一株生产灰树花菌丝体的灰树花诱变菌株的制作方法

本发明涉及食品微生物技术应用领域，尤其涉及一株通过诱变获得的可用于液态发酵米糠和麸皮全料新培养基生产灰树花菌丝体原料的灰树花新菌株。

背景技术：

药食两用真菌在中国有着悠久的使用历史和广泛的使用人群。现代科学揭示，现在常用的药食两用真菌如灰树花、灵芝、冬虫夏草、猴头菌等的菌丝体、子实体或孢子中能产生诸如氨基酸、蛋白质、维生素、多糖、核苷类、黄酮类及抗生素等多种活性成分或富集多种微量元素如硒、锌等，具有提高人体免疫力、抗肿瘤、增强肝脏功能、抗氧化等多种功效。正因为如此，国际国内研究和开发药食两用真菌的热情方兴未艾，在医药领域、食品领域、中医保健领域、农业和工业生产领域都有许多研究者和开发者，获得众多的研究成果或产品。就珍稀食用菌用于食品而言，国内市场已有食用菌保健食品如灵芝胶囊、灰树花胶囊及冬虫夏草胶囊等在热销，它们的经济价值很高。饼干中添加猴头菇则制成了猴头菇饼干，已经成为普通食品在国内超市进行销售。国际上新西兰、日本、美国、韩国等均产有类似的食用菌保健食品产品。

就灰树花而言，针对其的研究表明：灰树花具有较好的调节免疫力、辅助抗肿瘤治疗、治疗肝炎、降血脂、抗艾滋病毒、延缓衰老功能等功效（参考文献：①陈石良，药用真菌灰树花深层发酵技术及其抗肿瘤多糖的研究[D]，江南大学，2000；②崔凤杰，灰树花深层发酵条件优化及其菌丝体抗肿瘤糖肽的研究[D]，江南大学，2006；③李小定，灰树花多糖的结构及其生物活性[D]，华中农业大学，2002；④雷萍，灰树花提取物对脾虚小鼠免疫功能的影响及作用机制研究[D]，辽宁中医药大学，2011；⑤Nanba H.，Maitake mushroom immune therapy to prevent from cancergrowth and metastasis [J]，Explore 1995，6(1)：74-78；⑥Kubo K.， Nanba H.， Anti-hyperliposis effect of Maitake fruit body (Grifola frondosa) [J]，Biological & Pharmaceutical Bulletin， 1997， 20(7)：781-785．）。

灰树花是一种珍稀食用菌，在中国的浙江、河北、福建、四川等地有栽培，日本也有栽培。其子实体香气浓、营养丰富。灰树花含蛋白、氨基酸、脂肪、粗纤维、碳水化合物、微量元素等，具有多种生理活性功能。现在灰树花的获取方式主要是人工栽培，以子实体或孢子粉入药，但人工栽培灰树花周期长、生产效率不高、劳动强度大，受季节、环境等限制，易遭病虫害，质量与产量不稳定。食用菌液体深层发酵技术, 可克服传统的子实体栽培的不足，采用液态或固态发酵的方法生产灰树花菌丝体并加以深加工应用符合创新驱动的发展思路，具有良好的前景。对灰树花菌丝体的研究和开发取得的进步都将进一步推动灰树花的应用，带来实际的社会和经济效益。正因为如此，才有必要研究新的灰树花菌丝体及其深加工产品的生产方法，例如考虑将一些低端农产品加工副产品原料如米糠、麸皮高效转化为高价值的灰树花菌丝原料，可望降低灰树花菌粉原料的生产成本从而降低终产品灰树花类保健食品的价格，让普通人都能消费得起，促进大众健康，这也是本发明专利关注点之一。

