对片段筛选功用。“分离的抗体”在用于本文时意图指基本没有具有不同抗原特异性的其它抗体的抗体(例如与PD-1特异性结合的分离的抗体基本没有与PD-1以外的其它抗原特异性结合的抗体)。但是，与PD-1特异性结合的分离的抗体与其它抗原诸如来自其它物种的PD-1分子具有交叉反应性。此外，分离的抗体可以基本没有其它细胞材料和/或化学药品。“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”在用于本文时指单一分子组合物的抗体分子的制备物。单克隆抗体组合物展现出对特定表位的单一结合特异性和亲和力。术语“人抗体”在用于本文时意图包括可变区中的框架区和CDR区都源自人种系免疫球蛋白序列的抗体。此外，如果抗体包含恒定区，那么恒定区也源自人种系免疫球蛋白序列。本发明的人抗体可以包含不是由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如通过体外随机的或位点特异的诱变或者通过体内体细胞突变导入的突变)。但是，术语“人抗体”在用于本文时不想包括将源自另一哺乳动物物种诸如小鼠的CDR序列嫁接到人框架序列中所获得的抗体。术语“人单克隆抗体”指展示出单一结合特异性的抗体，其可变区中的框架区和CDR区都源自人种系免疫球蛋白序列。在一种实施方式中，人单克隆抗体由杂交瘤产生，该杂交瘤包括与永生化细胞融合的得自转基因非人动物，例如转基因小鼠的B细胞，其基因组包含人重链转基因和轻链转基因。术语“重组人抗体”在用于本文时包括所有通过重组手段制备、表达、创造或分离的人抗体，诸如(a)从人免疫球蛋白基因的转基因或转染色体动物(例如小鼠)或由其制备的杂交瘤(下文将进一步描述)中分离的抗体，(b)从通过转化表达人抗体的宿主细胞，例如从转染瘤中分离的抗体，(c)从重组的、组合的人抗体库中分离的抗体，和(d)通过涉及将人免疫球蛋白基因序列与其它DNA序列剪接的任何其它手段制备、表达、创造或分离的抗体。此类重组人抗体的可变区中的框架区和CDR区源自人种系免疫球蛋白序列。但是在某些实施方式中，可以对此类重组人抗体进行体外诱变(或者在使用人Ig序列的转基因动物时，进行体内体细胞突变)，如此使得重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列虽然源自且与人种系VH和VL序列有关，但不天然存在于体内人抗体种系全集(repertoire)中。在用于本文时，“同种型(isotype)”指由重链恒定区基因编码的抗体类型(例如IgM或IgG1)。短语“识别抗原的抗体”和“对抗原特异的抗体”在本文中可以与术语“与抗原特异性结合的抗体”互换使用。术语“人抗体衍生物”指人抗体的任何改良形式，例如抗体与另一试剂或抗体的偶联物。术语“人源化抗体”意图指将源自另一哺乳动物物种，诸如小鼠种系的CDR序列嫁接到人框架序列上获得的抗体。可以在人框架序列中进行别的框架区修饰。术语“嵌合抗体”意图指可变区序列源自一种物种而恒定区序列源自另一种物种的抗体，诸如可变区序列源自小鼠抗体而恒定区序列源自人抗体的抗体。在用于本文时，“与人PD-1特异性结合”的抗体意图指以1x10-7M或更小，更优选5x10-8M或更小，更优选1x10-8M或更小，更优选5x10-9M或更小的KD与人PD-1结合的抗体。术语“Kassoc”或“Ka”在用于本文时意图指特定抗体－抗原相互作用的结合速率(associationrate)，术语“Kdis”或“Kd”在用于本文时意图指特定抗体－抗原相互作用的解离速率(dissociationrate)。术语“KD”在用于本文时意图指解离常数，其由Kd与Ka的比值(即Kd/Ka)获得，以摩尔浓度(M)表示。抗体的KD值可以使用本领域公知的方法测定。一种优选的测定抗体KD的方法使用表面等离振子共振(surfaceplasmonresonance)，更优选使用生物传感器系统，例如系统。在用于本文时，术语IgG抗体的“高亲和力”指抗体对靶抗原具有10-8M或更小，更优选10-9M或更小，甚至更优选10-10M或更小的KD。但是，“高亲和力”结合对于其它抗体同种型可能有所不同。例如，IgM同种型的“高亲和力”结合指抗体具有10-7M或更小，更优选10-8M或更小，甚至更优选10-9M或更小的KD。术语“治疗”或“疗法”指为了以统计学显著的方式治疗、治愈、减轻、缓解、改变、补救、改善、改进或影响疾患(例如疾病)、疾患的症状，或预防或延缓症状、并发症、生化指标的发作，或以其它方式阻滞或抑制疾病、疾患或病症的进一步发展而施用活性剂。“不良事件”(AE)在用于本文时指与使用药物治疗有关的任何不利的和通常不是故意，甚至是不希望出现的征候(包括异常的化验所见)、症状或疾病。例如，不良事件可能与应答治疗引起的免疫系统的激活或免疫系统细胞(例如T细胞)的扩增有关。药物治疗可以具有一种或多种相关AE，每种AE可以具有相同或不同水平的严重程度。提及能够“改变不良事件”的方法表示该治疗方案降低了与使用不同治疗方案有关的一种或多种AE的发生率和/或严重性。在用于本文时，“过度增殖性疾病”指细胞生长超出正常水平的疾患。例如，过度增殖性疾病或病症包括恶性疾病(例如食道癌、结肠癌、胆癌)和非恶性疾病(例如动脉粥样硬化、良性增生、良性前列腺肥大)。在用于本文时，“亚治疗剂量”表示治疗化合物(例如抗体)的剂量低于单独施用该治疗化合物用于治疗过度增殖性疾病(例如癌症)时惯常或典型的剂量。例如，亚治疗剂量的CTLA-4抗体为少于约3mg/kg(即抗CTLA-4抗体的已知剂量)的单剂抗体。使用可选的(例如“或”)应理解为表示可选项的任一项、全部两项或其任意组合。在用于本文时，“一个”或“一种”应当理解为指“一个或多个”或“一种或多种”任何述及或列举的成分。在用于本文时，“约”或“基本含有”表示在本领域普通技术人员判定的对特定值可以接受的误差范围内，其部分取决于如何测量或测定该值，即测量系统的限制。例如，“约”或“基本含有”按照本领域实践可以表示1倍或超过1倍标准偏差以内。或者，“约”或“基本含有”可以表示多至20％的范围。此外，特别对于生物学系统或方法，该术语可以表示多至一个数量级或多至某值的5倍。当本申请或权利要求中给出特定值时，除非另有说明，“约”或“基本含有”的含义应认为是在该特定值可接受的误差范围内。如本文中所述，除非另有说明，任何浓度范围、百分比范围、比率范围或整数范围都应理解为包括所述范围内的任意整数值，而且在合适的时候包括其分数(诸如整数的十分之一和百分之一)。在用于本文时，术语“受试者”包括任何人类或非人动物。术语“非人动物”包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，诸如非人灵长类、绵羊、犬、猫、马、牛、鸡、两栖动物、爬行动物等。除非标明，术语“患者”或“受试者”可以互换使用。本发明的各个方面将在下述分部中进一步详细描述。抗PD-1抗体本发明抗体的特征在于抗体的特定功能特征或特性。例如，所述抗体与PD-1特异性结合(例如与人PD-1结合且可以与来自其它物种诸如猕猴的PD-1交叉反应)。优选的是，本发明的抗体以高亲和力，例如以1x10-7M或更小的KD与PD-1结合。本发明的抗PD-1抗体优选展现出一种或多种下列特征：(a)以1x10-7M或更小的KD与人PD-1结合；(b)不显著与CD28、CTLA-4或ICOS结合；(c)在混合淋巴细胞反应(MLR)测定法中增加T细胞增殖；(d)在MLR测定法中增加干扰素-γ的产量；(e)在MLR测定法中增加IL-2的分泌；(f)与人PD-1和猕猴PD-1结合；(g)抑制PD-L1和/或PD-L2与PD-1的结合；(h)刺激抗原特异性记忆应答；(i)刺激抗体应答；(j)抑制体内肿瘤细胞生长。优选的是，所述抗体以5x10-8M或更小的KD与人PD-1结合，以1x10-8M或更小的KD与人PD-1结合，以5x10-9M或更小的KD与人PD-1结合，或以1x10-8M和1x10-10M之间或更小的KD与人PD-1结合。本发明的抗体可展现出上述特征的任意组合，诸如两个、三个、四个、五个或更多个上述特征。评估抗体对PD-1的结合能力的标准测定法是本领域公知的，包括例如ELISA、Western印迹和RIA。抗体的结合动力学(例如结合亲和力)也可以通过本领域已知的标准测定法来评估，诸如通过Biacore分析。实施例中详细描述了适于评估任何上述特征的测定法。单克隆抗体17D8、2D3、4H1、5C4、4A11、7D3和5F4本发明优选的抗体是人单克隆抗体17D8、2D3、4H1、5C4、4A11、7D3和5F4，其分离及结构表征如实施例1和2中所述。17D8、2D3、4H1、5C4、4A11、7D3和5F4的VH氨基酸序列分别如SEQIDNOs:1、2、3、4、5、6和7中所示。17D8、2D3、4H1、5C4、4A11、7D3和5F4的VL氨基酸序列分别如SEQIDNOs:8、9、10、11、12、13和14中所示。倘若这些抗体中每个都能与PD-1结合，那么VH和VL序列可以“混合和匹配”以创造本发明的其它抗PD-1结合分子。可以使用上文和实施例中所述的结合测定法(例如ELISA)来测试PD-1与此类“混合和匹配”抗体的结合。优选的是，当VH和VL链混合和匹配时，来自特定VH/VL配对的VH序列用结构类似的VH序列替换。同样的，优选来自特定VH/VL配对的VL序列用结构类似的VL序列替换。因此，在一方面，本发明提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含：(a)重链可变区，其包含选自SEQIDNOs:1、2、3、4、5、6和7的氨基酸序列；和(b)轻链可变区，其包含选自SEQIDNOs:8、9、10、11、12、13和14的氨基酸序列；其中所述抗体与PD-1，优选人PD-1特异性结合。优选的重链和轻链组合包含：(a)重链可变区，其包含SEQIDNO:1的氨基酸序列；和(b)轻链可变区，其包含SEQIDNO:8的氨基酸序列；或(a)重链可变区，其包含SEQIDNO:2的氨基酸序列；和(b)轻链可变区，其包含SEQIDNO:9的氨基酸序列；或(a)重链可变区，其包含SEQIDNO:3的氨基酸序列；和(b)轻链可变区，其包含SEQIDNO:10的氨基酸序列；或(a)重链可变区，其包含SEQIDNO:4的氨基酸序列；和(b)轻链可变区，其包含SEQIDNO:11的氨基酸序列；或(a)重链可变区，其包含SEQIDNO:5的氨基酸序列；和(b)轻链可变区，其包含SEQIDNO:12的氨基酸序列；或(a)重链可变区，其包含SEQIDNO:6的氨基酸序列；和(b)轻链可变区，其包含SEQIDNO:13的氨基酸序列；或(a)重链可变区，其包含SEQIDNO:7的氨基酸序列；和(b)轻链可变区，其包含SEQIDNO:14的氨基酸序列。在另一方面，本发明提供了包含17D8、2D3、4H1、5C4、4A11、7D3和5F4的重链和轻链CDR1、CDR2和CDR3，或其组合的抗体。17D8、2D3、4H1、5C4、4A11、7D3和5F4的VHCDR1的氨基酸序列分别如SEQIDNOs:15、16、17、18、19、20和21所示。17D8、2D3、4H1、5C4、4A11、7D3和5F4的VHCDR2的氨基酸序列分别如SEQIDNOs:22、23、24、25、26、27和28所示。17D8、2D3、4H1、5C4、4A11、7D3和5F4的VHCDR3的氨基酸序列分别如SEQIDNOs:29、30、31、32、33、34和35所示。17D8、2D3、4H1、5C4、4A11、7D3和5F4的VKCDR1的氨基酸序列分别如SEQIDNOs:36、37、38、39、40、41和42所示。17D8、2D3、4H1、5C4、4A11、7D3和5F4的VKCDR2的氨基酸序列分别如SEQIDNOs:43、44、45、46、47、48和49所示。17D8、2D3、4H1、5C4、4A11、7D3和5F4的VKCDR3的氨基酸序列分别如SEQIDNOs:50、51、52、53、54、55和56所示。使用Kabat系统标示出CDR区(Kabat,E.A.等人(1991)SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,FifthEdition,U.S.DepartmentofHealthandHumanServices,NIHPublicationNo.91-3242)。倘若这些抗体中每个都能与PD-1结合且抗原结合特异性主要由CDR1、CDR2和CDR3区提供，那么VHCDR1、CDR2和CDR3序列和VKCDR1、CDR2和CDR3序列可以“混合和匹配”(即来自不同抗体的CDR可以混合和匹配，虽然每个抗体必需包含VHCDR1、CDR2和CDR3及VKCDR1、CDR2和CDR3)以创造本发明的其它抗PD-1结合分子。可以使用上文和实施例中所述的结合测定法(例如ELISA、Biacore分析)来测试PD-1与此类“混合和匹配”抗体的结合。优选的是，当混合和匹配VHCDR序列时，来自特定VH序列的CDR1、CDR2和/或CDR3序列用结构类似的CDR序列替换。同样的，当混合和匹配VKCDR序列时，来自特定VK序列的CDR1、CDR2和/或CDR3序列用结构类似的CDR序列替换。对于本领域普通技术人员而言显而易见的是，可以将一个或多个VH和/或VLCDR区序列用来自本文关于单克隆抗体17D8、2D3、4H1、5C4、4A11、7D3和5F4所公开的CDR序列的结构类似序列替换以创造新的VH和VL序列。因此，在另一方面，本发明提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含：(a)重链可变区CDR1，其包含选自SEQIDNOs:15、16、17、18、19、20和21的氨基酸序列；(b)重链可变区CDR2，其包含选自SEQIDNOs:22、23、24、25、26、27和28的氨基酸序列；(c)重链可变区CDR3，其包含选自SEQIDNOs:29、30、31、32、33、34和35的氨基酸序列；(d)轻链可变区CDR1，其包含选自SEQIDNOs:36、37、38、39、40、41和42的氨基酸序列；(e)轻链可变区CDR2，其包含选自SEQIDNOs:43、44、45、46、47、48和49的氨基酸序列；和(f)轻链可变区CDR3，其包含选自SEQIDNOs:50、51、52、53、54、55和56的氨基酸序列；其中所述抗体与PD-1，优选人PD-1特异性结合。在一优选的实施方式中，抗体包含：(a)重链可变区CDR1，其包含SEQIDNO:15；(b)重链可变区CDR2，其包含SEQIDNO:22；(c)重链可变区CDR3，其包含SEQIDNO:29；(d)轻链可变区CDR1，其包含SEQIDNO:36；(e)轻链可变区CDR2，其包含SEQIDNO:43；和(f)轻链可变区CDR3，其包含SEQIDNO:50。在另一优选的实施方式中，所述抗体包含：(a)重链可变区CDR1，其包含SEQIDNO:16；(b)重链可变区CDR2，其包含SEQIDNO:23；(c)重链可变区CDR3，其包含SEQIDNO:30；(d)轻链可变区CDR1，其包含SEQIDNO:37；(e)轻链可变区CDR2，其包含SEQIDNO:44；和(f)轻链可变区CDR3，其包含SEQIDNO:51。在另一优选的实施方式中，所述抗体包含：(a)重链可变区CDR1，其包含SEQIDNO:17；(b)重链可变区CDR2，其包含SEQIDNO:24；(c)重链可变区CDR3，其包含SEQIDNO:31；(d)轻链可变区CDR1，其包含SEQIDNO:38；(e)轻链可变区CDR2，其包含SEQIDNO:45；和(f)轻链可变区CDR3，其包含SEQIDNO:52。在另一优选的实施方式中，所述抗体包含：(a)重链可变区CDR1，其包含SEQIDNO:18；(b)重链可变区CDR2，其包含SEQIDNO:25；(c)重链可变区CDR3，其包含SEQIDNO:32；(d)轻链可变区CDR1，其包含SEQIDNO:39；(e)轻链可变区CDR2，其包含SEQIDNO:46；和(f)轻链可变区CDR3，其包含SEQIDNO:53。在另一优选的实施方式中，所述抗体包含：(a)重链可变区CDR1，其包含SEQIDNO:19；(b)重链可变区CDR2，其包含SEQIDNO:26；(c)重链可变区CDR3，其包含SEQIDNO:33；(d)轻链可变区CDR1，其包含SEQIDNO:40；(e)轻链可变区CDR2，其包含SEQIDNO:47；和(f)轻链可变区CDR3，其包含SEQIDNO:54。具有特定种系序列的抗体在某些实施方式中，本发明的抗体包含来自特定种系重链免疫球蛋白基因的重链可变区和/或来自特定种系轻链免疫球蛋白基因的轻链可变区。例如，在一优选的实施方式中，本发明提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含产自或源自人VH3-33基因的重链可变区，其中所述抗体与PD-1，优选人PD-1特异性结合。在另一优选的实施方式中，本发明提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含产自或源自人VH4-39基因的重链可变区，其中所述抗体与PD-1，优选人PD-1特异性结合。在又一优选的实施方式中，本发明提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含产自或源自人VKL6基因的轻链可变区，其中所述抗体与PD-1，优选人PD-1特异性结合。在又一优选的实施方式中，本发明提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含产自或源自人VKL15基因的轻链可变区，其中所述抗体与PD-1，优选人PD-1特异性结合。在又一优选的实施方式中，本发明提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体：(a)包含产自或源自人VH3-33或4-39基因的重链可变区(该基因分别编码SEQIDNO:71或73中所示的氨基酸序列)；(b)包含产自或源自人VKL6或L15基因的轻链可变区(该基因分别编码SEQIDNO:72或74中所示的氨基酸序列)；且(c)与PD-1特异性结合。VH和VK分别为VH3-33和VKL6的抗体的实例为17D8、2D3、4H1、5C4和7D3。VH和VK分别为VH4-39和VKL15的抗体的实例为4A11和5F4。在用于本文时，如果人抗体的重链或轻链可变区得自使用特定人种系免疫球蛋白基因的系统，那么所述抗体包含“产自”或“源自”所述种系序列的可变区。此类系统包括用目标抗原免疫携带人免疫球蛋白基因的转基因小鼠或用目标抗原筛选噬菌体展示的人免疫球蛋白基因库。鉴定“产自”或“源自”人种系免疫球蛋白序列的人抗体可以通过比较人抗体的氨基酸序列与人种系免疫球蛋白的氨基酸序列，然后选择在序列上与人抗体序列最接近(即最大％同一性)的人种系免疫球蛋白序列。由于例如天然发生的体细胞突变或故意引入的定点突变，“产自”或“源自”特定人种系免疫球蛋白序列的人抗体与种系序列相比可以包含氨基酸差异。然而，所选人抗体通常与人种系免疫球蛋白基因所编码的氨基酸序列具有至少90％的氨基酸序列同一性，而且包含在与其它物种的种系免疫球蛋白氨基酸序列(例如鼠种系序列)相比时将人抗体鉴定为人的氨基酸残基。在某些情况下，人抗体可以与种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列具有至少95％，或甚至至少96％、97％、98％或99％的氨基酸序列同一性。通常，源自特定人种系序列的人抗体与人种系免疫球蛋白基因所编码的氨基酸序列之间的氨基酸差异不超过10个。在某些情况下，人抗体与种系免疫球蛋白基因所编码的氨基酸序列之间的氨基酸差异可以不超过5个，或甚至不超过4个、3个、2个或1个。同源抗体在又一方面，本发明抗体包含的重链和轻链可变区所包含的氨基酸序列与本文所述的优选抗体的氨基酸序列同源，且其中所述抗体保留了本发明抗PD-1抗体的期望的功能特性。例如，本发明提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含重链可变区和轻链可变区，其中：(a)所述重链可变区包含与选自SEQIDNOs:1、2、3、4、5、6和7的氨基酸序列至少80％同源的氨基酸序列；(b)所述轻链可变区包含与选自SEQIDNOs:8、9、10、11、12、13和14的氨基酸序列至少80％同源的氨基酸序列；且所述抗体展现出一种或多种下述特性：(c)所述抗体以1x10-7M或更小的KD与人PD-1结合；(d)所述抗体不显著与人CD28、CTLA-4或ICOS结合；(e)所述抗体在MLR测定法中增加T细胞的增殖；(f)所述抗体在MLR测定法中增加干扰素-γ的产量；(g)所述抗体在MLR测定法中增加IL-2的分泌；(h)所述抗体与人PD-1和猕猴PD-1结合；(i)所述抗体抑制PD-L1和/或PD-L2与PD-1的结合；(j)所述抗体刺激抗原特异性记忆应答；(k)所述抗体刺激抗体应答；(l)所述抗体抑制体内肿瘤细胞生长。在其它实施方式中，VH和/或VL氨基酸序列可以与上述序列具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同源性。VH和VL区与上述序列的VH和VL区具有高(即80％或更高)同源性的抗体可以通过诱变(例如定点诱变或PCR介导的诱变)编码SEQIDNOs:57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69和70的核酸分子，然后使用本文所述的功能测定法对所编码的改变后的抗体测试所保留的功能(即上述(c)到(l)所示的功能)获得。在用于本文时，两氨基酸序列之间的百分比同源性等于两序列之间的百分比同一性。两序列间的百分比同一性为序列共有的相同位置数的函数(即％同源性＝相同位置数/位置总数x100)，其中需考虑产生两序列的最优比对需要引入的缺口数和每个缺口的长度。如下述非限制性实施例所示，可以使用数学算法完成序列的比较和两序列间百分比同一性的测定。可以使用E.Meyers和W.Miller的算法(Comput.Appl.Biosci.,4:11-17(1988))测定两氨基酸序列间的百分比同一性，该算法已收入到ALIGN程序(版本2.0)中，其使用PAM120残基权重表，缺口长度罚分为12，缺口罚分为4。此外，可以使用Needleman和Wunsch的算法(J.Mol.Biol.48:444-453(1970))测定两氨基酸序列间的百分比同一性，该算法已掺入到GCG软件包(可在www.gcg.com获得)中的GAP程序中，其使用Blossum62矩阵或PAM250矩阵，缺口权重为16、14、12、10、8、6或4，长度权重为1、2、3、4、5或6。另外/或者，本发明的蛋白质序列可以进一步用作“查询序列”对公用数据库进行搜索以例如鉴定相关序列。此类搜索可以使用Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215:403-10的XBLAST程序(版本2.0)进行。可以采用XBLAST程序以得分＝50，词长＝3进行BLAST蛋白质搜索以获得与本发明抗体分子同源的氨基酸序列。为获得用于比较的含缺口的比对结果，如Altschul等人(1997)NucleicAcidsRes.25(17):3389-3402所述使用GappedBLAST。当使用BLAST和GappedBLAST程序时，可以使用各程序(例如XBLAST和NBLAST)的缺省参数。(参见www.ncbi.nlm.nih.gov)。具有保守修饰的抗体在某些实施方式中，本发明的抗体包含含有CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区和含有CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区，其中这些CDR序列中的一个或多个包含基于本文所述优选抗体(例如17D8、2D3、4H1、5C4、4A11、7D3或5F4)的特定氨基酸序列或其保守修饰，且其中所述抗体保留了本发明抗PD-1抗体的期望的功能特性。因此，本发明提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含含有CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区和含有CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区，其中：(a)所述重链可变区CDR3序列包含选自SEQIDNOs:29、30、31、32、33、34和35所示氨基酸序列及其保守修饰的氨基酸序列；(b)所述轻链可变区CDR3序列包含选自SEQIDNOs:50、51、52、53、54、55和56所示氨基酸序列及其保守突变的氨基酸序列；且所述抗体展现出一种或多种下述特性：(c)所述抗体以1x10-7M或更小的KD与人PD-1结合；(d)所述抗体不显著与人CD28、CTLA-4或ICOS结合；(e)所述抗体在MLR测定法中增加T细胞的增殖；(f)所述抗体在MLR测定法中增加干扰素-γ的产量；(g)所述抗体在MLR测定法中增加IL-2的分泌；(h)所述抗体与人PD-1和猕猴PD-1结合；(i)所述抗体抑制PD-L1和/或PD-L2与PD-1的结合；(j)所述抗体刺激抗原特异性记忆应答；(k)所述抗体刺激抗体应答；(l)所述抗体抑制体内肿瘤细胞生长。