在高离子强度的溶液中形成DOPA黑素的制作方法

本申请要求于2014年3月25日提交的美国临时申请号61/969920的优先权，该文的全部内容通过引用纳入本文用于所有目的。

关于联邦资助研究或开发的声明

本发明是在政府支持下由美国国立卫生研究院授予的基金号R37DE014193资助完成的。政府对本发明拥有某些权利。

发明领域

本发明总体上涉及聚合颗粒和涂层。更具体而言，本发明涉及作为表面涂层或不溶性颗粒在高离子强度的溶液中自发形成的DOPA黑素(DOPA-melanin)聚合物。

背景技术：

黑素在自然界中广泛存在，提供着色、光保护、抗氧化、金属粘合以及其它生物学性质。黑素的一种重要亚类是真黑素，其由酪氨酸经由一种涉及3,4-二羟基苯丙氨酸(DOPA)的氧化、分子内环化、低聚和聚集以形成不溶性和非均相固体的路径形成。研究真黑素的动力部分来自于对于理解生物功能意义上的结构—性质关系的兴趣，但也来自于日益增加的对于黑素薄膜的有趣的光、电性质和技术应用的兴趣。

合成的和天然的黑素不溶于许多溶剂，该性质代表了将黑素处理成诸如薄膜这样的有用形式中的挑战。过去，类黑素的薄膜在基材上的沉积已通过溶液浇铸、(电)喷涂、旋涂、电化学沉积以及脉冲激光沉积实现。除了通常需要黑素在有机溶剂或水性NaOH或氨中能够溶解以外，大部分已报告的方法都是视线法(line-of-sight)，它们需要精密的装置，采用复杂多步方案，或者只能够在导电基材上实施。由于这些限制，仍然非常需要用于黑素薄膜沉积的简单而多用途的方法。不需要众多基础设施且能够适应多种基材组合物、形状和构造的用于形成黑素薄膜的方法会加快这种令人感兴趣的仿生材料的实际应用的发展。

美国专利公开号2008/0149566(该文通过引用纳入本文用于所有用途)公开了一种用类黑素涂层对表面进行改性的简单而多用途的方法，该方法包括将基材浸涂入富含DOPA的贻贝黏着蛋白质的儿茶酚胺模拟物(例如多巴胺)的水溶液中。多巴胺在温和的碱性和充气水溶液中经历自发的自氧化，以在几乎任意基材上形成粘附性聚多巴胺(PDA)膜。PDA也被称为多巴胺-黑素，因其与真黑素的化学相似性而能作为导致诸如生物分子固定、表面能改性、生物矿化以及生物传感这样的多种应用的进一步改性的引物发挥作用。还可使感兴趣的分子与多巴胺在一步反应中同时共沉积，以形成具有所需性质的表面。

多巴胺和其它儿茶酚胺的若干种衍生物以相似的方式聚合在种类广泛的基材之上。例如，去甲肾上腺素显示为聚合入粘附膜中，其具有因存在未在多巴胺中发现的羟基而引发ε-己内酯的开环聚合的附加能力。使DOPA黑素(DM)膜以与PDA相似的方式自发聚合在各种基材之上会令人感兴趣，因为这会进一步加速类真黑素薄膜的技术应用。相比于PDA，会期望DM展现出更高浓度的可用于各种应用中的游离羧酸。

然而，以往的关于DOPA在水或低离子强度缓冲溶液中的碱性自氧化的报告得到了一种类黑素产物，它是可溶的，或者是溶液稳定的超分子纳米聚集体。本领域技术人员在使用为PDA膜的自发形成(缓冲的充气H₂O，pH为8～9)而开发的标准条件由DOPA形成粘附膜时遇到过困难。原位生长的DM膜在使用多巴胺的条件下显示为只形成了10nm或更薄的厚度，而在该条件下通常会形成厚得多的膜。因此，相比于PDA，利用DOPA的自发性氧化使DM膜生长在基材上要困难得多。

所以，本领域需要用于生产用于各种应用中的DM膜和颗粒的改善的方法。

技术实现要素：

我们在本文中所要公开的是，DM膜在高离子强度下以简单方式进行的自发性原位自氧化沉积。厚的粘附性DM膜在包括金属氧化物、贵金属和聚合物在内的种类广泛的基材上形成。DM膜不但具有许多PDA膜的令人满意的特征，还具有一些优势，即更高的亲水性以及静电结合和释放阳离子的能力。上述性质中的后者可用于通过由DM膜负载和释放阳离子型氨基糖苷来制造抗菌涂层。

我们在本文中还公开了高离子强度的碱性缓冲溶液可被用于在不需要表面基材的条件下使DOPA自氧化，得到5,6-二羟基吲哚羧酸(DHIC)含量高的呈不溶性颗粒状的DOPA黑素(DM)。这些颗粒具有对金属离子的高结合能力，结合程度与溶液中所包含的盐的种类和浓度相关。因此，所得到的DM颗粒还可被用于重金属整治等。

所以，在第一个方面中，本发明包括一种合成DOPA黑素(DM)聚合物的方法。该方法包括在氧化条件下使具有下式的反应物与高浓度的盐的水溶液接触：

其中，R₁、R₃、R₄和R₅各自独立地选自C_1～3的烷基、伯胺、仲胺、卤化物、氢、羟基、羧酸、醛、羧酸酯或羧酰胺；其中，R₁、R₃、R₄和R₅中的至少一种为伯胺或仲胺；其中，x在0～3的范围内，且y在0～3的范围内，前提是x或y至少为1；其中，R₂为羧酸。作为实施该方法的结果，形成了DOPA黑素(DM)聚合物。

在一些实施方式中，x和y各自为1，R₂为-COOH，且R₅为-NH₂。在一些这样的实施方式中，反应物为3,4-二羟基苯丙氨酸(DOPA)。

在一些实施方式中，盐的水溶液中盐的浓度大于100mM。可选地，盐的浓度大于200mM或大于500mM。

在一些非限定性的示例性实施方式中，所使用的盐为钠盐、钾盐、镁盐或钙盐。在一些实施方式中，盐的水溶液为碱性溶液。

在一些实施方式中，该方法还包括使反应物和高浓度的盐的水溶液与表面接触的步骤。作为实施该步骤的结果，DM涂层或膜在该表面上形成。

在一些这样的实施方式中，DM涂层自发地在表面上形成。在另一些这样的实施方式中，DM涂层的厚度大于10nm。在另一些这样的实施方式中，表面包括带负电荷的基材。

在一些实施方式中，所形成的DM聚合物是不溶性颗粒的形式。

在第二个方面中，本发明包括通过实施上述方法而形成的DOPA黑素(DM)聚合物

在一些实施方式中，DM聚合物包含残留的羧酸部分。

在一些实施方式中，DM聚合物是基材表面上的涂层的形式。在一些这样的实施方式中，涂层的厚度大于10nm。在另一些这样的实施方式中，基材表面是医疗装置的表面。

在一些实施方式中，DM聚合物还包含在所述聚合物上捕获的重金属离子或阳离子型药物。在一些这样的实施方式中，阳离子型药物为阳离子型氨基糖苷。

在一些实施方式中，DM聚合物是不溶性颗粒的形式。

在第三个方面中，本发明包括一种减少流体中金属离子数量的方法。该方法包括使上述DOPA黑素(DM)聚合物与包含一种或多种金属离子的流体接触的步骤。结果是，DM聚合物结合至所述金属离子中的至少一种，从而降低所述流体中金属离子的数量。在一些实施方式中，所述一种或多种金属离子可以是Pb²⁺、Cd²⁺、Cu²⁺和Hg²⁺。

在第四个方面中，本发明包括一种递送阳离子型药物的方法。该方法包括以下步骤：(a)使上述DOPA黑素(DM)聚合物与一种或多种阳离子型药物接触，以使所述阳离子型药物可逆地结合至所述DM聚合物；和(b)从所述DM聚合物释放所述阳离子型药物。

在一些实施方式中，阳离子型药物为阳离子型氨基糖苷。可使用的示例性氨基糖苷包括但不限于庆大霉素、卡那霉素、阿米卡星、妥布霉素、地贝卡星、阿贝卡星、西索米星、奈替米星、新霉素和链霉素。

在第五个方面中，本发明包括一种用于合成DOPA黑素(DM)聚合物的试剂盒。这种试剂盒包含：a)具有下式的反应物：

其中，R₁、R₃、R₄和R₅各自独立地选自C_1～3的烷基、伯胺、仲胺、卤化物、氢、羟基、羧酸、醛、羧酸酯或羧酰胺；其中，R₁、R₃、R₄和R₅中的至少一种为伯胺或仲胺；其中，x在0～3的范围内，且y在0～3的范围内，前提是x或y至少为1；其中，R₂为羧酸；其中，x在0～10的范围内，且y在0～10的范围内，前提是x或y至少为1；b)金属盐；和c)用法说明。

在一些实施方式中，金属盐可以是钠盐、钾盐、镁盐或钙盐。在一些实施方式中，该试剂盒还包含碱性缓冲溶液。

在一些实施方式中，该试剂盒还包含待被DM聚合物涂布的基材表面。在一些这样的实施方式中，基材表面是医疗装置的表面。

在说明书和权利要求中，术语“包括”和“包含”是开放式的术语，应当被理解为表示“包括但不限于……”。这些术语包含限制性更强的术语“基本上由……组成”以及“由……组成”。

