本发明属于微生物益生菌应用
技术领域：
，涉及一株植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)及其饲料添加剂的应用。
背景技术：
：在畜禽养殖中，抗生素等抗菌药物的使用能有效的减少畜禽的发病率，提高畜禽等动物的生产性能而被广泛应用在畜禽的饲料中。但其使用大大提高了某些致病微生物的抗药性，不利于食品安全。因此寻求安全、无残留的抗生素替代品迫在眉睫。通过研究发现益生菌饲料添加剂是一种十分理想的抗生素替代品，而且益生菌饲料添加剂具有天然无公害、无污染、质量稳定及效果明显等优点。特别是乳酸菌做为益生菌，其在生长代谢过程能产生多种酸，有效调节动物肠道健康，并且某些优良菌株还具有抑制有害菌的作用。但是，目前益生菌的研究和开发最关键的问题是优良菌株的选育，特别是优良乳酸菌的分离和筛选。技术实现要素：为了解决上述问题，本发明提供一株优良特性的植物乳杆菌及其在畜禽养殖中的应用。本发明提供了一株植物乳杆菌，该菌株从仔猪粪便中分离经过初筛复筛得到，在MRS培养基上的菌落形态为菌落淡白色，圆形，湿润，液滴状，凸起，表面光滑，有光泽，边缘整齐，不透明。菌体杆状，单个或呈短链排列存在，革兰氏染色阳性菌株，无芽孢。初步鉴定为植物乳杆菌。利用细菌通用引物对筛选出的菌株进行16srDNAPCR扩增后鉴 定，经NCBI序列比对结果相似性最高(100％)的是植物乳杆菌，故分子鉴定DZS12为植物乳杆菌。将该菌株命名为植物乳杆菌DZS12(lactobacillusplantarumDZS12)，于2015年8月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为：CGMCCNo.11262。本发明还提供包含该植物乳杆菌的菌剂。在本发明一个实施方案中，所述菌剂为菌粉，所述菌粉还含有冻干保护剂。其中，所述菌剂的制备方法如下：将所述植物乳杆菌进行发酵培养得到发酵液，所得发酵液经离心得到菌体后，按菌体：冻干保护剂溶液质量比1:8-15加入冻干保护剂溶液，充分混匀，将上述混匀后的菌液置于冷冻干燥机中进行冻干得到菌剂。其中，所述的冻干保护剂含有20％的脱脂奶粉、5％的蔗糖、1％的维生素C和1％的谷氨酸钠。本发明还提供所述植物乳杆菌的发酵方法，其包括如下步骤：按体积比为1％-5％的接种量向发酵培养基中接入培养16-22h的所述植物乳杆菌的种子液，发酵过程中控制pH7.0-7.5，发酵温度35-40℃，转速200-300rpm，通气比1:0.4，罐压0.05MPa。其中，所述的发酵培养基含有下述重量百分比的组分：蛋白胨1％，牛肉膏1％，酵母膏0.5％，柠檬酸氢二铵0.2％，葡萄糖2％，吐温800.1％，乙酸钠0.5％，磷酸氢二钾0.2％，硫酸镁0.058％，硫酸锰0.025％。本发明还提供了含有所述的植物乳杆菌的饲料添加剂。其中，所述植物乳杆菌的添加量为1×108-12CFU/g。本发明的植物乳杆菌用于饲料添加剂中，主要用于畜、禽或水 产养殖的饲料添加剂，如：鸡、鸭、猪、牛、羊和鱼等的饲料添加剂。本发明还提供包含所述植物乳杆菌的预混料或配合料。本发明的植物乳杆菌DZS12，该菌株耐酸、耐胆盐，具有很高的抑菌能力，特别是在抑制大肠杆菌致病菌的能力测定中，与其他菌株相比具有明显的优势，通过动物实验发现其能有效促进畜禽的生产性能，可作为饲料添加剂和发酵剂应用于畜禽养殖中，应用前景广阔。具体实施方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例1植物乳杆菌DZS12的筛选1、初筛采集仔猪粪便样品20份，分别称取10g粪便样品，加入90mL无菌水制成菌悬液，于180r/min振荡30min，梯度稀释至合适梯度，涂布于MRS培养基上，培养获得26株乳酸菌。生理盐水的配置方法是：0.85％的氯化钠，高压蒸汽灭菌后备用。人工胃液的配置方法是：1％胃蛋白酶，0.85％的氯化钠，用盐酸调节pH到2.0，过滤除菌备用。MRS液体培养基的制作方法是：蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母膏5.0g，柠檬酸氢二铵2.0g，葡萄糖20.0g，吐温801.0mL，乙酸钠5.0g，磷酸氢二钾2.0g，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.25g，pH6.2～6.6，蒸馏水1000mL，高压蒸汽灭菌后备用。