中国是水稻和小麦的生产大国，米糠和麸皮资源丰富。米糠和麸皮作为稻谷或小麦加工的副产物，营养成分丰富，价格低廉。米糠中含有丰富优质的蛋白质、活性多糖、脂肪和生育三烯酚、生育酚等生理功能显著的活性物质，麸皮富含脂肪、蛋白质、矿物质、维生素和纤维素等营养成分，其中纤维素的含量可达麸皮总量的18%以上，所以，米糠和麸皮能为灰树花生长提供充足的碳源、氮源、维生素和矿物质。在灰树花纤维素酶及其它酶系的作用下，灰树花可将米糠和麸皮转化成所需营养物质进行生长代谢，合成灰树花菌丝体和腺苷类功能性物质。因此，运用农副产品米糠、麸皮作为全部的碳源和氮源，进行灰树花液体发酵生长灰树花类保健食品原料，具有技术可行性，并可带来较好的社会和经济效益。

多数食用菌粉液态发酵生产方法采用葡萄糖、粮食类原料如淀粉、马铃薯或黄豆粉等作为培养基，即使用到农副产品如米糠、麸皮等，也是将其作为辅助成分加入。原始食用菌冬虫夏草、灵芝、灰树花等菌株在不添加葡萄糖或其他粮食类原料的米糠麸皮全料液态培养基上生长状况并非为最好，加之米糠、麸皮原料中可能含有一些有害物质如铅、砷、黄曲霉毒素等可能会转移到菌丝体中，为阻止这种转移，故需要对此类菌的发酵米糠麸皮液态全料方法进行创新研究。

本专利第一发明人刘伟民的研究小组十多年来对灰树花、灵芝、冬虫夏草的液态发酵进行了大量的研究，先后形成硕士论文和发明专利等多个成果。刘伟民指导的硕士论文有：（1）杨锁华，灰树花发酵米糠制备多糖（2006年）；（2）顾慧敏，灰树花在米糠培养基中液态培养产多糖和富集有机硒的研究（2009年）；（3）张建，物理法诱变灰树花液体发酵米糠麸皮产多糖的研究（2010年）；（4）郭春梅，灰树花的菌种诱变、液体发酵米糠麸皮产多糖及富硒研究（2011年）；（5）李亚楠，灰树花菌种诱变及发酵和性能研究（2013年）；（6）刘丽丽，高值转化米糠麸皮的灵芝液体发酵及菌种诱变（2012年）；（7）郭天龙，灵芝菌种诱变及液态发酵高值化转化全米糠麸皮研究（2013年）；（8）陈静，冬虫夏草液体发酵高值化利用米糠麸皮产多糖的研究（2014年）；（9）张笑飞， 灵芝菌株（Ganoderma lucidum CFCC6043）液体发酵全米糠麸皮及多糖活性的研究（2014年），等。刘伟民作为第一发明人的发明专利有：（1）使用米糠麸皮复合原料和灰树花诱变菌株生产多糖的方法，20101010579048.4；（2）用于米糠和麸皮复合原料生产多糖的灰树花菌株，201010579078.5；（3）用于发酵米糠和麸皮提取液生产灰树花多糖的菌株，201110150888.3；（4）用于米糠和麸皮全料液态发酵生产灰树花多糖的菌株，201310274913.8；（5）一种灵芝诱变株液态发酵米糠麸皮全料生产多糖的方法， 201310275061.4；（6）一种液态发酵米糠麸皮全料生产冬虫夏草多糖的方法，201310274914.2；（7）一种灰树花诱变株液态发酵米糠麸皮全料生产多糖的方法，201310274911.9；（8）用于米糠和麸皮全料液态发酵生产灵芝多糖的菌株，201310274915.7，等。由以上描述可知，本专利第一发明人刘伟民一直围绕利用米糠和麸皮高效高值化生产珍稀食用菌菌丝及其功效成分这一专题进行研究，实现发明创造的设想，所以能提出用诱变的灰树花菌株进行米糠麸皮全料液体发酵，高效高值化转化米糠麸皮生产污染物含量合格的灰树花菌丝体原料，并将此菌丝体原料用于进一步深加工成保健食品。