附图说明

图1是图示通过在高离子强度下的碱性DOPA溶液中进行简单的浸涂来形成保形的DOPA黑素膜的示意图。

图2.在8.5的pH值下形成DM膜。(A)16小时后的NaCl浓度对DM膜厚度的影响。(B)DM膜(250mM的NaCl)随时间的生长。多巴胺氧化的反应方案I(A)和II(B)。

图3.由以下条件得到的PDA在16小时后的厚度：5mM的多巴胺在10mM的N,N-二羟乙基甘氨酸中，pH为8.5，含有0或250mM的NaCl。

图4.由以下条件得到的PDA膜的生长随时间的变化：5mM的多巴胺、250mM的NaCl、10mM的N,N-二羟乙基甘氨酸，pH为8.5。

图5.用DM涂布了0～3次的PC基材的照片。各涂布循环为20小时，由以下条件得到：5mM的多巴胺、250mM的NaCl、10mM的N,N-二羟乙基甘氨酸，pH为8.5。指出了涂层的厚度。

图6.涂布有DM(158nm厚，双面)的PC基材的宽带吸收光谱。

图7.沉积在Au上的PDA和DM膜的衰减全反射-傅里叶变换红外光谱，其显示COO-(1600cm^-1处的非对称伸缩)和COOH(1700～1730cm^-1处的C＝O伸缩)存在于DM而非PDA中。

图8.DM膜的表面形貌和润湿性质。(A)形成在TiO₂上的23nm厚的DM经过16小时后的扫描电子显微镜(SEM)图像。(B)形成在各种基材上的DM和PDA经过16小时后的前进水接触角。*表示角度小于10°。(C)分别在原始PC、涂布有PDA的PC和涂布有DM的PC上的前进水滴的图像。

图9.基于目前对于黑素合成的理解而设想的DM膜的形成路径，其中的最终产物由具有各种可能的键和氧化态的DHICA与DHI亚单位的混合物组成。

图10.阳离子型抗菌化合物与DM膜的结合以及从DM膜上释放。(A)DM或PDA暴露在H₂O或GM溶液中16小时后的厚度改变百分比。(B)4小时中从PC/DM/GM上释放的GM。(C)PC/DM/GM的4小时的GM释放量随DM膜厚度的变化关系。(D)涂布有DM/GM(上图)或PDA/GM(下图)的PC经过18小时的培养后的金黄色葡萄球菌抑制区。(E)显示浮游态金黄色葡萄球菌在涂布有PDA和DM的PC中暴露4小时之后的幸存率的死亡试验。

图11.利用酶联免疫吸附试验(ELISA)测得的从H₂O、羟乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES，10mM，pH为7.4)、HEPES加NaCl(150mM)、HEPES加NaCl和MgCl₂(0.814mM)、HEPES加NaCl和CaCl₂(1.8mM)以及杜尔伯科极限必需培养基(DMEM，155mM的Na⁺、0.814mM的Mg²⁺、1.8mM的Ca²⁺)中的DM/GM涂层释放的庆大霉素的释放量。(*和**分别表示p＜0.05和p＜0.01。)

图12.DM的形成与PDA的形成的比较，显示DM含有DHICA和DHI亚单位，而PDA只含有DHI亚单位。

图13.在pH为8.5的具有不同的NaCl浓度的10mM的N,N-二羟乙基甘氨酸缓冲溶液中的5mM的DOPA的光学显微照片。

图14.使用500mM的NaCl、N,N-二羟乙基甘氨酸缓冲溶液形成的PDA的SEM(上面一排图)和DM的SEM(下面一排图)。

图15.黑素样品在碱性过氧化物降解试验之后在269nm处进行检测的高效液相色谱(HPLC)分析。所示标准含有在7.9分钟时洗脱的1μg/mL的PDCA和在10.2分钟时洗脱的1μg/mL的PTCA。各样品的PTCA/PDCA比例被标注在其图谱下方。

图16.盐的种类和浓度对DM的形成的影响。(A)PTCA/PDCA比例、(B)pH为4.8时的来源于1mM溶液的Pb(II)结合。

图17.AC、PDA、DM(Na)DM(Mg)、SM和CM在1mM下对(A)Cu、(B)Pb、(C)Cd和(D)Hg的结合能力。

图18.pH为4.8时的Pb(II)的结合等温线(isotherm)。

图19.接触时间对来源于1mM溶液的Pb(II)结合的影响。

图20.寻找DM的一种不溶形式，其能够作为用于从水中除去有毒金属的固体载体发挥良好的作用，我们使DOPA在具有不同浓度的NaCl的pH为8.5的缓冲溶液中自氧化16小时。这些悬浊液的颜色随着盐浓度增加而变深，直至NaCl浓度达到250mM，超过该值后利用光学显微法观察到沉淀。

图21.扫描电子显微法揭示出PDA和DM颗粒具有可变的尺寸且包含更小的亚微米颗粒的聚集体。

图22A.虽然PDA的确切化学结构还有待充分阐明，但已知其主要含有DHI，[35]而由DOPA形成的合成黑素则会含有DHI和DHICA亚单位。我们还探索了一价盐(NaCl、KCl)和二价盐(MgCl₂、CaCl₂)的不同浓度对PTCA/PDCA比例、进而对Pb结合的影响。在存在125、250、500和1000mM的上述每一种盐的条件下形成DM，以确定对PTCA/PDCA比例的影响。对于每一种盐，我们发现一个明显的趋势(p＜0.01)，即PTCA/PDCA比例随盐浓度的上升而增大。

图22B.我们在此图中展示了我们发现使用MgCl₂形成的DM结合了最多的Pb(II)，排第二的是CaCl₂。使用NaCl和KCl形成的DM结合了最少的Pb(II)。对于每一种盐，结合的Pb(II)的量也在DM的形成过程中随盐浓度的上升而增多。该趋势与DM的PTCA/PDCA比例(Mg＞Ca＞Na～K)相关，并且暗示盐的种类及其浓度都能够通过增加形成过程中的DHICA含量而间接地增加DM结合Pb(II)的量。

图23.发现PDA具有89.2mg/g的最大Pb(II)结合能力，大约是最大Pb(II)结合能力为18.2mg/g的AC的5倍。所有含DHICA的黑素都具有比PDA高得多的最大Pb(II)结合能力，排序为PDA＜SM＜DM(Na)＜CM＜DM(Mg)。

图24.我们发现DM(Mg)、DM(Na)和CM在所研究的第一时间点(15分钟)内就达到了它们的最大吸收，该时间点为我们的第一时间点。对于SM和PDA，结合增加直至约60分钟。DM颗粒对Pb(II)的快速结合可使得它们适合作为用于在线水净化的吸附剂。

图25A.Cu(II)结合能力的排序为AC＜PDA＜SM＜DM(Na)＜CM＜DM(Mg)。

图25B.由于Pb(II)与Cu(II)具有定性上相似的结合趋势，我们推测Pb(II)类似地先结合至黑素的儿茶酚，然后在更高的浓度下结合至羧基。

图25C.对于Cd(II)，我们发现富含DHICA-DM(Na)、DM(Mg)和CM的黑素结合的Cd(II)是PDA结合的9.6倍～13.2倍。

图26.黑素样品在碱性过氧化物降解试验之后在269nm处进行检测的高效液相色谱(HPLC)分析。PDCA和PTCA的标准溶液(此处以1μg/mL显示)分别在7.7分钟和9.8分钟时洗脱。

图27.方案1

发明详述

I.综述

本发明提供一种新型的用于自发生成DOPA黑素聚合物的方法，该DOPA黑素聚合物为表面上的沉积膜或涂层形式或不溶性颗粒形式。本发明的界面和合成化学可用于包括医疗装置的生物相容性涂层、药物递送载体和组织工程支架的表面改性、生物传感器、抗生物淤积、工业和消费品涂层、半导体、金属去除、表面催化剂以及下一代电子显示在内的重要领域之中。以下对本发明的某些非限定性实施方式进行更详细的描述。

II.自发性自氧化的反应物

本文所述的自发性自氧化过程中所使用的反应物在氧化条件下、在高离子强度、且优选在碱性溶液中发生反应，以制造DOPA黑素(DM)聚合物。该反应物具有以下化学式：

其中，R₁、R₃、R₄和R₅各自独立地选自C_1～3的烷基、伯胺、仲胺、卤化物、氢、羟基、羧酸、醛、羧酸酯或羧酰胺；其中，R₁、R₃、R₄和R₅中的至少一种为伯胺或仲胺；其中，x在0～3的范围内，且y在0～3的范围内，前提是x或y至少为1；其中，R₂为羧酸。

DOPA

在一种这样的实施方式中，反应物为3,4-二羟基苯丙氨酸(DOPA)或其盐：

III.用于自发性自氧化的高离子强度溶液

本发明中所使用的高离子强度溶液还可包含添加剂，例如填料、色素、润湿剂、粘度调节剂、稳定剂、抗氧化剂或交联剂。如果需要，可使反应物交联。如果需要，盐溶液可包含各种佐剂，例如小颗粒填料、表面活性剂、UV吸收剂、光引发剂、着色剂和指示剂。