MRS固体培养基的制作方法是：蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母膏5.0g，柠檬酸氢二铵2.0g，葡萄糖20.0g，吐温801.0mL，乙酸钠5.0g，磷酸氢二钾2.0g，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.25g，琼脂2％，pH6.2～6.6，蒸馏水1000mL，高压蒸汽灭菌后备用。LB固体培养基制作方法是：蛋白胨10g，氯化钠10g，酵母膏5g，琼脂2％，pH7.0，蒸馏水1000mL，高压蒸汽灭菌后备用。LB液体培养基制作方法是：蛋白胨10g，氯化钠10g，酵母膏5g，pH7.0，蒸馏水1000mL，高压蒸汽灭菌后备用。人工胆盐的配置方法是：在MRS肉汤培养基中添加0.3％的猪胆盐，高压蒸汽灭菌后备用。2、复筛(1)平板菌落计数法检测菌粉的活菌数约为1011CFU/g。(2)抑菌能力测定指示菌：大肠杆菌K88、大肠杆菌K99和沙门氏菌，接种于LB液体培养液中，37℃，180rpm，培养15h；制备乳酸菌菌液：初筛分离得到的乳酸菌，接种于MRS液体培养液中，37℃，静止培养48h；体外抑菌试验：将培养48h的乳酸菌菌液离心，收集上清，取灭菌的96孔板，按1：1加入乳酸菌上清液和病原菌液，使混合液中的病原菌浓度为1×106CFU/mL，37℃，180rpm，培养6h；对照组为不添加等量MRS培养液的病原菌液，取出后用菌落计数法计算各种致病菌的活菌数计算混合液中的病原菌浓度，计算抑菌率。抑菌率为1-(B1-B0)/(A1-A0)×100％A为对照组混合液中的病原菌浓度，A0为0h数据，A1为6h数据；B为乳酸菌上清液处理组混合液中的病原菌浓度，B0为0h数据，B1为6h数据；经体外抑菌试验，筛选得到一株对大肠杆菌K88、大肠杆菌K99和沙门氏菌的生长都有显著抑制作用的乳酸菌，命名为DZS12。其抑菌综合效果最好，其对大肠杆菌K88的抑菌率达到85.34％；对大肠杆菌K99的抑菌率达到81.59％；同时对沙门氏菌的 抑菌率达到75.56％。此菌株和实验室其他有效益生菌株及某些国内外产品分离菌株(国内是从蔚蓝某产品分离得到的，命名1-1，国外是从DSM某产品分离得到的，命名为DSM1)的抑菌能力比较如下表1所示：表1：乳酸菌菌株抑菌能力测定通过表1，可见其与国内外部分产品及实验室之前所筛选出的乳酸菌相比具有更加明显的抑菌作用，可以有效抑制畜禽常见病原菌的增值。(3)人工胃液的耐受能力测定将1g菌粉溶于9ml灭菌的生理盐水中，振荡混匀后，用稀释涂布平板法计数。取上述菌液1ml加入9ml人工胃液中，37℃静置2小时，稀释涂布平板法计数，残存活菌浓度与原菌浓度之比为97.6％，从上述实验可以看出该菌能较好地在人工胃液中生存。(4)人工胆盐的耐受能力测定将1g菌粉溶于9ml灭菌的生理盐水中，振荡混匀后，用稀释涂布平板法计数。取上述菌液1ml加入9ml人工胆盐中，37℃静置2小时，稀释涂布平板法计数，残存活菌浓度与原菌浓度之比为89.8％，从上述实验可以看出该菌能较好地在人工胆盐中生存。实施例2植物乳杆菌DZS12的发酵和菌粉的制备植物乳杆菌DZS12的发酵：所用发酵培养基是按重量百分比： 蛋白胨1％，牛肉膏1％，酵母膏0.5％，柠檬酸氢二铵0.2％，葡萄糖2％g，吐温800.1％，乙酸钠0.5％，磷酸氢二钾0.2％，硫酸镁0.058％，硫酸锰0.025％配制的。按体积比为3％的接种量向发酵培养基中接入培养18h的所述植物乳杆菌的种子液，发酵过程中控制pH7.2，发酵温度37℃，转速300rpm，通气比1:0.4，罐压0.05MPa。培养至18h为发酵终点，放罐，得到植物乳杆菌DZS12活菌数为4.5×109CFU/mL。所得发酵液经离心得到菌体后，按菌体：保护剂溶液＝1:10加入保护剂溶液(20％的脱脂奶粉、5％的蔗糖、1％的维生素C、1％谷氨酸钠)，充分混匀。将上述混匀后的菌液置于冷冻干燥机中进行冻干，得到冻干后的菌粉，活菌数约为2×1011CFU/g。实施例3植物乳杆菌DZS12作为饲料添加剂在鸡上的应用将240只生长良好、体重相近的21日龄肉鸡随机分为2组，每组6个重复，每个重复20只，一组为对照组，饲喂普通商品日粮，另一组为实验组，在普通商品日粮的基础上添加质量百分比为0.2％的本发明植物乳杆菌粉剂。试验期为21天，测量肉鸡的日增重和料肉比。实验结果如下表2所示：表2植物乳杆菌DZS12对肉鸡生产性能的影响组别平均日增重(g)料肉比对照组63.73±3.541.59±0.04a实验组66.36±3.781.43±0.02b由上表2中试验结果可以看出，21日龄肉鸡饲养21天后，实验组的肉鸡平均日增重比对照组增加2.63g，料肉比降低了0.16，与对照组差异显著(P<0.05)。