正是由于在该领域深入的研究，以及后续的新研究所揭示的问题，我们发现还需要对灰树花发酵液态米糠麸皮全料进行革新。之前我们的研究已经达到的灰树花发酵米糠和麸皮全料培养基的最大发酵浓度为米糠8.0 g/100 mL，麸皮8.0 g/100 mL，两者之和为16.0 g/100 mL，灰树花菌丝的干重浓度可达为6.8g/100mL培养基。我们的进一步研究显示出再次经过诱变选择的新灰树花菌株发酵米糠和麸皮全料培养基的最大发酵浓度也可为米糠8.0 g/100 mL，麸皮8.0 g/100 mL，两者之和也可达到16.0 g/100 mL，所得到的纯菌丝的干重浓度可达到7.9g/100mL培养基，同时还可得到较高浓度的发酵液中的胞外粗多糖产物。这说明通过诱变选择得到更高的菌丝产量和更多的胞外粗多糖的新灰树花菌株，值得深入研究，是本发明专利需要解决的主要问题之一。

本发明专利第一发明人刘伟民在多年的研究中逐渐认识到米糠和麸皮全料作为发酵培养基还需要加以改造，以尽可能阻止原米糠和麸皮中的铅、砷、汞、镉等有害物质转移至菌丝中，这一问题在本发明之前还未研究过。中国不同地区土地铅、砷、汞的污染状况不同，所产水稻和小麦所含的铅、砷、汞量也不相同，为防止这些有害元素通过米糠和麸皮转移到菌丝中，对所用米糠和麸皮应进行初步的检验和处理，铅、砷、汞限量在一定控制范围之内的米糠和麸皮才可以被用作发酵培养基。由于食用菌在发酵过程中可能富集一些有害元素，因此在设计培养基时应考虑引入竞争性抑制富集有害元素的食品添加剂，如半胱氨酸盐酸盐等，通过其巯基与铅、砷、汞等元素的竞争性结合降低有害元素进入菌丝的机会，从而得到合格的菌丝。对有害元素铅、砷、汞等的转移控制为本发明专利需要解决的问题之二。

由于水稻和小麦在收割环节和贮藏环节有可能会发生霉变以及所加工的米糠和麸皮贮藏不当，产生黄曲霉毒素，所以在使用米糠和麸皮时也应进行检验和处理，黄曲霉限量在一定控制范围内的米糠和麸皮才可以被用作发酵培养基。由于食用菌在发酵过程中可能将黄曲霉毒素转移到菌丝中，因此在设计培养基时同样应考虑引入抑制黄曲霉毒素转移的食品添加剂，如叶绿素铜钠盐等，以得到合格的菌丝。叶绿素铜钠盐对平面芳香致癌物有络合作用，可抑制致癌物的活性，可降解致癌物质，具有清除自由基和抗氧化作用。水稻和小麦在种植过程中会被使用农药，米糠和麸皮中的残留农药同样需要通过原料检验和处理加以控制，食用菌在发酵过程中利用自身的酶系也可以降解一些有害物质，同时所加入的叶绿素铜钠盐等对防止农药残留的转移也具有有益作用，此三点可防止农药残留转移到发酵菌丝体中。因此，对有害物质黄曲霉毒素和农药残留的控制为本发明专利需要解决的问题之三。

综上所述，本发明要解决的关键问题为必须获得一种未见报道的灰树花新菌株，使其在新设计的米糠麸皮全料液态新培养基上有效生长并高效转化米糠麸皮全料为合格灰树花菌丝，该新设计的培养基中添加了半胱氨酸盐酸盐和叶绿素铜钠盐。因此本发明专利在设计时对授予发明专利所必须的独特性、取得突出的实质性特点和显著进步的创新性和实用性给予了充分的考虑。

本发明将得到一株高效利用新设计的米糠麸皮全料液态培养基的灰树花新菌株，该新菌株发酵新培养基后可以得到品质较好的灰树花菌丝原料，该菌丝原料可以用于进一步深加工成为保健食品。特别说明：本发明所述米糠麸皮全料液态发酵培养基特指“将经检验处理达到要求的米糠和麸皮作为培养基中唯一的碳源、氮源，不添加其他碳源、氮源，并且米糠、麸皮加水成液态状，不过滤，即全料加以利用”。新培养基指“添加了半胱氨酸盐酸盐、叶绿素铜钠盐以阻止原料中可能的有害物质转入菌丝的米糠麸皮全料液态培养基”。