“高离子强度”是指所使用的溶液中的盐浓度高于100mM，另一些实施方式使用盐浓度高于200mM、高于300mM、高于400mM或高于500mM的溶液。可使用的盐浓度范围包括100～5000mM、100～4000mM、100～3000mM、100～2000mM、100～1000mM、100～500mM、100～400mM、100～300mM、150～5000mM、150～4000mM、150～3000mM、150～2000mM、150～1000mM、150～500mM、150～400mM、150～300mM、200～5000mM、200～4000mM、200～3000mM、200～2000mM、200～1000mM、200～500mM、200～400mM以及200～300mM。

“碱性”是指溶液的pH值在7.1～12的范围内，优选pH在7.5～10的范围内，进一步优选pH在7.5～8.5的范围内。碱性溶液引发了反应物在基材表面上的聚合。

“溶液”是指一种混合物，在该混合物中，至少有一种溶质溶解在含有水的溶剂中，但该溶剂也包括水与诸如丙酮、氯仿、二氯甲烷、甲醇、乙醇、异丙醇、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜以及己烷这样的有机溶剂的互混溶液。优选地，溶液在临使用之前配置，虽然溶液也可在使用前保存至少一段不长的时间。

“在氧化条件下”是指具有溶解氧或诸如三乙胺这样的有机碱的水溶液和非水溶剂的碱性pH。在替代性的实施方式中，包含诸如以下氧化剂的溶液可被用于通过反应物的氧化而引发聚合：过氧化氢，高碘酸钠，叔丁基过氧化氢，有机过氧化物，包括苯醌、萘醌、蒽醌在内的醌类，硝基芳族化合物，包含Cu²⁺、Fe³⁺、Co³⁺和Mn³⁺的金属氧化剂，苯酚，吲哚，苯胺等。

在一种实施方式中，基材被浸入或浸渍在反应物溶液中。下文中的实施方式例示了优选的接触方法。然而，可使用各种技术使基材表面与反应物溶液接触，所述技术包括但不限于刷涂、浸涂、旋涂、模涂(die coating)、喷墨涂布、喷涂、丝网印刷(例如轮转丝网印刷)、凹版印刷、光刻印刷和柔版印刷、微接触印刷、纳米光刻。

通过接触，DM膜在基材表面上形成。在一种优选的实施方式中，DM膜包含位于基材表面上的平滑而连续的聚合涂层，该聚合涂层具有基本上不变的厚度。作为一般指导，存在于基材表面上的聚合涂层的厚度大于10nm。在一些实施方式中，该厚度在约11～1000nm的范围内，优选在约11～100nm的范围内。

在一些实施方式中，合成是自发性的。“自发性”是指反应在热力学上有利，且能够在不继续输入功或力的条件下继续进行。技术人员知晓非自发性反应的一个非限定性例子是电解，其需要外部施加的电流。

IV.基材

在一些实施方式中，该方法包括使基材的至少一部分与反应物接触，如上所述。

“基材”是指任意无机或有机基材。例如，基材可以是提供用于接收粘附性聚合物的表面的有机固体、无机固体或有机和无机固体的组合。合适的有机或无机基材还可以是纤维状、细丝状、网状、多孔或溶剂溶胀的(例如水凝胶或有机凝胶)物体。优选地，小心选择基材，以使基材与反应物之间具有足够程度的粘合。

合适的无机基材包括但不限于以下无机基材，例如石英、玻璃、二氧化硅和其它氧化物或陶瓷，例如氧化铝、铟锡氧化物、钽酸锂(LiTaO₃)、铌酸锂(LiNbO₃)、砷化镓(GaAs)、碳化硅(SiC)、硅酸镓镧(LGS)、氧化锌(ZnO)、氮化铝(AlN)、氧化铝(Al₂O₃)、硅(Si)、氮化硅(Si₃N₄)和钛酸锆铅(“PZT”)、氧化钛(TiO₂)、氧化铌(Nb₂O₅)；以及金属或合金，例如铝、铜、金、银和钢。其它合适的无机基材包括但不限于云母、金刚石和镍钛(NiTi)。

合适的有机基材包括但不限于以下有机基材，例如热塑性塑料，包括聚酯(例如聚对苯二甲酸乙二醇酯或聚萘二甲酸乙二醇酯)、聚丙烯酸酯(例如聚甲基丙烯酸甲酯或“PMMA”)、聚(乙酸乙烯酯)(“PVAC”)、聚(乙烯丁缩醛)(“PVB”)、聚(丙烯酸乙酯)(“PEA”)、聚(二苯氧基磷腈)(“PDPP”)、聚碳酸酯(“PC”)、聚丙烯(“PP”)、高密度聚乙烯(“HDPE”)、低密度聚乙烯(“LDPE”)、聚砜(“PS”)、聚醚砜(“PES”)、聚氨酯(“PUR”)、聚酰胺(“PA”)、聚(二甲基硅氧烷)(“PDMS”)、聚氯乙烯(“PVC”)、聚偏二氟乙烯(“PVdF”)、聚苯乙烯(“PSy”)和聚硫化乙烯；以及热固性塑料，例如纤维素衍生物、聚酰亚胺、聚酰亚胺苯并恶唑和聚苯并恶唑。其它合适的有机基材包括但不限于石墨、纳米碳管、富勒烯、石墨烯、聚(乙醇酸)、聚(乳酸)和聚(乳酸-乙醇酸)和

未处理的基材

本发明的方法可在任何条件下在基材上使用。例如，可在无任何额外预处理或清洁的条件下使用存在诸如油漆、油、油脂、保护剂等涂层的基材。

经过预处理的基材

在另一种实施方式中，可替代地或附加地对基材进行预处理，以促进膜的形成。优选的预处理包括但不限于在存在合适的反应性或非反应性气氛(例如等离子体、辉光放电、电晕放电、电介质阻挡放电或大气压放电)的条件下进行电子和离子束辐射、放电；化学预处理(例如用聚偏二氯乙烯的低固含溶液或用聚酯树脂与氮杂环丙烷交联剂的溶剂基混合物)；火焰预处理；有或没有臭氧预处理条件下的紫外光预处理；以及当使用聚合物基材时，将功能聚合物引入基材中。在一种替代性的实施方式中，本发明提供一种用于受到人工或天然损伤/改变的基材上的涂层的强化方法。

V.用途

经过反应物处理的基材的当前应用有许多，包括但不限于：抗生物淤积和抗氧化表面的应用；用于导尿管、支架、人工骨骼、牙齿和透析管的医疗装置；用于生物微电子机械系统(bio-MEMS)和传感器的半导体；以及用于传感器、诊断和细胞成像的金属纳米颗粒和量子点。

抗菌和抗淤积表面。在该实施方式中，涂覆有DM聚合物的基材表面可展现出抗微生物性，或者可包含结合在表面上的具备这些性质的抗生素。对于非限制性例子，参见以下的实施例1。

经过反应物处理的基材可被用于提供抗生物淤积基材，用于医疗和牙科装置和植入物，具有人造或天然组成的船体壳、离岸和在岸结构，水处理设施，诸如管线这样的液体处理或移动结构，化学处理设施，食品加工设施，以及建筑和房屋材料。

“生物淤积”是指大分子、细胞、蛋白质、细菌、藻类和其它生物体及它们的副产物在固-液或固-气界面的非特异性吸附，这经常对例如医疗装置和传感器的性能、安全和寿命产生不利的影响。“抗”是指对基材进行改性，以防止大分子、细胞、蛋白质、细菌、藻类和其它生物体及它们的副产物在固-液或固-气界面处发生与生物淤积有关的非特异性吸附。目前，聚乙二醇的表面固定(PEG或PEG化)是最为流行的用于非淤积表面制备的方法，但以不受表面约束的方式锚固PEG分子仍然是一大挑战。

防止氧化。在该实施方式中，DM聚合物可展现出抗氧化性，或者可保护下方的表面不受氧化。

药物递送。DM聚合物可以可逆地结合至某些阳离子型药物。因此，其可被用于药物递送。对于非限制性例子，参见以下的实施例1。

无电镀金属化。在该实施方式中，可优选地如上所述在高离子强度溶液中用反应物来处理表面，然后使经过处理的表面暴露在金属溶液中以形成粘合性金属膜。

附加亲核试剂。在该实施方式中，可优选地如上所述使基材与反应物在高离子强度溶液中接触，然后使经过反应物处理的基材暴露于亲核试剂中。“亲核试剂”是指具有被贫电子物质、亲电试剂吸引的倾向的富电子物质。重要的亲核试剂主要包括伯胺和仲胺、硫醇、叠氮化合物、腈、醛、咪唑、叠氮化合物、聚六亚甲基二硫代碳酸酯、氢、羟基、羧酸、醛、羧酸酯或羧酰胺等。

