抗PD-1抗体及其治疗用途的制作方法

本发明涉及医药领域，更具体地涉及一种抗PD-1抗体及其治疗用途。
背景技术：
：程序性细胞死亡蛋白质1(PD-1)，也被称为CD279，是表达于免疫细胞，包括T细胞的细胞表面受体。PD-1结合两个配体PD-L1和PD-L2。PD-1与其配体的结合触发PD-1介导的信号传导途径，这被认为是免疫应答负调控。PD-1是免疫球蛋白(Ig)的超家族成员，其包括CD28，和CTLA-4。PD-1和其它家族成员是I型跨膜糖蛋白,含有负责配体结合和胞质尾结合信令介体分子的胞外Ig结构域(KeirME等.AnnuRevImmunol.2008；26:677-704)。PD-1的胞质尾包含两个基于酪氨酸的信号基序，一个ITIM(免疫受体酪氨酸的抑制基序)和ITSM(免疫受体基于酪氨酸开关基序)。刺激后，PD-1募集酪氨酸磷酸酶SHP-2到ITSM基序，导致T细胞的效应分子激活，例如CD3ζ，PKCtheta和ZAP70的脱磷酸化。PD-1敲除小鼠发展自发自体免疫疾病，包括狼疮样增生性关节炎(NishimuraH.等.,1998,Int.Immunol.10:1563-1572)，致死性心肌病(NishimuraH.等.,2001,Science291:319-322)和I型糖尿病(WangJ.等.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A,2005,102:11823-11828)。总体而言，基因敲除动物的分析已经导致我们理解PD-1的功能主要是在诱导和调节外周免疫耐受。因此，对PD-1途径的治疗阻断可能对克服免疫耐受很有帮助。这种选择性阻断可能会使用在癌症或感染的治疗，以及在接种疫苗(无论是预防性或治疗性)期间升高免疫力。肿瘤通过创建免疫抑制微环境逃避免疫监视。许多原发肿瘤活检已经发现PD-1和PD-L1在肿瘤浸润淋巴细胞或肿瘤细胞中表达，并且参与免疫逃避(RibasA.CancerDiscov.2015,5(9):915-9).。这样的组织包括肺，肝，卵巢癌，宫颈癌，皮肤癌，结肠癌，神经胶质瘤，膀胱癌，乳腺癌，肾癌，食道癌，胃癌，口腔鳞状细胞癌，膀胱上皮细胞癌和胰腺以及头部和颈部的肿瘤(BrownJ.A.等.,J.Immunol.,2003，170:1257-1266；DongH.等.,Nat.Med.,2003,8:793-800；Wintterle等.,CancerRes.,2003,63:7462-7467；StromeS.E.等.,CancerRes.,2003,63:6501-6505；ThompsonR.H.等.,CancerRes.,2006,66:3381-5；Thompson等.,Clin.CancerRes.,2007,13:1757-61；NomiT.等.,Clin.CancerRes.,2007,13:2151-7)。PD-1，充当免疫检查站，起着重要的调节免疫系统作用。PD-1防止T细胞的活化失控，从而降低自身免疫及促进自身耐受调节。PD-1的抑制效果是通过促进抗原特异性T细胞细胞凋亡，同时降低调节性T细胞的凋亡，这一双重机制 来完成的。鉴于其免疫抑制作用，PD-1的抑制剂被认为能激活免疫系统来攻击肿瘤，因此用于治疗癌症和其它免疫相关疾病。阻断PD-1与其配体之间的相互作用以增强肿瘤特异性CD8T细胞免疫是能够杀灭肿瘤细胞(TopalianS.等.CurrOpinImmunol.2012,24(2):207-12)。近年来，抗PD-1的抗体已成为治疗黑色素瘤和肺癌的临床药物。技术实现要素：本发明是基于抗PD-1抗体，SHB-617，它表现出结合PD-1高亲和力，并成功地阻断PD-1介导的信号和增强的T细胞的活化。因此，本公开的一个方面提供了分离的抗PD-1抗体，它与SHB-617抗体的重链及轻链可变区的互补决定区(CDR)相同。这样抗体包含：(i)重链可变区(VH)包含重链互补决定区(HCCDR)1所列为GFSLSTSGT(按ChothiaCDR定义,下同)，一个HCCDR2规定为CWEDS，以及HCCDR3规定为EDSGYFWFPY；和(ii)轻链可变区(VL)其包含的轻链互补决定区(LCCDR)1所列为KAGQNVNNYLA，一个LCCDR2阐述为NANSLQT；和LCCDR3规定为QQYNSWTT。在一些实施方案中，本文所描述的分离的抗PD-1抗体包含为VH链，其包含的氨基酸序列至少80％(例如，85％，90％，95％，97％，或其以上)相同于QVTLKESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGTCVSWIRQPPGKALEWLATICWEDSKGYNPSLKSRLTISKDTSKNQAVLTMTNMDPVDTATYYCARREDSGYFWFPYWGQGTLVTVSS(SEQIDNO.:9)。备选地或另外，抗PD-1抗体包含为VL链，其包含的氨基酸序列至少80％(例如，85％，90％，95％，97％，或其以上)相同于NIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKAGQNVNNYLAWYQQKPGKAPKVLIFNANSLQTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNSWTTFGGGTKVEIKR(SEQIDNO.:7)。在一些实例中，本文所描述的分离的抗PD-1抗体包含为VH，其包括氨基酸序列QVTLKESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGTCVSWIRQPPGKALEWLATICWEDSKGYNPSLKSRLTISKDTSKNQAVLTMTNMDPVDTATYYCARREDSGYFWFPYWGQGTLVTVSS(SEQIDNO.:9)；和/或为VL链，其包括NIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKAGQNVNNYLAWYQQKPGKAPKVLIFNANSLQTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNSWTTFGGGTKVEIKR(SEQIDNO.:7)氨基酸序列。在一些实例中，本文描述的抗PD-1抗体包含为VH链，其包括QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGTCVSWIRQPSGKGLEWLATICWEDSKGYNPSLKNRLTISKDTSNNQAFLKITSVDTADSAIYYCARREDSGYFWFPYWGQGTLVSVS(SEQIDNO.:10)的氨基酸序列；和/或为VL链，其包括氨基酸序列NIQMTQSPSLLSASVGDRVTLSCKAGQNVNNYLAWYQQKLGEPPKVLIFNANS LQTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYFCQQYNSWTTFGAGTKLELKR(SEQIDNO.:8)。在一些实施方案中，本文描述的抗PD-1抗体可以抗体SSI-361都结合于相同的表位或相竞争SHB-617结合PD-1。本文所述的任何抗PD-1抗体可以是全长抗体(例如，IgG分子)或其抗原结合片段(例如，Fab或F(ab’)或单链抗体scFv)。在一些实例中，抗体可以是嵌合抗体或人源化抗体或多特异性抗体。在其它实例中，本文描述的抗体可以是多特异性抗体，其结合PD-1和一个或多个其它靶抗原的一部分。在又其它实施例中，本文中描述的抗体缀合与合适的试剂，例如治疗剂或诊断剂，以形成缀合物，例如，抗体药物偶联物(ADC)。在本发明的另一方面，提供了一种抗体重链，所述抗体重链具有以下CDR：CDR1：SEQIDNO.:17；CDR2：SEQIDNO.:18；CDR3：SEQIDNO.:19。本发明还提供了一种抗体轻链，所述抗体轻链具有以下CDR：CDR1：SEQIDNO.:20；CDR2：SEQIDNO.:21；CDR3：SEQIDNO.:22。本发明还提供了含有上述抗体重链和/或抗体轻链的抗体，例如人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单链抗体、或其组合。在另一个方面，本公开内容提供特定的核酸或一组核酸，其共同编码本文所描述的抗PD-1抗体。这样的核酸可以是一个载体或一组载体，例如其中的核苷酸序列编码VH或VL是或两者连接到合适的启动子的表达载体。在一些实例中，所述的载体是表达载体。在一些实例中，所述分离的核酸编码抗PD-1抗体包含VH编码在第一核苷酸序列，VL在第二核苷酸序列的。在其它实例中，VH的编码序列和VL链位于不同的核酸。在一些实例中，所述核酸包含第一核酸，所述第一核酸包含编码VH的第一核苷酸序列；和第二核酸，所述第二核酸包含编码VL的第二核苷酸序列。在另一优选例中，所述的第一核苷酸序列和第二核苷酸序列相互融合或各自独立。在另一个方面，本公开提供了一种载体或载体组(例如，含有两个载体)，其共同包含核酸(多个)编码任何抗PD-1本文中所描述的抗体。在一些实例中，所述载体或载体组是表达载体(多个)。在另一个方面，本公开内容提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包含本发明的载体或载体组。