本实验结果表明日粮中添加植物乳杆菌能够显著提高肉鸡的生产性能，降低生产成本，提高养殖效益。由此可见，植物乳杆菌DZS12作为饲料添加剂在肉鸡上具有良好的应用价值。实施例4植物乳杆菌DZS12作为饲料添加剂在仔猪上的应用本试验研究了不同乳酸菌对断奶仔猪生产性能的影响。选择了DSM产品和本发明的植物乳杆菌DZS12进行了比较。本试验研究了不同益生菌对断奶仔猪生产性能的影响。240头30±3日龄杜洛克×长白×大约克健康断奶仔猪随机分到3个处理中，每个处理4个重复，每个重复20头猪。分别为对照组，B组(DSM)，M组(植物乳杆菌DZS12)。试验进行35天。添加益生菌与不添加益生菌的日粮均由山东聊城金牌大北农饲料有限公司生产。B组添加量为200g/吨，M组添加量为800g/吨。试验猪饲养于仔猪舍中，水泥地面，早中晚各加一次料，观察各栏仔猪采食量，采取区别加料的策略，保证各种采食量的仔猪都能完全自由采食和饮水。按照常规程序和方法进行驱虫、免疫；专人管理，各组均给予相同的饲养管理和环境条件(温度、湿度)；试验猪发病，应在不影响试验结果的条件下依常规处理。试验猪在试验开始和试验末时，早晨8:00空腹称重(前一天20:00断料)，然后按下式计算日增重：ADG(kg)＝[末栏重(kg)-始栏重(kg)]/[每栏仔猪头数×饲养天数(d)]以栏为单位记录每天的投料量与剩料量，求出试验期间每栏总的投料量与剩料量，然后计算日采食量：ADFI(kg)＝[投料量(kg)-剩料量(kg)]/[每栏仔猪头数×饲养天数(d)]F/G＝ADFI(kg)/ADG(kg)腹泻率的统计方法：每天记录每个重复中腹泻的猪只数，求出该重复的总腹泻头次数，将其除以该重复的总饲养头次数，即得出该重复的腹泻率。最后算出该处理各重复腹泻率的平均值。腹泻的 标准是，粪便不形成稳定固体，有明显的肛尾粘着现象。腹泻率(％)＝[每栏总腹泻头日次数/(每栏仔猪头数×饲养天数(d))]×100％数据采用SAS8.0程序GLM过程进行统计分析，多重比较用邓肯法(Duncan),以p<0.05为显著水平，P<0.01为极显著。由表3可知，与对照组相比，B组提高了仔猪日增重和日采食量但并未达到显著水平，没有提高其饲料转化率；M组显著地提高了仔猪日增重、日采食量和饲料转化率(p<0.05)。使用B和M后腹泻率没有改善。表3不同益生菌对断奶仔猪生产性能的影响项目对照组B组M组SEMp值日增重ADG,g385.6b388.9ab415.5a3.3670.026日采食量ADFI,g707.7b721.0ab741.9a5.4710.016饲料转化率FCR1.84a1.85a1.79b0.0090.031个体重,kg22.723.123.50.3120.673腹泻率,％0.850.790.630.1380.825经济效益分析表4经济效益分析项目对照组B组M组饲喂时间，d353535总采食量，kg1981.62018.82077.3饲料成本，元13871.214180.014740.5饲料产生效益，元0-308.8-869.3体重，kg181618481880增重效益，元06401280仔猪减少药费效益，元00-5.6使用产品产生总效益，元0331.2405.1注：试验仔猪每组80头，对照组饲料以7000元/吨计算；B组以B120元/kg计算，每吨增加24元成本，以7024/吨计算；M组以M120元/kg计算，每吨增加成本96元，以7096元/吨计算。断奶仔猪以20元/kg计算。结果表明：1)与对照组相比，B组提高了仔猪日增重和日采食量但并未达到显著，也没有提高其饲料转化率，M组显著地提高了仔 猪日增重、日采食量和饲料转化率(p<0.05)。使用B和M后腹泻率没有改善；2)B、M增加的饲料成本为24元/吨和96元/吨，产生的经济效益分别为4.97元/头和6.0元/头。结论，从生产性能和经济效益上核算，M组优于B组，由此可见，植物乳杆菌DZS12作为一种饲料添加剂用于仔猪具有良好的应用价值。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
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的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页1 2 3