表1.重要的亲核试剂的部分列表

*R可以任意设定。

合适的亲核试剂可包含部分更加复杂的分子，例如蛋白质或核酸。

聚合物接枝。在该实施方式中，可优选地如上所述使基材与反应物在高离子强度溶液中接触，然后使经过反应物处理的基材暴露于聚合物，包括含有如上所述的亲核试剂的任何合成聚合物。例如，在聚(乙二醇)(PEG)的情况中，NH₂-PEG-NH₂、甲氧基-PEG-NH₂、甲氧基-PEG-SH、SH-PEG-SH、支化-PEG-NH₂和支化-PEG-SH是反应到经过SMA处理的表面上的聚合物结构。还可预期聚合接枝的替代性方式，包括自由基接枝聚合、原子转移自由基聚合、等离子体聚合/沉积、等离子体处理和表面辐射，以及阳离子和阴离子单体或低聚物加成。

金属清除。在该实施方式中，可通过结合至该方法制得的经过反应物处理的基材或不溶性DM颗粒来降低流体中金属离子的量。“降低”是指溶液中金属离子的量的任何降低，优选低于所有金属的最大污染物水平(MCL)或其它已建立的标准。可将由该方法制得的呈基材上的膜的不溶性颗粒形式的DM聚合物置于具有金属离子的溶液中，以使经过表面改性的基材降低该溶液中金属离子的量。该方法可在流通或批处理的模式下实施。对于非限制性例子，参见以下的实施例2和3。

VI.试剂盒

在本发明的一种替代性的实施方式中，提供一种用于自发性合成DM聚合物的试剂盒。在一种实施方式中，试剂盒包含用于制造高离子强度溶液的盐、按照如上所述的方式被稀释的反应物、可选的待改性的基材或缓冲溶液，以及用法说明。

“用法说明”是指用于传达本发明对于上述目的之一的有效性的出版物、记录、图表或任何表达介质。例如，可将试剂盒的指导材料粘附至含有本发明的容器中，或与含有本发明的容器一起运输。或者，指导材料可与容器分开运输，或以互联网网站上的可电子获取形式提供，旨在使指导材料和SMA溶液以及基材被接受者协作地使用。

VII.实施例

以下实施例描述了本发明的各种新颖且有用的实施方式。虽然这些实施方式涉及特定的由DOPA制得的涂层、膜和颗粒以及使用该DOPA的方法，但本发明并不受这些实施例中所展示的实施方式所限。

实施例1：用于负载和释放抗微生物化合物的DOPA黑素涂层的高离子强度制剂

通过高离子强度下在碱性DOPA溶液中进行简单的浸涂来在各种基材上形成保形的DOPA黑素膜(图1)。相比于聚多巴胺，DOPA黑素涂层具有高亲水性的优势以及结合和释放阳离子的能力。我们通过使用涂布有DOPA黑素的聚碳酸酯来形成抑制和杀灭金黄色葡萄球菌的抗菌表面来对后者进行展示。

黑素在自然界中广泛存在，提供着色、光保护、抗氧化、结合金属以及其它生物学性质。^[1]黑素的一种重要亚类是真黑素，其由酪氨酸经由一种涉及3,4-二羟基苯丙氨酸(DOPA)的氧化、分子内环化、低聚和聚集以形成不溶性和非均相固体的路径形成。^[2,3]研究真黑素的动力部分来自于对于理解生物功能意义上的结构—性质关系的兴趣，^[4]但也来自于日益增加的对于黑素薄膜的有趣的光、电性质和技术应用的兴趣。^[5-7]

合成的和天然的黑素不溶于许多溶剂，该性质代表了将黑素处理成诸如薄膜这样的有用形式中的挑战。过去，类黑素的薄膜在基材上的沉积已通过溶液浇铸^[8,9]、(电)喷涂^[10,11]、旋涂^[12-14]、电化学沉积^[7,9,15]以及脉冲激光沉积实现。^[16]除了通常需要黑素在有机溶剂或水性NaOH或氨中能够溶解以外，大部分已报告的方法都是视线法，它们需要精密的装置，采用复杂多步方案，或者只能够在导电基材上实施。由于这些限制，仍然非常需要用于黑素薄膜沉积的简单而多用途的方法。不需要众多基础设施且能够适应多种基材组合物、形状和构造的用于形成黑素薄膜的方法会加快这种令人感兴趣的仿生材料的实际应用的发展。

最近报告了一种用类黑素涂层对表面进行改性的简单而多用途的方法，该方法包括将基材浸涂入富含DOPA的贻贝黏着蛋白质的儿茶酚胺模拟物的水溶液中。^[17,18]本领域的文献中最常使用的典型的儿茶酚胺是多巴胺，其在温和的碱性和充气水溶液中经历自氧化，以在几乎任意基材上形成粘附性聚多巴胺(PDA)膜。^[17]PDA因其与真黑素的化学相似性而也被称为多巴胺-黑素，能作为导致诸如生物分子固定、表面能改性、生物矿化以及生物传感这样的多种应用的进一步改性的引物发挥作用^[19,20]。还可使感兴趣的分子与多巴胺在一步反应中同时共沉积，以形成具有所需性质的表面。^[21]

多巴胺和其它儿茶酚胺的若干种衍生物以相似的方式聚合在各种基材之上。例如，去甲肾上腺素显示为聚合入粘附膜中，其具有因存在未在多巴胺中发现的羟基而引发ε-己内酯的开环聚合的附加能力。^[22]其它含有儿茶酚和胺官能团的分子已被用于涂布各种表面以使得能够进行DNA的固定^[23]和抗淤积刷的表面聚合。^[24]

使DOPA黑素(DM)膜以与PDA相似的方式自发聚合在各种基材之上会令人感兴趣，因为这会进一步加速类真黑素薄膜的技术应用。相比于PDA，会期望DM膜展现出更高浓度的可用于各种应用中的游离羧酸。然而，以往的关于DOPA在水或低离子强度缓冲溶液中的碱性自氧化的报告得到了一种类黑素产物，它是可溶的^[25-27]，或者是溶液稳定的超分子纳米聚集体。^[28]与这种行为相一致，我们与其他人都在使用为PDA膜的自发形成而开发的标准条件(缓冲的充气H₂O，pH为8～9)由DOPA形成粘附膜时遇到过困难，特别是形成在诸如TiO₂和SiO₂这样的带负电荷的基材时。^[29]

Greco等人报道了利用DOPA在存在半胱氨酰基-DOPA黑素(CDM)的条件下的自氧化来自发形成核-壳黑素颗粒。^[30]该CDM颗粒似乎对DOPA的氧化和DM壳体的外延沉积起到了关键作用，因此不清楚该方法是否能够提供在其它基材上形成DM薄膜的通用方法。一些报道显示了将DOPA黑素(DM)薄涂层形成在聚合膜上以改善润湿性^[31,32]，以及作为分子共价固定的引物发挥作用，^[33-35]然而，原位生长的DM膜在使用多巴胺的条件下显示为只形成了10nm或更薄的厚度，而在该条件下通常会形成厚得多的膜。因此，相比于PDA，文献证明利用DOPA的自发性氧化使DM膜生长在基材上要困难得多。

在本实施例中，我们所要报告的未料想到的发现为，DM膜能够在高离子强度下以简单方式进行自发性原位自氧化沉积。厚的粘附性DM膜在包括金属氧化物、贵金属和聚合物在内的各种基材上形成。DM膜不但具有许多PDA膜的令人满意的特征，还具有一些优势，即更高的亲水性以及静电结合和释放阳离子的能力。上述性质中的后者可用于通过由DM膜负载和释放阳离子型氨基糖苷来制造抗菌涂层。

DM膜的形成对于离子强度的依赖性通过以下方法来揭示：使贵金属的典型例子(Au)、氧化物的典型例子(TiO₂)和聚合物的典型例子(聚碳酸酯，PC)在0～1M的NaCl浓度下暴露于N,N-二羟乙基甘氨酸缓冲溶液(10mM，pH为8.5)中的DOPA水溶液(5mM)中，并使用椭圆偏振光谱法测量16小时后所形成的DM膜的厚度(图2A)。在PC和TiO₂基材上，在没有NaCl的情况下未检测到DM膜，DM膜的厚度随离子强度的上升而增加，并且在NaCl浓度为250mM或更高时分别稳定在约80nm和40nm。该表现与PDA涂层的表现完全不同，发现后者的厚度与NaCl浓度无关(图3)。在Au上形成DM的不寻常之处在于，在没有NaCl的条件下形成20nm的薄膜，膜厚在250mM的NaCl下增加至140nm，然后在进一步升高NaCl浓度后降至约80nm。虽然这种反常行为的缘由目前还不得而知，但是该观察结果是可以重复的，且我们推测该现象可能与带负电荷的DM膜对Au基材的静电感应有关。不过，在NaCl为500mM及更高时，Au上的DM厚度与PC上的相似(～80nm)。