本发明需要通过诱变的方法获得灰树花新菌株。微生物的选育方法主要有物理诱变、化学诱变、基因重组等，本发明为避免使用有毒有害的化学诱变剂和在食品领域还未被大众认可的基因工程方法，将利用相对简单易行的紫外诱变技术，使出发菌株处于诱变的极端环境，最大限度扩大突变的位点范围，提高得到正突变菌株的可能性。本发明所得发酵米糠麸皮全料液态新培养基的新灰树花菌株为首次发明获得。本发明采用了纯菌丝干重浓度这一指标对发酵效果进行评价。

技术实现要素：

本发明为了利用灰树花菌株高效高值化转化液态米糠麸皮全料为灰树花菌丝体原料，需要诱变筛选出适合在米糠麸皮全料液态新培养基上生长的灰树花新菌株。为避免使用有毒有害的化学诱变剂和在食品领域还未被大众认可的基因工程方法，考虑紫外物理诱变技术简单易行，故采用紫外诱变的方法进行诱变，并通过一系列的稳定性、遗传性等筛选方法，保证灰树花新菌株的优良性状，为工业化高效高值化转化低成本的米糠麸皮为品质较好的灰树花菌丝保健食品原料奠定菌种基础。

本发明所采取的技术方案如下：

本发明提供的菌株灰树花JSU1401，即Grifola frondosa JSU1401，为可以在米糠麸皮全料液态新培养基中快速生长和高产的灰树花诱变株；该诱变菌株已经于2015年1月23日保藏在中国武汉的武汉大学的中国典型培养物保藏中心（CCTCC），编号为CCTCC M 2015065，可称为Grifola frondosa CCTCC M 2015065。

在本发明的一个方面中，提供上述Grifola frondosa CCTCC M 2015065的用途，用于发酵液态的米糠麸皮全料新培养基生产灰树花菌丝原料。

本发明的有益效果

为适应保健食品生产对原料的要求，本发明采用物理诱变技术选育灰树花高产菌株，由实验室现有的灰树花菌株Grifola frondosa CCTCC M 2013286出发，进行紫外诱变，以生长速率、纯菌丝干重和菌丝多糖为指标进行筛选，最终获得Grifola frondosa CCTCC M 2015065，在生长速度更快，复筛第五代在平板上可达到2.6cm/d，在不加其他碳源和氮源的米糠麸皮全料液态新培养基中生产灰树花产菌丝原料，与原始菌株Grifola frondosa CCTCC M 2013286相比生产能力更高，纯菌丝产量得到提高，菌丝多糖和发酵液中的多糖也相应得到提高。米糠和麸皮原料经检验合格才能使用。

摇瓶发酵时，Grifola frondosa CCTCC M 2015065的米糠麸皮全料液态新培养基中米糠和麸皮的总浓度可达16.0 g/100mL，纯菌丝的干重浓度、菌丝多糖浓度和发酵液中的粗多糖浓度分别达到7.9g/100mL、524.6mg/100mL和763.2mg/100mL，而原始菌株Grifola frondosa CCTCC M 2013286的米糠麸皮全料液态新培养基中米糠和麸皮的总浓度为16.0 g/100mL时，菌丝的干重浓度、菌丝多糖浓度分别为6.4g/100mL、452.7mg/100mL。新菌株的菌丝干重浓度增加23.4%，菌丝多糖浓度增加了15.9%，发酵液中的胞外粗多糖也具有较高的量。因为保健食品制造目前要求使用发酵菌丝粉，所以菌丝干重浓度和菌丝多糖浓度数值说明诱变所得新菌株具有更强的发酵米糠和麸皮的能力，菌株的发酵性能发生了显著的积极的变化。发酵液中的粗多糖则留作进一步深加工的原料使用。经过检验，铅、砷、汞等元素含量分别为1.72mg/kg、0.71mg/kg、0.07mg/kg，均低于GB16740-2014限量指标值，黄曲霉毒素含量为15.5μg/kg，低于GB2761-2011稻谷类及其制品的限量指标值。