在一优选的实施方式中，所述重链可变区CDR2序列包含选自SEQIDNOs:22、23、24、25、26、27和28所示氨基酸序列及其保守修饰的氨基酸序列；所述轻链可变区CDR2序列包含选自SEQIDNOs:43、44、45、46、47、48和49所示氨基酸序列及其保守修饰的氨基酸序列。在另一优选的实施方式中，所述重链可变区CDR1序列包含选自SEQIDNOs:15、16、17、18、19、20和21所示氨基酸序列及其保守修饰的氨基酸序列；所述轻链可变区CDR1序列包含选自SEQIDNOs:36、37、38、39、40、41和42所示氨基酸序列及其保守修饰的氨基酸序列。在用于本文时，术语“保守序列修饰”意图指氨基酸修饰不会显著影响或改变含有该氨基酸序列的抗体的结合特征。此类保守修饰包括氨基酸的取代、添加和缺失。修饰可以通过本领域已知的标准技术，例如定点诱变和PCR介导的优点引入到本发明的抗体中。保守氨基酸取代指氨基酸残基用具有类似侧链的氨基酸残基替换。本领域中对具有类似侧链的氨基酸残基家族已有详细说明。这些家族包括具有碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β-分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，可以用来自同一侧链家族的其它氨基酸残基替换本发明抗体CDR区中的一个或多个氨基酸残基，并使用本文所述的功能测定法对改变后的抗体测试保留的功能(即上述(c)至(l)所示的功能)。与本发明的抗PD-1抗体结合相同表位的抗体在另一实施方式中，本发明提供了与本发明的任何PD-1单克隆抗体结合人PD-1上相同表位的抗体(即能够与本发明的任何单克隆抗体交叉竞争与PD-1的结合的抗体)。在优选的实施方式中，用于交叉竞争研究的参照抗体可以是单克隆抗体17D8(具有分别如SEQIDNOs:1和8所示的VH和VL序列)或单克隆抗体2D3(具有分别如SEQIDNOs:2和9所示的VH和VL序列)或单克隆抗体4H1(具有分别如SEQIDNOs:3和10所示的VH和VL序列)或单克隆抗体5C4(具有分别如SEQIDNOs:4和11所示的VH和VL序列)或单克隆抗体4A11(具有分别如SEQIDNOs:5和12所示的VH和VL序列)或单克隆抗体7D3(具有分别如SEQIDNOs:6和13所示的VH和VL序列)或单克隆抗体5F4(具有分别如SEQIDNOs:7和14所示的VH和VL序列)。此类交叉竞争性抗体可以根据它们在标准PD-1结合测定法中与17D8、2D3、4H1、5C4、4A11、7D3或5F4交叉竞争的能力进行鉴定。例如，可使用BIAcore分析、ELISA测定法或流式细胞计量术来证明与本发明抗体的交叉竞争。受试抗体抑制例如17D8、2D3、4H1、5C4、4A11、7D3或5F4与人PD-1结合的能力证明了受试抗体能够与17D8、2D3、4H1、5C4、4A11、7D3或5F4竞争与人PD-1的结合，因此与17D8、2D3、4H1、5C4或4A11结合人PD-1上的相同表位。在一优选的实施方式中，与17D8、2D3、4H1、5C4、4A11、7D3或5F4结合人PD-1上的相同表位的抗体是人单克隆抗体。此类人单克隆抗体可以如实施例中所述的进行制备和分离。工程改造的和修饰的抗体本发明的抗体进一步可以使用具有一个或多个本文所公开的VH和/或VL序列的抗体作为起始材料来工程改造修饰后的抗体进行制备，其中所述修饰后的抗体可以具有与起始抗体不同的特性。抗体可以通过修饰一个或全部两个可变区(即VH和/或VL)中，例如一个或多个CDR区中和/或一个或多个框架区中的一个或多个残基来进行工程改造。另外/或者，抗体可以通过修饰恒定区中的残基以例如改变抗体的效应器功能来进行工程改造。可以进行的一类可变区工程改造是CDR嫁接。抗体与靶抗原相互作用主要是通过位于六个重链和轻链互补决定区(CDR)中的氨基酸残基。因为这个原因，抗体个体间CDR中的氨基酸序列的差异比CDR外序列的大。因为CDR序列负责大部分抗体－抗原相互作用，所以有可能通过构建表达载体来表达模拟特定天然存在抗体性质的重组抗体，该表达载体包含来自特定天然存在抗体的CDR序列，其嫁接到来自具有不同特性的不同抗体的框架序列上(参见例如Riechmann,L.等人(1998)Nature332:323-327；Jones,P.等人(1986)Nature321:522-525；Queen,C.等人(1989)Proc.Natl.Acad.See.U.S.A.86:10029-10033；Winter的美国专利No.5,225,539及Queen等人的美国专利Nos.5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370)。因此，本发明的另一实施方式涉及分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其所含重链可变区包含的CDR1、CDR2和CDR3序列分别包含选自SEQIDNOs:15、16、17、18、19、20和21，SEQIDNOs:22、23、24、25、26、27和28，及SEQIDNOs:29、30、31、32、33、34和35的氨基酸序列，其所含轻链可变区包含的CDR1、CDR2和CDR3序列分别包含选自SEQIDNOs:36、37、38、39、40、41和42，SEQIDNOs:43、44、45、46、47、48和49，及SEQIDNOs:50、51、52、53、54、55和56的氨基酸序列。因此，此类抗体包含单克隆抗体17D8、2D3、4H1、5C4、4A11、7D3或5F4的VH和VLCDR序列，但可以包含与这些抗体不同的框架序列。此类框架序列可以从包括种系抗体基因序列的公共DNA数据库或已发表的文献中获得。例如，人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可以在“VBase”人种系序列数据库(可以通过互联网在www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase上获得)和Kabat,E.A.等人(1991)SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,FifthEdition,U.S.DepartmentofHealthandHumanServices,NIHPublicationNo.91-3242；Tomlinson,I.M.等人(1992)"TheRepertoireofHumanGermlineVHSequencesRevealsaboutFiftyGroupsofVHSegmentswithDifferentHypervariableLoops"J.Mol.Biol.227:776-798；和Cox,J.P.L.等人(1994)"ADirectoryofHumanGerm-lineVHSegmentsRevealsaStrongBiasintheirUsage"Eur.J.Immunol.24:827-836中找到；其每一篇的内容均通过参考清楚的收入。作为另一实例，人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可以在GenBank数据库中找到。例如，下列在HCo7HuMAb小鼠中发现的重链种系序列可以通过附带的GenBank编号获得：1-69(NG_0010109,NT_024637和BC070333),3-33(NG_0010109和NT_024637)和3-7(NG_0010109和NT_024637)。作为另一实例，下列在HCo12HuMAb小鼠中发现的重链种系序列可以通过附带的GenBank编号获得：1-69(NG_0010109,NT_024637和BC070333),5-51(NG_0010109和NT_024637),4-34(NG_0010109和NT_024637),3-30.3(AJ556644)和3-23(AJ406678)。本发明抗体中所用的优选的框架序列是那些与本发明所选抗体所使用的框架序列结构类似的框架序列，例如与本发明优选的单克隆抗体所用的VH3-33框架序列(SEQIDNO:71)和/或VH4-39框架序列(SEQIDNO:73)和/或VKL6框架序列(SEQIDNO:72)和/或VKL15框架序列(SEQIDNO:74)类似。VHCDR1、CDR2和CDR3序列及VKCDR1、CDR2和CDR3序列可以嫁接到框架区上，其具有与衍生该框架序列的种系免疫球蛋白基因中所发现的序列相同的序列，或者CDR序列可以嫁接到与种系序列相比包含一处或多处突变的框架区上。例如，已经发现在某些情况中在框架区中突变残基对于保持或增强抗体的抗原结合能力是有益的(参见例如Queen等人的美国专利Nos.5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370)。另一类可变区修饰是突变VH和/或VKCDR1、CDR2和/或CDR3区中的氨基酸残基以改进目的抗体的一种或多种结合特性(例如亲和力)。可以通过定点诱变或PCR介导的诱变来导入突变，对抗体结合或其它感兴趣的功能特性的影响可以通过本文所述的和实施例中所提供的体外或体内测定法进行评测。优选导入(如上所述的)保守修饰。突变可以是氨基酸的取代、添加或缺失，但是优选为取代。此外，CDR区中残基变化通常不超过一个、两个、三个、四个或五个。因此，在另一实施方式中，本发明提供了分离的抗PD-1单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含的重链可变区包含：(a)VHCDR1区，其含有选自SEQIDNOs:15、16、17、18、19、20和21或与SEQIDNOs:15、16、17、18、19、20和21相比具有一个、两个、三个、四个或五个氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列的氨基酸序列；(b)VHCDR2区，其含有选自SEQIDNOs:22、23、24、25、26、27和28或与SEQIDNOs:22、23、24、25、26、27和28相比具有一个、两个、三个、四个或五个氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列的氨基酸序列；(c)VHCDR3区，其含有选自SEQIDNOs:29、30、31、32、33、34和35或与SEQIDNOs:29、30、31、32、33、34和35相比具有一个、两个、三个、四个或五个氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列的氨基酸序列；(d)VKCDR1区，其含有选自SEQIDNOs:36、37、38、39、40、41和42或与SEQIDNOs:36、37、38、39、40、41和42相比具有一个、两个、三个、四个或五个氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列的氨基酸序列；(e)VKCDR2区，其含有选自SEQIDNOs:43、44、45、46、47、48和49或与SEQIDNOs:43、44、45、46、47、48和49相比具有一个、两个、三个、四个或五个氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列的氨基酸序列；(f)VKCDR3区，其含有选自SEQIDNOs:50、51、52、53、54、55和56或与SEQIDNOs:50、51、52、53、54、55和56相比具有一个、两个、三个、四个或五个氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列的氨基酸序列。本发明的工程改造的抗体包括那些VH和/或VK中框架残基进行了修饰以例如改进抗体特性的抗体。通常进行此类框架修饰以降低抗体的免疫原性。例如，一种方法是“回复突变(backmutate)”一个或多个框架残基为相应的种系序列。更具体的说，发生体细胞突变的抗体可以含有与衍生该抗体的种系序列不同的框架残基。可以通过比较抗体框架序列和衍生该抗体的种系序列来鉴定此类残基。例如，下文表1显示了抗PD-1抗体17D8、2D3、4H1、5C4、4A11、7D3和5F4的框架区中与重链亲本种系序列不同的氨基酸改变的数目。为使框架区序列中的一个或多个氨基酸残基回归它们的种系构造，可以通过例如定点诱变或PCR介导的诱变将体细胞突变“回复突变”为种系序列。氨基酸改变可以发生在抗PD-1抗体中与轻链亲本种系序列不同的框架区中。例如，对于17D8，VK的氨基酸残基#47(FR2中)是异亮氨酸，但是相应的VKL6种系序列中该残基为亮氨酸。为使框架区序列回归它们的种系构造，可以通过例如定点诱变或PCR介导的诱变将体细胞突变“回复突变”为种系序列(例如18D7的VK的残基#47(FR2的残基#13)可以从异亮氨酸“回复突变”为亮氨酸)。作为另一实例，对于4A11，VK的氨基酸残基#20(FR1中)是丝氨酸，但是相应的VKL15种系序列中该残基为苏氨酸。为使框架区序列回归它们的种系构造，例如，4A11的VK的残基#20可以从丝氨酸“回复突变”为苏氨酸。此类“回复突变”抗体也意图涵盖在本发明的范围中。17D8、2D3、4H1、5C4和7D3的VH区与亲本种系VH3-33序列的比对结果如图8所示。4A11和5F4的VH区与亲本种系VH4-39序列的比对结果如图11所示。表1.重链种系构造向抗体17D8、2D3、4H1、5C4、4A11、7D3和5F4的突变抗PD-1抗体氨基酸位置抗体的氨基酸种系构造的原始氨基酸17D810DG16GR27VF28AT78MT93MV2D310DG27LF30TS85NS98TR4H13YQ84TN88VA98SR5C421DS23KA27IF80FY98TR4A1129LI79QH98VA7D323TA24TA27IF70LI74DN97VA98TR5F423ST29LI51AG77RK另一类框架修饰牵涉突变框架区中，或甚至一个或多个CDR区中的一个或多个残基以除去T细胞表位从而降低抗体潜在的免疫原性。该途径又称为“去免疫(deimmunization)”，进一步详细记载于Carr等人的公开号为No.20030153043的美国专利中。在框架区或CDR区中进行的修饰的另外的或可选的，可以工程改造本发明的抗体以在Fc区中包含修饰，这通常用于改变抗体的一种或多种功能特性，诸如血清半衰期、补体固定、Fc受体结合和/或抗体依赖性细胞的细胞毒性。此外，本发明的抗体可以进行化学修饰(例如在抗体上附着一个或多个化学模块)或者进行修饰以改变其糖基化，再次用于改变抗体的一种或多种功能特性。下文将进一步详细描述这些实施方式中的每一个。Fc区中残基的编号方式为Kabat的EU索引的编号方式。在一实施方式中，修饰CH1的铰链区以使铰链区中半胱氨酸残基的数目改变，例如增加或减少。该方法进一步记载于Bodmer等人的美国专利No.5,677,425中。改变CH1铰链区中半胱氨酸残基的数目以例如便于轻链和重链的组装或提高或降低抗体的稳定性。在另一实施方式中，突变抗体的Fc铰链区以缩短抗体的生物学半衰期。更具体的说，向Fc－铰链片段的CH2－CH3结构域界面区引入一个或多个氨基酸突变，从而使得抗体具有相对于天然Fc－铰链结构域SpA结合而言削弱了的葡萄球菌蛋白A(SpA)结合。该方法进一步详细记载于Ward等人的美国专利No.6,165,745中。在另一实施方式中，修饰抗体以延长其生物学半衰期。有多种方法是可行的。例如，如Ward的美国专利No.6,277,375中所述，引入一个或多个下述突变：T252L、T254S、T256F。或者，如Presta等人的美国专利Nos.5,869,046和6,121,022中所述，为延长生物学半衰期，抗体可以在CH1或CL区中进行改变以包含补救受体(salvagereceptor)结合表位，该表位取自IgG的Fc区的CH2结构域的两个环。在其它实施方式中，通过替换至少一个氨基酸残基为不同的氨基酸残基改变Fc区以改变抗体的效应器功能。例如，可以将选自氨基酸残基234、235、236、237、297、318、320和322的一个或多个氨基酸替换为不同的氨基酸残基以使得抗体对效应器配体具有改变的亲和力，但是保留亲本抗体的抗原结合能力。对之亲和力改变的效应器配体可以是例如Fc受体或补体的C1组分。该方法进一步详细记载于Winter等人的美国专利No.5,624,821和5,648,260中。在另一实例中，可以将选自氨基酸残基329、331和322的一个或多个氨基酸替换为不同的氨基酸残基以使得抗体具有改变的C1q结合和/或降低或消除了的补体依赖性细胞毒性(CDC)。该方法进一步详细记载于Idusogie等人的美国专利No.6,194,551中。在另一实例中，可以改变氨基酸位置231和239中的一个或多个氨基酸残基以改变抗体固定补体的能力。该方法进一步记载于Bodmer等人的PCT公开文本WO94/29351中。在又一实例中，修饰Fc区以提高抗体介导抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)的能力和/或提高抗体对Fcγ受体的亲和力，其通过修饰一个或多个下述位置的氨基酸：238、239、248、249、252、254、255、256、258、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、301、303、305、307、309、312、315、320、322、324、326、327、329、330、331、333、334、335、337、338、340、360、373、376、378、382、388、389、398、414、416、419、430、434、435、437、438或439。该方法进一步记载于Presta等人的PCT公开文本WO00/42072中。此外，人IgG1上供FcγR1、FcγRII、FcγIII和FcRn的结合位点已被定位，具有改良的结合的变体已有记载(参见Shields,R.L.等人(2001)J.Biol.Chem.276:6591-6604)。已显示在位置256、290、298、333、334和339的特定突变可改善与FcγRIII的结合。此外，已显示下列突变组合可改善FcγRIII结合：T256A/S298A、S298A/E333A、S298A/K224A和S298A/E333A/K334A。在又一实施方式中，修饰抗体的糖基化。例如可以制备无糖基化的(aglycoslated)抗体(即抗体缺少糖基化)。可以改变糖基化以例如提高抗体对抗原的亲和力。此类碳水化合物修饰可以通过例如改变抗体序列中的一个或多个糖基化位点来实现。例如，进行一个或多个氨基酸的取代以除去一个或多个可变区框架糖基化位点，进而除去该位点的糖基化。此类无糖基化可以提高抗体对抗原的亲和力。该方法进一步详细记载于Co等人的美国专利Nos.5,714,350和6,350,861中。另外/或者，可以制备糖基化类型改变的抗体，诸如所含岩藻糖残基数量减少的低岩藻糖化的(hypofucosylated)抗体或所含等分GlcNac结构增加的抗体。已证明此类改变的糖基化模式可以提高抗体的ADCC能力。此类碳水化合物修饰可以通过例如在具有改变的糖基化体系(glycosylationmachinery)的宿主细胞中表达抗体来实现。具有改变的糖基化体系的细胞在本领域已有记载，可作为表达本发明重组抗体的宿主细胞用于生产糖基化改变的抗体。例如，细胞系Ms704、Ms705和Ms709缺少岩藻糖基转移酶基因，FUT8(α(1,6)岩藻糖基转移酶)，因此Ms704、Ms705和Ms709细胞系中表达的抗体在它们的碳水化合物上缺少岩藻糖。Ms704、Ms705和Ms709FUT8-/-细胞系可以通过使用两个置换载体靶向破坏CHO/DG44细胞中的FUT8基因进行创建(参见Yamane等人的美国专利公开文本No.20040110704和Yamane-Ohnuki等人(2004)BiotechnolBioeng87:614-22)。作为另一实例，Hanai等人的EP1,176,195描述了编码岩藻糖基转移酶的FUT8基因遭到功能性破坏的细胞系，因此在这样的细胞系中表达的抗体展现出由于减少或消除α1,6键相关酶所导致的低岩藻糖化(hypofucosylation)。Hanai等人还描述了具有较低的用于添加岩藻糖到与抗体Fc区结合的N-乙酰葡糖胺的酶活性或者没有酶活性的细胞系，例如大鼠骨髓瘤细胞系YB2/0(ATCCCRL1662)。Presta的PCT公开文本WO03/035835描述了变异的CHO细胞系，Lec13细胞，其所具有的将岩藻糖附着于Asn(297)连接的碳水化合物的能力减弱，还导致该宿主细胞中表达的抗体低岩藻糖化(也参见Shields,R.L.等人(2002)J.Biol.Chem.277:26733-26740)。Umana等人的PCT公开文本WO99/54342描述了经工程改造而表达修饰糖蛋白的糖基转移酶(例如β(1,4)-N-乙酰葡糖胺基转移酶III(GnTIII))的细胞系，使得经工程改造的细胞系中表达的抗体展现出等分GlcNac结构增加，其导致抗体的ADCC活性提高(也参见Umana等人(1999)Nat.Biotech.17:176-180)。或者，可以使用岩藻糖苷酶切除抗体的岩藻糖残基。例如，岩藻糖苷酶α-L-岩藻糖苷酶从抗体中切除岩藻糖残基(Tarentino,A.L.等人(1975)Biochem.14:5516-23)。本发明所设想的本文抗体的另一修饰是PEG化。抗体可以PEG化以例如延长抗体的生物学(例如血清)半衰期。为PEG化抗体，通常在使得一个或多个PEG基团附着于抗体或抗体片段的条件下将抗体或其片段与聚乙二醇(PEG)，诸如PEG的反应性酯或醛衍生物进行反应。优选的是，PEG化可以通过与反应性PEG分子(或类似的反应性水溶性聚合物)的酰化反应或烷化反应进行。在用于本文时，术语“聚乙二醇”意图包括任何形式的已经用于衍生化其它蛋白质的PEG，诸如单(C1-C10)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇或聚乙二醇-马来酰亚胺。在某些实施方式中，待PEG化的抗体是无糖基化的抗体。PEG化蛋白质的方法是本领域已知的，可以用于本发明的抗体。参见例如Nishimura等人的EP0154316和Ishikawa等人的EP0401384。工程改造抗体的方法如上所述，可以使用具有本文所公开的VH和VK序列的抗PD-1抗体通过修饰VH和/或VK序列或其所连接的恒定区来创造新的抗PD-1抗体。因此，在本发明的另一方面，本发明的抗PD-1抗体，例如17D8、2D3、4H1、5C4、4A11、7D3或5F4的结构特征可用于创造保留至少一种本发明抗体的功能特性，诸如与人PD-1结合的结构相关的抗PD-1抗体。例如，如上所述，17D8、2D3、4H1、5C4、4A11、7D3或5F4或其突变体的一个或多个CDR区可以与已知的框架区和/或其它CDR通过重组技术联合以创造别的重组工程改造的本发明的抗PD-1抗体。其它修饰类型包括前述部分中所述的那些。用于工程改造方法的起始材料是本文所提供的一种或多种VH和/或VK序列，或其一个或多个CDR区。为创造工程改造的抗体，实际制备(即表达为蛋白质)具有本文所提供的一种或多种VH和/或VK序列或其一个或多个CDR区的抗体不是必需的。更确切的说，使用序列中所包含的信息作为起始材料来创造源自原始序列的“二代”序列，然后制备和表达“二代”序列成蛋白质。因此，在另一实施方式中，本发明提供了制备抗PD-1抗体的方法，其包括：(a)提供：(i)重链可变区抗体序列，其包含选自SEQIDNOs:15、16、17、18、19、20和21的CDR1序列，选自SEQIDNOs:22、23、24、25、26、27和28的CDR2序列；和/或选自SEQIDNOs:29、30、31、32、33、34和35的CDR3序列；和/或(ii)轻链可变区抗体序列，其包含选自SEQIDNOs:36、37、38、39、40、41和42的CDR1序列，选自SEQIDNOs:43、44、45、46、47、48和49的CDR2序列，和/或选自SEQIDNOs:50、51、52、53、54、55和56的CDR3序列；(b)改变重链可变区抗体序列和/或轻链可变区抗体序列中的至少一个氨基酸残基以创建至少一个经改变的抗体序列；并(c)将经改变的抗体序列表达为蛋白质。可以使用标准分子生物学技术来制备和表达经改变的抗体序列。优选的是，由经改变的抗体序列编码的抗体是保留了本文所述抗PD-1抗体的一项、一些或所有功能特性的抗体，这些功能特性包括但不限于：(a)所述抗体以1x10-7M或更小的KD与人PD-1结合；(b)所述抗体不显著与人CD28、CTLA-4或ICOS结合；(c)所述抗体在MLR测定法中增加T细胞的增殖；(d)所述抗体在MLR测定法中增加干扰素-γ的产量；(e)所述抗体在MLR测定法中增加IL-2的分泌；(f)所述抗体与人PD-1和猕猴PD-1结合；(g)所述抗体抑制PD-L1和/或PD-L2与PD-1的结合；(h)所述抗体刺激抗原特异性记忆应答；(i)所述抗体刺激抗体应答；(j)所述抗体抑制体内肿瘤细胞生长。