基于这些初步结果，缓冲溶液A(10mM的N,N-二羟乙基甘氨酸，pH为8.5，250mM的NaCl)被选为形成DM的最佳缓冲溶液，并被用于动力学研究，以观察暴露于5mM的DOPA时DM膜在基材上的生长。膜的生长展现出S形，且膜厚度在8～24小时之内增加得最快(图2B)。这些DM涂层是保形的且粘附至所有测试基材，虽然当用H₂O进行润洗时，用长于36小时的时间在TiO₂上生长的DM出现了斑点状的脱层，这可能是由于DM与带负电荷的TiO₂表面的静电排斥导致的(相同的膜未在用150mM的NaCl进行润洗时脱层)。而缓冲溶液A中所形成的PDA未显示出S形生长曲线(图4)。与PDA类似，DM膜表现为深色涂层，这取决于沉积时间和厚度(图5)，因为其宽带吸收(图6)与真黑素的宽带吸收相似。^[36]

使用衰减全反射模式下的傅里叶变换红外光谱(ATR-FTIR)来比较沉积在Au上的DM和PDA膜之间在官能团方面的差异。DM与PDA之间的一个主要差异在于在1600cm^-1处存在的峰以及在1700～1730cm^-1处的峰肩，它们分别对应于COO-(不对称伸缩)和COOH(伸缩)(图7)。^[37]这些数据暗示DM中存在羧酸基团，且该羧酸基团以质子化和羧酸盐形式存在。

使用X射线光电子能谱分析(XPS)来进一步表征16小时后所形成的DM涂层。相比于原始基材，经过DM改性的基材展现出N含量的增加，达到了与DOPA的理论N/C比0.11相似的N/C比(表2)。发现O/C比小于或等于DOPA的理论O/C比0.44。重要的是，基材的特征信号，例如Au和Ti消失或大幅降低，这暗示形成了一种比典型的XPS分析深度(～10nm)更厚的DM外膜。我们还注意到所有DM膜中都存在约3％的Na，这很可能是由于存在FTIR数据所暗示的羧酸Na盐的缘故。

表2：改性前、DM涂布(pH为8.5，在5mM的DOPA、250mM的NaCl、10mM的N,N-二羟乙基甘氨酸中进行16小时)后以及GM负载后利用XPS测得的基材的原子组成。破折号表示元素存在于检测极限以下。

DM涂布的TiO₂的扫描电子显微法揭露出DM膜遮盖了其下方的基材，且具有粗糙或多孔的表面(图8A)。三种DM改性的基材都几乎完全湿润(＜10°)，我们将其归因于存在高密度的离子化羧酸根基团。而PDA改性的基材的前进接触角约为35°(图8B～C)，这与文献所述相一致。^[17]

与PDA相似，DM膜粘附至不同种类基材的能力很可能与儿茶酚官能团的存在有关，因为儿茶酚官能团能够参与各种相互作用，例如金属配位、氢键结合和π-堆积。^[38]若干份最近的报道都以PDA的结构作为主题。^[39-41]一种假说认为PDA具有与真黑素有关的结构，通常认为真黑素由作为亚单位的5,6-二羟基吲哚(DHI)和5,6-二羟基吲哚羧酸(DHICA)组成。^[36]Vecchia等人最近的研究成果提出多巴胺先在高pH下氧化成其醌，该醌通过多种路径发生反应，得到一种含有未成环多巴胺、由多巴胺成环得到的DHI和吡咯羧酸部分的亚单位的复合产物。^[40]

由于DOPA是真黑素的前体，因此预期DM的形成(图9)能够更加接近地模拟生物学上的黑素合成，所述生物学上的黑素合成包括以酶为中介使DOPA氧化呈多巴醌，环化成环多巴，转化成多巴色素，利用多巴色素互变异构酶(DCT)重组成DHICA和DHI，其随后氧化聚合成真黑素。^[42]在没有DCT的情况下，大部分多巴色素经历脱羧化而形成DHI而非DHICA。^[43]而我们的FTIR和XPS数据暗示在形成于高盐缓冲溶液中的DM膜中仍然明显存在羧酸。DOPA及其衍生物的去质子化的羧酸盐的高离子强度下的电荷屏蔽可能导致聚集和表面结合的增加。DM膜的确切组成、未成环的DOPA亚单位的存在、亚单位之间的连接方式以及它们的氧化态仍然不得而知，需要进一步研究。

为了说明DM中的残留羧酸所提供的相比于PDA的功能优势，将DM膜用于阳离子型氨基糖苷庆大霉素(GM)的结合与释放。GM对包括耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(MRSA)在内的多种细菌有效^[44]，MRSA是导致高发病率和死亡率的医院感染的最大的原因之一。^[45]用DM或PDA涂布基材，然后将其在H₂O或GM溶液(5mg/mL在H₂O中)中浸泡16小时。厚度测试揭示出H₂O中的所有基材上的DM和PDA膜的厚度都减少了约1～5％，我们推测这可能是由于松散结合的DM和PDA减少所致(图10A)。在GM溶液中，PDA膜的厚度减少了相似的量(1～3％)，而所有三种基材上的DM膜都膨胀了约10～15％。XPS揭示出将GM载入DM涂布的基材中导致N/C比上升和O/C比下降，这与将GM引入DM膜时的情况(表1)相一致。另外，Na信号的实际损失暗示GM已通过对最初与DM膜中的羧酸盐相关联的Na⁺离子的阳离子取代而被引入。这些结果暗示GM被载入了DM但未被明显载入PDA。

通过将经过涂布的PC基材(PC/DM/GM)浸入杜氏培养基(DMEM)中，并且利用酶联免疫吸附试验(ELISA)测量GM的释放来研究GM从DM上的释放。如图10B所示，56nm厚的DM膜在4小时内释放了0.95μg/cm²的GM。可通过改变DM厚度轻易地调节DM膜上负载和释放的GM的总量(图10C)，这种调节反过来受到涂布时间或在步骤间进行清洗和干燥的多个涂布循环的控制，这种方法在之前已展示，用于形成更厚的PDA膜。^[46]发现释放介质中的无机盐的组成会影响GM的释放(图11)，暗示DMEM中发现的Na⁺、Mg²⁺和Ca²⁺在GM的释放中能够发挥作用。

实施Kirby-Bauer纸片扩散法以评价负载有GM的DM膜抑制金黄色葡萄球菌生长的能力。将经过涂布和未经涂布的PC基材置于接种了金黄色葡萄球菌并培养了18小时的琼脂盘上。如图10D所示，DM/GM的培养导致16.7mm的抑制区，表明GM从涂层上释放而抑制了细菌在基材上的生长。而用裸露PC、GM处理的PC(PC/GM)、PDA、PDA/GM和DM未展现出任何抑制区(表3)。

表3：具有各种涂层的基材的基材直径和接种有金黄色葡萄球菌的琼脂盘在培养18小时后的抑制区。N/D＝未检测到。

为了展示负载有GM的DM不仅是抑菌的，而且是杀菌的，我们实施了死亡试验，其中，用基材对浮游金黄色葡萄球菌进行4小时的培养，然后计算存活细菌的数量。暴露于负载有GM的DM中的细菌展现出很高的杀菌性，而其它所有涂层都具有与裸露PC在统计学上相似的存活率(图10E)。综合来看，这些实验证明只有DM膜能够负载和释放足够的GM以抑制和杀灭金黄色葡萄球菌，说明DM相对于PDA具有很大的优势，该优势很可能与DM中存在羧酸根基团有关。

总之，我们开发了一种简单的可用于多种基材的表面改性技术，该技术利用高离子强度在水性、弱碱性条件下，将DOPA聚合入厚的粘附性DM膜中。利用浸涂的DM膜自发性沉积相比于以往使用的DM涂布方法表现出明显的简单化，使可负载DM膜的基材的范围和构造得以扩展。相比于被更广泛研究的PDA膜，DM膜展现出提高的润湿能力，并且可负载阳离子型客体分子。这通过展示DM膜上负载和释放GM以杀灭金黄色葡萄球菌来例示，并且预期会对各种其它阳离子型氨基糖苷有效。DM膜的易形成性和可逆的阳离子结合性质可导致儿茶酚胺涂层用于防止表面的细菌定植的新应用。

实验。DOPA和多巴胺的聚合：先将L-DOPA(10mM)溶于H₂O中，然后将其以相等的量与2倍的缓冲溶液A(10mM的N,N-二羟乙基甘氨酸，pH为8.5，250mM的NaCl)混合。将多巴胺.HCl(5mM)直接溶于缓冲溶液A中。将基材置于24孔盘中，并将其浸入DOPA或多巴胺溶液中，保持一段所需的时间，然后用H₂O彻底清洗并用N₂吹干。使PC样品借由表面张力漂浮，面朝下。

GM的负载和释放：使涂布有PDA或DM的基材彻夜(16小时)暴露于5mg/mL的GM在H₂O中的溶液中，然后用H₂O清洗并用N₂吹干。将负载了GM的载体置于含有1mL的DMEM的24孔盘中。使用ELISA(Bioo科技公司(Bioo Scientific)，德克萨斯州)测量释放溶液中的GM浓度。

表征：使用ESM-300椭圆偏振光谱仪(J.A.Woollam公司(J.A.Woollam)，林肯市，内布拉斯加州)，采用400～1000nm的波长，以多种入射角测量所有膜的厚度。将PDA和DM层拟合至具有初始固定系数(An＝1.45，Bn＝0.01)的柯西模型的折射率和厚度。使用日立公司(Hitachi)的SU8030在10kV下对5nm Os涂布的样品进行SEM。