这样的宿主细胞可以在合适的条件，允许所述抗体的表达的条件下进行培养。所述宿主细胞可以被收集由此产生的抗体的分离。此外，本公开内容提供了一种药物组合物，其包含如本文所述的或如本文描述的抗PD-1抗体(例如，游离形式或缀合与如本文所述合适的试剂)，或任何核酸/核酸的设置，和药学上可接受的载体组成。这样的药物组合物可以用于治疗与PD-1 信号相关的疾病(如癌症，感染性疾病如病毒感染(如，甲型肝炎，乙型肝炎，丙型肝炎或C),以及其它免疫相关疾病)。本发明提供了一种用于制备抗PD-1抗体的方法，所述方法包括：(i)在能够表达抗体的条件下培养宿主细胞，所述宿主细胞包含本发明的载体或载体组合；和(ii)收集所述宿主细胞或培养基用于纯化所述抗体。在另一优选例中，所述的抗PD-1抗体是抗体SSI-361。在另一个方面，本公开内容提供了用于治疗与PD-1信号(通路)相关疾病的方法，所述方法包括给需要的对象施用有效量的本发明所述的药物组合。在一些实例中，所述药物组合物的作为单一药剂或组合。在一些实例中，所述方法还包括给需要的对象其他治疗剂。在一些实例中，所述的与PD-1信号(通路)相关的疾病包括癌症、感染性疾病、或其它免疫相关疾病。也在本公开的范围内是使用任何抗PD-1抗体，编码核酸(多个)，抗体偶联物(例如ADC)，或药物组合物，治疗本文所述的任何目标疾病的用途。本发明的一个或多个实施方案的细节阐述于以下说明中。其它特征或本发明的优点在从以下附图和几个实例详细描述，以及从所附的权利要求将是显而易见的。附图说明图1是一系列曲线图，显示抗PD-1嵌合抗体在刺激记忆T细胞应答情况。其中，图1A、1B、1C和1D分别显示了抗人PD-1抗体SHB-128、SHB-152、SHB-168和SHB-617刺激记忆T细胞应答的情况。图1E和1F分别显示了抗PD-L1和人IgG的应答情况，分别用作阳性和阴性对照。图2是SHB-617VL(SEQIDNO.:1)(ChothiaCDR的定义和编号)和所述人源化受体构架VK1-L1(SEQIDNO.:2)和JH4(SEQIDNO.:3)。图3是SHB-617VH(SEQIDNO.:4)(ChothiaCDR的定义和编号)和所述人源化人受体构架VH2-2-70(SEQIDNO.:5)和JH4(SEQIDNO.:6)。图4是人源化的SHB-617VL(SEQIDNO.:7)和亲代鼠VL域(SEQIDNO.:8)。图5是人源化的SHB-617VH(SEQIDNO.:9)和亲代鼠VH域(SEQIDNO.:10)。图6显示人源化抗体与人和猴子PD-1蛋白结合ELISA一个图表。其中，图6A：人PD-1结合ELISA。图6B：Rehsus猴子PD-1结合ELISA。图6C：食蟹猴PD-1结合ELISA。图7是表示通过FACS检测抗体和细胞表面人类PD-1的曲线图。图8描绘抗体阻断人类配体PD-L1及PD-L2结合到细胞的人类PD-1。其中，图8A和图8B分别显示了抗体阻断配体PD-L1、PD-L2结合的情况。图9显示抗体增强人类T细胞活化。其中，图9A显示了人T细胞TT活化分析，图9B显示了人MLR分析。图10是SSI-361在食蟹猴的药代动力学曲线图。序列的简要说明SEQIDNO.:1是SHB-617VL的氨基酸序列，与图2相关联。SEQIDNO.:2是人VK1-L1的氨基酸序列，与图2相关联。SEQIDNO.:3是人JK4的氨基酸序列，与图2相关联。SEQIDNO.:4是鼠SHB-617VH的氨基酸序列，与图3相关联。SEQIDNO.:5是人VH2-2-70的氨基酸序列，与图3相关联。SEQIDNO.:6是人JH4的氨基酸序列，与图3相关联。SEQIDNO.:7是人源化的SHB-617的VL的氨基酸序列显示在图4。SEQIDNO.:8是鼠SHB-617的VL的氨基酸序列显示在图4。SEQIDNO.:9是人源化的SHB-617的VH的氨基酸序列示于图5。SEQIDNO.:10是鼠SHB-617的VH的氨基酸序列示于图5。SEQIDNO.:11是SSI-361(人源化的SHB-617)的LC的氨基酸序列。SEQIDNO.:12是SSI-361(人源化的SHB-617)的HC的氨基酸序列。SEQIDNO.:13是SHB-617的重链的全长氨基酸序列。SEQIDNO.:14是SHB-617的重链的全长编码基因序列。SEQIDNO.:15是SHB-617的轻链的全长氨基酸序列。SEQIDNO.:16是SHB-617的轻链的全长编码基因序列。SEQIDNO.:17是SSI-361的重链互补决定区HCCDR1。SEQIDNO.:18是SSI-361的重链互补决定区HCCDR2。SEQIDNO.:19是SSI-361的重链互补决定区HCCDR3。SEQIDNO.:20是SSI-361的轻链互补决定区HCCDR1。SEQIDNO.:21是SSI-361的轻链互补决定区HCCDR2。SEQIDNO.:22是SSI-361的轻链互补决定区HCCDR3。具体实施方式本专利描述抗PD-1抗体，核酸编码这样抗体，其激活T细胞增强的免疫应答功能，和应用于治疗与PD-1的信号传导相关的疾病包括癌症。抗PD-1抗体PD-1是表达于免疫细胞，包括T细胞和B细胞的细胞表面受体，负调节免疫反应。人PD-1被PDCD1基因编码。作为一个例子，一个人PD-1的氨基酸序列是根据GenBank登录号NP_005009中公开。抗PD-1抗体(复数形式可互换使用)是免疫球蛋白分子，其能够特异性结合的PD-1蛋白质或其片段的，通过至少一个抗原识别位点，位于免疫球蛋白分子的可变区。如本文所用，术语“抗体”不仅包括完整的(即，全长)多克隆或单克隆抗体， 而且还包括抗原结合片段(例如Fab，Fab’，F(ab’)2，FV)，单链(单链抗体)，其突变体，融合蛋白包含抗体部分，人源化抗体，嵌合抗体，双抗体，线性抗体，单链抗体，多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和免疫球蛋白分子，其包含的任何其他修饰构抗原识别位点所需特异性的，包括抗体的糖基化的变体，氨基酸的抗体的氨基酸序列变体和共价修饰的抗体。抗体包括任何一类，如IgD的，IgE的，IgG的，IgA或IgM抗体(或子类物)的抗体，以及该抗体不必是任何特定种类的。取决于其重链的恒定结构域的抗体氨基酸序列，免疫球蛋白可归入不同的类。免疫球蛋白有五大类：IgA，IgD，IgE，IgG和IgM，其中有些可进一步分为亚类(同种型)，例如，IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA1和IgA。对应于不同类的免疫球蛋白的重链恒定域分别称作α，δ，ε，γ和μ的亚基结构和不同类的免疫球蛋白的三维构型是众所周知的。要使用在本文描述的方法的抗体可以是小鼠，大鼠，人或任何其他来源(包括嵌合或人源化抗体)。在一些实例中，所述抗体包含修饰的恒定区，如一个恒定区是免疫惰性，例如不触发补体介导的裂解，或者不刺激抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。ADCC活性可使用在美国专利5,500,362号中公开的方法进行评估。在其他实施方案中，恒定区包括改顺序(欧洲免疫学杂志(1999)29：2613-2624；PCT申请PCT/GB99/01441；和/或英国专利申请9809951.8号)。任何本文描述的抗体的可以是单克隆或多克隆的。“单克隆抗体”是指均质抗体群，“多克隆抗体”是指异源抗体群。这两个术语不限制抗体的来源或者其所用的方法。在一些实例中，本文公开的特异性抗体结合的靶的PD-1抗原。认为“特异性结合”(在本文可互换使用)到目标或的表位是本领域公知的术语和方法，以确定这种特异性结合也是本领域中公知的。分子被认为显示出“特异性的抗体结合”，如果它与靶点反应更频繁，更迅速，更大的持续时间。抗体“特异性结合”于靶抗原，如果它以更大的亲和力，亲合力，更容易和/或以比其结合其他物质的更大的持续时间结合。例如，抗体特异(或优先)地结合到PD-1的表位是结合本PD-1的表位具有更大的亲和力，亲合力，更容易和/或以比其结合其它PD-1的表位或非PD-1表位更大的持续时间的抗体。还应当理解通过阅读该定义，例如，抗体特异性结合第一靶抗原可以或可以不特异性或优先结合第二靶抗原。因此，“特异性结合”或“优先结合”不一定需要(虽然其可包括)专一结合。通常，但不一定，结合就是优先结合。抗PD-1抗体是抗体能够结合PD-1抗原并抑制PD-1介导的信号传导途径，从而增强免疫应答，例如T细胞的活化。在一些实例中，本文中所描述的抗PD-1抗体至少20％抑制PD-1的信号传导途径，至少40％，至少50％，至少75％，至少90％，至少100％，或由至少2倍，至少5倍，至少10倍，至少20倍，至少50倍，至少100倍，或至少1000倍。抗PD-1抗体与PD-1抗原的结合亲和力可以小于约100nM，约50nM，约10nM，约1nM，约500PM，约100pM，约50pM，约2pM。结合亲和力可表示为：KD解离常数，KD越小结合亲力越大。确定抗体PD-1的结合亲和力的一种方式是通过表面复共振来测定(BIAcore3000TM表面等离子共振(SPR)系统，的BIAcore，INC，Piscaway新泽西州)。动力学结合速率(kon)和分解率(koff)一般在25℃获得；平衡解离常数(KD)值的计算方法：KD＝koff/kon本文所描述的抗PD-1抗体可以结合到相同于SHB-617的表位，其VH氨基酸序列和VL氨基酸序列在图2，3，4和5中提供。