经改变的抗体的功能特性可以使用本领域可利用的和/或本文所描述的标准测定法进行评估，诸如实施例中所阐明的那些测定法(例如流式细胞计量术、结合测定法)。在本发明工程改造抗体的方法的某些实施方式中，可以向整个或部分抗PD-1抗体编码序列中随机或者有选择的引入突变，所产生的经修饰的抗PD-1抗体可如本文所述的进行结合活性和/或其它功能特性的筛选。本领域已经记载了突变的方法。例如，Short的PCT公开文本WO02/09278中描述了通过饱和诱变、合成的连接装配或其组合来创造和筛选抗体突变的方法。或者，Lazar等人的PCT公开文本WO03/074679描述了使用计算机筛选方法来优化抗体的物理化学特性的方法。编码本发明抗体的核酸分子本发明的另一方面涉及编码本发明抗体的核酸分子。核酸可以存在于完整的细胞中、存在于细胞溶胞物中、或者以部分纯化或基本纯的形式存在。当通过标准技术，包括碱/SDS处理、CsCl分带(banding)、柱层析、琼脂糖凝胶电泳和本领域众所周知的其它技术纯化除去其它细胞组分或其它污染物，例如其它细胞核酸或蛋白质时，核酸是“分离的”或“使得基本纯的”。参见F.Ausubel等人(1987)CurrentProtocolsinMolecularBiology,GreenePublishingandWileyInterscience,NewYork。本发明的核酸可以是例如DNA或RNA，而且可以含有或不含内含子序列。在一优选的实施方式中，核酸是cDNA分子。可以使用标准分子生物学技术来获得本发明的核酸。对于由杂交瘤(例如如下文所进一步描述的从携带人免疫球蛋白基因的转基因小鼠制备的杂交瘤)表达的抗体，可以通过标准PCR扩增或cDNA克隆技术获得编码杂交瘤所制备的抗体轻链和重链的cDNAs。对于从免疫球蛋白基因库(例如使用噬菌体展示技术)中获得的抗体，可以从文库中回收编码抗体的核酸。本发明优选的核酸分子是那些编码17D8、2D3、4H1、5C4、4A11、7D3或5F4单克隆抗体的VH和VL序列的核酸分子。编码17D8、2D3、4H1、5C4、4A11、7D3和5F4的VH序列的DNA序列分别如SEQIDNOs:57、58、59、60、61、62和63中所示。编码17D8、2D3、4H1、5C4、4A11、7D3和5F4的VL序列的DNA序列分别如SEQIDNOs:64、65、66、67、68、69和70中所述。一旦获得编码VH和VL区段的DNA片段，进一步通过标准重组DNA技术操作这些DNA片段，以例如将可变区基因转变为全长抗体链基因、Fab片段基因或scFv基因。在这些操作中，将编码VL或VH的DNA片段可操作的连接至编码另一蛋白质，诸如抗体恒定区或柔性接头的另一DNA片段。术语“可操作的连接”在用于本文时意图表示连接两DNA片段从而使得这两个DNA片段所编码的氨基酸序列保持在同一读码框中(in-frame)。通过将编码VH的DNA可操作的连接至编码重链恒定区(CH1、CH2和CH3)的另一DNA分子可以将编码VH区的分离的DNA转变为全长重链基因。人重链恒定区基因的序列是本领域已知的(参见例如Kabat,E.A.等人(1991)SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,FifthEdition,U.S.DepartmentofHealthandHumanServices,NIHPublicationNo.91-3242)，包含这些区的DNA片段可以通过标准PCR扩增获得。重链恒定区可以是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区，但是最优选为IgG1或IgG4恒定区。为获得Fab片段重链基因，可以将编码VH的DNA可操作的连接至仅编码重链CH1恒定区的另一DNA分子。通过将编码VL的DNA可操作的连接至编码轻链恒定区CL的另一DNA分子可以将编码VL区的分离的DNA转变为全长轻链基因(以及Fab轻链基因)。人轻链恒定区基因的序列是本领域已知的(参见例如Kabat,E.A.等人(1991)SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,FifthEdition,U.S.DepartmentofHealthandHumanServices,NIHPublicationNo.91-3242)，包含这些区的DNA片段可以通过标准PCR扩增获得。轻链恒定区可以是κ或λ恒定区，但最优选为κ恒定区。为创造scFv基因，将编码VH和VL的DNA片段可操作的连接至编码柔性接头，例如编码氨基酸序列(Gly4-Ser)3的另一片段，从而使得VH和VL序列可以表达成相邻的单链蛋白质，其中VL和VH区通过柔性接头连接(参见例如Bird等人(1988)Science242:423-426；Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879-5883；McCafferty等人(1990)Nature348:552-554)。本发明的单克隆抗体的产生本发明的单克隆抗体(mAb)可以通过多种技术进行制备，包括常规单克隆抗体方法学，例如Kohler和Milstein(1975)Nature256:495中所述的标准体细胞杂交技术。虽然优选体细胞杂交规程，但是原则上也可以使用制备单克隆抗体的其它方法，例如B淋巴细胞的病毒或致癌转化。用于制备杂交瘤的优选动物系统为鼠科动物系统。在小鼠中制备杂交瘤是非常完善的规程。分离用于融合的经免疫的脾细胞的免疫方案和技术是本领域已知的。融合配偶体(例如鼠骨髓瘤细胞)和融合规程也是已知的。本发明的嵌合或人源化抗体可以根据上述制备的鼠单克隆抗体的序列进行制备。编码重链和轻链免疫球蛋白的DNA可以从目标鼠杂交瘤中获得，并且使用标准分子生物学技术进行工程改造以包含非鼠(例如人)免疫球蛋白序列。例如，为创造嵌合抗体，可使用本领域已知的方法将鼠可变区连接至人恒定区(参见例如Cabilly等人的美国专利No.4,816,567)。为创造人源化抗体，可以使用本领域已知的方法将鼠CDR区插入人框架(参见Winter的美国专利No.5,225,539及Queen等人的美国专利Nos.5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370)。在一优选的实施方式中，本发明抗体是人单克隆抗体。此类针对PD-1的人单克隆抗体可以使用携带部分人免疫系统而非小鼠系统的转基因或转染色体小鼠产生。这些转基因和转染色体小鼠可以包括本文分别称为HuMAb小鼠和KM小鼠TM的小鼠，其在本文中统称为“人Ig小鼠”。HuMAb小鼠(Medarex,Inc.)含有编码未重排的人重链(μ和γ)和κ轻链免疫球蛋白序列的人免疫球蛋白基因微型基因座(miniloci)，加之使内源μ和κ链基因座失活的靶向突变(参见例如Lonberg等人(1994)Nature368(6474):856-859)。因此，所述小鼠展现出小鼠IgM或κ的表达降低，并且在对免疫作用的应答中，导入的人重链和轻链转基因经历类型转换和体细胞突变产生高亲和力的人IgGκ单克隆(Lonberg,N.等人(1994)同上；Lonberg,N.(1994)HandbookofExperimentalPharmacology113:49-101中的综述；Lonberg,N.andHuszar,D.(1995)Intern.Rev.Immunol.13:65-93及Harding,F.andLonberg,N.(1995)Ann.N.Y.Acad.Sci.764:536-546)。HuMab小鼠的制备及此类小鼠携带的基因组修饰进一步描述于Taylor,L.等人(1992)NucleicAcidsResearch20:6287-6295；Chen,J.等人(1993)InternationalImmunology5:647-656；Tuaillon等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:3720-3724；Choi等人(1993)NatureGenetics4:117-123；Chen,J.等人(1993)EMBOJ.12:821-830；Tuaillon等人(1994)J.Immunol.152:2912-2920；Taylor,L.等人(1994)InternationalImmunology6:579-591；及Fishwild,D.等人(1996)NatureBiotechnology14:845-851，所有文献的内容通过参考以全文明确的收入本文。进一步参见Lonberg和Kay的美国专利Nos.5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,789,650；5,877,397；5,661,016；5,814,318；5,874,299和5,770,429；Surani等人的美国专利No.5,545,807；Longberg和Kay的PCT公开文本Nos.WO92/03918,WO93/12227,WO94/25585,WO97/13852,WO98/24884和WO99/45962；及Korman等人的PCT公开文本No.WO01/14424。在另一实施方式中，使用在转基因和转染色体上携带人免疫球蛋白序列的小鼠，诸如携带人重链转基因和人轻链转染色体的小鼠来产生本发明的人抗体。此类小鼠称为“KM小鼠TM”，Ishida等人的PCT公开文本WO02/43478中对其有详细的描述。此外，其它可选的表达人免疫球蛋白基因的转基因动物系统是本领域中可以获得的，并且可用于产生本发明的抗PD-1抗体。例如，可以使用称为Xenomouse(Abgenix,Inc.)的可选的转基因系统；例如Kucherlapati等人的美国专利Nos.5,939,598；6,075,181；6,114,598；6,150,584和6,162,963中描述了此类小鼠。此外，其它可选的表达人免疫球蛋白基因的转染色体动物是本领域中可以获得的，并且可用于产生本发明的抗PD-1抗体。例如，可以使用同时携带人重链转染色体和人轻链转染色体的小鼠，其称为“TC小鼠”；Tomizuka等人(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA97:722-727中描述了此类小鼠。此外，携带人重链和轻链转染色体的牛在本领域中已有记载(Kuroiwa等人(2002)NatureBiotechnology20:889-894)，并且可用于产生本发明的抗PD-1抗体。本发明的人单克隆抗体也可以使用噬菌体展示技术筛选人免疫球蛋白基因库进行制备。此类用于分离人抗体的噬菌体展示技术是本领域已建立的。参见例如Ladner等人的美国专利Nos.5,223,409；5,403,484；和5,571,698；Dower等人的美国专利Nos.5,427,908和5,580,717；McCafferty等人的美国专利Nos.5,969,108和6,172,197；及Griffiths等人的美国专利Nos.5,885,793；6,521,404；6,544,731；6,555,313；6,582,915和6,593,081。本发明的人单克隆抗体还可以使用SCID小鼠进行制备，该小鼠中已重新构建了人免疫细胞从而使得能在免疫作用后产生人抗体应答。例如Wilson等人的美国专利Nos.5,476,996和5,698,767中描述了此类小鼠。人Ig小鼠的免疫在使用人Ig小鼠来产生本发明的人抗体时，可以用PD-1抗原和/或重组PD-1，或PD-1融合蛋白的纯化或富集制备物免疫此类小鼠，如同Lonberg,N.等人(1994)Nature368(6474):856-859；Fishwild,D.等人(1996)NatureBiotechnology14:845-851；和PCT公开文本WO98/24884和WO01/14424中所述的。优选的是，在首次输注时小鼠为6-16周大。例如，可以用PD-1抗原的纯化或重组制备物(5-50μg)腹膜内免疫人Ig小鼠。下述实施例1中描述了产生PD-1的完全人的单克隆抗体的详细规程。使用各种抗原的累积实验显示了在最初用完全弗氏佐剂中的抗原腹膜内(IP)免疫，然后每隔一周用不完全弗氏佐剂中的抗原IP免疫(直至总共6次)时转基因小鼠发生应答。但是，发现弗氏佐剂以外的其它佐剂也是有效的。此外，没有佐剂时的完整细胞也发现具有高免疫原性。用通过眼眶取血获得的血浆样本监控免疫方案过程中的免疫应答。可以通过ELISA对血浆进行筛选(如下所述)，将具有足够抗PD-1人免疫球蛋白滴度的小鼠用于融合。在处死前3天，用抗原对小鼠进行静脉内强化，然后切出脾脏。预计对每次免疫作用需要进行2-3次融合。通常用每种抗原免疫6到24只小鼠。通常使用HCo7和HCo12两种品系。此外，HCo7和HCo12两种转基因可以育种到一起，产生具有两种不同人重链转基因的单一小鼠(HCo7/HCo12)。或者/另外，如实施例1中所述，可以使用KM小鼠TM品系。生成本发明人单克隆抗体的杂交瘤的产生为产生生成本发明人单克隆抗体的杂交瘤，可以自经免疫小鼠分离脾细胞和/或淋巴结细胞，并将其与合适的永生化细胞系，诸如小鼠骨髓瘤细胞系融合。筛选产生抗原特异性抗体的所获杂交瘤。例如，可以用50％PEG使来自经免疫小鼠的脾淋巴细胞的单细胞悬浮液与六分之一数目的P3X63-Ag8.653不分泌小鼠骨髓瘤细胞(ATCC，CRL1580)融合。或者，来自经免疫小鼠的脾淋巴细胞的单细胞悬浮液可以使用基于电场的电融合方法进行融合，其使用CytoPulse大室细胞融合电穿孔仪(CytoPulseSciences,Inc.,GlenBurnie,MD)。细胞以大约2x105在平底微量滴度板中培养，然后在含有20％fetalCloneSerum血清,18％"653"条件培养基,5％origen(IGEN),4mML-谷氨酰胺,1mM丙酮酸钠,5mMHEPES,0.055mM2-巯基乙醇,50单位/ml青霉素,50mg/ml链霉素,50mg/ml庆大霉素和1XHAT(Sigma；在融合后24小时加入HAT)的选择性培养基中温育两周。大约两周后，在用HT替换HAT的培养基中培养细胞。然后通过ELISA对各孔筛选人单克隆IgM和IgG抗体。一旦出现大量杂交瘤生长，通常在10-14天后观察培养液。分泌抗体的杂交瘤可以重新铺板，再次筛选，如果还是人IgG阳性的，那么可以通过有限稀释亚克隆单克隆抗体至少两次。随后可以在体外培养稳定的亚克隆以在组织培养物的培养液中产生少量抗体用于品质鉴定。为纯化人单克隆抗体，所选杂交瘤可以在两升旋转烧瓶中培养以进行单克隆抗体纯化。在用蛋白A-sepharose(Pharmacia,Piscataway,N.J.)进行亲和层析前过滤和浓缩上清液。通过凝胶电泳和高效液相层析检验洗脱的IgG以确保纯度。可将缓冲液替换为PBS，使用1.43消光系数通过OD280测定浓度。等分单克隆抗体，于-80℃保存。生成本发明单克隆抗体的转染瘤的产生本发明的抗体也可以在宿主细胞转染瘤中产生，其联合使用例如本领域众所周知的重组DNA技术和基因转染方法(例如Morrison,S.(1985)Science229:1202)。例如，为表达抗体或其抗体片段，可以通过标准分子生物学技术(例如PCR扩增或使用表达目标抗体的杂交瘤的cDNA克隆)获得编码部分或全长轻链和重链的DNA，并且可以将DNA插入到表达载体中，从而使得基因与转录和翻译调控序列可操作的连接。在本文中，术语“可操作的连接”意图表示抗体基因连入载体中，从而使得载体中的转录和翻译调控序列行使调控抗体基因的转录和翻译的预定功能。选择适合所用表达宿主细胞的表达载体和表达调控序列。可将抗体轻链基因和抗体重链基因插入到不同的载体中，或者更通常的，将两个基因插入到同一表达载体中。通过标准方法将抗体基因插入到表达载体中(例如连接抗体基因片段和载体上互补的限制性位点，或者如果没有限制性位点那么进行平端连接)。可以使用本文所述抗体的轻链和重链可变区来创造任何抗体同种型的全长抗体基因，其通过将它们插入已编码期望同种型的重链恒定区和轻链恒定区的表达载体中，从而使得VH区段与载体中的CH区段可操作的连接，VK区段与载体中的CL区段可操作的连接。另外/或者，重组表达载体可以编码信号肽，其利于宿主细胞中抗体链的分泌。可将抗体链基因克隆到载体中以使信号肽与抗体链基因的氨基末端连接于同一读码框中(in-frame)。信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或异源信号肽(即来自非免疫球蛋白的信号肽)。除了抗体链基因，本发明的重组表达载体还携带调控序列，其调控抗体链基因在宿主细胞中的表达。术语“调控序列”意图包括启动子、增强子和其它表达调控元件(例如聚腺苷酸化信号)，其调控抗体链基因的转录或翻译。此类调控序列记载于例如Goeddel,GeneExpressionTechnology.MethodsinEnzymology185,AcademicPress,SanDiego,CA(1990)中。本领域技术人员应当了解表达载体的设计，包括调控序列的选择，取决于诸如将转化的宿主细胞的选择、期望的蛋白质表达水平等因素。用于哺乳动物宿主细胞表达的优选调控序列包括在哺乳动物细胞中指导高水平蛋白质表达的病毒元件，诸如源自巨细胞病毒(CMV)、猿病毒40(SimianVirus40,SV40)、腺病毒(例如腺病毒主要晚期启动子(AdMLP))和多瘤病毒的启动子和/或增强子。或者，可以使用非病毒调控序列，诸如遍在蛋白启动子或β-球蛋白启动子。又进一步的，调控元件含有来自不同来源的序列，诸如SRα启动子系统，其包含来自SV40早期启动子的序列和人T细胞1型白血病病毒的长末端重复序列(Takebe,Y.等人(1988)Mol.Cell.Biol.8:466-472)。除了抗体链基因和调控序列，本发明的重组表达载体可以携带别的序列，诸如调控宿主细胞中载体复制的序列(例如复制起点)和选择标志基因。选择标志基因使得导入有载体的宿主细胞的选择更容易(参见例如Axel等人的美国专利Nos.4,399,216,4,634,665和5,179,017)。例如，通常选择标志基因赋予导入有载体的宿主细胞以对药物，诸如G418、潮霉素或甲氨蝶呤的抗性。优选的选择标志基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(用于进行甲氨蝶呤选择/扩增的dhfr-宿主细胞中)和neo基因(用于G418选择)。为表达轻链和重链，通过标准技术将编码重链和轻链的表达载体转染到宿主细胞中。各种形式的术语“转染”意图涵盖多种通常用于将外源DNA导入原核或真核宿主细胞的技术，例如电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE－右旋糖苷转染等。虽然理论上在原核或真核宿主细胞中都有可能表达本发明的抗体，但是最优选在真核细胞中(最优选在哺乳动物宿主细胞中)表达抗体，因为此类真核细胞(特别是哺乳动物细胞)比原核细胞更有可能组装和分泌正确折叠且具有免疫学活性的抗体。已有报导抗体基因的原核表达对于产生高产量的活性抗体是无效的(Boss,M.A.andWood,C.R.(1985)ImmunologyToday6:12-13)。用于表达本发明重组抗体的优选哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)(包括Urlaub和Chasin(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:4216-4220中所述的dhfr-CHO细胞，其与DHFR选择标志一起使用，例如R.J.Kaufman和P.A.Sharp(1982)Mol.Biol.159:601-621中所述的)、NSO骨髓瘤细胞、COS细胞和SP2细胞。具体而言，为与NSO骨髓瘤细胞一起使用，另一优选的表达系统为WO87/04462、WO89/01036和EP338,841中所披露的GS基因表达系统。当将编码抗体基因的重组表达载体导入哺乳动物宿主细胞时，通过培养宿主细胞一段足以使宿主细胞中抗体表达的时间生产抗体，或者更优选的是，将抗体分泌到培养宿主细胞的培养基中。可以使用标准蛋白质纯化方法从培养物的培养液中回收抗体。与抗原结合的抗体的表征本发明的抗体可以通过例如标准ELISA来测试与PD-1的结合。简言之，将微量滴定板用PBS中的0.25μg/ml纯化的PD-1包被，然后用PBS中的5％牛血清清蛋白封闭。向每孔中加入抗体稀释液(例如来自PD-1免疫小鼠的血浆的稀释液)并于37℃温育1-2小时。将板用PBS/Tween清洗，然后用与碱性磷酸酶偶联的第二种试剂(例如对于人抗体，是山羊抗人IgGFc特异性多克隆试剂)一起于37℃温育1小时。清洗后，将板用pNPP底物(1mg/ml)显色，并分析405-650处的OD。优选的是，将形成最高滴度的小鼠用于融合。如上所述的ELISA测定法还可用于筛选显示与PD-1免疫原的阳性反应性的杂交瘤。将以高亲合力与PD-1结合的杂交瘤亚克隆并进一步表征。可以从每个杂交瘤中选取一个保留亲本细胞反应性(通过ELISA)的克隆来制备5-10瓶细胞库，保存于-140℃，并用于抗体纯化。为纯化抗PD-1抗体，可以在两升旋转烧瓶中培养选定的杂交瘤供单克隆抗体纯化。可以将上清液过滤并浓缩，然后用蛋白A-sepharose(Pharmacia,Piscataway,NJ)进行亲和层析。可以通过凝胶电泳和高效液相层析检查洗脱的IgG以确保纯度。可以将缓冲溶液交换入PBS，并且可以利用1.43消光系数通过OD280来测定浓度。可以将单克隆抗体等分并保存于-80℃。为测定选定的抗PD-1单克隆抗体是否与独特表位结合，可以使用商品化试剂(Pierce,Rockford,IL)将每种抗体生物素化。可以利用上文所述PD-1包被的ELISA板来进行竞争研究，该研究使用未标记的单克隆抗体和生物素化的单克隆抗体。可以用链霉亲合素-碱性磷酸酶探针来检测生物素化单克隆抗体的结合。为确定纯化抗体的同种型，可以使用对特定同种型抗体特异的试剂来进行同种型ELISA。例如，为确定人单克隆抗体的同种型，可以将微量滴定板的孔用1μg/ml抗人免疫球蛋白于4℃包被过夜。用1％BSA封闭后，将板与1μg/ml或更少的测试单克隆抗体或纯化的同种型对照于环境温度反应1-2小时。然后可以将孔与人IgG1或人IgM特异性碱性磷酸酶偶联的探针反应。如上所述对板进行显色和分析。抗PD-1人IgG可以通过Western印迹来进一步测试与PD-1抗原的反应性。简言之，可以制备PD-1并进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳后，将分离的抗原转移至硝酸纤维素膜，用10％胎牛血清封闭，并用待测试的单克隆抗体探查。人IgG的结合可以用抗人IgG碱性磷酸酶来检测并用BCIP/NBT底物片剂(SigmaChem.Co.,St.Louis,Mo.)来显色。免疫偶联物另一方面，本发明的特色是与治疗性模块，诸如细胞毒素、药物(例如免疫抑制剂)或放射性毒素偶联的抗PD-1抗体或其片段。此类偶联物在本文中称作“免疫偶联物”。包含一种或多种细胞毒素的免疫偶联物称作“免疫毒素”。细胞毒素或细胞毒剂包括对细胞有害(例如杀伤细胞)的任何试剂。实例包括紫杉醇、松胞菌素B、短杆菌肽D、溴化乙啶、依米丁、丝裂霉素,依托泊苷、替尼泊苷、长春新碱、长春碱、秋水仙素、多柔比星、柔红霉素、二羟基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光神霉素、放线菌素D、1-去氢睾酮、糖皮质激素类、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔和嘌呤霉素，及其类似物或同系物。治疗剂还包括例如抗代谢物类(例如甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶、达卡巴嗪(decarbazine))、烷化剂类(例如双氯乙基甲胺、塞替哌(thioepa)、苯丁酸氮芥、美法仑、卡莫司汀(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)、环磷酰胺(cyclothosphamide)、白消安、二溴甘露醇、链唑霉素、丝裂霉素C、和顺式二氯二胺铂(II)(DDP)顺铂)、蒽环类抗生素(例如柔红霉素(以前称为道诺霉素)和多柔比星)、抗生素类(例如放线菌素D(以前称为放线菌素)、博来霉素、光神霉素、和氨茴霉素(AMC))、和抗有丝分裂剂(例如长春新碱和长春碱)。可以与本发明的抗体偶联的治疗性细胞毒素的其它优选实例包括duocarmycin、加利车霉素、美登素和auristatin，及其衍生物。加利车霉素抗体偶联物的一个实例可商购(MylotargTM；Wyeth-Ayerst)。利用本领域现有的接头技术可以将细胞毒素偶联至本发明的抗体。已经用于将细胞毒素偶联至抗体的接头类型的实例包括但不限于腙、硫醚、酯、二硫化物和含肽的接头。可以选择例如易于在溶酶体隔室内被低pH切割或易于被蛋白酶诸如优先在肿瘤组织中表达的蛋白酶诸如组织蛋白酶(例如组织蛋白酶B、C、D)切割的接头。关于细胞毒素的类型、接头及将治疗剂偶联至抗体的方法的进一步讨论还可参见Saito,G.