抑菌和死亡试验：用DM(～90nm)或PDA(～80nm)对PC基材进行两次20小时的涂布，然后如上所述负载GM。使金黄色葡萄球菌(ATCC 29213)在胰蛋白酶大豆培养基(30g/L)中彻夜增殖，然后在4000rcf下进行两次5分钟的离心并用生理盐水冲洗。对于Kirby-Bauer试验，使细菌在150mM的生理盐水中重新悬浮成10⁸CFU/mL，将其中的100μL分布在4mm厚的经过阳离子调整的Müller-Hinton(CAMH)琼脂上。将这些测试样品(12mm直径的圆形PC)置于用于培养(18小时，35℃)的琼脂上，然后测量抑制区。将GM纸片(10μg的GM，6mm直径，BD，NJ)用于正对照。对于死亡试验，使细菌重新悬浮在具有10％小牛血清(ATCC)的DMEM(ATCC)中，浓度为10⁷CFU/mL，使其中的100μL暴露于24孔盘中的各基材。正对照为具有50μg/mL的GM的相同细菌溶液。经过4小时的培养(37℃，5％的CO₂)之后，对带孔盘进行2分钟的超声处理，以释放任何粘附的细菌，连续稀释细菌溶液并将它们铺置在CAMH琼脂上。培养(37℃，5％的CO₂)24小时后计算数量。

除非另有说明，否则所有试剂均购自西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)。使用Barnstead Nanopure(赛默飞科技公司(Thermo Scientific))对H₂O进行纯化(≥18MΩ)。利用热蒸镀(Lesker Nano-38)将Au涂布到Si芯片上，或者通过电子束蒸镀(Edwards Auto 500)将TiO₂涂布到Si芯片上。PC(Makrolon GP)基材购自McMaster-Carr(Elmhurst，IL)。将所有基材切割成1×1cm，并且通过依次在5％的Contrad-70、H₂O和IPA中进行10分钟的超声处理来进行清洗。

在ESCALab 250Xi(赛默飞科技公司)上进行XPS，波谱用C(1s)峰(284.6eV)进行校准。使用配备有ZnSe ATR晶体的Thermo Nicolet Nexus 870收集ATR-FTIR数据。在西北大学的Nuance Keck-II设施中进行XPS和ATR-FTIR分析。

实施例2：用于除去有毒重金属的富含DHICA的DOPA黑素颗粒的高离子强度形成。

在本实施例中，我们研究了使用高离子强度缓冲溶液来形成不溶性DM颗粒，将它们用于结合重金属，并且将它们的结合性能与AC、PDA颗粒以及黑素的其它形式的结合性能进行了比较。我们展示了聚合溶液中所使用的盐的种类和浓度对于DM的DHICA亚单位与DHI亚单位的比例具有显著影响，这与DM结合重金属的能力相关。

饮用水的重金属污染在发展中国家和发达国家中都是重大问题。具体而言，铅污染是一个严重的问题，因为其对儿童和未出生的胎儿具有毒性作用。真黑素，一种普遍存在的生物色素，因其对重金属离子的高结合亲和力而受到关注。然而，还未将合成真黑素用作除去重金属离子的试剂，部分因为它是可溶的。在本实施例中，我们展示了高离子强度的碱性缓冲溶液可被用于使DOPA自氧化，导致形成DHICA含量高的DOPA黑素的不溶性颗粒。我们随后展示了黑素的DHICA含量与其对Pb(II)、Cd(II)、Cu(II)和Hg(II)的结合能力的关系。具体而言，发现使用MgCl₂碱性缓冲溶液形成的DOPA黑素具有比天然乌贼墨黑素更高的对上述重金属离子的结合能力。这些发现显示在高离子强度下形成的合成DOPA黑素可成为一种优异的重金属整治用材料。

全世界数以百万计的人无法获得清洁的饮用水，尽管这是一项基本人权。(1)在法规不完善的发展中国家，含有诸如铅、镉、汞这样的重金属的工业废料持续污染着供水。(2)即便是在发达国家，铅管的持续使用有时也会导致自来水中的铅达到危险水平。(3)即使是低血铅水平，也会对儿童的智力发育产生不利影响(4)，而且慢性暴露与诸如肌肉震颤和虚弱、高血压、神经性行为紊乱和肾病这样的各种健康问题相关。(5,6)最近发生的华盛顿特区自来水中的铅污染已经导致当地儿童的血铅达到危险水平(7)并且还与死胎的增加有关。(8)

黑素是广泛存在于动植物中的深色色素，其具有各种功能，例如光保护、抗氧化和金属结合。(9)黑素的主要种类是真黑素、褐黑素和神经黑素。真黑素是一种黑色或棕色聚合物，其由5,6-二羟基吲哚(DHI)和5,6-二羟基吲哚羧酸(DHICA)亚单位组成，并且是人类皮肤、毛发和眼睛中发现的主要色素。在生物学上的黑素合成中，酪氨酸被酪氨酸酶氧化成多巴醌，然后成环并转化成多巴色素，多巴色素自发地脱羧成DHI或者通过多巴色素互变异构酶酶促重组成DHICA。然后，DHI和DHICA经历进一步的氧化聚合和聚集而形成真黑素。(10)褐黑素，一种使红发具有红色的黄色或红色色素，由苯并噻嗪和苯并噻唑亚单位组成。褐黑素的形成是真黑素的形成中形成多巴醌之后的分支，其包括与半胱氨酸反应而形成半胱氨酰多巴，半胱氨酰多巴经历进一步的反应而形成褐黑素亚单位。(10)神经黑素分布在黑质中，其与真黑素的区别在于其由多巴胺通过自氧化形成，而非通过酶的活性，因此会主要含有DHI而不是DHICA亚单位。(11)

黑素因其具有以高亲和性结合重金属离子的能力而受到关注，对于一些金属，所述能力甚至强于螯合剂EDTA。(12-14)具体而言，推测神经黑素能够通过螯合重金属来起到保护神经的作用。(15,16)事实上，帕金森氏病就与神经黑素的缺失有关。(11)通过多巴胺在碱性pH下的自氧化而形成的多巴胺黑素已被用作神经黑素的合成模型。(17,18)我们最近发现多巴胺黑素还能够简单地通过在多巴胺的碱性水溶液中进行浸涂而在几乎任意基材上形成为保形的涂层。(19)该涂层作为聚多巴胺(PDA)而变得广为人知，且被证明可用于多种领域中的无数应用中。(19)PDA的一种应用是重金属整治。发现涂布有PDA的玻璃珠粒结合重金属的能力是活性炭(AC)的若干倍，后者已成为重金属去除的工业标准。(20)PDA颗粒和经过PDA功能化的石墨水凝胶也被用作相同的目的。(21,22)

由于PDA由多巴胺形成，其主要含有DHI，而缺乏只能使用DOPA作为起始分子而形成的DHICA。(23)据认为PDA通过DHI亚单位的儿茶酚和胺来结合至重金属。(20)而由DOPA形成的合成黑素会含有DHI和DHICA亚单位(图12)。由于DHICA相比于DHI含有额外的羧酸，会期望合成DOPA黑素(DM)以提高了的容量和亲和性来结合重金属。然而，关于将DM用于重金属整治中的报道很少，我们认为这是由于通过DOPA在碱性缓冲溶液中的自氧化而形成的DM在pH大于3时保持可溶所导致的。(17,24)相比之下，在相同缓冲溶液中形成的PDA能够轻易沉淀，因此适于在重金属结合后进行物理分离。(17)另外，DM不会像PDA那样形成涂层，特别是在像金属氧化物这样的带负电荷的基材上。(25)我们推测这是由于形成过程中DHICA的羧基的负电荷的排斥限制了聚合和/或聚集所致，并且通过使用高离子强度的缓冲溶液来展现，这些电荷可被屏蔽以允许DM膜形成在各种基材上，其还具有通过静电结合负载和释放阳离子型药物的能力(参见上述实施例1)

材料。Pb(II)、Cu(II)、Cd(II)和Hg(II)的10000ppm溶液购自Inorganic Ventures(克里斯琴斯堡，弗吉尼亚州)。L-DOPA、多巴胺HCl以及所使用的所有其它化学试剂都购自西格玛公司(Sigma，圣路易斯市，密苏里州)。

黑素的合成。将DOPA或多巴胺(10mM)溶于缓冲溶液(20mM的N,N-二羟乙基甘氨酸，500mM的NaCl，pH为8.5)中。使该溶液在室温下在通过震荡而与空气接触的敞口瓶中彻夜反应(20小时)。然后在4500rcf下离心5分钟，轻轻倒出上层清液，并使颗粒在H₂O中重新悬浮。该清洗步骤重复进行约10次，直至上层清液澄清。然后是颗粒重新悬浮在5mL的H₂O中，用液氮冰冻，冻干3天，用一天时间使其与大气湿度平衡。DM也在添加盐之后，在pH被调节至8.5的条件下，在含有125～1000mM的NaCl、KCl、MgCl₂或CaCl₂的N,N-二羟乙基甘氨酸缓冲溶液中形成。