上罐发酵时，纯菌丝的干重浓度、菌丝多糖浓度和发酵液中的粗多糖浓度分别达到7.3g/100mL、510.8mg/100mL和742.8mg/100mL。经过检验，铅、砷、汞等元素含量分别为1.81mg/kg、0.75mg/kg、0.05mg/kg，均低于GB16740-2014限量指标值，黄曲霉毒素含量为11.7μg/kg，低于GB2761-2011稻谷类及其制品的限量指标值。

本发明通过反复的紫外诱变筛选研究，最终获得了一株新的灰树花菌株Grifola frondosa CCTCC M 2015065，该新菌株在不加其他碳源和氮源的米糠麸皮全料液态新培养基中生长速度更快、发酵米糠和麸皮的能力更强，使得指定发酵体积中的菌丝量和菌丝多糖产量更高，且新菌株的发酵特性与出发菌株Grifola frondosa CCTCC M 2013286相比有变化，体现出鲜明的独特性。以Grifola frondosa CCTCC M 2015065为基础，形成了新的发酵米糠麸皮全料液态新培养基的方法，该方法将米糠和麸皮全料加以液态发酵应用，并在生产能力和产量上全面超过了Grifola frondosa CCTCC M 2013286，可见本发明的菌株取得了“取得突出的实质性特点和显著进步的创新性”。本发明专利高效利用了廉价的米糠麸皮，可以降低生产成本，减少资源消耗，明显增加产量，经限制污染物转移的技术手段发酵后所获得的菌丝体的污染物含量已经低于国家标准限量指标值，具有实用性。

综上所述，本发明利用已经具备了发明专利的独特性、取得突出的实质性特点和显著进步的创新性和实用性，产生了有益的效果。

附图说明

图1为本发明菌株紫外诱变选育方法的流程图。

图2为Grifola frondosa CCTCC M 2015065与出发菌株的拮抗图，注:图中左边为Grifola frondosaCCTCC M 2013286，右边为Grifola frondosa CCTCC M 2015065。

图3为诱变菌株复筛第五代平板筛选过程中，诱变菌株和出发菌株生长速率对比图。

具体实施方式

本发明按照说明书附图1所示的流程，提供了通过紫外诱变，选育在米糠麸皮全料液态培养基上生长速度更快、多糖产量更高的诱变菌株Grifola frondosa CCTCC M 2015065的方法，所述方法包括下列步骤：

取实验室保藏的Grifola frondosa CCTCC M 2013286为出发菌株；

将所取出发菌株接种于PDA培养基上进行活化培养；

菌体培养后用无菌生理盐水洗脱制得孢子悬液；

将孢子悬液稀释所需倍数，在紫外灯下照射进行诱变后，接至米糠麸皮筛选培养基上避光培养，初筛选出生长速率较快、比较稳定的菌株；将初筛的菌株进行遗传稳定性试验，复筛选出生长速率较快、比较稳定的菌株；

用米糠麸皮全料液态培养基进行摇瓶发酵，三筛选出生长速率高和多糖产量高的菌株；

进行拮抗试验；

在一个实施方案中，所用的PDA培养基为马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，蛋白胨5g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，硫酸镁0.75g/L，琼脂20g/L，pH自然。

在一个实施方案中，所述恒温为28℃。

在一个实施方案中，所述紫外诱变采用红光暗操作，在距离功率为30W的紫外灯20cm下分别照射40s。

在一个实施方案中，所述避光培养为在28℃下避光培养5天。

在一个实施方案中，所述避光培养所用培养基为米糠、麸皮固体平板培养基：米糠30g/L，麸皮30g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，硫酸镁0.75g/L，琼脂20g/L，pH自然，米糠、麸皮全料使用）。

在一个实施方案中，所述筛选方法为平板直径测定法。

在一个实施方案中，所述初筛步骤为：从紫外诱变避光培养的平板上挑取生长良好的单菌落分别接种至新的米糠麸皮固体平板培养基中，从紫外诱变中挑选出10株生长速度快且浓密的诱变株，对其进行3代传代培养，从中选出相对于出发菌株生长快、形状好、稳定性高的菌株。