等人(2003)Adv.DrugDeliv.Rev.55:199-215；Trail,P.A.等人(2003)CancerImmunol.Immunother.52:328-337；Payne,G.(2003)CancerCell3:207-212；Allen,T.M.(2002)Nat.Rev.Cancer2:750-763；Pastan,I.andKreitman,R.J.(2002)Curr.Opin.Investig.Drugs3:1089-1091；Senter,P.D.andSpringer,C.J.(2001)Adv.DrugDeliv.Rev.53:247-264。本发明的抗体还可以与放射性同位素偶联以生成细胞毒性放射性药物，也称作放射性免疫偶联物。可以与抗体偶联以用于诊断或治疗的放射性同位素的实例包括但不限于碘131、铟111、钇90和镥177。用于制备放射性免疫偶联物的方法是本领域已确立的。放射性免疫偶联物的实例可商购，包括ZevalinTM(IDECPharmaceuticals)和BexxarTM(CorixaPharmaceuticals)，并且可以使用类似的方法利用本发明的抗体来制备放射性免疫偶联物。本发明的抗体偶联物可以用于改进给定的生物学应答，而且药物模块不应解释为限于经典的化疗剂。例如，药物模块可以是具有期望生物学活性的蛋白质或多肽。此类蛋白质可以包括例如酶活毒素或其活性片段，诸如相思豆毒素、蓖麻毒素A、假单胞菌外毒素、或白喉毒素；蛋白质，诸如肿瘤坏死因子或干扰素-γ；或者，生物学应答修饰剂，诸如例如淋巴因子、白介素-1("IL-1")、白介素-2("IL-2")、白介素-6("IL-6")、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子("GM-CSF")、粒细胞集落刺激因子("G-CSF")、或其它生长因子。将此类治疗性模块偶联至抗体的技术是众所周知的，参见例如Arnon等人,"MonoclonalAntibodyForImmunotargetingOfDrugsInCancerTherapy",在MonoclonalAntibodyAndCancerTherapy中,Reisfeld等人(编),pp.243-56(AlanR.Liss,Inc.1985)；Hellstrom等人,"AntibodyForDrugDelivery",在ControlledDrugDelivery(第2版),Robinson等人(编),pp.623-53(MarcelDekker,Inc.1987)；Thorpe,"AntibodyCarriersOfCytotoxicAgentsInCancerTherapy:AReview",在MonoclonalAntibody'84:BiologicalAndClinicalApplications中,Pinchera等人(编),pp.475-506(1985)；"Analysis,Results,AndFutureProspectiveOfTheTherapeuticUseOfRadiolabeledAntibodyInCancerTherapy",在MonoclonalAntibodyForCancerdetectionAndTherapy中,Baldwin等人(编),pp.303-16(AcademicPress1985)；及Thorpe等人,"ThePreparationAndCytotoxicPropertiesOfAntibody-ToxinConjugates",Immunol.Rev.,62:119-58(1982)。双特异性分子另一方面,本发明的特色是包含本发明的抗PD-1抗体或其片段的双特异性分子。本发明的抗体或其抗原结合部分可以进行衍生化或连接至另一功能性分子上，例如另一种肽或蛋白质(例如受体的另一种抗体或配体)以生成与至少两种不同结合位点或靶分子结合的双特异性分子。本发明的抗体事实上可以进行衍生化或连接至一个以上其它功能性分子以生成与两个以上不同结合位点和/或靶分子结合的多特异性分子；此类多特异性分子还意图为本文中所使用的术语“双特异性分子”所涵盖。为创建本发明的双特异性分子，可以将本发明的抗体在功能上连接(例如通过化学偶联、基因融合、非共价结合或其它方式)至一种或多种其它结合分子，诸如另一种抗体、抗体片段、肽或结合模仿物，从而产生双特异性分子。因此，本发明包括包含至少一种对PD-1的第一结合特异性和对第二种靶表位的第二结合特异性的双特异性分子。在本发明的一个具体实施方案中,所述第二种靶表位是Fc受体，例如人FcγRI(CD64)或人Fcα受体(CD89)。因此，本发明包括能够与表达FcγR或FcαR的效应细胞(例如单核细胞、巨噬细胞或多形核细胞(PMN))及与表达PD-1的靶细胞结合的双特异性分子。这些双特异性分子将表达PD-1的细胞靶向效应细胞并触发Fc受体介导的效应细胞活性，诸如表达PD-1的细胞的吞噬作用、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、细胞因子释放、或超氧阴离子的生成。在本发明的一个实施方案中，其中双特异性分子是多特异性的，该分子可以在抗Fc结合特异性和抗PD-1结合特异性之外进一步包括第三结合特异性。在一个实施方案中，第三结合特异性是抗增强因子(EF)部分，例如与牵涉细胞毒性活性的表面蛋白结合并由此提高针对靶细胞的免疫应答的分子。“抗增强因子部分”可以是与给定分子例如抗原或受体结合并由此导致结合决定簇对Fc受体或靶细胞抗原的作用增强的抗体、功能性抗体片段或配体。“抗增强因子部分”可以与Fc受体或靶细胞抗原结合。或者，抗增强因子部分可以与有别于第一和第二结合特异性所结合之实体的实体结合。例如，抗增强因子部分可以与细胞毒性T细胞结合(例如经由CD2、CD3、CD8、CD28、CD4、CD40、ICAM-1或导致针对靶细胞的免疫应答提高的其它免疫细胞)。在一个实施方案中,本发明的双特异性分子包含至少一种抗体或其抗体片段作为结合特异性，其中的抗体片段包括例如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv或单链Fv。抗体还可以是轻链或重链二聚体或其任何最小片段，诸如Fv或单链结构，如Ladner等人的美国专利No.4,946,778中所述，在此明确收入其内容作为参考。在一个实施方案中，通过单克隆抗体来提供对Fcγ受体的结合特异性，其结合不受人免疫球蛋白G(IgG)所阻断。在用于本文时，术语“IgG受体”指位于染色体1上的八种γ链基因中的任一种。这些基因编码总共十二种跨膜或可溶性受体同种型，其分成三个Fcγ受体类别：FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)、和FcγRIII(CD16)。在一个优选的实施方案中，Fcγ受体是人高亲和性FcγRI。人FcγRI是72kDa的分子，其显示对单体IgG的高亲和力(108-109M-1)。某些优选的抗Fcγ单克隆抗体的生成和表征记载于Fanger等人的PCT公开文本WO88/00052和美国专利No.4,954,617，在此完整收入其教导作为参考。这些抗体在不同于受体之Fcγ结合位点的位点处与FcγRI、FcγRII或FcγRIII的表位结合，因而它们的结合基本上不受生理水平的IgG所阻断。可用于本发明的特异性抗FcγRI抗体是mAb22、mAb32、mAb44、mAb62和mAb197。产生mAb32的杂交瘤可获自美国典型培养物保藏中心，ATCC编号HB9469。在其它实施方案中，抗Fcγ受体抗体是mAb22的人源化形式(H22)。H22抗体的生成和表征记载于Graziano,R.F.等人(1995)J.Immunol155(10):4996-5002和PCT公开文本WO94/10332。产生H22抗体的细胞系保藏于美国典型培养物保藏中心，命名为HA022CL1，编号CRL11177。在还有一些优选的实施方案中，对Fc受体的结合特异性由与人IgA受体例如Fcα受体(FcαRI(CD89))结合的抗体提供，其结合优选不受人免疫球蛋白A(IgA)所阻断。术语“IgA受体”意图包括位于染色体19上的一个α基因(FcαRI)的基因产物。已知此基因编码55-110kDa的数种可变剪接的跨膜同种型。FcαRI(CD89)在单核细胞/巨噬细胞、嗜酸性和嗜中性粒细胞上组成性表达，但不在非效应细胞群体上组成性表达。FcαRI具有对IgA1和IgA2的中等亲和力(约5x107M-1)，其在暴露于细胞因子诸如G-CSF或GM-CSF后提高(Morton,H.C.等人(1996)CriticalReviewsinImmunology16:423-440)。已经描述过在IgA配体结合域以外结合FcαRI的四种FcαRI特异性单克隆抗体，鉴定为A3、A59、A62和A77(Monteiro,R.C.等人(1992)J.Immunol.148:1764)。FcαRI和FcγRI是用于本发明双特异性分子的优选触发受体，因为它们(1)主要在免疫效应细胞例如单核细胞、PMN、巨噬细胞和树突细胞上表达；(2)以高水平表达(例如每个细胞5,000-100,000个)；(3)是细胞毒性活性(例如ADCC、吞噬作用)的介质；(4)对于靶向它们的抗原，包括自身抗原，介导增强的抗原呈递。尽管优选人单克隆抗体，但是在本发明的双特异性分子中可以采用的其它抗体为鼠的、嵌合的和人源化的单克隆抗体。利用本领域已知的方法，可以通过偶联组成性的结合特异性，例如抗FcR和抗PD-1结合特异性来制备本发明的双特异性分子。例如，可以分别生成双特异性分子的每一种结合特异性，然后彼此偶联。当结合特异性是蛋白质或肽时，可以使用多种偶联或交联剂用于共价偶联。交联剂的例子包括蛋白A、碳化二亚胺、N-琥珀酰亚氨基-S-乙酰基-硫代乙酸酯(SATA)、5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、邻苯二马来酰亚胺(oPDM)、N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、和磺基琥珀酰亚氨基4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(sulfo-SMCC)(参见例如Karpovsky等人(1984)J.Exp.Med.160:1686；Liu,MA等人(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:8648)。其它方法包括Paulus(1985)BehringIns.Mitt.No.78:118-132；Brennan等人(1985)Science229:81-83和Glennie等人(1987)J.Immunol.139:2367-2375中所记载的那些。优选的偶联剂是SATA和sulfo-SMCC，二者都可获自PierceChemicalCo.(Rockford,IL)。当结合特异性是抗体时，它们可以经由两条重链的C末端铰链区的巯基键合而偶联。在一个特别优选的实施方案，在偶联前将铰链区修饰以包含奇数个巯基，优选一个。或者，两种结合特异性都可以在同一载体中编码并在同一宿主细胞中表达和装配。当双特异性分子是mAbxmAb、mAbxFab、FabxF(ab')2或配体xFab融合蛋白时，这种方法特别有用。本发明的双特异性分子可以是包含单个单链抗体和结合决定簇的单链分子，或包含两个结合决定簇的单链双特异性分子。双特异性分子可以包含至少两条单链分子。制备双特异性分子的方法描述于例如美国专利号5,260,203；美国专利号5,455,030；美国专利号4,881,175；美国专利号5,132,405；美国专利号5,091,513；美国专利号5,476,786；美国专利号5,013,653；美国专利号5,258,498；和美国专利号5,482,858。双特异性分子与它们的特异性靶物的结合可以通过例如酶联免疫吸附测定法(ELISA)、放射性免疫测定法(RIA)、FACS分析、生物测定法(例如生长抑制)或Western印迹测定法来验证。这些测定法中的每一种一般通过采用对目的复合物特异的经标记试剂(例如抗体)来检测特定目的蛋白质-抗体复合物的存在。例如，可以利用例如识别并特异性结合抗体-FcR复合物的酶联抗体或抗体片段来检测FcR-抗体复合物。或者，可以使用多种其它免疫测定法中的任一种来检测复合物。例如，可以对抗体进行放射性标记并用于放射性免疫测定法(RIA)(参见例如Weintraub,B.,PrinciplesofRadioimmunoassays,SeventhTrainingCourseonRadioligandAssayTechniques,TheEndocrineSociety,March,1986，将其收入本文作为参考)。放射性同位素可以通过诸如使用γ计数仪或闪烁计数仪或者通过放射自显影的手段来检测。药用组合物另一方面，本发明提供了一种组合物，例如药用组合物，其包含一种或一组本发明的单克隆抗体或其抗原结合部分，与药剂学可接受载体配制在一起。此类组合物可以包含一种或一组(例如两种或多种不同的)本发明的抗体或免疫偶联物或双特异性分子。例如，本发明的药用组合物可以包含一组抗体(或免疫偶联物或双特异性分子)，其结合靶抗原上的不同表位或者其具有互补的活性。本发明的药用组合物还可以以联合疗法施用，即联合其它药剂。例如，联合疗法可以包括本发明的抗PD-1抗体，与至少一种其它抗炎剂或免疫抑制剂联合。可以用于联合疗法的治疗剂的例子在下文关于本发明抗体的用途一节中有更加详细的描述。在用于本文时，“药剂学可接受载体”包括任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂、等等生理学相容的载体。优选的是，载体适于静脉内、肌肉内、皮下、胃肠外、脊髓或表皮施用(例如通过注射或输注)。根据施用路径，活性化合物，即抗体、免疫偶联物或双特异性分子，可以包被在一种物质中，以保护该化合物不受酸和可以使该化合物失活的其它天然条件的作用。本发明的药用化合物可以包含一种或多种药剂学可接受的盐。“药剂学可接受的盐”指这样一种盐，其保留亲本化合物的期望生物学活性且不产生任何不利的毒物学效果(参见例如Berge,S.M.等人(1977)J.Pharm.Sci.66:1-19)。此类盐的例子包括酸加成盐和碱加成盐。酸加成盐包括衍生自无毒无机酸，诸如盐酸、硝酸、磷酸、硫酸、氢溴酸、氢碘酸、亚磷酸等等的盐，以及衍生自无毒有机酸，诸如脂肪族单羧酸和二羧酸、苯基取代的链烷酸、羟基链烷酸、芳香族酸、脂肪族和芳香族磺酸等等的盐。碱加成盐包括衍生自碱土金属，诸如钠、钾、镁、钙等等的盐，以及衍生自无毒有机胺，诸如N,N'-二苄乙二胺、N-甲基葡糖胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、普鲁卡因等等的盐。本发明的药用组合物还可以包含药剂学可接受的抗氧化剂。药剂学可接受的抗氧化剂的例子包括：(1)水溶性的抗氧化剂，诸如抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠等等；(2)油溶性的抗氧化剂，诸如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基化羟基茴香醚(BHA)、丁基化羟基甲苯(BHT),卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等等；和(3)金属螯合剂，诸如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸等等。可以用于本发明的药用组合物的合适的水性和非水性载体的例子包括水、乙醇、多元醇(诸如甘油、丙二醇、聚乙二醇等等)及其合适的混合物、植物油诸如橄榄油、和可注射的有机酯诸如油酸乙酯。通过例如使用包衣材料诸如卵磷脂，通过在分散体的情况中保持期望颗粒大小，及通过使用表面活性剂，可以维持适当的流动性。这些组合物还可以包含佐剂，诸如防腐剂、湿润剂、乳化剂和分散剂。通过灭菌规程，见上文，及通过加入各种抗细菌和抗真菌剂，诸如对羟基苯甲酸酯类(paraben)、氯丁醇、酚、山梨酸等等，可以确保对微生物存在的预防。可能还希望向组合物中加入等渗剂，诸如糖类、氯化钠等等。此外，通过加入延迟吸收的药剂，诸如单硬脂酸铝和明胶，可以导致可注射药用形式的延长吸收。药剂学可接受的载体包括无菌水溶液或分散体和用于即时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。此类介质和药剂用于药剂学活性物质的用途是本领域已知的。除了任何常规介质或药剂都与活性化合物不相容的情况之外，设想了其在本发明的药用组合物中的用途。还可以向组合物中掺入补充性的活性化合物。治疗性组合物在生产和贮存条件下通常必须是无菌的和稳定的。可以将组合物配制成溶液、微乳液、脂质体、或适于高药物浓度的其它有序结构。载体可以是包含例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、和液体聚乙二醇等等)及其合适混合物的溶剂或分散介质。例如通过使用涂层诸如卵磷脂，在分散体的情况中通过维持期望颗粒大小，及通过使用表面活性剂，可以保持适当的流动性。在许多情况中，优选在组合物中包含等渗剂，例如糖类、多元醇诸如甘露醇、山梨醇、或氯化钠。通过在组合物中包含延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸盐和明胶，可以造成可注射组合物的延长吸收。通过将所需量的活性化合物掺入含有一种或一组上文列举成分的合适溶剂，根据需要，随后进行灭菌微量过滤，可以制备无菌可注射溶液。一般而言，通过将活性化合物掺入包含基本的分散介质和所需的上面列举其它成分的无菌媒介来制备分散体。在用来制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况中，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，它们由其先前无菌过滤的溶液产生活性成分加任何其它所需成分的粉末。可以与载体材料组合以产生单剂量形式的活性成分的量将根据所治疗的受试者及具体的施用模式而变化。可以与载体材料组合以产生单剂量形式的活性成分的量一般是产生治疗效果的组合物量。一般而言，在百分比中，这种量的范围将是大约0.01％到大约99％的活性成分，优选大约0.1％到大约70％，最优选大约1％到大约30％的活性成分，与药剂学可接受的载体联合。可调整剂量方案以提供最佳的期望应答(例如治疗性应答)。例如，可以施用单次推注，可以随时间施用数个分开的剂量，或者可以根据治疗情况的紧急事件所指示的，按比例降低或提高剂量。以剂量单位形式配制胃肠外组合物对于易于施用和统一剂量而言是尤其有利的。剂量单位形式在用于本文时指在物理上离散的单位，适于作为单位剂量用于待治疗的受试者；每个单位都含有预定数量的活性化合物，经计算所述预定数量与所需的药剂学载体相关联产生期望的治疗效果。本发明剂量单位形式的规格取决于且直接依赖于(a)活性化合物的独特特性及要实现的特定治疗效果，和(b)技术上固有的配制这样的活性化合物用于治疗个体中的敏感性的局限。对于抗体的施用，剂量的范围为大约0.0001-100mg/kg，更加通常的为0.01-5mg/kg宿主体重。例如，剂量可以是0.3mg/kg体重、1mg/kg体重、3mg/kg体重、5mg/kg体重或10mg/kg体重或在1-10mg/kg的范围内。例示性的治疗方案要求每周施用一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每月一次、每3个月一次或每3-6个月一次。对于本发明的抗PD-1抗体而言，优选的剂量方案包括经静脉内施用1mg/kg体重或3mg/kg体重，其利用下列剂量给药方案之一来给予抗体：(i)每四周一剂达六个剂量，然后每三个月一剂；(ii)每三周一剂；(iii)给予一次3mg/kg体重，随后每三周给予1mg/kg体重。在有些方法中，同时施用具有不同结合特异性的两种或多种单克隆抗体，在该情况中所施用的每种抗体的剂量落入指定的范围内。通常分多次施用抗体。单个剂量之间的间隔可以是例如一周、一个月、三个月或一年。间隔还可以是不规则的，根据测量患者体内针对靶抗原的抗体的血液水平所指示。在有些方法中，调整剂量以达到大约1-1000μg/ml的血浆抗体浓度，而在有些方法中为大约25-300μg/ml。或者，可以将抗体作为持续释放剂型来施用，在该情况中需要施用的频繁较低。剂量和频率根据抗体在患者体内的半寿期而变化。一般而言，人抗体显示最长的半寿期，接下来是人源化抗体、嵌合抗体、和非人抗体。施用的剂量和频率可以根据治疗是预防性的还是治疗性的而变化。在预防性应用中，在较长一段时间里以相对较不频繁的间隔施用相对较低的剂量。有些患者在其余生继续接受治疗。在治疗性应用中，有时需要以相对较短的时间间隔施用相对较高的剂量直到疾病进程得以减弱或终止，优选直到患者显示疾病症状的部分或完全改善。其后，可以对患者施用预防性方案。本发明药用组合物中的活性成分的实际剂量水平可以变化，从而获得对于特定患者、组合物和施用模式有效实现期望治疗性应答而对患者是无毒的活性成分量。选定的剂量水平将取决于多种药动学因素，包括所采用的本发明的特定组合物或其酯、盐或酰胺的活性，施用路径，施用时间，所采用的特定化合物的排泄速率，治疗的持续时间，与所采用的特定组合物联合使用的其它药物、化合物和/或材料，所治疗患者的年龄、性别、体重、状况、大体健康状态和先前病历，及医学领域众所周知的类似因素。“治疗有效量”的本发明抗PD-1抗体优选导致疾病症状严重性降低、无疾病症状期的频率和持续时间提高、或对患病所造成的损害或残疾的预防。例如，对于肿瘤的治疗而言，“治疗有效量”优选相对于未治疗受试者抑制细胞生长或肿瘤生长达至少大约20％、更优选达至少大约40％、甚至更优选达至少大约60％、且仍更优选达至少大约80％。可以在动物模型系统中评估化合物抑制肿瘤生长的能力，所述动物模型系统可以预测在人肿瘤中的功效。或者，可以通过检验化合物的抑制能力来评估化合物的这种特性，这种体外抑制可通过熟练从业人员已知的测定法来进行。治疗有效量的治疗性化合物可以缩小肿瘤大小，或以其它方式改善受试者的症状。本领域普通技术人员将会能够基于诸如受试者体型大小、受试者症状的严重性、及所选择的特定组合物或施用路径的因素来确定此类量。另一方面，如本文所述，本说明书提供了包含抗PD-1抗体和抗CTLA-4抗体的部分的药物试剂盒。该试剂盒还可以进一步包含用于治疗过度增殖性疾病(诸如本文所述的癌症)的说明书。在另一个实施方案中，可以将抗PD-1和抗CTLA-4抗体以单位剂量形式共同包装。在某些实施方案中，同时施用两种或多种具有不同结合特异性(例如抗PD-1和抗CTLA-4)的单克隆抗体，在该情况中所施用的每种抗体的剂量都落入指定的范围内。可以将抗体作为单剂施用，或者更常见的是可以多次施用。单个剂量之间的间隔可以是例如一周、一个月、三个月或一年。根据通过测量患者体内针对靶抗原的抗体的血液水平所显示的，间隔也可以是不规则的。在有些方法中，调整剂量以获得大约1-1000μg/ml的血浆抗体浓度，而在有些方法中为大约25-300μg/ml。可以利用本领域已知的多种方法中的一种或多种经一种或多种施用路径来施用本发明的组合物。正如熟练技术人员将会理解的，施用的路径和/或模式将根据期望的结果而变化。本发明抗体的优选施用路径包括静脉内、肌肉内、皮内、腹膜内、皮下、脊髓/脊柱或其它胃肠外施用路径，例如通过注射或输注。短语“胃肠外施用”在用于本文时意味着除了肠和局部施用之外的施用模式，通常通过注射，包括但不限于静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注。或者，可以经非胃肠外路径来施用本发明的抗体，诸如局部、表皮或黏膜施用路径，例如鼻内、口服、阴道、直肠、舌下或局部。活性化合物可以与载体一起进行制备，所述载体将保护化合物以免迅速释放，诸如受控释放剂型，包括植入物、透皮贴、和微囊递送系统。可以使用生物可降解的、生物相容性的聚合物，诸如乙烯乙酸乙烯、聚酸酐类、聚乙醇酸、胶原、聚正酯类、和聚乳酸。制备此类剂型的许多方法已经获得了专利或为本领域技术人员所公知。参见例如SustainedandControlledReleaseDrugDeliverySystems,J.R.Robinson编,MarcelDekker,Inc.,NewYork,1978。可以用本领域已知的医疗装置来施用治疗性组合物。例如，在一个优选的实施方案中，可以用无针皮下注射装置来施用本发明的治疗性组合物，诸如美国专利号5,399,163；5,383,851；5,312,335；5,064,413；4,941,880；4,790,824；或4,596,556中所披露的装置。可用于本发明的众所周知的植入物和模块的实例包括：美国专利号4,487,603，其公开了可植入的微输注泵，用于以受控速率分配药物；美国专利号4,486,194，其公开了一种治疗用装置，用于通过皮肤施用药物；美国专利号4,447,233，其公开了一种药物输注泵，用于以精确输注速率投递药物；美国专利号4,447,224，其公开了一种变流可植入输注装置，用于持续的药物投递；美国专利号4,439,196，其公开了一种渗透性药物投递系统，它具有多室隔室；和美国专利号4,475,196，其公开了一种渗透性药物投递系统。