碱性过氧化物降解试验。使用已建立的方案(26)在最小的调整下使黑素降解。简而言之，使0.1mg的黑素悬浮于100μL的H₂O中，将其与375μL的1M的K₂CO₂和25μL的30％的H₂O₂混合，并在室温下震荡20小时。然后，通过添加50μL的10％的Na₂SO₃使残留的H₂O₂分解，并用140μL的6M的HCl酸化该混合物。使用采用C18柱的RP-HPLC在50℃和0.7毫升/分钟的流率下对80μL的样品进行分析，检测269nm处的吸收，并将其用于定量。使用各种浓度的PTCA和PDCA溶液进行标定。

金属离子的结合。所有金属离子溶液都由10000ppm的库存液配制成它们所需的浓度，并且对于Pb、Cu和Cd，将pH调整为4.8，对于Hg，将pH调整至3.6。在15mL不含金属的离心管中，将5mg的各样品与10mL的金属离子溶液混合。然后在室温下在摇匀机(rocker)上进行3小时的平衡，在4500rcf下使这些试管离心5分钟。然后使上层清液通过0.22μm的过滤器，并使用电感耦合等离子体质谱((ICP-MS)在已知的稀释下进行分析以测定其金属浓度。然后通过上层清液中金属浓度的降低推断出被黑素结合的金属。

扫描电子显微法。使PDA和DM颗粒悬浮在H₂O中，将其滴在1×1cm的硅晶片上并使其干燥。然后对这些样品涂布5nm的锇并使用日立SU8030扫描电子显微镜在10kV下获取图像。

PDA和DM的合成。PDA颗粒通过将多巴胺(10mM)溶解在pH为8.5的N,N-二羟乙基甘氨酸缓冲溶液(20mM)中并搅拌20小时来合成。所形成的PDA颗粒可通过离心来简单获得，且对于H₂O润洗稳定。而当试图在相同缓冲溶液中由DOPA来合成DM颗粒时，所形成的DM保持可溶而无法离心分离。Chio等人之前对该现象进行过描述，并且注意到为了使DM在形成后沉淀，需要将pH降至低于3(以使羧基质子化)，或者需要使用诸如氯化钠或硫酸铵这样的盐。(24)然而，我们发现形成DM并在之后利用酸化或盐来沉淀而形成的DM颗粒会在用纯H₂O润洗时重新溶解。

代替只使用盐来在DM形成后使其沉淀，我们研究了使盐存在于DM形成过程中的缓冲溶液中所带来的效果。在NaCl的各种浓度下使DOPA在pH为8.5的缓冲溶液中进行彻夜(20小时)自氧化，使用光学显微法对这些溶液进行观察。如图13所示，含有不超过125mM的NaCl的缓冲溶液中未形成可见的颗粒，虽然这些溶液的颜色确实变得越来越深。从250mM的NaCl开始出现小颗粒，而在500mM～1000mM的NaCl之间沉淀出更大的颗粒。500～1000mN的NaCl缓冲溶液所形成DM可通过离心以及在纯H₂O中清洗来收集而无需进行酸化。这暗示使盐在DM的形成过程中存在很可能通过降低DHICA的静电排斥而能够增加DM的聚合或聚集，得到更大的颗粒。

扫描电子显微法揭示出PDA颗粒的直径约为5μm，且似乎由直径约为500nm的更小的颗粒融合在一起而成。DM颗粒要大得多，测得其横跨40μm，且也在其表面具有亚微米特征(图14)。

PTCA/PDCA比。我们推测Na⁺阳离子在形成过程中屏蔽了DHICA的带负电荷的羧基，降低了静电排斥，从而通过引入更多的DHICA使得聚合增加，形成更大的DM颗粒。为了对此进行研究，进行了碱性过氧化物降解试验，以将PDA和DM破碎成PTCA和PDCA，它们分别是DHICA和DHI的降解产物。如图15所示，随后使用RP-HPLC对这些产物进行量化，给予我们能够指示DHICA/DHI的比例的PTCA/PDCA比。(27)为了进行对比，我们还对PDA、黑素的两种市售可得的形式、通过酪氨酸的过氧化物氧化制得的合成黑素(SM)以及从乌贼上分离得到的乌贼黑素(CM)进行了该试验。

PDA的PTCA/PDCA比最低，为0.426±0.02，这是意料之中的，因为PDA中没有形成DHICA。然而，仍然存在可测量水平的来自于PDA的PTCA，这很可能是因为通过2号位与相邻分子共轭的DHI所致。(23)而使用500mM的NaCl缓冲溶液合成的DM具有1.96±0.19的PTCA/PDCA比，这明显高于PDA的PTCA/PDCA比。该结果与我们之前的发现相符，即利用FTIR确定，与PDA形成对比的是，DM含有羧酸(参见实施例1)。DM的PTCA/PDCA比也比SM的PTCA/PDCA比(0.533±0.01)高得多，这表明使用NaCl碱性缓冲溶液形成黑素的方法相比于酪氨酸的过氧化物氧化(该方法用于形成商业SM)会导致更高的DHICA含量。我们的试验还显示CM还具有23.3±0.9的更高的比例，这与文献中所发现的数值相一致。(28)这并不令人吃惊，因为已知天然黑素由于会使多巴色素重排成DHICA的多巴色素互变异构酶的酶促作用而含有约50％的DHICA，而在没有酶的条件下形成的合成黑素由于多巴色素的自发性脱羧而只含有约10％的DHICA。(29)

提高黑素的DHICA含量。为了提高我们的合成黑素的DHICA含量，我们探索了在DM的形成过程中在pH为8.5的缓冲溶液中在各种浓度下使用不同的一价和二价盐，即Na、K、Mg和Ca的氯化物。对于各盐，使用125、250、500和1000mM以形成DM，以确定种类和浓度对PTCA/PDCA比的影响。我们观察到需要至少500mM的NaCl或KCl以在不进行酸化的条件下形成不溶性DM，但只需要125mM的MgCl₂或CaCl₂就可办到。如图16A所示，通过使用碱性过氧化物降解试验，我们发现当缓冲溶液中存在更高浓度的盐时，所形成的DM的PTCA/PDCA比有升高的趋势。使用二价盐比使用一价盐导致了高得多的DM的PTCA/PDCA比。这暗示DM形成过程中缓冲溶液的离子强度会对所形成的DM的DHICA/DHI比产生重要影响。当将Na与K、Mg与Ca进行比较时，使用离子半径更小的金属导致了更高的PTCA/PDCA比。这可能是因为电荷密度更高的金属离子具有更强的电荷屏蔽作用。我们的合成黑素中实现最高PTCA/PDCA比的是使用1000mM的MgCl₂所形成的DM，其PTCA/PDCA比20.3几乎与CM的比例23.3相当。

然后，我们使用在铅结合试验中使用四种不同盐所形成的DM来确定这些盐对所形成的DM的铅结合容量的影响。在该试验中，将这些样品与1mM的Pb(II)溶液混合3小时，离心，并使用ICP-MS分析上层清液以确定Pb浓度的改变。如图16B所示，我们发现被DM结合的Pb的量的排序与DM的PTCA/PDCA比的排序相同(Mg＞Ca＞Na～K)，这显示DHICA的增加会导致金属结合的增加。

重金属结合。我们使用在含20mM的N,N-二羟乙基甘氨酸、pH为8.5、具有500mM的NaCl或500mM的MgCl₂的缓冲溶液中形成的DM(下文中分别记为DM(Na)和DM(Mg))来继续研究金属结合。将这两种DM与活性炭(AC)、PDA、SM和CM进行关于铅、铜、镉和汞的结合容量的比较。

如图17A所示，Cu(II)结合容量的排序为DM(Mg)＞CM＞DM(Na)＞SM＞PDA。该排序与它们的PTCA/PDCA比的排序相匹配，只有DM(Mg)例外，它具有比CM更低的PTCA/PDCA比，但其具有比CM更高的Cu(II)结合容量。性能最佳的材料是DM(Mg)，其结合了可结合的Cu(II)的95.6％，实现了124.3mg/g的结合容量。CM紧随其后，结合了可结合的Cu(II)的76.5％，相当于99.5mg/g的结合能力。Hong等人的研究发现新鲜的乌贼墨黑素结合了不超过70mg/g的Cu(II)，接近我们自己得出的结果。(30)相同的研究表明，黑素中的CU(II)结合位点是儿茶酚基团而非羧基。然而，Froncisz和Sarna早先使用电子顺磁共振谱法提出当pH小于6时，Cu(II)结合至黑素的羧基。(31,32)Hong和Simon之后总结道，Cu(II)首先结合至儿茶酚位点，然后在更高的Cu(II)浓度下在羧基上结合。(33)我们的结果显示，DHICA含量更高的黑素具有对Cu(II)更多的结合，支持了羧基确实在4.8的pH下会参与Cu(II)的结合这一观点。

对于Pb(II)结合，PDA结合的Pb(II)是AC的约7倍，这与之前的研究相一致(图17B)。(20)这些含有DHICA的黑素都具有比PDA高得多的Pb(II)结合容量，其排序为DM(Mg)＞CM＞DM(Na)＞SM。由于具有与Cu(II)结合相似的定性趋势，我们推测Pb(II)类似地先结合至儿茶酚，然后在更高的浓度下结合至羧基。应当注意的是，DM(Mg)除去了超过99％的所有可除去的Pb(II)，相当于412.4mg/g的结合容量。