在一个实施方案中，所述复筛步骤为：将粗筛选出的较优菌株分别进行5代平板传代培养，挑取生长良好的单菌落分别接种至新的米糠麸皮固体平板培养基中，挑选出生长速度快、健壮、纯正的变异株。

在一个实施方案中，所述三筛步骤为：以复筛确定的高生长速率变异株作为三筛的对象，与出发菌株一起进行摇瓶发酵筛选从而确定变异株优良性状稳定表达的菌株。将复筛选出的菌株和出发菌株Grifola frondosa CCTCC M 2013286进行摇瓶发酵试验，连续发酵5代，按指标确定目的诱变株。

本发明提供的菌株灰树花JSU1401，即Grifola frondosa JSU1401，为可以在米糠麸皮全料液态新培养基中快速生长和高产的灰树花诱变株；该诱变菌株已经于2015年1月23日保藏在位于中国武汉的武汉大学的中国典型培养物保藏中心（CCTCC），编号为CCTCC M 2015065，可称为Grifola frondosa CCTCC M 2015065。

在一个实施方案中，所述Grifola frondosa CCTCC M 2015065为第10号菌株，在复筛第五代平板上的生长速率为1.1mm/h，是生长速率较快的一株菌株。

在一个实施方案中，所述摇瓶为250mL锥形瓶。

在一个实施方案中，所述米糠、麸皮液体发酵培养基为：米糠8.0g/100mL，麸皮8.0g/100mL，磷酸二氢钾0.36g/100mL，硫酸镁0.36g/100mL，半胱氨酸盐酸盐50mg/100mL，叶绿素铜钠盐10mg/100mL，pH自然。

在一个实施方案中，所述指标为100mL发酵体积的纯菌丝干重、菌丝多糖重量和发酵液胞外粗多糖重量。

在一个实施方案中，以拮抗性试验表征遗传性状，其结果如附图2所示，拮抗线明显，右边Grifola frondosa CCTCC M 2015065的生长浓密、厚实，可见其生长性能强于出发菌株的性能，遗传性状发生了有益的变化。

在一个实施方案中，所述筛选得到的灰树花新菌株Grifola frondosa CCTCC M 2015065利用发酵新培养基获得的发酵结果为：纯菌丝的干重浓度、菌丝多糖浓度和发酵液中的粗多糖浓度分别达到7.9g/100mL、524.6mg/100mL和763.2mg/100mL。

在一个实施方案中，新菌株的菌丝干重浓度增加23.4%，菌丝多糖浓度增加了15.9%，说明诱变所得新菌株具有更强的发酵米糠和麸皮的能力，菌株的发酵性能发生了显著的积极的变化。

在一个实施方案中，经过检验，新菌株发酵所得的菌丝中，铅、砷、汞等元素含量分别为1.72mg/kg、0.71mg/kg、0.07mg/kg，均低于GB16740-2014限量指标值，黄曲霉毒素含量为15.5μg/kg，低于GB2761-2011稻谷类及其制品的限量指标值，所得菌丝符合保健食品原料要求。

实施例一

灰树花菌株采用灰树花CCTCC M 2015065。米糠使用量为8.0g/100mL培养基，麸皮的使用量为8.0g/100mL培养基，添加KH2PO4 0.36g/100mL，MgSO4 ‘7H2O 0.36g/100mL， 半胱氨酸盐酸盐50mg/100mL，叶绿素铜钠盐10mg/100mL，pH自然，加水至所需的体积，121℃灭菌30min，作为培养基用于发酵，摇瓶装样量为40%，接种量为10%，培养温度28^oC，转速180r/min，培养时间7d。以下按前述发明内容所描述技术方案中的步骤（3）～（8）实施。结果为：菌丝干重7.9 g/100mL培养基，菌丝多糖为524.6mg/100 mL 培养基，胞外多糖为763.2mg/100mL培养基，铅的含量1.72mg/kg，砷的含量0.71mg/kg，汞的含量0.07mg/kg，均低于GB16740-2014限量指标值。黄曲霉毒素的含量15.5μg/kg，低于GB2761-2011稻谷类及其制品的限量指标值。