或者是可竞争SHB-617结合到PD-1靶抗原的抗体。这样的抗体可以表现出至少相对于SHB-617的20％(例如，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，或更高)抑制由PD-1介导的活性。这种抗PD-1抗体可以包括重链CDRs和/或轻链CDRs相同于SHB-617CDRs，例如，图2和图3所显示CDR区(跟据Chothia编号方案所决定。可替代地或另外地，本文描述的抗PD1抗体可以包含为VH的CDR1，CDR2和CDR3的至少75％(例如，80％，85％，90％，95％，或98％)相同SHB-617，和/或为VL的CDR1，CDR2，和CDR3至少75％(例如，80％，85％，90％，95％，或98％)相同于SHB-617的对应的CDRs。“互补决定区”或“CDR”是本领域中已知为是指抗体可变区中的非邻接的氨基酸的序列，其赋予抗原特异性和结合亲和力。在一般情况下，有在每条重链可变区的三(3)个CDR和在每一个轻链可变区的三(3)的CDR。一个给定的CDR的精确氨基酸序列的边界可以使用任意数量的公知的方案中，包括那些由Kabat等人所述来确定。这些文献包括Kabat(1991),5thEd.PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,Md.(theKabat"numberingscheme),Al-Lazikanietal.,(1997)JMB273,927-948(theChothia"numberingscheme),MacCallumetal.,J.Mol.Biol.262:732-745(1996)(theContactnumberingscheme),LefrancMPetal.,DevCompImmunol,2003January；27(1):55-77(theIMGTnumberingscheme),andHoneggerAandPluckthunA,JMolBiol,2001Jun.8；309(3):657-70,(theAHonumberingscheme).一个给定的CDR的边界可以根据用于识别该方案而有所不同。例如，所述的Kabat方案是基于结构比，而Chothia方案基于结构信息。联系人方案基于复合物晶体结构的分析，并在许多方面与Chothia编号方案类似。因此，除非另有规定，术语“互补决定区”或一个给定的抗体的“CDR”应被理解通过任何以上描述的已知的方案所限定为包括互补决定区。如果，用相同的编号方案确定的，抗体具有相同的VH和/或VL的CDR作为SHB-617，这样的抗体被视为具有相同的CDR作为SHB-617和本公开的范围之内。例如，这样的抗体可具有相同的VH和/或VL的CDR作为克隆SHB-617如由Chothia编号方案所决定。在另一实例中，本公开的范围内的抗PD-1抗体可具有相同的VH和/或VL的CDR作为克隆SHB-617如通过Kabat编号方案来确定。可替代地，本文描述的抗PD-1抗体可以包含VH至少75％(例如，80％，85％，90％，95％，或98％)相同SHB-617VH(成熟或前体)和/或VL至少75％(例如，80％，85％，90％，95％，或98％)相同于SHB-617VL(成熟前体的)。两个氨基酸序列的“同一性百分比”是使用Karlin和Altschul的算法来确定(Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:2264-68,1990,modifiedasinKarlinandAltschulProc.Natl.Acad.Sci.USA90:5873-77,1993)。这样的算法并入NBLAST和XBLAST程序Altschul(版本2.0)，J.Mol.Biol.215:403-10,1990.BLAST蛋白质检索可以用XBLAST程序进行，得分＝50，字长＝3，以获得同源的氨基酸序列与感兴趣的蛋白质分子。当两个序列之间存在的一些间隙，空位BLAST可以如Altschul描述被利用(NucleicAcidsRes.25(17):3389-3402,1997)。当利用BLAST和GappedBLAST程序时，可以使用各自程序的默认参数(例如，XBLAST和NBLAST)。在其它实例中，本文所描述的抗PD-1抗体可以包含VH变种，其包括多达5个(例如，1，2，3，4或5)在VHCDR区的氨基酸残基变化(VHCDR1，CDR2和/或CDR3)相比SHB-617的CDR，和/或VL变种，其包括多达5个(例如，1，2，3，4或5)在VLCDR区的氨基酸残基变化(VLCDR1，CDR2和/或CDR3)相比SHB-617的CDRs。如本文所描述的抗PD-1抗体可以是从SHB-617衍生的嵌合抗体，这样的嵌合抗体可以包括来自SHB-617衍生为VH和VL(本文描述的那些)和重恒定区和轻恒定区来自人抗体。嵌合抗体是指具有从第一物种来自第二物种的可变区或可变区的一部分，和恒定区的抗体。典型地，在这些嵌合抗体，包括轻链和重链模拟的可变区的抗体的可变区是来自于哺乳动物(例如，非人哺乳动物，如小鼠，兔和大鼠)中的一个物种，而恒定部分的序列与另一个哺乳动物衍生的诸如人的抗体中的序列。在一些实施方案中，氨基酸修饰可以在可变区和/或恒定区来制备。在其它实例中，本文所描述的抗PD-1抗体是SHB-617“人源化抗体”。人源化抗体可以改变非人类抗体，以人序列取代某些抗体片段(例如，构架区)，从而减少在人体中免疫原性。本文所描述的人源化抗体可以是任何抗体形式。在一些实施方案中，它们是完整的免疫球蛋白分子(全长抗体)，包括IgG，IgA的，IgD的，IgE和IgM抗体。在其他实施方案中，人源化抗体的抗原结合片段，例如，Fab，F(ab’)2，scFv和Fv。在某些情况下，它们也可以是单链抗体或双特异性抗体。人源化抗体可设计如下。首先对非人抗体VH及VL各可变区进行三维分子建模，分析按照本领域中已知的方法，例如，Queen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86:10029-10033(1989)。接着，使用鉴定相同的分子建模分析预测框架氨基酸残基对正确的CDR结构的形成起非常重要作用。同时，从人抗体基因数据库搜索查询与非人类抗体氨基酸序列具有高同源抗体基因，从而选择人VH及VL受体基因。所选择的人受体基因CDR区可以替换为从非人抗体或其功能变体CDR区。在必要时，被预测为与CDR区相互作用重要母体链的框架区内的残基(见上面的描述)可以被用于替代在人受体基因的相应残基。本文所述提供从SHB-617而来的嵌合体和人源化抗PD-1抗体氨基酸序列及抗体基因列于下方(也参见图2-5；和实施例1-3)：SHB-617序列(鼠/人IgG4/卡帕嵌合体)重链的全长氨基酸序列(448AA)SEQIDNO.:13QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGTCVSWIRQPSGKGLEWLATICWEDSKGYNPSLKNRLTISKDTSNNQAFLKITSVDTADSAIYYCARREDSGYFWFPYWGQGTLVSVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK重链全长编码基因序列SEQIDNO.:14CAGGTGACACTCAAGGAAAGCGGACCTGGAATCCTCCAACCTTCCCAGACTCTTTCCCTGACCTGTAGCTTCTCCGGGTTCTCCTTGTCCACCTCTGGCACATGCGTGTCATGGATCAGACAGCCATCTGGGAAGGGCTTGGAGTGGCTGGCAACAATTTGCTGGGAGGATTCAAAGGGGTACAACCCCAGTCTGAAGAACAGGCTGACCATTAGCAAGGACACCAGCAACAATCAGGCCTTCCTGAAAATTACTAGCGTCGATACAGCTGACAGCGCCATCTACTACTGCGCCCGCCGGGAGGACAGCGGGTACTTTTGGTTTCCCTATTGGGGCCAGGGCACTCTCGTCTCCGTGAGCAGTgctagcactaaggggccatcagtgttccccctggccccatgcagccggagtacaagcgaatccactgccgcccttggatgcctcgtgaaggattacttccccgagcccgtgaccgtgagttggaacagcggagccttgacaagcggcgtccacacattccccgccgtcctccagtctagcgggctttacagcctcagctccgtcgtgaccgtccctagttcctccctcggaactaagacatacacttgcaacgtggatcataagccctcaaacacaaaggtcgataagcgggtcgagagcaaatacggcccaccatgcccaccttgtcccgcccccgagtttttggggggcccctctgtgttcctctttcctcctaagcctaaggacactctcatgattagccggacacccgaggtcacctgcgtcgtcgtggacgtgagccaggaggaccctgaagtgcagttcaattggtatgtggacggggtcgaggtccacaacgccaagacaaagccaagagaggagcagtttaacagtacctaccgggtcgtgagtgtgctgacagtgcttcaccaggactggctgaacgggaaggagtataagtgcaaggtgtccaacaagggcctcccctcaagcatcgagaagactatctctaaggccaaggggcagcccagagagccacaggtgtatacattgccccctagccaggaggagatgactaaaaaccaggtgtctctgacctgtctggtcaaaggcttctacccctccgatatcgctgtggagtgggagtccaacggacagccagaaaacaactacaagaccacacctcccgtcctggatagcgacggctcatttttcctatacagcaggctgaccgtggacaaatccagatggcaggagggcaacgtgttctcctgcagcgtgatgcatgaggccctgcacaaccactacactcagaagtccctgtccctgagcctgggcaaatag轻链全长氨基酸序列(213AA)SEQIDNO.:15NIQMTQSPSLLSASVGDRVTLSCKAGQNVNNYLAWYQQKLGEPPKVLIFNANSLQTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYFCQQYNSWTTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC轻链全长基因编码序列：SEQIDNO.:16AATATCCAGATGACCCAGTCCCCTTCCCTCCTCAGCGCTTCCGTGGGAGATAGGGTGACACTCAGTTGCAAGGCAGGACAGAACGTGAACAACTACCTGGCCTGGTACCAGCAGAAGCTGGGCGAACCTCCAAAGGTCCTTATCTTCAACGCCAACAGCCTGCAGACCGGGGTGCCCTCACGGTTTTCTGGGTCTGGGAGCGGCACAGACTTTACTTTGACTATTAGCTCCTTGCAGCCCGAGGACGTCGCCACATATTTCTGTCAGCAATACAACAGCTGGACCACCTTCGGGGCCGGCACAAAGCTGGAGCTGAAAcgtacggtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgttag人源化的SHB-617(SSI-361)可变区VL氨基酸序列SEQIDNO.:7NIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKAGQNVNNYLAWYQQKPGKAPKVLIFNANSLQTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNSWTTFGGGTKVEIKRVH氨基酸序列SEQIDNO.:9QVTLKESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGTCVSWIRQPPGKALEWLATICWEDSKGYNPSLKSRLTISKDTSKNQAVLTMTNMDPVDTATYYCARREDSGYFWFPYWGQGTLVTVSS人源化的SHB-617(人IgG4)，也称为SSI-361重链全长序列(448AA)SEQIDNO.:11QVTLKESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGTCVSWIRQPPGKALEWLATICWEDSKGYNPSLKSRLTISKDTSKNQAVLTMTNMDPVDTATYYCARREDSGYFWFPYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK轻链全长序列(213AA)SEQIDNO.:12NIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKAGQNVNNYLAWYQQKPGKAPKVLIFNANSLQTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNSWTTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC本文还描述了上述披露示例人源化抗PD-1抗体SSI-361的功能性变体。这样的功能变体可以包括为VH，其包含的氨基酸序列至少85％(例如，90％，92％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％)相同于SSI-361，和/或为VL具有的氨基酸序列中的至少85％(例如，90％，92％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％)相同于SSI-361.这些变体能够结合到PD-1，特别是人的PD-1抗原。在一些实例中，所述变体具有抗原结合亲和力相对于上述的示例性人源化抗体相似(例如，具有的Kd<100×10-9M)。在一些实施方案中，上述的功能性变体包含一个或多个突变(例如，保守取代)中的任一在VH或VL的FR(相比SSI-361)。优选地，这样的突变不会发生在被预测为与一种或多个CDRs相互作用氨基酸残基(见实施例2下文)。正如本领域已知的，FR区中的突变是不太可能影响抗体的抗原结合活性。在其他实施方案中，功能性变体本文所述的包含一个或多个突变(例如，1，2，或3)在一个CDR区的一个或多个。优选地，这种功能性变体保持相同的区域/残基负责抗原结合作为母体，如CDR的内部相同的特异性决定残基。任何抗PD-1抗体可以通过常规的方法，例如，重组技术来制备。见，例如，Green等,NatureGenetics7,13；和美国专利号5545806和5569825。当制备一个全长抗体，编码本文所述的任何抗PD-1抗体VH及VL的序列可以连接于人免疫球蛋白的Fc区和所得基因的编码全的编码序列全长抗体重和轻链可以表示并装配在合适的宿主细胞，例如，植物细胞，哺乳动物细胞，酵母细胞，或昆虫细胞。抗原结合片段可通过常规方法制备。例如，F(ab’)2片段可通过胃蛋白酶消化的全长抗体分子；Fab片段可以通过还原F(ab’)2片段的二硫桥产生产生。或者，这样的片段可通过重组技术通过表达在合适的宿主细胞中的重链和轻链片段制备(例如，大肠杆菌，酵母，哺乳动物，植物，或昆虫细胞)，并让它们在体内或体外组装以形成所需的抗原结合片段。单链抗体可通过重组技术通过将一核苷酸序列编码的重链可变区和核苷酸序列编码的轻链可变区来制备。优选地，柔性接头结合两个可变区之间。如上所述产生人源化抗PD-1抗体可以进行检查，以确定其性能，如抗原结合活性和生物功能，以下的常规方法，例如，实施例3下面描述的那些。本文还公开了编码本文描述的任何抗PD-1抗体的核酸，载体如包含这些核酸的表达载体，和包含所述载体的宿主细胞。在一个实例中，两个重链和轻链编码序列包含在一个表达载体，每个重链编码序列和轻链编码序列可以可操作地连接到合适的启动子。可替代地，这两个重链和轻链的表达可以由相同的启动子来驱动。在另一实例中，每个抗体的重链和轻链克隆在给个体载体。在后一种情况下，编码重链和轻链的表达载体可以被共转染到一个宿主细胞中的两条链，其可以被组装以形成完整的抗体在体内或体外的表达。备选地，表达载体编码重链和编码轻链可引入不同宿主细胞中表达各重链和轻链，然后可以被纯化和组装以形成完整的抗体。合适的宿主细胞包括，但不限于，哺乳动物细胞(例如，CHO细胞或293细胞)，植物细胞，昆虫细胞，酵母细胞，或细菌细胞。本公开还提供一种免疫偶联包含任何本文中所描述的抗PD-1抗体和合适的试剂，其可以是治疗剂或诊断剂。在一些实例中，本文公开抗PD-1抗体连接到细胞毒性剂，放射性同位素，或药物。制备这种免疫缀合物在本领域中是公知的。例如见，WO2014/160160,美国专利号5208020和5416064，及Chari等，1992癌症研究。52：127-131。例如，可将抗体与双功能试剂如N-琥珀酰亚胺-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)改性以引入活性二硫化物部分。如果需要的话，该代理也可以缀合到抗体可以被修饰，以引入硫醇基团以下常规实践。反应与含硫醇试剂将产生其中抗体和试剂通过二硫键连接的免疫缀合物。抗PD-1抗体用途本文所描述的抗PD-1抗体(游离形式或作为免疫缀合物)可以用作治疗剂和诊断剂，以及作为研究工具应用于生物化学，分子生物学和医学研究工作。因此，本文所公开的用于治疗与PD-1的信号传导有关的疾病的方法(例如，癌症，感染性疾病如病毒感染(如，甲型肝炎，乙型肝炎，丙型肝炎或C)，以及其它免疫相关疾病)，其包括给予需要所述治疗的个体本文所述的任何抗PD-1抗体的有效量，这种抗体也可用于增强免疫反应，如T细胞的活化在需要治疗的受试者。在一个实例中，需要刚刚提到的治疗的对象(例如，人类患者)是具有，怀疑具有，或有风险有癌症发展的患者。