将这些专利收入本文作为参考。许多其它的此类植入物、投递系统、和模块是本领域熟练技术人员所知道的。在某些实施方案中，可以配制本发明的人单克隆抗体以确保正确的体内分布。例如，血脑屏障(BBB)排斥许多高亲水性化合物。为确保本发明的治疗性化合物穿过BBB，(如果需要的话)可以将它们配制在例如脂质体中。对于生产脂质体的方法，参见例如美国专利4,522,811；5,374,548和5,399,331。脂质体可以包含一种或多种选择性的运输进入特定细胞或器官，因而增强靶向药物递送的模块(参见例如V.V.Ranade(1989)J.Clin.Pharmacol.29:685)。例示性的靶向模块包括叶酸或生物素(参见例如授予Low等人的美国专利5,416,016)；甘露糖苷(Umezawa等人(1988)Biochem.Biophys.Res.Commun.153:1038)；抗体(P.G.Bloeman等人(1995)FEBSLett.357:140；M.Owais等人(1995)Antimicrob.AgentsChemother.39:180)；表面活性剂蛋白A受体(Briscoe等人(1995)Am.J.Physiol.1233:134)；p120(Schreier等人(1994)J.Biol.Chem.269:9090)；还参见K.Keinanen；M.L.Laukkanen(1994)FEBSLett.346:123；J.J.Killion；I.J.Fidler(1994)ImmunoMethods4:273。本发明的用途和方法本发明的抗体、抗体组合物和方法具有众多体外和体内用途，包括例如检测PD-1或通过阻断PD-1来增强免疫应答。在一个优选的实施方案中，本发明的抗体是人抗体。例如，可以将这些分子施用于体外或离体培养的细胞，或者施用于人受试者，例如在体内，用以在多种情况中增强免疫力。因此，一方面，本发明提供了修饰受试者体内的免疫应答的方法，包括给受试者施用本发明的抗体或其抗原结合部分，使得受试者体内的的免疫应答得到修饰。优选的是，应答得到增强、刺激或上调。在用于本文时，术语“受试者”意图包括人和非人动物。非人动物包括所有的脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，诸如非人灵长类、绵羊、犬、猫、牛、马、鸡、两栖类和爬行类，尽管优选哺乳动物，诸如非人灵长类、绵羊、犬、猫、牛和马。优选的受试者包括需要增强免疫应答的人类患者。所述方法特别适于治疗患有可通过提升T细胞介导的免疫应答来治疗的病症的人类患者。在一个具体的实施方案中，所述方法特别适于治疗体内癌细胞。为了实现免疫力的抗原特异性增强，可以将抗PD-1抗体与目的抗原一起施用。当针对PD-1的抗体与另一种药剂一起施用时，二者可以以任一次序或同时施用。本发明进一步提供了检测样品中人PD-1抗原的存在或测量人PD-1抗原的量的方法，包括使样品和对照样品与特异性结合人PD-1的人单克隆抗体或其抗原结合部分在容许形成抗体或其部分与人PD-1之间的复合物的条件下接触。然后检测复合物的形成，其中样品与对照样品相比不同的复合物形成表明样品中存在人PD-1抗原。假如与CD28、ICOS和CTLA-4相比，本发明的抗体对PD-1有特异性结合，那么本发明的抗体可用于特异性检测细胞表面上的PD-1表达，此外，可用于通过免疫亲和纯化来纯化PD-1。癌症抗体对PD-1的阻断可以增强患者体内对癌细胞的免疫应答。PD-1的配体，PD-L1，在正常人细胞中不表达，但在多种人癌症中丰度高(Dong等人(2002)NatMed8:787-9)。PD-1与PD-L1之间的相互作用导致浸润肿瘤的淋巴细胞减少、T细胞受体介导的增殖降低、及癌细胞的免疫逃脱(Dong等人(2003)JMolMed81:281-7；Blank等人(2005)CancerImmunol.Immunother.54:307-314；Konishi等人(2004)Clin.CancerRes.10:5094-100)。通过抑制PD-1与PD-L1的局部相互作用可以逆转免疫抑制作用，而且当PD-1与PD-L2的相互作用也受到阻断时，此效果是叠加的(Iwai等人(2002)PNAS99:12293-7；Brown等人(2003)J.Immunol.170:1257-66)。尽管以往的研究显示T细胞增殖可以通过抑制PD-1与PD-L1的相互作用而恢复，但尚无通过阻断PD-1/PD-L1相互作用对体内癌症肿瘤生长的直接效果的报告。一方面，本发明涉及使用抗PD-1抗体治疗受试者，使得癌性肿瘤的生长得到抑制。可以单独使用抗PD-1抗体来抑制癌性肿瘤的生长。或者，可以联合下文所述其它免疫原性剂、标准癌症治疗、或其它抗体来使用抗PD-1抗体。因此，在一个实施方案中，本发明提供了抑制受试者中肿瘤细胞生长的方法，包括给受试者施用治疗有效量的抗PD-1抗体或其抗原结合部分。优选的是，所述抗体是人抗PD-1抗体(诸如本文所述的任何人抗人PD-1抗体)。另外/或者，所述抗体可以是嵌合的或人源化的抗PD-1抗体。其生长可以使用本发明的抗体来抑制的优选的癌症包括通常对免疫疗法有响应的癌症。进行治疗的优选癌症的非限制性例子包括黑素瘤(例如转移性恶性黑素瘤)、肾癌(例如透明细胞癌)、前列腺癌(例如激素不应性前列腺腺癌)、乳癌、结肠癌和肺癌(例如非小细胞肺癌)。此外，本发明包括其生长可以使用本发明的抗体来抑制的顽固性或复发性恶性肿瘤。可以使用本发明的方法来治疗的其它癌症的例子包括骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头或颈癌、皮肤或眼内恶性黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛区癌、胃肠、睾丸癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、阴户癌、何杰金氏病、非何杰金氏淋巴瘤、食道癌、小肠癌、内分泌系统的癌症、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、慢性或急性白血病(包括急性髓细胞样白血病、慢性髓细胞样白血病、急性成淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病)、儿童期实体瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)的赘生物/肿瘤、原发性CNS淋巴瘤、肿瘤血管发生、脊髓轴(spinalaxis)肿瘤、脑干胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西氏(Kaposi)肉瘤、表皮样癌、鳞状细胞癌、T细胞淋巴瘤、环境诱发的癌症(包括由石棉诱发的那些癌症)、及所述癌症的组合。本发明还可用于治疗转移性癌症，尤其是表达PD-L1的转移性癌症(Iwai等人(2005)Int.Immunol.17:133-144)。任选的是，针对PD-1的抗体可以与免疫原性剂联合，诸如癌细胞、纯化的肿瘤抗原(包括重组蛋白、肽、和碳水化合物分子)、细胞、和经编码免疫刺激性细胞因子的基因转染的细胞(He等人(2004)J.Immunol.173:4919-28)。可以使用的肿瘤疫苗的非限制性实例包括黑素瘤抗原的肽，诸如肽gp100、MAGE抗原、Trp-2、MART1和/或酪氨酸酶、或经转染而表达细胞因子GM-CSF的肿瘤细胞(下文有进一步讨论)。在人类中，已经显示有些肿瘤是免疫原性的，诸如黑素瘤。预计通过PD-1阻断提高T细胞激活的阈值，我们可以期望在宿主中激活肿瘤应答。在与疫苗接种方案联合时，PD-1阻断有可能是最有效的。已经为针对肿瘤的疫苗接种设计了许多实验策略(参见Rosenberg,S.,2000,DevelopmentofCancerVaccines,ASCOEducationalBookSpring:60-62；Logothetis,C.,2000,ASCOEducationalBookSpring:300-302；Khayat,D.,2000,ASCOEducationalBookSpring:414-428；Foon,K.,2000,ASCOEducationalBookSpring:730-738；还参见Restifo,N.andSznol,M.,CancerVaccines,Ch.61,pp.3023-3043,在DeVita,V.等编的Cancer:PrinciplesandPracticeofOncology中,第5版,1997)。在这些策略之一中，使用自体的或同种异基因的肿瘤细胞来制备疫苗。已经显示当肿瘤细胞经转导而表达GM-CSF时，这些细胞疫苗最有效。已经显示GM-CSF是用于肿瘤疫苗接种的抗原呈递的有力激活剂(Dranoff等人(1993)Proc.Natl.Acad.SciU.S.A.90:3539-43)。在各种肿瘤中进行的基因表达和大规模基因表达样式研究已经带来所谓肿瘤特异性抗原的定义(Rosenberg,SA(1999)Immunity10:281-7)。在许多情况中，这些肿瘤特异性抗原是在肿瘤和在肿瘤起源细胞中表达的分化抗原，例如黑色素细胞抗原gp100、MAGE抗原和Trp-2。更加重要的是，这些抗原中的许多可以显示为在宿主中发现的肿瘤特异性T细胞的靶物。可以与在肿瘤中表达的重组蛋白和/或肽的集合联合使用PD-1阻断，以产生针对这些蛋白质的免疫应答。这些蛋白质在正常情况下被免疫系统视为自身抗原，所以对于它们是耐受的。肿瘤抗原还可以包括蛋白质端粒酶，其是染色体端粒合成所需的且其在超过85％的人类癌症中表达，而仅在有限数目的体组织中表达(Kim,N等人(1994)Science266:2011-2013)。(可通过多种手段来保护这些体组织免受免疫攻击。)肿瘤抗原还可以是由于改变蛋白质序列或生成两种无关序列之间的融合蛋白(即费城染色体中的bcr-abl)的体细胞突变或来自B细胞肿瘤的独特型而在癌细胞中表达的“新抗原”(neo-antigen)。其它肿瘤疫苗可以包括来自牵涉人类癌症的病毒的蛋白质，诸如人乳头瘤病毒(HPV)、肝炎病毒(HBV和HCV)和卡波西氏疱疹肉瘤病毒(KHSV)。可以与PD-1阻断联合使用的另一种形式的肿瘤特异性抗原是从肿瘤组织自身分离得到的纯化的热休克蛋白(HSP)。这些热休克蛋白包含来自肿瘤细胞的蛋白质片段，而且这些HSP在投递至抗原呈递细胞以引发肿瘤免疫力方面是高度有效的(Suot,R&Srivastava,P(1995)Science269:1585-1588；Tamura,Y.等人(1997)Science278:117-120)。树突细胞(DC)是可用于引发抗原特异性应答的有力的抗原呈递细胞。DC可以离体生产并与各种蛋白质和肽抗原以及肿瘤细胞提取物一起加载(Nestle,F.等人(1998)NatureMedicine4:328-332)。还可以通过遗传手段来转导DC以表达这些肿瘤抗原。DC还已直接融合肿瘤细胞用于免疫目的(Kugler,A.等人(2000)NatureMedicine6:332-336)。作为疫苗接种方法，DC免疫可以有效联合PD-1阻断以激活更有力的抗肿瘤应答。PD-1阻断还可以联合标准癌症治疗。PD-1阻断可以有效联合化疗方案。在这些情况中，有可能减少所施用的化疗剂的剂量(Mokyr,M.等人(1998)CancerResearch58:5301-5304)。这样的联合的一个例子是抗PD-1抗体联合达卡巴嗪(decarbazine)来治疗黑素瘤。这样的联合的另一个例子是抗PD-1抗体联合白介素-2(IL-2)来治疗黑素瘤。在PD-1阻断和化疗联合使用后面的科学原理是细胞死亡将会导致抗原呈递途径中肿瘤抗原水平升高，所述细胞死亡是大多数化疗化合物的细胞毒性作用的结果。可以通过细胞死亡带来与PD-1阻断的协同作用的其它联合疗法为放射、手术和激素剥夺(hormonedeprivation)。这些方案的每一种都在宿主中产生肿瘤抗原的来源。血管发生抑制剂也可以与PD-1阻断联合。对血管发生的抑制导致肿瘤细胞死亡，这可以将肿瘤抗原投入宿主抗原呈递途径。PD-1阻断性抗体还可以与将表达Fcα或Fcγ受体的效应细胞靶向肿瘤细胞的双特异性抗体联合使用(参见例如美国专利号5,922,845和5,837,243)。可以使用双特异性抗体靶向两种分开的抗原。例如，已经使用抗Fc受体/抗肿瘤抗原(例如Her-2/neu)双特异性抗体来将巨噬细胞靶向肿瘤位点。这种靶向可以更加有效的激活肿瘤特异性应答。这些应答的T细胞臂将通过利用PD-1阻断而得以提升。或者，可以通过使用与肿瘤抗原和树突细胞特异性细胞表面标志结合的双特异性抗体将抗原直接投递至DC。肿瘤通过极其多种机制来规避宿主的免疫监视。这些机制中的许多可以通过肿瘤所表达的且是免疫抑制性的蛋白质的灭活来克服。这些包括TGF-β(Kehrl,J.等人(1986)J.Exp.Med.163:1037-1050)、IL-10(Howard,M.&O'Garra,A.(1992)ImmunologyToday13:198-200)、和Fas配体(Hahne,M.等人(1996)Science274:1363-1365)。针对这些实体中每一种的抗体可以与抗PD-1联合使用以抵消免疫抑制剂的效果并促成宿主的肿瘤免疫应答。可用于激活宿主免疫响应性的其它抗体可以与抗PD-1联合使用。这些包括树突细胞表面上激活DC功能和抗原呈递的分子。抗CD40抗体能够有效取代T辅助细胞活性(Ridge,J.等人(1998)Nature393:474-478)，而且可以与PD-1抗体联合使用(Ito,N.等人(2000)Immunobiology201(5):527-40)。针对T细胞共刺激性分子诸如CTLA-4(例如美国专利号5,811,097)、OX-40(Weinberg,A.等人(2000)Immunol164:2160-2169)、4-1BB(Melero,I.等人(1997)NatureMedicine3:682-685(1997)和ICOS(Hutloff,A.等人(1999)Nature397:262-266)的激活性抗体还可以导致T细胞激活水平的提高。目前正在使用骨髓移植来治疗多种造血起源的肿瘤。尽管移植物抗宿主病是这种治疗的后果，但可以从移植物抗肿瘤应答获得治疗益处。可以利用PD-1阻断来提高供体移入肿瘤特异性T细胞的功效。还有数种实验性治疗方案，其牵涉抗原特异性T细胞的离体激活和扩增及这些细胞进入受体的继承性转移，以产生针对肿瘤的抗原特异性T细胞(Greenberg,R.&Riddell,S.(1999)Science285:546-51)。还可以利用这些方法来激活针对传染剂诸如CMV的T细胞应答。可以预期在抗PD-1抗体存在时的离体激活提高继承性转移的T细胞的频率和活性。传染病利用本发明的其它方法来治疗已经暴露于特定毒素或病原体的患者。因此，本发明的另一方面提供了治疗受试者中的传染病的方法，包括给受试者施用抗PD-1抗体或其抗原结合部分，使得受试者中的传染病得到治疗。优选的是，所述抗体是人抗人PD-1抗体(诸如本文所述任何人抗PD-1抗体)。另外/或者，所述抗体可以是嵌合的或人源化的抗体。类似于上文所讨论的它对于肿瘤的应用，抗体介导的PD-1阻断可以单独使用，或作为佐剂，与疫苗联合，以刺激针对病原体、毒素和自身抗原的免疫应答。这种治疗方法可以对它特别有用的病原体的例子包括目前没有有效疫苗的病原体，或常规疫苗并非完全有效的病原体。这些包括但不限于HIV、肝炎(甲型、乙型和丙型)(Hepatitis(A,B,&C))、流行性感冒(Influenza)、疱疹(Herpes)、贾第虫(病)(Giardia)、疟疾(Malaria)、利什曼虫(病)(Leishmania)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、铜绿假单胞菌(PseudomonasAeruginosa)。PD-1阻断对于由诸如HIV的传染剂导致的感染特别有用，所述传染剂在感染过程中呈递变化的抗原。这些新表位在抗人PD-1施用时被识别成外来物，因而引起强烈的T细胞应答，其并不被通过PD-1的阴性信号所减弱。引起可通过本发明方法治疗的感染的病原性病毒的一些实例包括HIV、肝炎(甲型、乙型或丙型)病毒(hepatitis(A,B,orC))、疱疹病毒(herpesvirus)(例如VZV、HSV-1、HAV-6、HSV-II和CMV、埃巴二氏病毒(EpsteinBarrvirus))、腺病毒(adenovirus)、流感病毒(influenzavirus)、黄病毒(flaviviruses)、艾柯病毒(echovirus)、鼻病毒(rhinovirus)、柯萨奇病毒(coxsackievirus)、冠状病毒(cornovirus)、呼吸道合胞病毒(respiratorysyncytialvirus)、腮腺炎病毒(mumpsvirus)、轮状病毒(rotavirus)、麻疹病毒(measlesvirus)、风疹病毒(rubellavirus)、细小病毒(parvovirus)、牛痘病毒/痘苗病毒(vacciniavirus)、HTLV病毒、登革热病毒(denguevirus)、乳头瘤病毒(papillomavirus)、软疣病毒(molluscumvirus)、脊髓灰质炎病毒(poliovirus)、狂犬病病毒(rabiesvirus)、JC病毒和虫媒病毒性脑炎病毒(arboviralencephalitisvirus)。引起可通过本发明方法治疗的感染的病原性细菌的一些实例包括衣原体(chlamydia)、立克次氏体细菌(rickettsialbacteria)、分枝杆菌(mycobacteria)、葡萄球菌(staphylococci)、链球菌(streptococci)、肺炎球菌(pneumonococci)、脑膜炎球菌(meningococci)和淋球菌(conococci)、克雷伯氏菌(klebsiella)、变形菌(proteus)、沙雷氏菌(serratia)、假单胞菌(pseudomonas)、军团菌(legionella)、白喉(diphtheria)、沙门氏菌(salmonella)、(芽胞)杆菌(bacilli)、霍乱(cholera)、破伤风(tetanus)、肉毒中毒(botulism)、炭疽(anthrax)、鼠疫(plague)、钩端螺旋体病(leptospirosis)和莱姆病细菌(Lymesdiseasebacteria)。引起可通过本发明方法治疗的感染的病原性真菌的一些实例包括假丝酵母(Candida)(白色假丝酵母(albicans)、克鲁斯假丝酵母(krusei)、光滑假丝酵母(glabrata)、热带假丝酵母(tropicalis)等)、新型隐球酵母(Cryptococcusneoformans)、曲霉(Aspergillus)(烟曲霉(fumigatus)、黑曲霉(niger)等)、毛霉目(Mucorales)的属(毛霉属(mucor)、犁头霉属(absidia)、根霉属(rhizophus))、申克氏孢子丝菌(Sporothrixschenkii)、皮炎芽酵母(Blastomycesdermatitidis)、巴西副球孢子菌(Paracoccidioidesbrasiliensis)、粗球孢菌(Coccidioidesimmitis)和夹膜组织胞浆菌(Histoplasmacapsulatum)。引起可通过本发明方法治疗的感染的病原性寄生虫的一些实例包括痢疾内变形虫(Entamoebahistolytica)、结肠肠袋虫(Balantidiumcoli)、福纳氏虫(Naegleriafowleri)、棘变形虫(Acanthamoebasp.)、吸吮贾第虫(Giardialambia)、隐孢子虫(Cryptosporidiumsp.)、卡氏肺囊虫(Pneumocystiscarinii)、间日疟原虫(Plasmodiumvivax)、田鼠巴贝虫(Babesiamicroti)、布鲁斯锥虫(Trypanosomabrucei)、克鲁兹锥虫(Trypanosomacruzi)、多氏利什曼虫(Leishmaniadonovani)、鼠弓浆虫(Toxoplasmagondi)和巴西日圆线虫(Nippostrongylusbrasiliensis)。在上述所有方法中，可以将PD-1阻断与其它形式的免疫疗法联合，诸如细胞因子治疗(例如干扰素、GM-CSF、G-CSF、IL-2)或双特异性抗体疗法，其提供增强的肿瘤抗原呈递(参见例如Holliger(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448；Poljak(1994)Structure2:1121-1123)。自身免疫反应抗PD-1抗体可以引发和扩大自身免疫应答。事实上，利用肿瘤细胞和肽疫苗诱导抗肿瘤应答揭示了许多抗肿瘤应答牵涉抗自身反应性(在抗CTLA-4+GM-CSF修饰的B16黑素瘤中观察到的除色素作用(vanElsas等人,同上)；在Trp-2疫苗接种小鼠中观察到的除色素作用(Overwijk,W.等人(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.96:2982-2987)；由TRAMP肿瘤细胞疫苗(Hurwitz,A.(2000)同上)、黑素瘤肽抗原疫苗接种诱发的自身免疫性前列腺炎，和在人临床试验中观察到的白癜风(Rosenberg,SAandWhite,DE(1996)J.ImmunotherEmphasistumorImmunol19(1):81-4)。所以，有可能考虑抗PD-1阻断与各种自身蛋白质的联合使用以设计疫苗接种方案来有效生成针对这些自身蛋白质的免疫应答，用于疾病治疗。例如，阿尔茨海默氏病牵涉Aβ肽在脑中淀粉样蛋白沉积物中的不适当积累；针对淀粉样蛋白的抗体应答能够清除这些淀粉样蛋白沉积物(Schenk等人(1999)Nature400:173-177)。其它自身蛋白质也可用作靶物，诸如IgE用于治疗变态反应和哮喘，及TNFα用于治疗类风湿性关节炎。最后，通过利用抗PD-1抗体可以诱导针对各种激素的抗体应答。针对生殖激素的中和性抗体应答可以用于避孕。针对特定肿瘤生长所需的激素和其它可溶性因子的中和性抗体应答也可以视为可能的疫苗接种的靶物。与上文所述抗PD-1抗体用途类似的方法可以用于诱导治疗性免疫应答以治疗患有其它自身抗原的不适当积累的患者，诸如淀粉样蛋白沉积物(包括阿尔茨海默氏病中的Aβ)、细胞因子(诸如TNFα)和IgE。疫苗通过抗PD-1抗体与目的抗原(例如疫苗)的共施用，可以将抗PD-1抗体用于刺激抗原特异性免疫应答。因此，另一方面，本发明提供了在受试者中增强针对抗原的免疫应答的方法，包括给受试者施用：(i)抗原；和(ii)抗PD-1抗体或其抗原结合部分，使得受试者体内针对抗原的免疫应答得到增强。优选的是，所述抗体是人抗人PD-1抗体(诸如本文所述的任何人抗PD-1抗体)。另外/或者，所述抗体可以是嵌合的或人源化的抗体。所述抗原可以是例如肿瘤抗原、病毒抗原、细菌抗原或来自病原体的抗原。此类抗原的非限制性实例包括上文各节所讨论的那些，诸如上文所讨论的肿瘤抗原(或肿瘤疫苗)、或来自上文所述病毒、细菌或其它病原体的抗原。在体内或在体外施用本发明的抗体组合物(例如人单克隆抗体、多特异性和双特异性分子、及免疫偶联物)的合适路径是本领域众所周知的，是普通技术人员可以选择的。例如，可以通过注射(例如静脉内或皮下)来施用抗体组合物。所用分子的合适剂量将取决于受试者的年龄和体重及抗体组合物的浓度和/或剂型。如前所述，本发明的人抗PD-1抗体可以与一种或多种其它治疗剂共施用，例如细胞毒剂、放射毒性剂或免疫抑制剂。可以将抗体连接至所述药剂(作为免疫复合物)，或者可以与所述药剂分开施用。在后一种情况中(分开施用)，抗体可以在所述药剂之前、之后或同时施用，或者可以与其它已知疗法共施用，例如抗癌疗法，例如放射。此类治疗剂包括抗肿瘤剂，诸如多柔比星(doxorubicin)(阿霉素(adriamycin))、顺铂(cisplatin)、硫酸博来霉素(bleomycinsulfate)、卡莫司汀(carmustine)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、达卡巴嗪(decarbazine)和环磷酰(cyclophosphamide)、羟脲(hydroxyurea)等，这些治疗剂其自身仅仅是在对患者有毒性或亚毒性的水平上有效。顺铂静脉内施用100mg/剂，每四周一次，而阿霉素静脉内施用60-75mg/ml剂量，每21天一次。本发明的人抗PD-1抗体或其抗原结合片段与化疗剂的共施用提供两种抗癌剂，其通过不同机制发挥作用，所述机制对人肿瘤细胞产生细胞毒性作用。此类共施用可以解决由于药物抗性的形成或使得肿瘤细胞与抗体不反应的肿瘤细胞抗原性变化而导致的问题。包含本发明的抗体组合物(例如人抗体、双特异性或多特异性分子、或免疫偶联物)及使用说明书的试剂盒也在本发明的范围内。试剂盒可进一步包含至少一种别的药剂，或一种或多种别的本发明人抗体(例如具有互补活性的人抗体，其与第一种人抗体结合PD-1抗原中的不同表位)。试剂盒通常包括标签，其指明试剂盒内容物的预期用途。术语标签包括在试剂盒上或与试剂盒一起提供的或者以其它方式随附于试剂盒的、任何书写的或记录的材料。联合疗法本发明部分基于下列实验数据。使用小鼠肿瘤模型(MC38结肠癌和SA1/N纤维肉瘤)来检验通过联合免疫刺激性治疗性抗体抗CTLA-4和抗PD-1来治疗肿瘤的体内效果。