本发明涉及农业生物
技术领域：
，具体涉及一种基于基因组SSR标记的荷花品种‘秣陵秋色’的分子鉴定方法。
背景技术：
：荷花（Nelumbo）也称莲花，是多年生挺水植物，我国十大传统名花中唯一的水生花卉；在我国已有两千多年的栽培历史，具有极高的观赏价值和深厚的文化底蕴。荷花的群体花期长，而且在整个生长期都有观赏价值,以其美观的形态、独特的清香而深受人们喜爱，为水景园林布置中的主题植物，是重要的夏季观赏花卉之一，也可用于插花和盆景。我国分布的野生荷花资源为中国莲，花色包括红色、粉色及白色，植株高大，花型多样，除少瓣花型外，还有重瓣、重台、千瓣等。黄色荷花种类依然较少，其在花态及花型上多样性不够丰富。因此，通过与美洲黄莲杂交选育具有黄色基因且花型多样的新品种在荷花育种上具有重要意义。江苏省中科院植物研究所与大学和企业联合攻关，培育了一个优异的黄色系荷花新品种——‘秣陵秋色’。‘秣陵秋色’花似菊花，初开色较淡，盛开色变深，易开花，着花密度大，群体花期长，抗逆性佳、适应性广，广泛适应于长江中下游地区种植。该品种于2015年已经通过江苏省农委鉴定。‘秣陵秋色’是典型的营养繁殖型荷花新品种，其外部形态特征易受到环境条件和管理水平的影响，导致消费者难以辨别品种的真实性，给新品种的开发利用带来影响。因此，寻找一种真实有效、不受环境影响，能够准确区分不同基因型的简单、有效的鉴别技术十分重要。SSR（简单重复序列）分子标记技术是以PCR为基础的DNA多态性检测技术，具有共显性、稳定性好、多态性高和遗传信息量大的特点，与其他的分子标记相比较有明显的优势，是理想的分子标记方法。技术实现要素：技术问题：本发明提供一种基于荷花基因组的SSR分子标记鉴定方法，克服了仅依据形态特征鉴定新品种的不确定性，且检测方法更为快速、准确、高效。技术方案：上述荷花品种‘秣陵秋色’的分子鉴定方法，其特征在于：1.用CTAB法提取‘秣陵秋色’幼嫩叶片的DNA。用荧光标记引物SSRM01（正向引物序列5-CATTTTGAAGTTTGGGGACAAAAG-3，反向引物序列5-GACACTAGGCCCAAAGTAGAGGGT-3）对上述DNA进行扩增，扩增产物采用毛细管电泳荧光检测法检测分析，得到且只能得到该位点的片段大小为198bp。用荧光标记引物SSRM02（正向引物序列5-ATTTTCGAATCTCCCTCCCATACT-3，反向引物序列5-GAACAACAAAAAGAATGAGGATCTATTG-3）对上述DNA进行扩增，扩增产物采用毛细管电泳荧光检测法检测分析，得到且只能得到该位点的片段大小为214bp和238bp。用荧光标记引物SSRM03（正向引物序列5-TGAATGTGAAAAGAAAAAGTCGCA-3，反向引物序列5-TGTACTACTTTCCTCGAAGACGGC-3）对上述DNA进行扩增，扩增产物采用毛细管电泳荧光检测法检测分析，得到且只能得到该位点的片段大小为136bp和148bp。同时用以上3对引物对荷花某一新品种叶片DNA进行SSR荧光扩增检测，每对引物得到结果与上述要求的SSR指纹数据完全一致，则表明该品种为‘秣陵秋色’。否则为其它品种。2.扩增及检测方法：SSR-PCR采用25ul的反应体系，其中包括50ngDNA,2.5μL10×PCRbuffer,0.2mmolL-1dNTPs,1UTaqDNA聚合酶，正反向引物各4μmolL-1。PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55°C~60℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸10min，4℃保存。扩增产物用美国ABI3730进行自动荧光检测，用GeneMapper软件分析原始数据，获得SSR指纹数据。有益效果：1.本发明通过直接检测‘秣陵秋色’的DNA序列对其进行鉴定，克服了依据外部形态特征对其鉴定的不确定性。2.本发明为‘秣陵秋色’新品种保护提供了科学的技术保障。3.本发明为‘秣陵秋色’品种推广应用过程中的鉴定提供了实验证据。具体实施方式1.DNA的提取及鉴定标记的获得选择生产上常用且具代表性的27种荷花品种，采集这27个品种以及‘秣陵秋色’的幼嫩叶片，使用CTAB法提取其基因组DNA。用0.8%琼脂糖凝胶电泳和OneDrop分光光度计检测DNA质量和浓度。用16对SSR引物对所提取的DNA进行扩增。SSR-PCR采用25μL的反应体系，其中包括：50ngDNA,2.5μL10×PCRbuffer,0.2mmolL-1dNTPs,1UTaqDNA聚合酶，正反向引物各4μmolL-1。SSR-PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55°C~60℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸10min，4℃保存。扩增产物用美国ABI3730进行自动荧光检测，用GeneMapper软件分析原始数据，获得各位点等位基因数据。扩增结果表明，16对引物中SSRM01、SSRM02及SSRM03三对引物的PIC值最大，多态性最好（表1）；仅用这三对引物完全可以区分‘秣陵秋色’和其它供试的27个品种，指纹数据见表2。表1三对SSR引物多态性表228个品种在3对SSR引物下的指纹数据2.用所筛选的3对SSR引物对‘秣陵秋色’品种鉴定的验证实验用上述3对SSR荧光引物，选择江苏省中科院植物所和企业新选育的16个荷花新品种，与‘秣陵秋色’同时进行扩增，扩增及检测方法同上。结果发现，这3对引物可以将‘秣陵秋色’与其它品种区分开，‘秣陵秋色’与这16个品种的SSR指纹数据见表3。表317个品种在3对SSR引物下的指纹数据品种引物SSRM01引物SSRM02引物SSRM03秣陵秋色198214/238136/148XY-N-1198/202244136XY-N-2198/202224/244136/148XY-N-3202/216218/244136/142XY-N-4212222/244136XY-N-5198/216222/238134/136XY-N-6198214/222136XY-N-7188/198224/244136/148XY-N-8198222/244134/136XY-N-9202/216218/244136/142XY-N-10216238/244136/142XY-N-11212222/238148XY-N-12212244136/148XY-N-13216218136XY-N-14198210/222136/148XY-N-15198/216214/222136/148XY-N-16188/198230/238136/148从验证结果可以看出，仅利用其中1对或2对SSR引物就可以区分‘秣陵秋色’与其它16个新品种，但考虑到未来还会有更多新品种出现，所以为了鉴定的科学性，本发明建议采用以上3对引物同时进行检测，若3对引物扩增得到的结果与本发明公布的完全一致，则说明该品种为荷花品种‘秣陵秋色’。当前第1页1 2 3