如本文所用，“治疗”一词是指一种组合物，包括一种或多种活性剂对受试者的施用或给药。患者具有与PD-1介导相关的病症/疾病(例如，本文描述的那些)，症状的疾病/紊乱，或者向疾病/病症的诱因，其宗旨是治疗，治愈，减轻，解除，改变，矫正，缓解，改善或影响疾病/病症，这种病的症状/病症，或朝向该疾病/病症的倾向。本文所用的“有效量”指的是赋予治疗效果上的问题，无论是单独或与一种或多种其它活性剂组合所需的每种活性剂的量。有效量而有所不同，所确认的本领域技术人员在，根据特定的条件被治疗的病症的严重程度，个体患者参数，包括年龄，身体状况，身高，性别和体重，治疗的持续时间，所述并行治疗的性质(如果有的话)，管理和像的保健医生的知识和经验范围内的因素的具体路线。这些因素是公知的那些普通技术人员在本领域中，并且可以与不超出常规的实验来解决。它通常优选的是其使用的各个组件或组合的最大剂量，也就是最高安全，根据剂量，以合理的医学判断。但是像本领域的普通技术人员可理解的，患者可能跟据医疗原因，心理原因或几乎任何其他原因坚持要求较低剂量或可耐受的剂量。在一些实施方案中，抗PD-1抗体本文所述的量是有效地抑制了PD-1信号(例如，至少20％，30％，50％，80％，100％，200％，400降低PD1信号％，或500％相比，空白对照)。在其他实施方案中，抗PD-1抗体本文所述的量是有效的活化免疫应答(例如，至少20％，30％，50％，80％，100％，200％，400％，或500％相比于空白对照)。通常，对于任何本文描述的抗体的施用，初始候选剂量可以是约2毫克/公斤。为了本公开的目的，典型的日剂量的范围为约任何0.1微克/公斤至3微克/公斤到30微克/公斤至300微克/公斤至3毫克/公斤，30毫克/公斤至100毫克/公斤或更多，这取决于上述因素。对于持续数天或更长的重复施用，根据状况，治疗或持续直到不良症状发生。示例性的给药方案包括施用初始剂量为约2毫克/公斤，随后是约1毫克/公斤的抗体的每周维持剂量，或之后的约1毫克/公斤每隔一周的维持剂量。然而，其它剂量方案可能是有用的，这取决于药物代谢动力学衰变该医生希望达到的图案。例如，每周1-4次给药是预期的。在一些实施方案中，剂量范围从约3微克/公斤到约2毫克/公斤(约3微克/公斤，约30微克/公斤，约300微克/公斤，约3毫克/公斤)可被使用。在一些实施方案中，给药频率每周是一次，每2周，每4周，每5周，每6周，每7周，每8周，每9周，或每10周一次；或每月一次，每2个月，或每3个月，或更长的时间一次。此疗法的进展易于通过常规技术和测定法监测。给药方案(包括使用的抗体)可以随时间变化。能够实践本文所公开的处理中，任何抗PD-1抗体或编码核酸的可与药学上可接受的载体混合以形成用于给予需要该治疗的受试者的药物组合物。药学上可接受的载体是与组合物中的活性成分(多个)相容(和优选地，能够稳定它的)，而不是有害于要治疗的受试者。例如，增溶剂如环糊精，如本文所述其中形成具有抗PD-1抗体更可溶络合物，或核酸编码这样，或多种增溶剂，可以用作药 物载体用于递送激动剂/拮抗剂。其它载体的实例包括胶体二氧化硅，硬脂酸镁，月桂基硫酸钠，和D&C黄#10，例如，见Remington’sPharmaceuticalSciences,Edition16,MackPublishingCo.,Easton,Pa(1980)；andGoodmanandGilman’s"ThePharmacologicalBasisofTherapeutics",TenthEdition,Gilman,J.HardmanandL.Limbird,eds.,McGraw-HillPress,155-173,2001.配制为用于治疗用途的药物组合物，可用于存储由混合的药剂具有纯度与任选的药学上可接受的载体，赋形剂或稳定剂在所希望的程度来制备(Remington’sPharmaceuticalSciences16thedition,Osol,A.Ed.(1980))，以冻干配制剂或水溶液的形式。可接受的载体，赋形剂，或稳定剂是无毒的收件人在所采用的剂量和浓度，并且包括缓冲剂如磷酸盐，柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基氯化铵；氯化己烷双胺；苯扎氯铵，苄索氯铵；苯酚，丁基或苄基醇；对羟基苯甲酸酯的烷基如甲基或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白，明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，组氨酸，精氨酸，或赖氨酸；单糖，二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖，甘露糖，或糊精；螯合剂，如EDTA；糖，如蔗糖，甘露醇，海藻糖或山梨醇；形成盐的抗衡离子如钠；金属配合物(例如，Zn-蛋白质复合物)；和/或非离子表面活性剂例如TWEENTM，PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。治疗目标疾病，上面提到的药物组合物的有效量可以通过合适的途径给予受试者(例如人)。需要治疗的受试者可以是有风险，或怀疑患有与PD-1介导有关病症的患者。这样的患者可以通过常规体检来鉴定。本文所述的治疗性多核苷酸或多肽可使用基因递送载体被递送。基因递送载体可以是病毒或非病毒来源的(一般参见，Jolly,CancerGeneTherapy(1994)1:51；Kimura,HumanGeneTherapy(1994)5:845；Connelly,HumanGeneTherapy(1995)1:185；andKaplitt,NatureGenetics(1994)6:148)。这样的编码序列的表达可以使用内源哺乳动物的或异源启动子和/或增强子被诱导。编码序列的表达可以是组成型或调节。递送所需多核苷酸的表达在期望的细胞的病毒为基础的载体是公知的现有技术。示例性的基于病毒的载体包括，但不限于，重组逆转录病毒(见，例如，PCTPublicationNos.WO90/07936；WO94/03622；WO93/25698；WO93/25234；WO93/11230；WO93/10218；WO91/02805；U.S.Pat.Nos.5,219,740and4,777,127；GBPatentNo.2,200,651；andEPPatentNo.0345242)，甲病毒为基础的载体(例如，辛德毕斯病毒载体，塞姆利基森林病毒(ATCCVR-67；ATCCVR-1247)，罗斯河病毒(ATCCVR-373；ATCCVR-1246)和委内瑞拉马脑炎病毒(ATCCVR-923；ATCCVR-1250；ATCCVR1249；ATCCVR-532)，和腺相关病毒(AAV)载体(见，例如，PCTPublicationNos.WO94/12649,WO93/03769；WO93/19191；WO94/28938；WO 95/11984andWO95/00655)。DNA联接到杀死的腺病毒也可以使用(Curiel,Hum.GeneTher.(1992)3:147)。非病毒递送载体和方法也可使用，包括，但不限于，聚阳离子凝聚的DNA连接或单独切断了杀死腺病毒(见，例如，Curiel,Hum.GeneTher.(1992)3:147)；配体连接的DNA(例如，Wu,J.Biol.Chem.(1989)264:16985)；真核细胞输送载体细胞(见，例如，美国专利No.5,814,482；PCTPublicationNos.WO95/07994；WO96/17072；WO95/30763；andWO97/42338)和核酸电荷中和或融合细胞膜。裸DNA也可以采用。示例性的裸DNA导入方法在PCT公开号WO90/11092和美国专利号5580859中所述。脂质体，可作为基因递送载体在专利中描述(U.S.Pat.No.5,422,120；PCTPublicationNos.WO95/13796；WO94/23697；WO91/14445；andEPPatentNo.0524968)。其他方式见Philip,Mol.Cell.Biol.(1994)14:2411,andinWoffendin,Proc.Natl.Acad.Sci.(1994)91:1581。如果需要的话，本文所述的药物组合物，含有抗PD-1抗体或其编码核酸(多个)，可以共同施用第二治疗剂。第二治疗剂的选择取决于疾病的待处理的类型。例如，如果目标疾病是癌症，所述第二剂可以是抗癌剂(例如，他莫昔芬，紫杉醇，替尼，塞米松，和赫赛汀)。当这里所描述的药物组合物是共用于与第二治疗剂，无论是组合物中的第二药剂的或，或两者的亚治疗剂量的亚治疗剂量，可以在受试者中具有可用于治疗，或有发展与细胞信号由PD-1介导相关的疾病或病症的风险。靶疾病包括癌症(例如，本文中描述的那些)，感染性疾病等引起的病毒，细菌，或真菌感染，或免疫缺陷，如T细胞功能障碍相关的其他疾病的疾病。由病毒感染引起的疾病包括，但不限于，甲型肝炎，乙型肝炎，丙型肝炎病毒。这里所用的“亚治疗剂量”是指一种剂量，这是小于会产生治疗效果的剂量(如果受试者施用在没有其他试剂或试剂)。因此，亚治疗剂量在不使用本发明的药剂时给药对象不会产生所需治疗结果。许多试剂治疗剂量是在临床使用的是在医药领域公知的，和另外的治疗剂量可以由本领域技术人员无需过度的实验来确定。