与肿瘤细胞植入物同时(实施例14和17)或在植入肿瘤细胞足够时间以变成确立的肿瘤之后(实施例15、16和18)提供联合免疫疗法。不管抗体治疗的时间安排如何，发现单独的抗CTLA-4抗体治疗和单独的抗PD-1抗体(嵌合抗体，其中大鼠抗小鼠PD-1用小鼠免疫球蛋白Fc区修饰，见实施例1)治疗对于降低MC38肿瘤模型中的肿瘤生长具有中等效果(见例如图21A-21D、24A-24D和27A-27H)。单独的抗CTLA-4抗体在SA1/N肿瘤模型中相当有效(见图30D)，其需要较低剂量的抗CTLA-4抗体用于此模型中的组合研究。尽管如此，与单独使用任一种抗体的治疗相比，抗CTLA-4抗体和抗PD-1抗体的联合治疗在降低肿瘤生长方面显示出意料不到的、显著更大的效果(见例如图21D、24D、30F和33H-33J)。此外，实施例14、16和18的结果显示，与单独使用任一种抗体的治疗相比，即使是在亚最优的治疗性剂量，抗CTLA-4抗体和抗PD-1抗体的联合治疗对肿瘤生长也具有显著的(协同)效果(即联合疗法在亚治疗剂量上比任一种单一疗法都要出人意料的更加有效)。不希望受理论束缚，有可能的是通过PD-1和CTLA-4阻断来提高T细胞激活的阈值，由此可以激活宿主中的抗肿瘤应答。在一个实施方案中，本发明提供了治疗过度增殖性疾病的方法，包括给受试者施用PD-1抗体和CTLA-4抗体。在其它实施方案中，以亚治疗剂量施用抗PD-1抗体，以亚治疗剂量施用抗CTLA-4抗体，或以亚治疗剂量施用二者。在另一个实施方案中，本发明提供了改变与用免疫刺激剂治疗过度增殖性疾病有关的不良事件的方法，包括给受试者施用抗PD-1抗体和亚治疗剂量的抗CTLA-4抗体。在某些实施方案中，所述受试者是人。在某些实施方案中，抗CTLA-4抗体是人序列单克隆抗体10D1而抗PD-1抗体是人序列单克隆抗体，诸如17D8、2D3、4H1、5C4和4A11。已经分离了人序列单克隆抗体17D8、2D3、4H1、5C4和4A11，并进行了结构表征，如美国临时专利号60/679,466中所述。可以通过多种技术来生产本发明的抗CTLA-4抗体和抗PD-1单克隆抗体(mAb)和人序列抗体，包括常规单克隆抗体方法学，例如KohlerandMilstein(1975)Nature256:495的标准体细胞杂交技术。可以采用生产单克隆抗体的任何技术，例如B淋巴细胞的病毒或致癌转化。一种用于制备杂交瘤的动物系统是鼠系统。在小鼠中生产杂交瘤是已完全建立的方法。用于分离供融合用的经免疫脾细胞的免疫方案和技术是本领域已知的。融合配偶体(例如鼠骨髓瘤细胞)和融合规程也是已知的(参见例如HarlowandLane(1988)Antibody,ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarborNewYork)。本发明的抗CTLA-4抗体可以与人CTLA-4上的表位结合从而抑制CTLA-4与人B7反受体相互作用。由于人CTLA-4与人B7的相互作用转导导致携带人CTLA-4受体的T细胞灭活的信号，因此所述相互作用的拮抗作用有效诱导、提升或延长携带人CTLA-4受体的T细胞的激活，由此延长或提升免疫应答。抗CTLA-4抗体在美国专利号5,811,097；5,855,887；6,051,227中；在PCT申请公开号WO01/14424和WO00/37504中；及在美国专利公开号2002/0039581中有描述。将这些参考文献中的每一篇明确收入本文作为参考，用于描述抗CTLA-4抗体的目的。例示性的临床抗CTLA-4抗体是人单克隆抗体10D1，如在WO01/14424和美国专利申请号09/644,668中所公开的。已经以单剂或多剂，单独的或联合疫苗、化疗或白介素-2的，给超过500名诊断患有转移性黑素瘤、前列腺癌、淋巴瘤、肾细胞癌、乳癌、卵巢癌和HIV的患者施用了抗体10D1。本发明的方法所涵盖的其它抗CTLA-4抗体包括例如：WO98/42752；WO00/37504；美国专利号6,207,156；Hurwitz等人(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA95(17):10067-10071；Camacho等人(2004)J.Clin.Oncology22(145):AbstractNo.2505(抗体CP-675206)；和Mokyr等人(1998)CancerRes.58:5301-5304中所公开的那些。在某些实施方案中，本发明的方法包括抗CTLA-4抗体的用途，所述抗体是人序列抗体，优选单克隆抗体，而在另一个实施方案中是单克隆抗体10D1。在某些实施方案中，抗CTLA-4抗体以5x10-8M或更小的KD与人CTLA-4结合，以1x10-8M或更小的KD与人CTLA-4结合，以5x10-9M或更小的KD与人CTLA-4结合，或以1x10-8M和1x10-10M之间或更小的KD与人CTLA-4结合。抗体的组合可用于通过阻断PD-1和CTLA-4来增强针对过度增殖性疾病的免疫应答。在一优选的实施方案中，本发明的抗体是人抗体。例如，可以对培养中的、在体外的或离体的细胞或者向人受试者(例如在体内)施用这些分子，以增强多种情形中的免疫力。因此，一方面，本发明提供了修饰受试者中的免疫应答的方法，包括给受试者施用本发明的抗体组合或其抗原结合部分的组合，使得受试者中的免疫应答得到修饰。优选的是，应答得到增强、刺激或上调。在另一实施方案中，本说明书提供了改变与用免疫刺激性治疗剂治疗过度增殖性疾病有关的不良事件的方法，包括给受试者施用抗PD-1抗体和亚治疗剂量的抗CTLA-4抗体。抗体对PD-1和CTLA-4的阻断可以增强患者体内针对癌性细胞的免疫应答。可以使用本说明书的抗体抑制其生长的癌症包括通常对免疫疗法有响应的癌症。用本说明书的联合疗法治疗的癌症的代表性实例包括黑素瘤(例如转移性恶性黑素瘤)、肾癌、前列腺癌、乳癌、结肠癌和肺癌。可以利用本说明书的方法治疗的其它癌症的例子包括骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头或颈癌、皮肤或眼内恶性黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛区癌、胃癌、睾丸癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、阴户癌、何杰金氏病、非何杰金氏淋巴瘤、食道癌、小肠癌、内分泌系统的癌症、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、慢性或急性白血病(包括急性髓细胞样白血病、慢性髓细胞样白血病、急性成淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病)、儿童期实体瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)的赘生物/肿瘤、原发性CNS淋巴瘤、肿瘤血管发生、脊髓轴肿瘤、脑干胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西氏肉瘤、表皮样癌、鳞状细胞癌、T细胞淋巴瘤、环境诱发的癌症(包括由石棉诱发的那些癌症)、及所述癌症的组合。本发明还可用于治疗转移性癌症。在某些实施方案中，可以将本文所讨论的治疗性抗体组合作为药剂学可接受载体中的单一组合物同时施用，或者可以作为每种抗体在药剂学可接受载体中的分开的组合物同时施用。在另一个实施方案中，可以序贯施用治疗性抗体的组合。例如，可以序贯施用抗CTLA-4抗体和抗PD-1抗体，诸如先施用抗CTLA-4后施用抗PD-1，或者先施用抗PD-1后施用抗CTLA-4。另外，如果序贯施用超过一个剂量的联合疗法，可以在每次施用时间点颠倒序贯施用的次序或保持相同次序，序贯施用可以与同时施用或其任意组合联合。例如，第一次施用抗CTLA-4抗体和抗PD-1抗体的组合可以是同时的，第二次施用可以是序贯的，先抗CTLA-4后抗PD-1，而第三次施用可以是序贯的，先PD-1后抗CTLA-4，等。另一种代表性的剂量给药方案可以包括第一次施用是序贯的，先PD-1后CTLA-4，而后续施用可以是同时的。任选的是，抗PD-1和抗CTLA-4抗体组合可以进一步联合免疫原剂，诸如癌性细胞、纯化的肿瘤抗原(包括重组蛋白质、肽和碳水化合物分子)、细胞、及经编码免疫刺激性细胞因子的基因转染的细胞(He等人(2004)J.Immunol.173:4919-28)。可以使用的肿瘤疫苗的非限制性实例包括黑素瘤抗原的肽，诸如肽gp100、MAGE抗原、Trp-2、MART1和/或酪氨酸酶，或经转染而表达细胞因子GM-CSF的肿瘤细胞(下面有进一步讨论)。联合的PD-1和CTLA-4阻断可以进一步联合疫苗接种方案。已经设计了针对肿瘤的疫苗接种的许多实验策略(参见Rosenberg,S.(2000)DevelopmentofCancerVaccines,ASCOEducationalBookSpring:60-62；Logothetis,C.,2000,ASCOEducationalBookSpring:300-302；Khayat,D.(2000)ASCOEducationalBookSpring:414-428；Foon,K.(2000)ASCOEducationalBookSpring:730-738；还参见RestifoandSznol,CancerVaccines,Ch.61,pp.3023-3043,在DeVita等编的Cancer:PrinciplesandPracticeofOncology中,第5版,1997)。在这些策略之一中，使用自体或同种异基因的肿瘤细胞来制备疫苗。已经显示当肿瘤细胞经转导而表达GM-CSF时这些细胞疫苗最有效。已经显示GM-CSF是用于肿瘤疫苗接种的抗原呈递的有力激活剂(Dranoff等人(1993)Proc.Natl.Acad.SciU.S.A.90:3539-43)。各种肿瘤中基因表达和大规模基因表达样式的研究已经带来了对所谓的肿瘤特异性抗原的定义(Rosenberg(1999)Immunity10:281-7)。在许多情况中，这些肿瘤特异性抗原是在肿瘤中和在肿瘤起源细胞中表达的分化抗原，例如黑色素细胞抗原gp100、MAGE抗原和Trp-2。更重要的是，许多这些抗原可以显示为在宿主中发现的肿瘤特异性T细胞的靶物。在某些实施方案中，使用本文所述的抗体组合物的联合PD-1和CTLA-4阻断可以与在肿瘤中表达的重组蛋白和/或肽的集合联合使用，以产生针对这些蛋白质的免疫应答。这些蛋白质在正常情况下被免疫系统视为自身抗原，因此对它们耐受。肿瘤抗原还可以包括蛋白质端粒酶，它是染色体端粒合成所需的且在超过85％的人类癌症中表达，而只在有限数目的体组织中表达(Kim等人(1994)Science266:2011-2013)。(可通过各种手段来保护这些体组织免受免疫攻击。)肿瘤抗原还可以是由于改变蛋白质序列或生成两种无关序列之间的融合蛋白(费城染色体中的bcr-abl)的体细胞突变或来自B细胞肿瘤的独特型而在癌细胞中表达的“新抗原”。其它肿瘤疫苗可以包括来自牵涉人癌症的病毒的蛋白质，诸如人乳头瘤病毒(HPV)、肝炎病毒(HBV和HCV)和卡波西氏疱疹肉瘤病毒(KHSV)。可以与PD-1阻断联合使用的另一种形式的肿瘤特异性抗原是从肿瘤组织自身分离得到的纯化的热休克蛋白(HSP)。这些热休克蛋白包含来自肿瘤细胞的蛋白质片段，而且这些HSP在递送至抗原呈递细胞以引发肿瘤免疫力方面是高度有效的(Suot&Srivastava(1995)Science269:1585-1588；Tamura等人(1997)Science278:117-120)。树突细胞(DC)是可用来引发抗原特异性应答的有力的抗原呈递细胞。DC可以离体生产并与各种蛋白质和肽抗原以及肿瘤细胞提取物一起加载(Nestle等人(1998)NatureMedicine4:328-332)。还可以通过遗传手段来转导DC以表达这些肿瘤抗原。DC还已直接融合肿瘤细胞用于免疫目的(Kugler等人(2000)NatureMedicine6:332-336)。作为疫苗接种方法，DC免疫可以进一步有效联合联合的PD-1和CTLA-4阻断以激活更有力的抗肿瘤应答。联合的PD-1和CTLA-4阻断还可以进一步联合标准癌症治疗。例如，联合的PD-1和CTLA-4阻断可以有效联合化疗方案。在这些情况中，如对于联合抗PD-1和抗CTLA-4抗体所观察到的，有可能降低与本说明书的组合一起施用的其它化疗剂的剂量(Mokyr等人(1998)CancerResearch58:5301-5304)。此类联合的一个例子是抗PD-1和抗CTLA-4抗体组合进一步联合达卡巴嗪(decarbazine)来治疗黑素瘤。另一个例子是抗PD-1和抗CTLA-4抗体组合进一步联合白介素-2(IL-2)来治疗黑素瘤。在PD-1和CTLA-4阻断与化疗联合使用后面的科学原理是细胞死亡将会导致抗原呈递途径中肿瘤抗原水平升高，所述细胞死亡是大多数化疗化合物的细胞毒性作用的结果。可以通过细胞死亡带来与PD-1和CTLA-4阻断的协同作用的其它联合疗法包括放射、手术和激素剥夺。这些方案的每一种都在宿主中产生肿瘤抗原的来源。血管发生抑制剂也可以与联合的PD-1和CTLA-4阻断联合。对血管发生的抑制导致肿瘤细胞死亡，这也可以是将投入宿主抗原呈递途径的肿瘤抗原的来源。PD-1和CTLA-4阻断性抗体组合还可以与将表达Fcα或Fcγ受体的效应细胞靶向肿瘤细胞的双特异性抗体联合使用(参见例如美国专利号5,922,845和5,837,243)。可以使用双特异性抗体靶向两种分开的抗原。例如，已经使用抗Fc受体/抗肿瘤抗原(例如Her-2/neu)双特异性抗体来将巨噬细胞靶向肿瘤位点。这种靶向可以更加有效的激活肿瘤特异性应答。这些应答的T细胞臂将通过利用联合的PD-1和CTLA-4阻断而得以提升。或者，可以通过使用与肿瘤抗原和树突细胞特异性细胞表面标志结合的双特异性抗体将抗原直接递送至DC。在另一个实例中，抗PD-1和抗CTLA-4抗体组合可以与抗瘤抗体联合使用，诸如(rituximab)、(trastuzumab)、(tositumomab)、(ibritumomab)、(alemtuzumab)、(eprtuzumab)、(bevacizumab)和(erlotinib)等等。举例而言且不希望受理论束缚，用抗癌抗体或偶联有毒素的抗癌抗体进行的治疗能导致癌细胞(例如肿瘤细胞)死亡，这将加强由CTLA-4或PD-1介导的免疫应答。在一个例示性的实施方案中，过度增殖性疾病(例如癌症肿瘤)的治疗可以包括抗癌抗体与抗PD-1和抗CTLA-4抗体的联合，同时或序贯施用或其任意组合，这可以加强宿主的抗肿瘤免疫应答。肿瘤通过极其多种机制来规避宿主的免疫监视。这些机制中的许多可以通过肿瘤所表达的且是免疫抑制性的蛋白质的灭活来克服。这些包括TGF-β(Kehrl,J.等人(1986)J.Exp.Med.163:1037-1050)、IL-10(Howard,M.&O'Garra,A.(1992)ImmunologyToday13:198-200)、和Fas配体(Hahne,M.等人(1996)Science274:1363-1365)等。在另一个实例中，针对这些实体中每一种的抗体可以进一步与抗PD-1和抗CTLA-4组合联合以抵消免疫抑制剂的效果并促进宿主的肿瘤免疫应答。可用于激活宿主免疫响应性的其它抗体可以与抗PD-1和抗CTLA-4组合进一步联合使用。这些包括树突细胞表面上激活DC功能和抗原呈递的分子。抗CD40抗体能够有效取代T辅助细胞活性(Ridge,J.等人(1998)Nature393:474-478)，而且可以与抗PD-1和抗CTLA-4组合联合使用(Ito,N.等人(2000)Immunobiology201(5):527-40)。针对T细胞共刺激性分子诸如OX-40(Weinberg,A.等人(2000)Immunol164:2160-2169)、4-1BB(Melero,I.等人(1997)NatureMedicine3:682-685(1997)和ICOS(Hutloff,A.等人(1999)Nature397:262-266)的激活性抗体还可以导致T细胞激活水平的提高。目前正在使用骨髓移植来治疗多种造血起源的肿瘤。尽管移植物抗宿主病是这种治疗的后果，但可以从移植物抗肿瘤应答获得治疗益处。可以利用联合的PD-1和CTLA-4阻断来提高供体植入肿瘤特异性T细胞的功效。还有数种实验性治疗方案，其牵涉抗原特异性T细胞的离体激活和扩增以这些细胞进入受体的继承性转移，以产生针对肿瘤的抗原特异性T细胞(Greenberg,R.&Riddell,S.(1999)Science285:546-51)。还可以利用这些方法来激活针对传染剂诸如CMV的T细胞应答。可以预期在抗PD-1和抗CTLA-4抗体存在时的离体激活提高继承性转移的T细胞的频率和活性。如本文所述，在免疫刺激性治疗性抗体疗法之后器官可以呈现免疫相关不良事件，诸如在用抗CTLA-4抗体治疗后的GI道(腹泻和结肠炎)和皮肤(皮疹和瘙痒)。例如，在抗CTLA-4抗体治疗后，食管(食管炎)、十二指肠(十二指肠炎)、和回肠(回肠炎)中也观察到非结肠的胃肠免疫相关不良事件。在某些实施方案中，本发明提供了改变与用免疫刺激剂治疗过度增殖病有关的不良事件的方法，包括给受试者施用抗PD-1抗体和亚治疗剂量的抗CTLA-4抗体。例如，通过给患者施用不可吸收的类固醇，本发明的方法提供了降低免疫刺激性治疗性抗体诱导的结肠炎或腹泻的发病率的方法。因为将接受免疫刺激性治疗性抗体的任何患者都有发展成由这样的抗体诱导的结肠炎或腹泻的危险，这一整个患者群适合依照本发明方法的疗法。尽管已经施用类固醇来治疗炎性肠病(IBD)和预防IBD恶化，但并未使用它们来预防(降低发病率)尚未诊断患有IBD的患者发生IBD。与类固醇，甚至是不可吸收的类固醇有关的显著副作用阻碍了预防用途。在其它实施方案中，联合的PD-1和CTLA-4阻断(即免疫刺激性治疗性抗体抗PD-1和抗CTLA-4)可以进一步联合任何不可吸收的类固醇的使用。在用于本文时，“不可吸收的类固醇”是在肝中代谢之后，呈现广泛的首过代谢的糖皮质激素，所述类固醇的生物利用度低，即小于大约20％。在本发明的一个实施方案中，所述不可吸收的类固醇是布地奈德(budesonide)。布地奈德是一种局部作用的糖皮质类固醇，它在口服施用后广泛代谢，主要是通过肝。ENTOCORT(Astra-Zeneca)是布地奈德的pH和时间依赖型口服剂型，经开发而优化药物递送至回肠并遍及结肠。ENTOCORT在美国批准用于治疗涉及回肠和/或升结肠的轻度到中度的克罗恩氏病。ENTOCORT用于治疗克罗恩氏病的通常口服剂量是6-9mg/天。ENTOCORT在被吸收之前在肠中释放并保留在肠黏膜中。一旦它穿过肠黏膜靶组织，ENTOCORT就被肝中的细胞色素P450系统广泛代谢成具有可忽略糖皮质激素活性的代谢物。因此，生物利用度低(大约10％)。与具有较不广泛首过代谢的其它糖皮质激素相比，布地奈德的低生物利用度导致治疗比率提高。布地奈德带来较少的副作用，包括比系统性作用的皮质类固醇更少的下丘脑-垂体抑制。不过，长期施用ENTOCORT可以导致系统性糖皮质激素效应，诸如肾上腺皮质功能亢进和肾上腺抑制。参见PDR,第58版,2004,608-610。在其它实施方案中，联合的PD-1和CTLA-4阻断(即免疫刺激性治疗性抗体抗PD-1和抗CTLA-4)与不可吸收的类固醇的联合可以进一步联合水杨酸盐/酯。水杨酸盐/酯包括5-ASA药剂，诸如例如柳氮磺吡啶(sulfasalazine)(Pharmacia&UpJohn)、奥沙拉秦(olsalazine)(Pharmacia&UpJohn)、巴柳氮(balsalazide)(SalixPharmaceuticals,Inc.)和美沙拉秦(mesalamine)(Procter&GamblePharmaceuticals；ShireUS；AxcanScandipharm,Inc.；Solvay)。根据本发明的方法，与抗PD-1和抗CTLA-4抗体及不可吸收的类固醇联合施用的水杨酸盐/酯可以包括任何交叠或序贯施用水杨酸盐/酯和不可吸收的类固醇，用于降低由免疫刺激性抗体诱导的结肠炎的发病率。因而，例如，降低由根据本发明的免疫刺激性抗体诱导的结肠炎发病率的方法包括同时或序贯施用水杨酸盐/酯和不可吸收的类固醇(例如在不可吸收的类固醇之后6小时施用水杨酸盐/酯)，或其任意组合。另外，根据本发明，可以通过相同路径(例如两者都通过口服施用)或通过不同路径(例如水杨酸盐/酯口服施用而不可吸收的类固醇直肠施用)施用水杨酸盐/酯和不可吸收的类固醇，所述途径可以不同于用来施用抗PD-1和抗CTLA-4抗体的路径。通过下列实施例进一步说明本发明，所述实施例不应解释为进一步限制。在此将整篇申请中引用的所有附图和所有参考文献、专利和已公开专利申请的内容明确收入本文作为参考。实施例实施例1：针对PD-1的人单克隆抗体的生成抗原免疫方案利用下述二者作为抗原：(i)包含PD-1的胞外部分的重组融合蛋白，和(ii)膜结合的全长PD-1。两种抗原都通过重组转染方法在CHO细胞系中生成。转基因HuMab和KM小鼠TM使用HuMab转基因小鼠的HCo7品系和转基因转染色体小鼠的KM品系来制备针对PD-1的完全人的单克隆抗体，这两种品系都表达人抗体基因。在这些小鼠品系的每一种中，已经如Chen等人(1993)EMBOJ.12:811-820中所述纯合性破坏了内源小鼠κ轻链基因，并且如PCT公开文本WO01/09187的实施例1中所述纯合性破坏了内源小鼠重链基因。如Fishwild等人(1996)NatureBiotechnology14:845-851中所述，这些小鼠品系中的每一种都携带人κ轻链转基因，KCo5。如美国专利号5,545,806；5,625,825和5,545,807中所述，HCo7品系携带HCo7人重链转基因。如PCT公开文本WO02/43478中所述，KM品系包含SC20转染色体。HuMab和KM免疫：为了生成针对PD-1的完全人的单克隆抗体，用纯化的重组PD-1融合蛋白和经PD-1转染的CHO细胞作为抗原，免疫HuMab小鼠和KM小鼠TM。对于HuMab小鼠，一般性免疫方案记载于Lonberg,N.等人(1994)Nature368(6474):856-859；Fishwild,D.等人(1996)NatureBiotechnology14:845-851和PCT公开文本WO98/24884。在第一次输注抗原时小鼠为6-16周龄。使用PD-1融合蛋白抗原的纯化重组制品(5-50μg)和5-10x106个细胞腹膜内、皮下(Sc)或经足垫注射免疫HuMab小鼠和KM小鼠TM。用完全弗氏佐剂或Ribi佐剂中的抗原两次腹膜内免疫转基因小鼠，接着于3-21天后用不完全弗氏佐剂或Ribi佐剂中的抗原进行腹膜内免疫(可多达总共11次免疫)。通过眼窝后放血监测免疫应答。通过ELISA筛选血浆(如下所述)，使用具有足够抗PD-1人免疫球蛋白滴度的小鼠来进行融合。用抗原进行静脉内加强免疫后3天，处死小鼠并取出脾。通常，对每种抗原进行10-35次融合。每种抗原免疫数十只小鼠。选择产生抗PD-1抗体的HuMab或KM小鼠TM：为了选择产生与PD-1结合的抗体的HuMab或KM小鼠TM，如Fishwild,D.等人(1996)所述通过ELISA对来自经免疫小鼠的血清进行测试。简言之，用100μl/孔PBS中的1-2μg/ml来自经转染CHO细胞的纯化的重组PD-1融合蛋白包被微量滴定板即于4℃温育过夜，随后用200μl/孔PBS/Tween(0.05％)中的5％胎牛血清进行封闭。向每孔加入来自PD-1免疫小鼠的血清稀释液并于环境温度温育1-2小时。用PBS/Tween洗涤板，然后与偶联有辣根过氧化物酶(HRP)的山羊抗人IgG多克隆抗体一起于室温温育1小时。洗涤后，用ABTS底物(Sigma,A-1888,0.22mg/ml)对板进行显色，并于OD415-495通过分光光度计进行分析。利用产生最高抗PD-1抗体滴度的小鼠进行融合。如下所述进行融合并通过ELISA对杂交瘤上清液测试抗PD-1活性。生成产生针对PD-1的人单克隆抗体的杂交瘤：利用基于PEG的标准方案或使用CytoPulse大室细胞融合电穿孔仪(CytoPulseSciences,Inc.,GlenBurnie,MD)的基于电场的电融合，将分离自HuMab或KM小鼠的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞系融合。然后对得到的杂交瘤筛选抗原特异性抗体的产生。用50％PEG(Sigma)将来自经免疫小鼠的脾细胞的单细胞悬浮液与四分之一数目的SP2/0不分泌性小鼠骨髓瘤细胞(ATCC,CRL1581)融合。将细胞以大约1x105/孔铺在平底微量滴定板中，随后在选择性培养基中温育大约两周，所述培养基在DMEM(Mediatech,CRL10013,含高葡萄糖,L-谷氨酰胺和丙酮酸钠)加5mMHEPES,0.055mM2-巯基乙醇,50mg/ml庆大霉素和1xHAT(Sigma,CRLP-7185)中含有10％胎牛血清,10％P388D1(ATCC,CRLTIB-63)条件培养基,3-5％origen(IGEN)。1-2周后，将细胞在用HT替换HAT的培养基中进行培养。然后通过ELISA(如上所述)对各个孔筛选人抗PD-1单克隆IgG抗体。一旦发生广泛的杂交瘤生长，通常在10-14天后监测培养基。对分泌抗体的杂交瘤重新铺板，再次筛选，并且，如果对人IgG仍然是阳性的，那么通过有限稀释将抗PD-1单克隆抗体亚克隆至少两次。然后体外培养稳定的亚克隆以在组织培养基中生成小量抗体用于进一步表征。选择杂交瘤克隆17D8、2D3、4H1、5C4、4A11、7D3和5F4供进一步分析。实施例2：人单克隆抗体17D8、2D3、4H1、5C4、4A11、7D3和5F4的结构表征使用标准PCR技术分别从17D8、2D3、4H1、5C4、4A11、7D3和5F4杂交瘤中获得编码17D8、2D3、4H1、5C4、4A11、7D3和5F4单克隆抗体的重链和轻链可变区的cDNA序列，并使用标准DNA测序技术进行测序。17D8的重链可变区的核苷酸和氨基酸序列分别显示于图1A及SEQIDNO:57和1。17D8的轻链可变区的核苷酸和氨基酸序列分别显示于图1B及SEQIDNO:64和8。17D8重链免疫球蛋白序列与已知人种系免疫球蛋白重链序列的比较表明17D8重链利用来自人种系VH3-33的VH区段、未确定的D区段、和来自人种系JH4b的JH区段。17D8VH序列与种系VH3-33序列的比对显示于图8。使用确定CDR区的Kabat系统对17D8VH序列的进一步分析描述了重链CDR1、CDR2和CDR3区，分别显示于图1A和8及SEQIDNOs:15、22和29。17D8轻链免疫球蛋白序列与已知人种系免疫球蛋白轻链序列的比较表明17D8轻链利用来自人种系VKL6的VL区段和来自人种系JK4的JK区段。17D8VL序列与种系VKL6序列的比对显示于图9。使用确定CDR区的Kabat系统对17D8VL序列的进一步分析描述了轻链CDR1、CDR2和CDR3区，分别显示于图1B和9及SEQIDNOs:36、43和50。2D3的重链可变区的核苷酸和氨基酸序列分别显示于图2A及SEQIDNO:58和2。2D3的轻链可变区的核苷酸和氨基酸序列分别显示于图2B及SEQIDNO:65和9。2D3重链免疫球蛋白序列与已知人种系免疫球蛋白重链序列的比较表明2D3重链利用来自人种系VH3-33的VH区段、来自人种系7-27的D区段、及来自人种系JH4b的JH区段。2D3VH序列与种系VH3-33序列的比对显示于图8。使用确定CDR区的Kabat系统对2D3VH序列的进一步分析描述了重链CDR1、CDR2和CDR3区，分别显示于图2A和8及SEQIDNOs:16、23和30。2D3轻链免疫球蛋白序列与已知人种系免疫球蛋白轻链序列的比较表明2D3轻链利用来自人种系VKL6的VL区段和来自人种系JK4的JK区段。2D3VL序列与种系VKL6序列的比对显示于图9。使用确定CDR区的Kabat系统对2D3VL序列的进一步分析描述了轻链CDR1、CDR2和CDR3区，分别显示于图2B和9及SEQIDNOs:37、44和51。4H1的重链可变区的核苷酸和氨基酸序列分别显示于图3A及SEQIDNO:59和3。4H1的轻链可变区的核苷酸和氨基酸序列分别显示于图3B及SEQIDNO:66和10。4H1重链免疫球蛋白序列与已知人种系免疫球蛋白重链序列的比较表明4H1重链利用来自人种系VH3-33的VH区段、未确定的D区段、及来自人种系JH4b的JH区段。4H1VH序列与种系VH3-33序列的比对显示于图8。使用确定CDR区的Kabat系统对4H1VH序列的进一步分析描述了重链CDR1、CDR2和CDR3区，分别显示于图3A和8及SEQIDNOs:17、24和31。4H1轻链免疫球蛋白序列与已知人种系免疫球蛋白轻链序列的比较表明4H1轻链利用来自人种系VKL6的VL区段和来自人种系JK1的JK区段。4H1VL序列与种系VKL6序列的比对显示于图10。使用确定CDR区的Kabat系统对4H1VL序列的进一步分析描述了轻链CDR1、CDR2和CDR3区，分别显示于图3B和10及SEQIDNOs:38、45和52。5C4的重链可变区的核苷酸和氨基酸序列分别显示于图4A及SEQIDNO:60和4。5C4的轻链可变区的核苷酸和氨基酸序列分别显示于图4B及SEQIDNO:67和11。5C4重链免疫球蛋白序列与已知人种系免疫球蛋白重链序列的比较表明5C4重链利用来自人种系VH3-33的VH区段、未确定的D区片段、及来自人种系JH4b的JH区段。5C4VH序列与种系VH3-33序列的比对显示于图8。使用确定CDR区的Kabat系统对5C4VH序列的进一步分析描述了重链CDR1、CDR2和CDR3区，分别显示于图4A和8及SEQIDNOs:18、25和32。5C4轻链免疫球蛋白序列与已知人种系免疫球蛋白轻链序列的比较表明5C4轻链利用来自人种系VKL6的VL区段和来自人种系JK1的JK区段。5C4VL序列与种系VKL6序列的比对显示于图10。使用确定CDR区的Kabat系统对5C4VL序列的进一步分析描述了轻链CDR1、CDR2和CDR3区，分别显示于图4B和10及SEQIDNOs:39、46和53。4A11的重链可变区的核苷酸和氨基酸序列分别显示于图5A及SEQIDNO:61和5。4A11的轻链可变区的核苷酸和氨基酸序列分别显示于图5B及SEQIDNO:68和12。4A11重链免疫球蛋白序列与已知人种系免疫球蛋白重链序列的比较表明4A11重链利用来自人种系VH4-39的VH区段、来自人种系3-9的D区段、及来自人种系JH4b的JH区段。4A11VH序列与种系VH4-39序列的比对显示于图11。使用确定CDR区的Kabat系统对4A11VH序列的进一步分析描述了重链CDR1、CDR2和CDR3区，分别显示于图5A和11及SEQIDNOs:19、26和33。4A11轻链免疫球蛋白序列与已知人种系免疫球蛋白轻链序列的比较表明4A11轻链利用来自人种系VKL15的VL区段和来自人种系JK1的JK区段。4A11VL序列与种系VKL6序列的比对显示于图12。使用确定CDR区的Kabat系统对4A11VL序列的进一步分析描述了轻链CDR1、CDR2和CDR3区，分别显示于图5B和12及SEQIDNOs:40、47和54。7D3的重链可变区的核苷酸和氨基酸序列分别显示于图7A及SEQIDNO:62和6。7D3的轻链可变区的核苷酸和氨基酸序列分别显示于图7B及SEQIDNO:69和13。7D3重链免疫球蛋白序列与已知人种系免疫球蛋白重链序列的比较表明7D3重链利用来自人种系VH3-33的VH区段、人种系7-27的D区段、及来自人种系JH4b的JH区段。7D3VH序列与种系VH3-33序列的比对显示于图8。使用确定CDR区的Kabat系统对7D3VH序列的进一步分析描述了重链CDR1、CDR2和CDR3区，分别显示于图6A和8及SEQIDNOs:20、27和34。7D3轻链免疫球蛋白序列与已知人种系免疫球蛋白轻链序列的比较表明7D3轻链利用来自人种系VKL6的VL区段和来自人种系JK4的JK区段。7D3VL序列与种系VKL6序列的比对显示于图9。使用确定CDR区的Kabat系统对7D3VL序列的进一步分析描述了轻链CDR1、CDR2和CDR3区，分别显示于图6B和9及SEQIDNOs:41、48和55。5F4的重链可变区的核苷酸和氨基酸序列分别显示于图7A及SEQIDNO:63和7。5F4的轻链可变区的核苷酸和氨基酸序列分别显示于图7B及SEQIDNO:70和14。5F4重链免疫球蛋白序列与已知人种系免疫球蛋白重链序列的比较表明5F4重链利用来自人种系VH4-39的VH区段、来自人种系3-9的D区段、及来自人种系JH4b的JH区段。5F4VH序列与种系VH4-39序列的比对显示于图11。使用确定CDR区的Kabat系统对5F4VH序列的进一步分析描述了重链CDR1、CDR2和CDR3区，分别显示于图7A和11及SEQIDNOs:21、28和35。5F4轻链免疫球蛋白序列与已知人种系免疫球蛋白轻链序列的比较表明5F4轻链利用来自人种系VKL15的VL区段和来自人种系JK1的JK区段。5F4VL序列与种系VKL6序列的比对显示于图12。使用确定CDR区的Kabat系统对5F4VL序列的进一步分析描述了轻链CDR1、CDR2和CDR3区，分别显示于图7B和12及SEQIDNOs:42、49和56。实施例3：抗PD-1人单克隆抗体的结合特异性和结合动力学的表征在此实施例中，通过Biacore分析检验抗PD-1抗体的结合亲和力和结合动力学。通过流式细胞计量术检验结合特异性和交叉竞争。结合亲和力和动力学通过Biacore分析(BiacoreAB,Uppsala,Sweden)对抗PD-1抗体表征亲和力及结合动力学。利用标准胺偶联化学和由Biacore提供的试剂盒，经伯胺将纯化的重组人PD-1融合蛋白共价连接至CM5芯片(羧甲基右旋糖酐包被的芯片)。通过将抗体以267nM的浓度、50μl/min的流速在HBSEP缓冲液(由BiacoreAB提供)中流动而测量结合。追踪抗原-抗体结合动力学3分钟并追踪解离动力学7分钟。使用BIAevaluation软件(BiacoreAB)将结合和解离曲线拟合至1:1朗格缪尔(Langmuir)结合模型。为了使亲合力在评估结合常数时的作用最小化，仅使用对应于结合和解离期的起始数据段来进行拟合。测定的KD、kon和koff值显示于表2。表2：PD-1人单克隆抗体的Biacore结合数据通过流式细胞计量术测定的结合特异性开发出在细胞表面表达重组人PD-1的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系，并用于通过流式细胞计量术测定PD-1人单克隆抗体的特异性。用包含编码跨膜形式PD-1的全长cDNA的表达质粒转染CHO细胞。为评估5C4和4H1抗PD-1人单克隆抗体的结合，将经过转染的细胞与浓度为20μg/ml的抗PD-1人单克隆抗体一起温育。洗涤细胞并用FITC标记的抗人IgGAb检测结合。使用FACScan流式细胞计量仪(BectonDickinson,SanJose,CA)来进行流式细胞计量分析。结果描绘于图13A(5C4)和13B(4H1)。抗PD-1人单克隆抗体结合经PD-1转染的CHO细胞，但不结合未用人PD-1转染的CHO细胞。这些数据表明抗PD-1人单克隆抗体针对PD-1的特异性。通过针对其它CD28家族成员的ELISA测定的结合特异性利用四种不同的CD28家族成员通过标准ELISA进行抗PD-1抗体结合CD28家族成员的比较，以检验对PD-1的结合特异性。对CD28家族成员，ICOS、CTLA-4和CD28的融合蛋白(R&DBioSystems)测试对抗PD-1人单克隆抗体17D8、2D3、4H1、5C4和4A11的结合。实施标准ELISA规程。加入浓度为20μg/ml的抗PD-1人单克隆抗体。将偶联有辣根过氧化物酶(HRP)的山羊抗人IgG(κ链特异的)多克隆抗体用作二抗。结果显示于图14。抗PD-1人单克隆抗体17D8、2D3、4H1、5C4、4A11,7D3和5F4中的每一种都以高特异性结合PD-1，但不结合CD28家族其它成员。实施例4：与人和猴细胞表面表达的PD-1结合的抗PD-1抗体的表征通过流式细胞计量术对抗PD-1抗体测试与在其细胞表面表达PD-1的细胞的结合。对激活的人T细胞、猴外周血单个核细胞(PBMC)和经PD-1转染的CHO细胞中的每一个测试抗体结合。通过抗CD3抗体激活人T细胞和猕猴PBMC以诱导T细胞上的PD-1表达，然后用人抗PD-1单克隆抗体结合。通过将经过转染的细胞与不同浓度的IgG1或IgG4形式的抗PD-1人单克隆抗体一起温育来评估5C4和4H1抗PD-1人单克隆抗体的结合。洗涤细胞并用FITC标记的抗人IgGAb检测结合。使用FACScan流式计量仪(BectonDickinson,SanJose,CA)进行流式细胞计量分析。结果描绘于图15A(激活的人T细胞)、15B(猕猴PBMC)和15C(PD-1转染的CHO细胞)。根据染色的平均荧光强度(MFI)的测量，抗PD-1人单克隆抗体5C4和4H1结合激活的人T细胞、激活的猴PBMC和用人PD-1转染的CHO细胞。这些数据表明抗PD-1HuMAb结合人和猕猴二者细胞表面PD-1。实施例5：人抗PD-1抗体在混合淋巴细胞反应中对细胞增殖和细胞因子产生的影响采用混合淋巴细胞反应来证明阻断淋巴细胞效应细胞的PD-1途径的影响。在测定中，在抗PD-1HuMAb抗体存在或缺失的情况下，对T细胞测试增殖、IFN-γ分泌和IL-2分泌。使用人CD4+T细胞富集柱(R&DSystems)由PBMC纯化人T细胞。每份培养物在200μl的总体积中包含105个纯化的T细胞和104个同种异基因的树突细胞。向每份培养物中加入不同抗体浓度的抗PD-1单克隆抗体5C4、4H1、17D8、2D3、或5C4的Fab片段部分。无抗体或同种型对照抗体用作阴性对照。将细胞于37℃培养5天。5天后，从每份培养物中取出100μl培养基用于细胞因子测量。利用OptEIAELISA试剂盒(BDBiosciences)来测量IFN-γ和其它细胞因子的水平。将细胞用3H-胸苷标记，再培养18小时，并分析细胞增殖。结果显示于图16A(T细胞增殖)、16B(IFN-γ分泌)和16C(IL-2分泌)。抗PD-1人单克隆抗体以浓度依赖性方式促进T细胞增殖、IFN-γ分泌和IL-2分泌。5C4-Fab片段也以浓度依赖性方式促进T细胞增殖、IFN-γ分泌和IL-2分泌。相反，包含同种型对照抗体的培养物并不显示T细胞增殖、IFN-γ或IL-2分泌的增加。实施例6：人抗PD-1抗体对配体结合PD-1的阻断利用流式细胞计量测定法对抗PD-1HuMAb测试其阻断配体PD-L1和PD-L2与经转染CHO细胞上表达的PD-1结合的能力。将表达PD-1的CHO细胞悬浮于FACS缓冲液(含4％胎牛血清的PBS)中。向细胞悬浮液中加入各种浓度的抗PD-1HuMAb5C4和4H1并于4℃温育30分钟。洗去未结合的抗体并将FITC标记的PD-L1融合蛋白或FITC标记的PD-L2融合蛋白加入到试管中并于4℃温育30分钟。使用FACScan流式细胞仪(BectonDickinson,SanJose,CA)进行流式细胞计量分析。结果描绘于图17A(PD-L1的阻断)和17B(PD-L2的阻断)。根据染色的平均荧光强度(MFI)的测量，抗PD-1单克隆抗体5C4和4H1阻断PD-L1和PD-L2与用人PD-1转染的CHO细胞的结合。这些数据表明抗PD-1HuMAb阻断配体(PD-L1和PD-L2二者)与细胞表面PD-1的结合。实施例7：人抗PD-1抗体对人血液中细胞因子释放的影响将抗PD-1HuMAb与新鲜人全血混合以确定单独的抗PD-1HuMAb是否刺激人血细胞释放某些细胞因子。将500μl肝素化的新鲜人全血添加到每个孔中。向每个孔中加入10μg或100μg抗PD-1HuMAb(4H1或5C4，后者为IgG1或IgG4同种型)。有些孔与抗CD3抗体一起温育作为阳性对照，或者与人IgG1或人IgG4抗体一起温育作为同种型匹配的阴性对照。将细胞于37℃温育6或24小时。将细胞离心下来并收集血浆用于细胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10和IL-12的测量，所述测量利用细胞因子细胞计量珠阵列测定法(BDBiosciences)。每种细胞因子的浓度(pg/ml)显示于下面表3a(6小时温育)和3b(24小时温育)。结果显示单独用人抗PD-1抗体5C4和4H1进行的处理并不刺激人血细胞释放细胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10和IL-12中的任一种。表3a：6小时温育后的细胞因子产生表3b：24小时温育后的细胞因子产生实施例8：抗PD-1抗体对T细胞凋亡的影响利用膜联蛋白V染色测试来测量抗PD-1抗体对诱导T细胞凋亡的影响。将T细胞在混合淋巴细胞反应中培养，如上文实施例5中所述。向试管中加入浓度为25μg/ml的抗PD-1抗体5C4。使用非特异性抗体作为对照。根据标准方案添加膜联蛋白V和碘化丙啶(BDBiosciences)。将混合物在黑暗中于室温温育15分钟，然后使用FACScan流式细胞仪(BectonDickinson,SanJose,CA)进行分析。结果显示于图18。抗PD-1抗体5C4对T细胞凋亡没有影响。实施例9：抗PD-1抗体对来自病毒阳性供体的病毒刺激PBMC细胞的细胞因子分泌的影响在此实施例中，从CMV阳性的供体分离外周血单个核细胞(PBMC)并在抗PD-1抗体存在或缺失的情况下暴露于CMV溶胞物以检验抗体对由抗原刺激的细胞因子分泌的影响。将2x105个来自CMV阳性供体的人PMBC在总体积200μl中培养，并与CMV感染细胞的溶胞物一起加到每个孔中。将各种浓度的抗PD-1HuMAb5C4加到每个孔中达4天。第4天后，从每份培养物中取100μl培养基用于细胞因子测量。使用OptEIAELISA试剂盒(BDBiosciences)测量IFN-γ的水平。用3H-胸苷标记细胞，再培养18小时，并分析细胞增殖。使用CellTiter-Glo试剂(Promega)分析细胞增殖。结果显示于图19。抗PD-1HuMab5C4以浓度依赖性方式提高IFNγ分泌。这些结果显示抗PD-1HuMAb可以在记忆T细胞应答中刺激先前对抗原进行过刺激的PBMC细胞释放IFN-γ。实施例10：抗PD-1抗体对针对抗原的二次抗体应答的影响用TI抗原(DNP-Ficoll)对小鼠进行免疫和再攻击，还用大鼠抗小鼠PD-1抗体或对照抗体进行处理以检验抗PD-1抗体对抗体滴度的影响。将雌性C57BL6小鼠分成两组，每组6只小鼠。一组用对照大鼠IgG处理，另一组用大鼠抗小鼠PD-1抗体处理。在第0天用50μlCFA中的5μgDNP-Ficoll(一种T1抗原)通过腹膜内注射对小鼠进行免疫。在第-1、0和2天给予对照大鼠IgG抗体或大鼠mPD-1抗体(200μg/小鼠)。四周后，在第0天用50μlIFA中的5μgDNP-Ficoll对小鼠进行再攻击。在第0和1天通过膜腹内给予大鼠抗mPD-1抗体或对照抗体(200μg/小鼠)。加强后在第7天通过标准ELISA测定法测量抗体滴度。结果显示于下文表4。在用抗mPD-1抗体处理的小鼠中，与用对照抗体处理的小鼠相比，在用T1抗原攻击后，IgM和IgG3同种型都显示最大的滴度升高。这些结果表明抗PD-1处理可以在针对T1抗原的应答中提高抗体滴度。表4：用抗PD-1抗体处理后的鼠二次应答抗体同种型对照组大鼠抗小鼠PD-1抗体P值IgM60612000.026IgG915.550.18IgG11.21.10.83IgG2b5.059.260.18IgG321.981.20.03*显示的结果是抗体同种型的平均浓度(μg/ml)实施例11：使用抗PD-1抗体处理体内肿瘤模型用抗PD-1抗体体内处理植入有癌性肿瘤的小鼠以检验抗体对肿瘤生长的体内影响。作为阳性对照，使用抗CTLA-4抗体，因为已经显示此类抗体在体内抑制肿瘤生长。在此实验中，所用的抗PD-1抗体是利用众所周知的实验室技术生成的嵌合大鼠抗小鼠PD-1抗体。为了生成大鼠抗小鼠PD-1抗体，用经转染而表达重组小鼠PD-1融合蛋白的小鼠细胞(R&DSystemsCatalogNo.1021-PD)免疫大鼠，并通过ELISA测定法对单克隆抗体筛选与小鼠PD-1抗原的结合。然后使用标准分子生物学技术将大鼠抗PD-1抗体V区重组连接至鼠IgG1恒定区并通过ELISA和FACS再次筛选与小鼠PD-1的结合。这里所用的嵌合大鼠抗小鼠PD-1抗体称作4H2。为肿瘤研究，根据体重将6-8周龄之间的雌性AJ小鼠(HarlanLaboratories)随机分成6组。在第0天将溶于200μlDMEM培养基的2x106个SA1/N纤维肉瘤细胞在右侧皮下植入小鼠。用PBS媒介或10mg/kg的抗体处理小鼠。在第1、4、8和11天用大约200μl含有抗体的PBS或媒介通过腹膜内注射给动物剂量给药。每组包含10只动物，各组组成如下：(i)媒介组，(ii)对照小鼠IgG，(iii)对照仓鼠IgG，(iv)仓鼠抗小鼠CTLA-4抗体和(v)嵌合抗PD-1抗体4H2。对小鼠每周两次监测肿瘤生长，持续大约6周。使用电子测径器对肿瘤进行三维测量(高度x宽度x长度)并计算肿瘤体积。当肿瘤达到肿瘤终点(1500mm3)或显示大于15％的体重减少时将小鼠安乐死。结果显示于图20。抗PD-1抗体将达到肿瘤终点体积(1500mm3)的平均时间从对照组的～25天延长到～40天。因而，抗PD-1抗体处理对肿瘤生长具有直接的体内抑制效果。实施例12：生成嵌合(大鼠-小鼠)抗PD-1抗体4H2利用标准杂交瘤生产方法(参见KohlerandMilstein(1975)Nature256:495；HarlowandLane(1988)Antibodies,ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarborNewYork)由用mPD-1-hFc融合蛋白免疫的大鼠生成针对小鼠PD-1抗体的大鼠单克隆抗体(大鼠抗mPD-1)。将8个杂交瘤亚克隆，并分离抗体和筛选它们阻断小鼠PD-L2(mPD-L2)结合mPD-1的能力。鉴定出数种能够阻断mPD-L2结合mPD-1的抗mPD-1抗体(见例如4H2的活性，图41)，并通过ELISA测定这些抗体中的数种对mPD-1-Fc融合蛋白的结合亲和力(图42)。进一步表征抗体4H2.B3，其在本文中可以互换的称作“4H2”。构建表达小鼠PD-1的CHO细胞并与浓度范围为200μg/ml到0.012μg/ml的4H2抗mPD-1抗体一起温育以测定4H2对PD-1的结合亲和力。通过与偶联有FITC的驴抗大鼠IgG一起温育并通过FACS测量来检测抗mPD-1抗体与表达PD-1的CHO细胞的结合。抗mPD-1抗体具有大约0.38μg的EC50(50％有效浓度)(图43)和4.7x10-9M的KD。为了检验对PD-L1结合PD-1的抑制，进行相同的测定，除了还将细胞与0.16μgmPD-L1-hFc融合蛋白一起温育，然后通过与偶联有FITC的山羊抗人IgG(Fc特异的)一起温育并通过FACS测量结合信号(MFI，平均荧光强度)来检测PD-L1与表达PD-1的CHO细胞的结合。抗mPD-1抗体具有大约0.72μg的EC50(图44)。为了在小鼠肿瘤模型中使用，需要修饰4H2大鼠抗mPD-1，使得小鼠免疫系统不会中和免疫治疗性抗体(即使得抗体将会具有更好的药动学)并通过减弱Fc受体相互作用来避免抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)(即使得可以通过ADCC作用的危害来评估抗PD-1所起的阻断作用)。起始的大鼠抗mPD-1抗体，4H2，确定为大鼠IgG2a同种型。因此，用来自小鼠IgG1同种型的Fc部分替换4H2抗体的Fc部分。利用上述测定法，发现大鼠-小鼠嵌合4H2对mPD-1的结合亲和力与大鼠4H2.B3抗mPD-1抗体相当(图45)。类似的，两种抗体对PD-L1结合PD-1的抑制作用相当(图46)。因而，利用大鼠-小鼠嵌合4H2抗mPD-1抗体来检验抗PD-1与抗CTLA-4组合的治疗功效。实施例13：联合疗法(抗CTLA-4和抗PD-1抗体)对肿瘤确立和生长的体内功效将MC38结肠直肠癌细胞(PD-L1-)(可获自Dr.N.Restifo,NationalCancerInstitute,Bethesda,MD或JeffreySchlom,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD)植入C57BL/6小鼠(2x106个细胞/小鼠)。在第0天(即将MC38细胞植入小鼠的那天)，每组10只小鼠的四个组中的每一只腹膜内(IP)注射下列之一：(1)小鼠IgG(对照)，(2)抗CTLA-4单克隆抗体9D9(小鼠抗小鼠CTLA-4，获自J.Allison,MemorialSloan-KetteringCancerCenter,NewYork,NY)，(3)抗PD-1单克隆抗体4H2(嵌合抗体，其中大鼠抗小鼠PD-1用小鼠Fc区修饰，如实施例6中所述)，或(4)抗CTLA-4抗体9D9和抗PD-1抗体4H2。然后在第3、6和10天进一步施用抗体注射。以10mg/kg施用单一抗体治疗，并以每种抗体5mg/kg(即10mg/kg全部抗体)施用抗CTLA-4抗体和抗PD-1抗体的组合。使用电子测径器对肿瘤进行三维测量(高度x宽度x长度)并计算肿瘤体积。当肿瘤达到设定的肿瘤终点时将小鼠安乐死。结果显示于表5和图21A-21D。表5：抗PD-1和/或抗CTLA-4处理后无肿瘤小鼠的百分比处理研究的小鼠总数无肿瘤小鼠(％)mIgG1100抗CTLA-4101(10)抗PD-1103(30)抗CTLA-4+抗PD-1106(60)IgG组中有八只小鼠到大约第30天时达到肿瘤终点且IgG组中有两只小鼠(86066和87260)肿瘤溃烂(图21A)。在仅用抗CTLA-4抗体组中，七只小鼠到大约第60天时达到肿瘤终点，一只小鼠肿瘤溃烂(84952)，一只小鼠的肿瘤体积小于1500mm3(85246)，及一只小鼠无肿瘤(86057)(图21B)。在仅用抗PD-1抗体组中，六只小鼠到大约第60天时达到肿瘤终点，一只小鼠肿瘤溃烂(86055)，及三只小鼠无肿瘤(84955、85239和86750)(图21C)。在抗CTLA-4抗体和抗PD-1抗体联合组中，四只小鼠到大约第40天时达到肿瘤终点，及六只小鼠无肿瘤(84596、85240、86056、86071、86082和86761)(图21D)。