治疗剂量已经于如Remington的PharmaceuticalSciences，第22版(2012)的引用已广泛地描述；还有许多其他医学界作为指导疾病和病症的治疗的医学文献。常规方法，已知的医学领域的普通技术人员，可以用于施用药物组合物给受试者，这取决于疾病的要治疗的类型或疾病的部位。此组合物还可以通过其它常规途径，例如，口服，肠胃外给药，通过吸入喷雾，局部，直肠，经鼻，口腔，阴道或通过植入库。本文所用的术语“肠胃外”包括皮下，皮内，静脉内，肌内，关节内，动脉内，滑膜内，胸骨内，鞘内，病灶内和颅内注射或输注技术。此外，它可以施用到通过施用可注射的贮库途径，例如使用1-，3-，或6个月的贮库可注射或可生物降解的材料和方法的主题。注射组合物可以含有各种载体如植物油，二甲基乙酰胺(dimethylactamide)，二甲基甲酰胺，乳酸乙酯，碳酸乙酯，肉豆蔻酸异丙酯，乙醇，多元醇(甘油，丙二 醇，液体聚乙二醇，等等)。对于静脉内注射，水溶性抗体可以通过点滴方法，由此含有抗体和生理上可接受的赋形剂的药物制剂输注给药。生理上可接受的赋形剂可以包括，例如，5％葡萄糖，0.9％盐水，林格溶液或其它合适的赋形剂。肌内制剂，例如，抗体的一个合适的可溶盐形式的无菌制剂，可以溶解和施用的药用赋形剂诸如水换注射液，0.9％盐水，或5％葡萄糖溶液。当用编码本文所述用作治疗剂的抗PD-1抗体核酸作治疗，核酸或载体表达该抗体可以递送受试者(Akhtar等,1992,TrendsCellBio.2,139).例如，它可以通过使用脂质体，水凝胶，环糊精，生物可降解的纳米胶囊，或生物粘附性微球被引入到细胞中。或者，所述核酸或载体可在本地通过直接注射或通过使用输注泵递送。其它方法包括通过使用缀合物和生物可降解的聚合物的使用各种运输和载体系统。为了便于输送，任何抗PD-1抗体或其编码核酸可以结合有伴侣剂。如本文所用，“缀合”是指两个实体相关联，优选以足够亲和力，这两个实体之间的关联的治疗益处的实现。轭包括共价或非共价键合，以及其它形式的关联，如任一实体对截留或内的其它，或上或内的第三实体(两个实体，例如，胶束)。伴侣剂可以是天然存在的物质，如蛋白质(例如，人血清白蛋白，低密度脂蛋白，或球蛋白)，碳水化合物(例如，葡聚糖，支链淀粉，壳多糖，脱乙酰壳多糖，菊糖，环糊精或透明质酸)，或脂质。它也可以是一个重组或合成分子，例如合成聚合物，例如，一种合成的聚氨基酸。聚氨基酸的实例包括聚赖氨酸(PLL)，聚L-天冬氨酸，聚L-谷氨酸，苯乙烯-马来酸酐共聚物，聚(L-丙交酯-共-glycolied)共聚物，二乙烯基醚-马来酸酐共聚物，N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺共聚物(HMPA)，聚乙二醇(PEG)，聚乙烯醇(PVA)，聚氨基甲酸酯，聚(2-ethylacryllic酸)，N-异丙基丙烯酰胺的聚合物，和聚膦嗪。在一个实例中，伴侣剂是微胶粒，脂质体，纳米颗粒，或微球体，其中的寡核苷酸/干扰RNA被封装。制备这种微胶粒，脂质体，纳米颗粒，或微球体是公知的现有技术。见，例如，美国专利5108921；5354844；5416016；和5,527,5285。在另一实例中，伴侣剂作为基底用于连接一个或多个膜融合或缩合剂的。阿膜融合剂是响应局部pH值。例如，在核内体中遇到的pH值，它可以导致在其直接环境，物理变化，例如，在渗透性质的变化扰乱或增大核内体膜的渗透性，从而有利于释放的反义寡核苷酸进入宿主细胞的细胞质中。优选的促融合剂改变电荷，例如，在pH低于生理范围时变得质子化(例如，在pH4.5-6.5)。促融合剂可以是含有能够经历电荷改变的氨基分子(如质子)当暴露于特定的pH值范围。这种促融合剂包括具有聚链的聚合物(例如，聚乙烯亚胺)和膜破坏剂(如，mellittin)。其他的例子包括多组氨酸，polyimidazole，聚吡啶，聚丙烯亚胺，和聚缩醛物质(例如，阳离子聚缩醛)。与反义寡核苷酸甲冷凝剂相互作用，导致它以冷凝(例如，减少寡核苷酸的大小)，从而保护它免于降解。优选地，所述缩合剂包括：部分(例如，带电的部分)，其与通过，寡核苷酸相互作用，例如，离子相互作用。缩合剂的实例包括聚赖氨酸， 精胺，亚精胺，聚胺或季盐，假肽-聚胺，肽聚胺，聚胺树枝状聚合物，精氨酸，脒，鱼精蛋白，阳离子脂质，阳离子卟啉，和α-螺旋肽。组合治疗本文还提供了如本文所述的与任何抗PD-1这里所描述的抗体和合适的第二药剂的组合疗法为任何与PD-1的信号传导相关的疾病。术语联合治疗，如本文所使用的，包括这些试剂的给药(例如，抗PD-1抗体，例如本文所述的那些和第二种合适的治疗剂)以顺序的方式，也就是，其中每种治疗剂的给药在不同的时间这些治疗剂，或至少两种药剂的，以基本同步的方式，以及施用。每种药剂的顺序或基本上同时给予可受任何适当的途径，包括但不限于，口服途径，静脉途径，肌内，皮下途径，并直接吸收通过粘膜组织。所述剂可以通过相同的途径或不同的途径给药。例如，第一药剂(例如，抗PD-1抗体)可以口服给药，而第二药剂(例如，抗癌症剂，抗感染剂；或免疫调节剂)可以被静脉内给药。此外，所选择的组合的试剂可以通过静脉注射施用，而组合的其它药剂可以口服给药。可替代地，例如，两个或多个代理可以通过静脉内或皮下注射施用。如本文所用，术语“连续”的意思，除非另有规定，其特点是正规的顺序或次序，例如，如果一个剂量方案包括抗PD-1抗体的施用和第二剂，顺序给药方案可以之前包括抗PD-1抗体的施用，同时，基本同时，或施用第二药剂，但两种药剂之后将被施用在一个普通的顺序或次序。术语“分开的”是指，除非另有规定，保持除了从另一个。术语“同时”的意思，除非另有说明，或发生在相同的时间内完成，也就是说，本发明的药剂施用同时。术语“基本上同时”是指该试剂彼此分钟内施用(例如，在10分钟之内)，并打算涵盖联合施用以及连续施用，但如果施用是连续它是在时间上分离的只有很短的时间(如时间，将采取一个医生来管理两种化合物另发)。如本文所用，同时施用和基本上同时给药可以互换使用。顺序给药是指在时间上分离的本文所述药剂的施用。联合疗法还可以接受在进一步结合本文中所描述与其它生物活性成分的试剂的施用。其中联合疗法还包括放射治疗，放射治疗可以在任何合适的时间进行，只要从治疗剂和放射治疗的组合的协同作用的有益效果达到进行。例如，在适当的情况下，有益的作用仍由天甚至数周时达到辐射治疗被暂时从治疗剂的施用除去，也许。当目标疾病是癌症，抗PD-1抗体也可以前或手术或放疗后使用。但是应当理解的是，任何组合如本文所述的，可以使用任何顺序用于治疗本文中所述的对象疾病。本文所述的组合可以由许多因素，包括但不限于抑制或预防目标疾病进展，减轻了组合的另一种药剂的副作用的有效性，或效力的基础上选择减轻的目标有关的疾病症状的效果。例如，本文所述的联合治疗可减少任何由组合的每个个别成员有关的副作用。合适的试剂为与任何共使用实施例抗PD-1抗体包括抗体结合的共刺激受体(例如，CD137/4-1BB，OX40，CD40，或GITR)，的药剂诱导的免疫原性细胞死 亡(例如，化疗剂，放射治疗剂，抗血管生成剂，或用于靶向治疗的试剂)中，抑制一个检查点的分子的试剂(例如，CTLA4，LAG3，TIM3，BTLA，或TIGIT)，一个癌症疫苗，修饰免疫酶(例如，IDO1或iNOS)的，靶向Treg细胞，用于过继细胞疗法，或者其调节髓样细胞的试剂。用于增强免疫反应和治疗PD-1信号相关疾病工具包本公开还提供试剂盒用于增强免疫应答和/或治疗与PD-1信号有关的疾病的使用。此类试剂盒可包括一个或多个容器，包括如本文所述的抗PD-1抗体。在一些实施方案中，试剂盒可以包括用于根据本文所述任何方法的使用说明。所包括的指令可以包括抗PD-1抗体给药的说明，以加强免疫应答和/或如本文所述的治疗对象疾病。所述试剂盒可进一步包括基于鉴定个体是否具有本文所述的那些PD-1信号传导有关的疾病。关于使用抗PD-1抗体的指令一般包括信息如剂量，给药时间表，和给药途径用于预期治疗。所述容器可以是单位剂量，散装包(例如，多剂量包装)或亚单位剂量。在本发明的试剂盒提供的指令通常写在标签或包装插页(指示例如，包括在试剂盒的纸页)，但机器可读指令(例如，携带的磁或光存储盘上的指示)也可以接受的。所述标签或包装插页指示该组合物用于治疗本文所公开的任何目标疾病的或减轻这种疾病的一种或多种症状，可以提供用于实施本文所述任何方法。本发明的试剂盒在合适的包装中。合适的包装包括但不限于，小瓶，瓶，罐，软包装(例如密封的聚脂薄膜或塑料袋)和类似物。还预期的是包装组合使用与特定设备，例如吸入器，鼻施用装置(例如，雾化器)或输液设备，诸如微型泵。一种试剂盒，可以具有无菌存取口(例如容器可以是静脉内溶液袋或具有可刺穿的塞子皮下注射针头的小瓶)。容器还可以具有无菌存取口(例如容器可以是静脉内溶液袋或具有可刺穿的塞子皮下注射针头的小瓶)。在组合物中的至少一种活性剂是抗PD-1抗体如本文所述。本文描述的试剂盒可包括一种或多种另外的治疗剂，例如那些如上所述在“联合治疗”。试剂盒可任选地提供额外的组分，例如缓冲液和解释性的信息。通常，试剂盒包括一个容器，在标签或包装插页或与容器相关联。在一些实施方案中，本发明提供的上述试剂盒的制造，包括内容的文章。通用技术本发明的实践将采用，除非另有说明，分子生物学的常规技术(包括重组技术)，微生物学，细胞生物学，生物化学和免疫学，这是本领域的技术范围内。这些技术在文献中充分解释，诸如，分子克隆：实验室手册，第二版冷泉港出版社；(Sambrook等，1989。)寡核苷酸合成(MJ步态，编，1984年。)；在分子生物学方法，Humana公司出版社；细胞生物学：实验室笔记本(JECellis，编辑，1998年)科学出版社；动 物细胞培养(RIFreshney编，1987年)；介绍细胞和组织培养(JP马瑟和PE罗伯茨，1998年)中全会出版社；细胞与组织培养：检验操作规程(A.多伊尔，JB格里菲思和DG纽厄尔，EDS，1993-8)，J。Wiley和Sons；酶学方法(学术出版社有限公司)；手册实验免疫学(DM堰和CC布莱克威尔，合编)；基因转移载体的哺乳动物细胞(JM米勒和MPCalos合编，1987年)；在分子生物学当前协议(调频Ausubel等，编，1987)；PCR：聚合酶链式反应，(Mullis的，等人，编着，1994)；当前协议中免疫学(JEColigan等人编着，1991)；分子生物学短期协议(Wiley和Sons，1999年)；免疫学(CA詹韦和P.斯格特，1997年)；抗体(P.芬奇，1997年)；抗体：一个实用的方法(。D.凯蒂，编，IRL出版社，1988至1989年)；单克隆抗体：一个实用的方法(P.牧羊人和C.院长，编，牛津大学出版社，2000。)；使用抗体：实验室手册(E.Harlow和D.巷(冷泉港实验室出版社，1999)；该抗体(M.萨内蒂和JD卡普拉编，哈伍德学术出版社，1995年)。无需进一步详细说明，据信本领域的技术人员可根据上面的描述，利用本发明至其最大限度。以下的具体实施方案，因此，应解释为仅仅是说明性的，并且不限制本公开的以任何方式的其余部分。本文引用的所有出版物都通过用于本文引用的目的或主题引入作为参考。实施例1：先导抗PD-1抗体的产生试剂和方法人类PD-1蛋白(目录号1086-PD，Fc嵌合体)，PD-L1的(目录号156-B7，Fc嵌合体)，和针对人PD-1(目录号AF1086)抗原亲和纯化的多克隆山羊IgG购自R&D系统(美国)。单克隆小鼠抗人PD-1(克隆J116，目录号16-9989-82)从eBiosciences(美国)购买。表达人PD-1稳定的CHO细胞系通过转染全长人PD-1基因(基因ID：5133)构建。捕获ELISA检测抗PD-1抗体：ELISA板先包被链霉亲和素和生物素-PD-1，加抗体样品与之结合后，用偶联了辣根过氧化物酶的二抗检测(羊抗小鼠或大鼠的IgG)。FACS检测抗PD-1抗体与CHO-PD-1细胞的结合：抗体样品与CHO-PD1细胞孵育后用PE或FITC标记的二抗标记并用流式检测。FACS检测抗体阻断PD-1和PD-L1的结合：PD-L1与抗-PD1抗体竞争结合CHO-PD-1，结合的PD-L1用Alexa488偶联的抗人Fc段二抗检测。杂交瘤细胞的构建以及抗体鉴定BALB/c小鼠和Wistar大鼠用重组人PD-1蛋白(R&D，#1086-PD，Fc嵌合体)进行免疫。免疫动物的抗血清PD-1滴度通过捕获ELISA进行监测并复筛人Fc段。阳性滴度的血清进一步在CHO-PD1细胞上用FACS确定。将抗体滴度最高的小鼠和大鼠处死后，分离脾脏细胞，按杂交瘤实验方法与SP2/0骨髓瘤细胞融合。我们用捕获法ELISA筛选了20块96孔板小鼠杂交瘤细胞，鉴定出334个阳性孔。阳性的细胞进一步用人Fc段复筛，鉴定出85个克隆为PD-1特异性。然后，用FACS方法检测这些特异性克隆与CHO-PD-1细胞的结合，鉴定出34个结合能力最高的克隆用于进一步的PD-L1阻断筛选试验。我们还用捕获法ELISA筛选了25块96孔板大鼠杂交瘤细胞，鉴定出207个阳性孔。阳性的细胞进一步用人Fc段复筛，鉴定出54个克隆为PD-1特异性。然后，用FACS方法检测这些特异性克隆与CHO-PD-1细胞的结合，鉴定出30个结合能力最高的克隆用于进一步的PD-L1阻断筛选试验。我们用阻断PD-1和PD-L1结合试验筛选阳性杂交瘤细胞，鉴定出24个能特异性结合PD-1并阻断PD-L1结合的克隆。然后我们亚克隆了13个作用最强的杂交瘤(5个大鼠杂交瘤和8个小鼠杂交瘤)，从8个单细胞克隆中生产并纯化出抗体，包括1个大鼠IgM，7个小鼠IgG杂交瘤。这些纯化的抗体进一步用人PD-1蛋白结合试验，细胞表面PD-1蛋白结合试验，以及阻断PD-L1结合试验进行确证。我们对这些确证的杂交瘤细胞抗体可变区进行测序。从冷冻的杂交瘤细胞中抽提总RNA，用特异性引物或通用引物用SuperScriptIII第一链合成系统反转录得到cDNA。抗体的VH和VL片段按照RACEofGenScript的标准方法进行扩增。扩增的抗体片段按标准克隆方法分别被克隆进标准克隆载体中。用PCR方法鉴定克隆是否插入了正确长度的片段。挑选出5个含有正确VH和VL插入片段长度的单克隆进一步进行测序鉴定。测序结果表明5个不同克隆的VH和VL基因几乎完全相同。一致的序列说明应该是杂交瘤细胞所产生的抗体序列。我们合成了编码抗PD-1抗体可变区的cDNA序列与包含S228P铰链(EUnumbering；Kabatnumbering241)稳定突变的(Angalet.,Mol.Immunol30:105,1993)人IgG4重链恒定区组成嵌合体，及与人的kappa轻链恒定区组成嵌合体，在HEK293细胞中瞬转表达。这些嵌合性抗体用proteinA亲和层析方法纯化，纯化的抗体对PBS透析平衡后，检测内毒素<EU/mg)，单体含量>95％。我们检测了这些嵌合性抗体对体外活化人T细胞功能的作用。密度梯度法分离近期免疫过破伤风疫苗的人PBMC，重悬于10％胎牛血清的RPMI-1640培养基。调整细胞密度1*10^6/ml，200ul/孔铺于96孔板内。加入梯度稀释的待测抗体(终浓度为0、0.03、0.1、0.3、1、3、10、30ug/ml)孵育30min。加入1ug/ml破伤风抗原(AstarteBiologics,cat#1002)，37℃，5％CO2培养箱中培养7天。7天后收集上清，ELISA(eBioscience,88-7316-88)检测IFNg的浓度。阳性对照抗体为购自eBioscience的抗人PD-L1抗体(eBioscience#16-5983)。SHB-617(rat/humanIgG4/kappa)嵌合体诱导活化T细胞表达最高的IFNg(图1)。SHB-617衍生自大鼠IgM。SHB-617的活性表示，其结合结构域具有阻断PD-1功能独特的活性。实施例2：先导抗PD-1抗体的人源化如本文所述和人源化抗体如此得到进一步表征SHB-617是人源化的。我们分析了抗体SHB-617嵌合性抗体的氨基酸序列并参照了最新的ChothiaCDR定义(Al-Lazikanietal,1997)。可变区的CDR部分(L1,L2,L3,H1,H2和H3)如图2,3所示。除非特别指明按Chothia1987编号，位置是按顺序标记。SHB-617可变区与人胚系序列的对比。依照整体序列的一致性、配对部分位置以及相似的CDR规范位置，一个最符合受体框架的胚系轻链和重链家族序列被鉴定出来，轻链的VK1-L1和重链的VH2-2-70。将J-片段基因上的FR4与父本序列进行对比，选择JK4和JH4分别作为轻链和重链。父本序列在受体框架上的排列如图2,3所示。人源化SHB-617由CDR嫁接法将其连接到人的框架内，构建好父本的结构模型以及人源化序列。注意位于FR2区域(Cys35)和CDRH2区域(Cys54)的两个半胱氨酸残基。在许多鼠源胚系序列中半胱氨酸残基常存在于这些位置，并可能形成二硫键以稳定VH区。另外的重链间氨基酸H:Cys35和H:Cys54二硫键被构建用于建模。FR2上的H:Cys35残基被保留于人源化序列中。另外，由于这个位点构象的缘故，将胚系FR3上的H:Asn67残基替换成苏氨酸并不合适，因此，我们将其替换成丝氨酸，使其更适合局部构象。轻链框架并没有做回复突变。人源化以及父本的轻重链可变区排列如图4、5所示。从HEK293细胞或CHO细胞中表达并纯化人源化抗体SSI-361含人源化的SHB-617可变区和人IgG4/卡帕(含铰链S228P(EU编号；Kabat编号241)人IgG4构建的稳定突变(Angalet.,Mol.Immunol30:105,1993)和人κ轻链恒定区域。实施例3：抗PD-1人源化抗体的评估用Biacore测定结合PD-1抗原亲和常数CM5sensorchip流室(GEHealthcareLifeSciences)用新鲜50mmol/LNHS和200mmol/LEDC激活360秒(10μL/分钟)，注入溶于10mmol/LNaAC(pH5.0)的抗HisIgG于活化的流室上(10μL/分钟)300秒，HBS-EP+(10mMHEPES,150mMNaCl,3mMEDTAand0.05％P20,pH7.4)为运行缓冲液。未结合的活化位点用1mol/L乙醇胺(10μL/分钟)阻断420秒。在2个流室上分别重复该过程2次以固定蛋白。维持低流速过夜以平衡固定的蛋白。人的PD1用流细胞2捕获(10μL/分钟)后，将梯度稀释的SSI-361(3.125nM,6.25nM,12.5nM,25nMand50nM)注于抗原结合的流室上(30ul/分钟，180秒)，注入双份单浓度抗原以解离600秒。没有结合抗原的流细胞1作为对照流室。为去除流室表面结合的抗体和抗原，注入10mMpH1.5的盐酸甘氨酸60秒(10μL/分钟,流室1-2)。每个浓度的待测抗体都重复以上步骤。亲和常数(表1)用BiacoreX100评估软件2.0的1:1相互作用模型计算得出。