图22显示在第21天测量的平均肿瘤体积，IgG对照组为大约2955mm3；仅用CTLA-4抗体组为大约655mm3；仅用PD-1抗体组为大约510mm3；而抗CTLA-4抗体和抗PD-1抗体联合组为大约280mm3。图23显示在第21天测量的中间肿瘤体积，IgG组为大约2715mm3；仅用CTLA-4抗体组为大约625mm3；仅用PD-1抗体组为大约525mm3；而抗CTLA-4抗体和抗PD-1抗体联合组为大约10mm3(且到第32天时降至0mm3)。此研究表明，在鼠肿瘤模型中，仅用CTLA-4抗体处理和仅用PD-1抗体处理对肿瘤生长具有适度效果，而CTLA-4抗体和PD-1抗体的联合处理对肿瘤生长具有显著更大的效果。令人感兴趣的是注意到，与以较高剂量10mg/kg施用任一种抗体时的效果相比，每种抗体的剂量为5mg/kg的CTLA-4抗体和PD-1抗体联合处理对肿瘤生长具有更加显著的效果。实施例14：联合疗法(抗CTLA-4和抗PD-1抗体)对已确立的肿瘤生长的体内功效将MC38结肠直肠癌细胞(PD-L1-)植入C57BL/6小鼠(2x106个细胞/小鼠)达足够长的时间(大约6-7天)以容许形成肿瘤。在植入(第-1天)后的第6天，进行肿瘤测量并基于平均肿瘤体积(大约250mm3)将小鼠随机分成11个组用于后续抗体疗法。在第0天(即植入MC38细胞后的一周)，给小鼠腹膜内注射(1)小鼠IgG(对照)，(2)抗CTLA-4单克隆抗体9D9，(3)抗PD-1单克隆抗体4H2，或(4)抗CTLA-4单克隆抗体9D9和抗PD-1单克隆抗体4H2，浓度为10mg/kg每只小鼠。还在第3、6和10天施用抗体注射。所用的单克隆抗体组合物具有低水平的内毒素且不显著聚集。使用电子测径器对肿瘤进行三维测量(高度x宽度x长度)并计算肿瘤体积。在第0天(治疗开始时肿瘤体积为大约125mm3)及在抗体注射后第3、6、10、13、17和20天进行肿瘤测量。当肿瘤达到设定的肿瘤终点时(特定肿瘤体积诸如1500mm3和/或当小鼠显示超过大约15％的体重减少时)将小鼠安乐死。IgG组中的全部11只小鼠都在大约第17天时达到肿瘤终点(图24A)。在仅用抗CTLA-4抗体组中，11只小鼠中的七只到大约第12天时达到肿瘤终点(图24B)。在仅用抗PD-1抗体组中，四只小鼠到大约第13天时达到肿瘤终点且两只小鼠无肿瘤(图24C)。在抗CTLA-4抗体和抗PD-1抗体联合组中，一只小鼠到大约第17天时达到肿瘤终点，一只小鼠到大约第45天时达到肿瘤终点且九只小鼠到大约第45天时无肿瘤(图24D)。图25显示在第10天测量的平均肿瘤体积，IgG对照组为大约1485mm3；仅用CTLA-4抗体组为大约1010mm3；仅用PD-1抗体组为大约695mm3；而抗CTLA-4抗体和抗PD-1抗体联合组为大约80mm3。图26显示在第10天测量的中间肿瘤体积，IgG对照组为大约1365mm3；仅用抗CTLA-4抗体组为大约1060mm3；仅用抗PD-1抗体组为大约480mm3；而抗CTLA-4抗体和抗PD-1抗体联合组为大约15mm3(到第17天时降至0mm3)。此研究表明，在鼠肿瘤模型中，CTLA-4抗体和PD-1抗体联合治疗比仅用任一种抗体对肿瘤生长具有显著更大的效果，即使当肿瘤已经充分确立的时候。实施例15：联合疗法(抗CTLA-4和抗PD-1抗体)对已确立的肿瘤生长的剂量滴定将MC38结肠直肠癌细胞(PD-L1-)植入C57BL/6小鼠(2x106个细胞/小鼠)达足够长的时间(大约6-7天)以容许形成肿瘤，如实施例3中所述。在第0、3、6和10天给10只小鼠的各组腹膜内注射：(A)组，小鼠IgG(对照，20mg/kg)；(B)组，抗PD-1单克隆抗体4H2(10mg/kg)和小鼠IgG(10mg/kg)；(C)组，抗CTLA-4单克隆抗体9D9(10mg/kg)和小鼠IgG(10mg/kg)；(D)组，抗CTLA-4单克隆抗体9D9(10mg/kg)和抗PD-1抗体单克隆抗体4H2(10mg/kg)；(E)组，抗CTLA-4单克隆抗体9D9(3mg/kg)和抗PD-1单克隆抗体4H2(3mg/kg)；或(F)组，抗CTLA-4单克隆抗体9D9(1mg/kg)和抗PD-1单克隆抗体4H2(1mg/kg)。使用电子测径器对肿瘤进行三维测量(高度x宽度x长度)并计算肿瘤体积。在治疗开始时(即在第0天，肿瘤具有大约90mm3的平均体积)及抗体处理后的第3、6、10、13、17和20天进行肿瘤测量。当肿瘤达到设定的肿瘤终点时(特定肿瘤体积诸如1500mm3和/或当小鼠显示超过大约15％的体重减少时)将小鼠安乐死。图27A显示所有10只对照小鼠都达到肿瘤终点。图27B显示用10mg/kg抗PD-1抗体处理的组(B组)有6只小鼠达到肿瘤终点和4只小鼠具有大约750mm3或更小体积的肿瘤。图27C显示用10mg/kg抗CTLA-4抗体处理的组(C组)有3只小鼠达到肿瘤终点和7只小鼠具有大约1000mm3或更小体积的肿瘤。图27D显示用10mg/kg抗PD-1抗体与10mg/kg抗CTLA-4抗体联合处理的组(D组)有2只小鼠具有大约1000mm3或更小体积的肿瘤和8只小鼠无肿瘤。图27E显示用3mg/kg抗PD-1抗体与3mg/kg抗CTLA-4抗体联合处理的组(E组)有1只小鼠达到肿瘤终点，7只小鼠具有大约500mm3或更小体积的肿瘤，和2只小鼠无肿瘤。图27F显示用1mg/kg抗PD-1抗体与1mg/kg抗CTLA-4抗体联合处理的组(F组)有4只小鼠达到肿瘤终点，5只小鼠具有大约1100mm3或更小体积的肿瘤，和1只小鼠无肿瘤。图27G和27H显示先用抗PD-1抗体后用抗CTLA-4抗体或反之序贯处理的小鼠中的肿瘤体积。图27G的小鼠首先在第0和3天各接受10mg/kg抗CTLA-4抗体，然后在第6和10天各接受10mg/kg抗PD-1抗体。图27H的小鼠首先在第0和3天各接受10mg/kg抗PD-1抗体，然后在第6和10天各接受10mg/kg抗CTLA-4抗体。对于G组，在第27天8只小鼠达到肿瘤终点，1只小鼠具有非常小的肿瘤(它在显著的延迟后最终长大)而1只小鼠无肿瘤。对于H组，在第27天8只小鼠达到肿瘤终点而2只小鼠无肿瘤。图28显示在第10天测量的平均肿瘤体积，IgG对照组为大约1250mm3；PD-1抗体与IgG对照为大约470mm3；CTLA-4抗体与IgG对照为大约290mm3(第6天测量)；抗CTLA-4抗体(10mg/kg)和抗PD-1抗体(10mg/kg)联合组为大约40mm3；抗CTLA-4抗体(3mg/kg)和抗PD-1抗体(3mg/kg)联合组为大约165mm3；而抗CTLA-4抗体(1mg/kg)和抗PD-1抗体(1mg/kg)联合组为大约400mm3。图29显示在第13天测量的中间肿瘤体积，IgG对照组为大约1680mm3；PD-1抗体和IgG对照为大约400mm3；CTLA-4抗体和IgG对照为大约660mm3；抗CTLA-4抗体(10mg/kg)和抗PD-1抗体(10mg/kg)联合组为0mm3；抗CTLA-4抗体(3mg/kg)和抗PD-1抗体(3mg/kg)联合组为大约90mm3；而抗CTLA-4抗体(1mg/kg)和抗PD-1抗体(1mg/kg)联合组为大约650mm3。对于抗PD-1抗体与抗CTLA-4抗体的联合处理，在研究的第27天每组的无肿瘤小鼠数目为8/10(10mg/kg)、2/10(3mg/kg)和1/10(1mg/kg)(数据未显示)。此研究表明，在鼠肿瘤模型中，CTLA-4抗体和PD-1抗体的联合处理以剂量依赖性方式发挥作用，并且比两种抗体单独使用时对肿瘤生长具有显著更大的效果，即使是在较低的剂量及即使当肿瘤已经充分确立时。另外，可以序贯施用抗体(先抗CTLA-4抗体后抗PD-1抗体，或反之)并且联合疗法仍然优于抗体单一疗法。实施例16：联合疗法(抗CTLA-4和抗PD-1抗体)对纤维肉瘤确立和生长的体内功效在第0天将SA1/N纤维肉瘤细胞(PD-L1-)(Leach等人(1996)Science271:1734-1736)皮下植入A/J小鼠(2x106个细胞/小鼠)。在植入后的第1、4、7和11天，对小鼠腹膜内注射如下：(A)组，仅用PBS(称作“媒介”)；(B)组，小鼠IgG(对照，10mg/kg每只小鼠)；(C)组，抗PD-1单克隆抗体4H2(10mg/kg每只小鼠)；(D)组，抗CTLA-4单克隆抗体9D9(10mg/kg或0.2mg/kg每只小鼠)；和(E)组，抗PD-1单克隆抗体4H2(10mg/kg每只小鼠)联合抗CTLA-4单克隆抗体9D9(0.2mg/kg每只小鼠)。研究持续41天并在整个研究过程中的不同天进行肿瘤测量(见图29)。通过使用电子测径器对肿瘤进行三维测量(高度x宽度x长度)来计算肿瘤体积。当肿瘤达到设定的肿瘤终点体积1500mm3和/或溃烂肿瘤时，将小鼠安乐死。图30A和30B显示20只对照小鼠中的19只(A组中的9/10只和B组中的10/10只)达到肿瘤终点或形成溃烂肿瘤。图30C显示用10mg/kg抗PD-1抗体处理的组(C组)有6只小鼠达到肿瘤终点(2只体积大于1500mm3和4只具有溃烂肿瘤)和4只小鼠无肿瘤。图30D显示用10mg/kg抗CTLA-4抗体处理的组(D组)有5只小鼠达到肿瘤终点(2只体积大于1500mm3和3只具有溃烂肿瘤)，1只小鼠具有小肿瘤(体积为大约70mm3)和4只小鼠无肿瘤。图30E显示用0.2mg/kg抗CTLA-4抗体处理的组(E组)有10只小鼠达到肿瘤终点(6只体积大于1500mm3和4只具有溃烂肿瘤)。图30F显示用10mg/kg抗PD-1抗体与0.2mg/kg抗CTLA-4抗体联合处理的组(F组)有2只小鼠达到肿瘤终点(1只体积大于1500mm3和1只具有溃烂肿瘤)和8只小鼠无肿瘤。图31和32分别显示在本研究过程中在处理和未处理小鼠中形成的平均和中间肿瘤体积。与用对照抗体小鼠IgG处理的小鼠相比，用这些抗体处理的小鼠中的肿瘤生长抑制总结于表6中。表6：抗PD-1和/或抗CTLA-4处理后的肿瘤生长抑制和无肿瘤小鼠*TGI＝肿瘤生长抑制；只有当少于50％的小鼠达到肿瘤终点时才能计算中间值。各组如图30A-30F中所定义。A＝媒介(PBS)；B＝小鼠IgG；C＝抗PD-1，10mg/kg；D＝抗CTLA-4，10mg/kg；E＝抗CTLA-4，0.2mg/kg；而F＝抗PD-1，10mg/kg及抗CTLA-4，0.2mg/kg。这些数据进一步表明包含抗PD-1和抗CTLA-4抗体的联合疗法实质性的比仅用任一种抗体处理更加有效。事实上，即使当联合疗法包含亚治疗剂量的抗CTLA-4抗体时，联合处理仍然比单一抗体处理更加有效。这些数据还表明，出人意料的是，PD-L1在肿瘤上的存在或缺失可能对这种抗体联合处理的功效没有影响，尽管PD-L1的存在可能影响抗体单一疗法的效果，其在于PD-L1在肿瘤上的表达可能还导致对抗肿瘤T细胞应答的抑制(见图40A-40D)。实施例17：联合疗法(抗CTLA-4和抗PD-1抗体)对PD-L1-纤维肉瘤生长的体内功效和剂量滴定在第0天将SA1/N纤维肉瘤细胞(PD-L1-)皮下植入A/J小鼠(2x106个细胞/小鼠)达足够时间(大约7天)以容许肿瘤确立。在植入后的第7、10、13和16天，对具有110mm3平均肿瘤体积的10组小鼠(每组8只)腹膜内注射如人：(A)组，仅用PBS(称作“媒介”)；(B)组，小鼠IgG(对照，10mg/kg每只小鼠)；(C)组，抗CTLA-4单克隆抗体9D9(0.25mg/kg)；(D)组，抗CTLA-4单克隆抗体9D9(0.5mg/kg每只小鼠)；(E)组，抗CTLA-4单克隆抗体9D9(5mg/kg)；(F)组，抗PD-1单克隆抗体4H2(3mg/kg每只小鼠)；(G)组，抗PD-1单克隆抗体4H2(10mg/kg每只小鼠)；(H)组，抗PD-1单克隆抗体4H2(10mg/kg每只小鼠)联合抗CTLA-4单克隆抗体9D9(0.25mg/kg每只小鼠)；(I)组，抗PD-1单克隆抗体4H2(10mg/kg每只小鼠)联合抗CTLA-4单克隆抗体9D9(0.5mg/kg每只小鼠)；和(J)组，抗PD-1单克隆抗体4H2(3mg/kg每只小鼠)联合抗CTLA-4单克隆抗体9D9(0.5mg/kg每只小鼠)。在植入后的第10、13、16和19天，对具有255mm3平均肿瘤体积的2组小鼠(每组6只)腹膜内注射如下：(K)组，小鼠IgG(对照，10mg/kg每只小鼠)；和(L)组，抗PD-1单克隆抗体4H2(10mg/kg每只小鼠)联合抗CTLA-4单克隆抗体9D9(1mg/kg每只小鼠)。该研究持续51天并在整个研究过程中的不同天进行肿瘤测量(见图33A-38)。通过使用电子测径器对肿瘤进行三维测量(高度x宽度x长度)来计算肿瘤体积。当肿瘤达到设定的肿瘤终点体积1500mm3和/或溃烂肿瘤时，将小鼠安乐死。图33A-33J显示在具有起始体积大约110mm3(即在第一次抗体处理时)的小鼠中对免疫刺激性抗体处理的应答。图33A和33B显示所有16只对照小鼠(A组和B组)达到肿瘤终点(15只肿瘤体积大于1500mm3和1只具有溃烂肿瘤)。图33C-33E显示携瘤小鼠以剂量依赖性方式对抗CTLA-4抗体处理产生应答(例如，接受0.25mg/kg的C组有7/8只小鼠达到肿瘤终点和1只小鼠肿瘤体积小于200mm3，而接受5mg/kg的E组有6/8只小鼠达到肿瘤终点和2只小鼠无肿瘤)。图33F和33G显示小鼠应答大致相同，而与抗PD-1抗体剂量无关(F组接受3mg/kg和G组接受10mg/kg)。相反，接受10或3mg/kg抗PD-1抗体与0.25或0.5mg/kg抗CTLA-4抗体联合处理的小鼠(H组、I组和J组)显示肿瘤生长的显著减弱。例如，图33J显示用3mg/kg抗PD-1抗体与0.5mg/kg抗CTLA-4抗体联合处理的组(J组)有2只小鼠具有溃烂肿瘤，2只小鼠肿瘤体积小于500mm3，和4只小鼠无肿瘤。抗PD-1抗体联合抗CTLA-4抗体的意料不到的协同效果及组合中亚治疗水平的抗CTLA-4抗体的令人吃惊的效力显示于图34(平均肿瘤体积)和图35(中间肿瘤体积)。图36A-36B显示具有大肿瘤的小鼠中对免疫刺激性抗体处理的应答，所述大肿瘤是那些具有大约250mm3的起始体积的肿瘤(即在第一次抗体处理时)。图36A显示所有6只对照小鼠(K组)都达到肿瘤终点(4只肿瘤体积大于1500mm3和2只具有溃烂肿瘤)。图36B显示用10mg/kg抗PD-1抗体与1mg/kg抗CTLA-4抗体联合处理的组(L组)有1只小鼠有溃烂肿瘤，4只小鼠肿瘤体积大于1500mm3，和1只小鼠无肿瘤。平均和中间肿瘤体积显示于图37和38。与用对照抗体小鼠IgG处理的小鼠相比，用这些抗体处理的小鼠中的肿瘤生长抑制总结于表7和图39中。表7：抗PD-1和/或抗CTLA-4处理后的肿瘤生长抑制*TGI＝肿瘤生长抑制；只有当少于50％的小鼠达到肿瘤终点时才能计算中间值。各组如图33A-33J和36A-36B中所定义。对于较小的起始肿瘤：A＝媒介(PBS)；B＝小鼠IgG，10mg/kg；C＝抗CTLA-4，0.25mg/kg；D＝抗CTLA-4，0.5mg/kg；E＝抗CTLA-4，5mg/kg；F＝抗PD-1，3mg/kg；G＝抗PD-1，10mg/kg；H＝抗PD-1，10mg/kg及抗CTLA-4，0.25mg/kg；I＝抗PD-1，10mg/kg及抗CTLA-4，0.5mg/kg；和J＝抗PD-1，3mg/kg及抗CTLA-4，0.5mg/kg。对于较大的起始肿瘤：K＝小鼠IgG，10mg/kg；和L＝抗PD-1，10mg/kg及抗CTLA-4，0.25mg/kg。这些数据在一起表明包含抗PD-1和抗CTLA-4抗体的联合疗法实质性比仅用任一种抗体的处理更加有效。此外，令人吃惊的是可以降低每种抗体的剂量而不会影响免疫刺激性治疗性抗体的这种组合的协同功效。即使当肿瘤块更加成熟(即更大)时，联合疗法似乎仍然有效。实施例18：用抗PD-1抗体处理和用PD-L1-纤维肉瘤细胞再攻击后小鼠中的肿瘤免疫力对于用肿瘤细胞攻击和用抗PD-1抗体处理(即类似于实施例5和6中所述功效研究的处理)后无肿瘤存活的小鼠，然后用肿瘤细胞再次攻击以研究在这样的处理后对肿瘤形成的免疫力。简言之，在起始攻击中，在第0天将SA1/N纤维肉瘤细胞(PD-L1-)皮下植入A/J小鼠(1x106个细胞/小鼠)。在植入后的第1、4、7、10、14、17和20天，各组小鼠腹膜内注射小鼠IgG(对照，10mg/kg每只小鼠)或各种剂量的抗PD-1单克隆抗体4H2(30、10、3、1和0.3mg/kg每只小鼠)。用精确电子测径器每周两次监测肿瘤形成和体积直到研究结束。在抗PD1抗体处理后一组8只小鼠无肿瘤(4只以30mg/kg，2只以3mg/kg，1只以1mg/kg，和1只以0.3mg/kg处理)。通过皮下植入1x106个SA1/N纤维肉瘤细胞/小鼠对8只处理过的、无肿瘤A/J小鼠进行再攻击。作为对照，以1x106个SA1/N纤维肉瘤细胞/小鼠皮下植入9只首次用于实验的小鼠。用精确电子测径器每周两次监测肿瘤形成和体积直到植入后的第62天。到植入纤维肉瘤细胞后的第22天，全部9只首次用于实验的(对照)小鼠达到肿瘤终点。相反，直到植入后62天，用纤维肉瘤细胞再攻击的8只无肿瘤小鼠并未形成肿瘤。图47显示首次用于实验的和再攻击的小鼠的平均肿瘤体积。这些结果证明用免疫刺激性抗体，诸如抗PD-1处理，为所处理受试者提供了对进一步肿瘤形成的免疫力，即使在存在能够形成肿瘤的细胞时。实施例19：单一抗体疗法(抗PD-1)或联合抗体疗法(抗CTLA-4和抗PD-1)和PD-L1-结肠直肠癌细胞再攻击后小鼠中的肿瘤免疫力对于用肿瘤细胞攻击和仅用抗PD-1抗体或用抗PD-1抗体联合抗CTLA-4抗体处理(即类似于实施例2-4中所述功效研究的处理)后无肿瘤存活的小鼠，然后用肿瘤细胞再次攻击以研究在这样的处理后对肿瘤形成的免疫力。简言之，在起始攻击中，在第0天将MC38结肠直肠癌细胞(PD-L1-)植入C57BL/6小鼠(2x106个细胞/小鼠)。在植入后的第0、3、6和10天，各组小鼠腹膜内注射下列处理之一：(1)小鼠IgG(对照，10mg/kg每只小鼠)，(2)抗PD-1单克隆抗体4H2，或(3)抗PD-1单克隆抗体4H2联合抗CTLA-4单克隆抗体9D9。如实施例15中所述用精确电子测径器监测肿瘤生长。在抗PD1抗体处理(共2只)或联合抗PD-1/抗CTLA-4抗体处理(共9只)后一组11只小鼠无肿瘤。通过植入2x107个MC38结肠直肠癌细胞/小鼠(即比起始攻击大10倍的一剂细胞)对11只处理过的、无肿瘤C57BL/6小鼠进行再攻击。作为对照，以2x107个MC38结肠直肠癌细胞/小鼠植入7只首次用于实验的小鼠。在再攻击实验期间(至少20天)用精确电子测径器监测肿瘤形成和体积。图48显示到植入结肠直肠癌细胞后第18天，全部7只首次用于实验的(对照)小鼠都形成肿瘤并达到肿瘤终点。相反，直到植入后18天，所有11只用结肠直肠癌细胞再攻击的无肿瘤小鼠都未形成肿瘤。图49显示首次用于实验的和再攻击的小鼠的平均肿瘤体积。这些数据表明，与抗体单一疗法类似，导致PD-1和CTLA-4阻断的联合抗体疗法产生对肿瘤复发的持久免疫力。实施例20：联合疗法(抗CTLA-4和抗PD-1抗体)对已确立的肿瘤生长的体内功效将CT26结肠直肠癌细胞植入BALB/C小鼠(2x106个细胞/小鼠)达足够时间(大约10天)以容许形成肿瘤。在植入后的第10天，进行肿瘤测量并根据平均肿瘤体积(大约250mm3)将小鼠随机分入5组用于后续抗体疗法。在第0天(即植入CT26细胞后10天)，对小鼠腹膜内注射(1)小鼠IgG(对照)，(2)抗CTLA-4单克隆抗体9D9，(3)抗PD-1单克隆抗体4H2，或(4)抗CTLA-4单克隆抗体9D9和抗PD-1单克隆抗体4H2，浓度为10mg/kg每只小鼠。还在第3、6和10天施用抗体注射。所用的单克隆抗体组合物具有低水平的内毒素且不显著聚集。使用电子测径器对肿瘤进行三维测量(高度x宽度x长度)并计算肿瘤体积。在第0天(治疗开始时肿瘤体积为大约125mm3)及在抗体注射后的第3、6、10、13、17和20天进行肿瘤测量。当肿瘤达到设定的肿瘤终点时(特定肿瘤体积诸如1500mm3和/或当小鼠显示超过大约15％的体重减少时)将小鼠安乐死。结果显示于图50。此研究表明，在鼠肿瘤模型中，用CTLA-4抗体和PD-1抗体联合处理比仅用任一种抗体对于肿瘤生长具有显著更大的作用，即使当肿瘤已经充分确立时。实施例21：人抗PD-1抗体对T调控性细胞功能的影响T调控性细胞是抑制免疫应答的淋巴细胞。在此实施例中，对T调控性细胞测试其在抗PD-1人单克隆抗体存在或缺失的情况下对CD4+CD25-T细胞的增殖和IFN-γ分泌的抑制功能。使用CD4+CD25+调控性T细胞分离试剂盒(MiltenyiBiotec)由PBMC中纯化T调控性细胞。将T调控性细胞添加至混合淋巴细胞反应(见上文)，所述反应包含纯化的CD4+CD25-T细胞和同种异基因树突细胞，CD4+CD25-与T调控性细胞的比例为2:1。添加浓度为10μg/ml的抗PD-1单克隆抗体5C4。将无抗体或同种型对照抗体用作阴性对照。在第5天收集培养物上清液用于利用Beadlyte细胞因子检测系统(Upstate)进行细胞因子测量。用3H-胸苷标记细胞，再培养18小时，并分析细胞增殖。结果显示于图51A(T细胞增殖)和51B(IFN-γ分泌)。添加抗PD-1人单克隆抗体5C4部分释放Treg细胞对CD4+CD25-T细胞的增殖和IFN-γ分泌施加的抑制，表明抗PD-1抗体对T调控性细胞有影响。实施例22：人抗PD-1抗体对T细胞激活的影响在此实施例中，检验抗PD-1抗体5C4阻断PD-1途径对T细胞激活的影响。在自体单核细胞或单核细胞衍生树突细胞(DC)存在下，用1μg/ml可溶性抗CD3抗体(BD)激活纯化的人CD4+T细胞(DynalCD4T细胞纯化试剂盒)。使用MiltenyiCD14单核细胞纯化试剂盒纯化单核细胞，并在单核细胞与GM-CSF和IL-4(PeproTech)一起培养7天后生成DC。在滴定过的抗PD-1抗体或无关同种型对照mAb存在或缺失的情况下激活三天后，收集培养物上清液用于IFNγ分泌的ELISA分析，同时在测定的最后18个小时期间添加氚标记的胸苷以便测量T细胞增殖。显示于图52A和52B的结果证明抗PD-1抗体的PD-1阻断导致T细胞增殖和IFN-γ分泌增强。还观察到在存在单核细胞的情况下抗PD-1抗体和抗CTLA-4抗体对T细胞激活(具体是对IFN-γ分泌)的协同作用。实施例23：抗PD-1抗体的ADCC活性的评估在此实施例中，进行抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)测定以评估抗PD-1抗体是否能够诱导ADCC靶向细胞。在测定中测试两种型式的5C4，一种具有人IgG1的Fc区(5C4-IgG1)，而另一种具有人IgG4的Fc区(5C4-IgG4)。利用来自PerkinElmer的Delfia细胞细胞毒性试剂盒进行测定。简言之，通过板结合的抗CD3抗体(BD)激活纯化的人CD4T细胞(DynalCD4T细胞纯化试剂盒)以诱导PD-1表达。然后用BATDA试剂标记靶物激活的CD4T细胞。将经标记的CD4T细胞加至V底96孔板，随后加入人PBMC(效应细胞对靶细胞比率(E/T)为50:1)和设定的抗体。于37℃温育1小时后，将板离心。将上清液转移入平底96孔板中并利用RubyStar读板仪读板。结果显示5C4-IgG4并不介导对激活的CD4T细胞的ADCC，而5C4-IgG1却介导对激活的CD4T细胞的ADCC(图53)，表明ADCC活性与抗PD-1抗体的Fc区有关。实施例24：抗PD-1抗体的补体依赖性细胞毒性的评估在此实施例中，检验抗PD-1抗体的补体依赖性细胞毒性(CDC)。在测定中测试两种型式的5C4，一种具有人IgG1的Fc区(5C4-IgG1)，而另一种具有人IgG4的Fc区(5C4-IgG4)。简言之，通过板结合的抗CD3抗体(BD)激活纯化的人CD4T细胞(DynalCD4T细胞纯化试剂盒)以诱导PD-1表达。在人补体(Quidel-A113)存在的情况下对抗PD-1抗体(5C4)和对照抗体从50μg/mL到640pg/mL的连续稀释液测试CDC。使用alamarblue(BiosourceInternational)测量细胞毒性。在荧光读板仪(EX530EM590)上读板。活细胞计数与荧光单位成比例。结果显示5C4-IgG1或5C4-IgG4都不介导对激活的CD4T细胞的CDC，而阳性对照抗体(抗HLA-ABC抗体)介导(图54)。实施例25：人T细胞上PD-1表达的评估在此实施例中，通过FACS对来自不同供体的人PBMC检验各细胞亚类上的PD-1表达。在测定中使用生物素化的抗PD-1抗体，其显示比商品化抗PD-1抗体高得多的对细胞表面上PD-1分子检测的灵敏性。使用PE偶联的链霉亲合素检测结合的抗体。利用FACScan流式细胞计量仪(BectonDickinson)和Flowjo软件(TreeStar)来进行流式细胞计量分析。在有些外周人T细胞上检测到PD-1表达，但在B细胞或单核细胞上没有检测到。对T细胞亚类的进一步检验表明PD-1在CD4和CD8记忆和效应T细胞上表达，但在幼稚CD4或CD8T细胞上缺失。本发明并不限于本文所述具体实施方案的范围。事实上，除了本文所述的那些，根据在前描述和附图，对于本领域熟练技术人员来说本发明的各种改进将是显而易见的。这些改进将落入所附权利要求的范围。所以，本发明只限于所附权利要求的条款以及授权权利要求的等同内容的全部范围。当前第1页1 2 3