数据均减去作为本底水平的流细胞1数值。表1.Biacore分析SSI-361的结合动力学抗原ka(1/Ms)kd(1/s)KD(M)人PD12.296E+51.165E-35.072E-9ka：缔合常数；kd：解离常数；KD：亲和常数。PD-1结合ELISA用PBS缓冲液将待检测的抗PD-1抗体稀释至1ug/ml，100ul/孔体积加至高吸附的ELISA板内(Costar,Cat#3590,highbinding)，4℃放置过夜。将96孔板中PBS缓冲液拍掉，加入200ul/孔封闭液(eBioscience,5*ELISA/ELISPOTDiluent,Cat#00-4202-55)，室温孵育1h进行封闭。拍去封闭液，用PBST缓冲液洗板3次后，加入100ul/孔用封闭液梯度稀释(0,0.001,0.01,0.1,1,10ug/ml)的his-tagged人PD-1protein(SinoBiologicalInc.Cat#10377-H08H-100)，或his-taggedrhesusmonkeyPD-1-His(SinoBiologicalInc.Cat#90305-K08H-100)，置室温孵育1h。用PBST缓冲液洗板4次后，加入100ul/孔用封闭液1:2000稀释的anti-His-HRP(GenscriptCat#A00612)，置室温孵育1h。用PBST缓冲液洗板4次后，加入100ul底物TMB，室温孵育约15min，加入50ul/孔1MH2S04终止反应。用FlexStation3酶标仪450nm处读取吸收值，用Graphpad5.0,"log(agonist)vs.response--Variableslope"计算SSI-661ELISA结合EC50值为0.33nM(人PD-1)and0.39nM(猴PD-1)，见图6A&B。用PBS缓冲液将食蟹猴PD1-Fctag(SinoBiologicalInc.Cat#90311-C02H)稀释至2ug/ml，100ul/孔体积加至高吸附的ELISA板内(Costar,Cat#3590,highbinding)，4℃放置过夜。将96孔板中PBS缓冲液拍掉，加入200ul/孔封闭液，室温孵育1h进行封闭。拍去封闭液，用PBST缓冲液洗板3次后，加入100ul/孔用封闭液梯度稀释的待测抗PD-1抗体(0,0.001,0.01,0.1,1,10ug/ml)，置室温孵育1h。用PBST缓冲液洗板3次后，加入100ul/孔用封闭液1:4000稀释的anti-HuIgG-HRP(goat-anti-humanIgkappa-HRP,Millipore,Cat#AP502P)，置室温孵育1h。用PBST缓冲液洗板4次后，加入100ul底物TMB，室温孵育约15min，加入50ul/孔1MH2S04终止反应。用FlexStation3酶标仪在450nm处读取吸收值，计算SSI-661与食蟹猴PD-1ELISA结合EC50值为0.08nM(图6C)。PD-1结合FACS将高表达人PD-1的CHO细胞以1000rpm的转速离心5分钟，收集沉淀并用预冷的流式缓冲液重悬，细胞计数，细胞密度调整为5*10^6/ml，每个反应分装100ul。每个反应加入50ul3*梯度稀释的待测抗PD-1抗体(0,0.01,0.1,1,10ug/ml)，混匀候4℃避光孵育60分钟。加入1ml流式缓冲液(3％BSAinPBS)，洗2次。加入100ul二抗(20ul/testPEMouseAnti-HumanIgGinstainingbuffer.BD,Cat#555787)。将细胞重悬，4℃避光孵育60分钟。用流式缓冲液洗两次细胞，并用2％的多聚甲醛重悬细胞进行固定，进行流式检测(BD,FACScalibur)。如图7 所示,SSI-361at1μg/mL(～6.7nM)饱和了CHO细胞PD-1结合.阻断PD-1和PD-L1/2结合将高表达PD-1的CHO细胞以1000rpm的转速离心5分钟，收集沉淀并用预冷的流式缓冲液重悬，细胞计数，细胞密度调整为5*10^6/ml，每个反应分装100ul。每个反应加入50ul4x梯度稀释的待测抗PD-1抗体at1ug/ml，以及50ul4xPD-L1(HumanPD-L1(HisTag)(SinoBiologicalInc.Cat#10084-H08H-100)，终浓度为2ug/ml)或50ul4xPD-L2(HumanPD-L2(HisTag)(SinoBiologicalInc.Cat#10292-H08H-100)，终浓度为1ug/ml)。混匀后4℃避光孵育4h。加入1ml流式缓冲液，洗2次。加入100ul2ug/mlanti-HisTagAntibody[iFluor488](GenScript,Cat#A01800-100))。将细胞重悬，4℃避光孵育60分钟。用流式缓冲液洗两次细胞，并用2％的多聚甲醛重悬细胞进行固定，进行流式检测。SSI-361有效阻断了PD-1和PD-L1/2结合(图8)。T细胞功能密度梯度法分离近期免疫过破伤风疫苗的人PBMC，重悬于10％胎牛血清的RPMI-1640培养基。调整细胞密度1*10^6/ml，200ul/孔铺于96孔板内。加入稀释的待测抗体(终浓度为3ug/ml)孵育30min。加入1ug/ml破伤风抗原(AstarteBiologics,cat#1002)，37℃，5％CO2培养箱中培养7天。7天后收集上清，ELISA(eBioscience,88-7316-88)检测IFNg的浓度。SSI-361增强了破伤风抗原诱导IFNg产生(图9A)。我们也用混合人淋巴细胞反应(MLR)测量SSI-361活性。密度梯度法分离人PBMC新鲜人PBMC，重悬于无血清RPMI-1640培养基中，调整细胞密度为2*10^6/ml，每孔2ml接种于6孔板，37℃，5％CO2培养箱中放置1.5小时，将悬浮细胞吸走，向贴壁细胞中加入2ml含有50ng/mlGM-CSF(粒细胞集落剌激生长因子)和35ng/mlIL-4(Peprotech,AF-HDC)的RPMI1640培养基，培养7天。每2天换一次含细胞因子的新鲜培液。第7天加1ug/mlLPS刺激，继续培养1天得到成熟树突细胞。再用10ug/ml丝裂霉素(Sigma,M0503-2MG)处理1.5h后，彻底清洗去掉残余丝裂霉素。用EasySepTMHumanTCellIsolationKit(Stemcell,Cat#17951)分离人T细胞.PBMC用EasySepTM缓冲液稀释成5*10^7/ml，加入IsolationCocktail抗体50ul/ml细胞，混匀后室温静置5分钟。再加入RapidSpheres磁珠50ul/ml，混匀后室温静置5分钟。加入EasySepTM缓冲液至5ml体积，将管子置于EASYSEPTMMAGNETS磁铁中，静置5分钟。倒出缓冲液至新的离心管，里面含有所需T细胞，非T细胞将留在管壁内。将上述树突细胞及同种异体的T细胞分别离心重悬成浓度为1*10^6/ml和1*10^5/ml，于96孔板中每孔各加入100ul，抗体用培液按一定倍数稀释成终浓 度为3ug/ml,加入96孔板细胞中,37℃，5％CO2培养箱中培养5天，收上清用ELISA(eBioscience,88-7316-88or88-7025-88)检测IFNg的水平。SSI-361增强了MLR诱导IFNg产生(图9B).在食蟹猴药物动力学(PK)将待检测抗PD-1抗体SSI-361用PBS稀释按5mg/kg剂量尾静脉注射4只雄性食蟹猴，体重大约3kg。于0,5,30min,1,2,4,8hr,1,3,5,8,11,15,22,29and36天(16个时间点)经外周静脉穿刺的取血。分离血清后冻存于-80℃。ELISA检测血清中抗体浓度。用PBS缓冲液将重组人PD-1蛋白(SinoBiologicalInc.Cat#10377-H08H-100)稀释至2ug/ml，100ul/孔体积加至高吸附的ELISA板内(Costar,Cat#3590,highbinding)，4℃放置过夜。将96孔板中PBS缓冲液拍掉，加入200ul/孔封闭液，室温孵育1h进行封闭。拍去封闭液，用PBST缓冲液洗板3次后，加入100ul/孔用封闭液稀释的待测血清orSSI-361standards，置室温孵育1h。用PBST缓冲液洗板3次后，加入100ul/孔用封闭液1:4000稀释的anti-HuIgG-HRP(goat-anti-humanIgkappa-HRP,Millipore,Cat#AP502P)，置室温孵育1h。用PBST缓冲液洗板4次后，加入100ul底物TMB，室温孵育约15min，加入50ul/孔1MH2S04终止反应。用FlexStation3酶标仪在450nm处读取吸收值。根据标准曲线，计算试样中的SSI-661浓度，并示于图10。PK参数如表2所示。表2。SSI-361在食蟹猴中单次静脉注射药物动力学.药物动力学参数。其他实施所有在本说明书中公开的所有特征可以任何组合进行组合。在本说明书中公开的每个特征可被用于相同，等效或类似目的的替代特征所代替。因此，除非明确声明，否则公开的每个特征仅是一系列的等效或类似特征的一个例子。从上面的描述，本领域的技术人员可以容易地确定本发明的基本特征，在不脱离其精神和范围的前提下，可以进行各种改变，并且本发明的修改，以使其适应各种用途和条件。因此，其它实施方案也在权利要求书内。当前第1页1 2 3