我们目前在我们的结果中所观察到的趋势为DM(Mg)可比CM结合更多的金属离子，尽管其具有更低的PTCA/PDCA比，这可归因于多种因素的组合。首先，所使用的CM是由约5～7％的基质蛋白组成的对金属离子没有明显结合作用的黑素颗粒。(13)第二个可能的因素可能是DM(Mg)中残余的未氧化的DOPA减少了溶液中的金属离子。

对于Cd(II)结合，含有DHICA的黑素具有相比于PDA至少8倍的结合容量(图17C)。这一巨大的差异可能是由于Cd(II)在DHICA的羧基上的结合比在儿茶酚上的结合更多所致。Chen等人的研究发现相比于Pb(II)，结合至乌贼墨黑素的Cd(II)因与大盐(macrosalt)竞争而减少得更多，这支持了对羧基的静电吸引对Cd(II)结合具有更重要的作用这一观点。(14)

对于Hg(II)结合，DM(Na)、DM(Mg)和CM的表现地同样好，除去了所有可除去的Hg(II)的约99％(图17D)。PDA和SM分别除去了可除去的Hg(II)的80％和88％。PDA和含有DHICA的黑素之间在Hg(II)结合容量上的反差比前述三种金属离子的情况要小得多。然而，DM(Na)、DM(Mg)和CM除去的Hg(II)仍然是AC的7倍。这暗示相比于羧基，儿茶酚结合位点是更好的Hg(II)螯合剂。

Pb(II)结合亲和性和接触时间的影响。我们进一步研究了在0.2mM～2mM范围内各种初始浓度下的Pb(II)对我们样品的结合，以确定等温线(图18)。我们注意到金属离子对黑素的结合发生在多于一种单一种类的结合位点上，且未显示为表面吸附事件，因此不适用朗缪尔吸附方程的假设。然而，现有文献使用了朗缪尔吸附模型来描述金属离子对黑素的聚集结合亲和性和容量(34,35)，因此我们为了进行对比也采用相同的方法。如表4所示，我们样品的结合亲和力和最大容量都遵循相同的排序：DM(Mg)＞CM＞DM(Na)＞SM＞PDA＞AC。DM(Mg)的最大Pb(II)结合容量为420.7mg/g，结合亲和性为405mM^-1。相比之下，发现AC具有19.2mg/g的结合容量和3.5mM^-1的结合亲和性。

表4：通过Pb(II)结合等温线的线性化的朗缪尔回归而得到的朗缪尔最大结合容量、朗缪尔亲和常数和R²值。

Demirbas等人发现市售可得的磺化离子交换树脂具有84mg/g的结合容量和12.3mM^-1的结合亲和性。(36)Sono等人确认了通过DOPA的酪氨酸酶自氧化涂布到PVDF上的合成真黑素具有92mg/g的Pb(II)结合容量和17.4mM^-1的结合亲和性。(34)我们的DM颗粒的高得多的结合容量和亲和性可归因于其在高离子强度缓冲溶液中形成的更高的DHICA含量，虽然我们注意到这些差异也可能部分由于采用不同的方法所致。

Pb(II)结合对接触时间的依赖性通过对与黑素混合了不同时间的1mM的Pb(II)进行取样来确定。如图19所示，我们发现DM(Mg)、DM(Na)和CM在10分钟内就达到了它们的最大吸收，该时间点为我们的第一时间点。对于SM，结合增加直至约240分钟，而PDA在60分钟时到达其结合峰值。DM颗粒对Pb(II)的快速结合使得它们适合作为用于在线水净化的材料。

表面积。AC吸附重金属的能力归因于其高表面积。如表5所示，我们使用布朗诺尔-埃米特-泰勒(BET)表面分析来确定我们样品的表面积。发现AC具有792.2m²/g的表面积。相比之下，发现我们研究中的所有黑素具有小于8m²/g的表面积，可被认为是无孔的。DM(Na)和DM(Mg)都具有比其它黑素小得多的表面积，这可被归因于其较大的粒度。利用BET表面积分析和巴雷特-乔伊纳-哈兰达(BJH)孔容分析，Liu和Simon还确定了乌贼墨黑素是一种无孔材料(37)，这与我们的发现相一致。考虑到DM和CM的高结合容量，金属结合很可能不仅发生在黑素颗粒的表面上，还通过金属离子的内扩散而在整个材料中发生。Liu等人还推测在乌贼墨黑素中存在离子扩散通道。(13)

表5：AC和各种黑素的BET表面积。

收率。在冻干三天以后，与大气湿度平衡一天，随后计算1克规模中PDA和DM形成的收率(平衡收率)。结果与推测的含水量一起示于表6中。

表6：PDA和DM形成的收率和推测的含水量。

结论。总之，我们通过在高离子强度下使用碱性缓冲溶液合成了具有高DHICA含量的DM颗粒。我们展示了随着DHICA含量的增加，黑素对诸如Pb(II)、Cd(II)、Cu(II)和Hg(II)这样的重金属具有更高的结合容量。DM颗粒被显示为对Pb(II)具有高结合亲和性和快速结合。综上所述，本研究证明了高DHICA的合成黑素可在有毒重金属去除的用途中具有前景。使用高离子强度的缓冲溶液使黑素自氧化，其DHICA/DHI比接近天然真黑素的DHICA/DHI比，这也可能是使用真黑素合成模型的研究者所感兴趣的。

实施例3.用于重金属捕获的富含DHICA的DOPA黑素的简单的制备。

在本实施例中，我们研究了使用高离子强度缓冲溶液来形成不溶性DM颗粒，将它们用于重金属的捕获，并且将它们的性能与AC、PDA颗粒以及黑素的其它形式的结合性能进行了比较。我们展示了聚合溶液中所使用的盐的种类和浓度对于DM的DHICA亚单位与DHI亚单位的比例具有显著影响，这反过来与DM结合重金属的能力相关。

从水中除去高浓度重金属的常规方法包括化学沉淀、膜过滤、离子交换树脂、氧化-还原和溶剂萃取。[9]然而，这些方法常常不足以将重金属的浓度降低至低于严格的法规要求。[10]对于痕量重金属离子的去除，诸如活性炭、壳聚糖、沸石和黏土这样的基于吸附剂的技术已被广泛探索。[11]不幸的是，这些吸附剂中的许多遭受对于重金属离子相对较低的结合容量和弱结合亲和力之苦。[12]虽然在试图通过现有吸附剂的化学改性来增加容量和亲和性上取得了一些进展，[12-15]但仍然需要开发替代性的吸附剂。

虽然PDA的确切化学结构还有待充分阐明，但已知其主要含有DHI,[35]，而由DOPA形成的合成黑素则会含有DHI和DHICA亚单位(图27)。由于DHICA含有可作为第二金属结合位点发挥作用的羧酸，会期望合成DOPA黑素(DM)以相比于PDA更高的容量和亲和性来结合重金属。然而，相比于天然真黑素中发现的50％的DHICA，已显示合成DM只含有约10％的DHICA。[36]迄今，关于将合成DM用于重金属整治中的报道很少，我们认为这部分由于通过DOPA在碱性缓冲溶液中的自氧化而形成的DM在pH大于3时保持可溶所致。[24,37]

相比之下，在相同缓冲溶液中形成的PDA容易沉淀且因此适于在重金属结合后进行物理分离。[24]另外，DM的自氧化不会像PDA那样容易生成涂层，特别是在诸如金属氧化物这样的带负电荷的基材上。[38]推测这是由于形成过程中DHICA的羧基的负电荷的排斥限制了聚合和/或聚集所致，我们最近展示了使用高离子强度的缓冲溶液使DM膜能够在各种基材上形成，给予其以通过静电结合负载和释放阳离子型药物的能力。[39]

材料和方法。Pb(II)、Cu(II)、Cd(II)和Hg(II)的10000ppm标准溶液购自Inorganic Ventures(克里斯琴斯堡，弗吉尼亚州)。多巴胺.HCl、l-DOPA、乌贼黑素(CM，目录号M2649)、合成黑素(SM，目录号M8631)和所有其它化学试剂都购自西格玛公司(圣路易斯市，密苏里州)。使用购自Thermolyne公司(迪比克市，艾奥瓦州)的NANOpure Infinity System将所有H₂O纯化至电阻≥18.2MΩ-cm。PDCA和PTCA由Kazumasa Wakamatsu博士友情提供。

黑素的合成。通过在室温下使置于摇匀机上的敞口瓶中的N,N-二羟乙基甘氨酸缓冲溶液(20mM，pH为8.5)中的多巴胺.HCl(10mM)自氧化来形成PDA。然后在4500rcf下将溶液离心5分钟，轻轻倒出上层清液，并使颗粒在H₂O中重新悬浮。该清洗步骤重复进行10次，直至上层清液澄清。然后使颗粒在5mL的H₂O中重新悬浮，冻干，并在使用前储存在干燥器中。除了将l-DOPA(10mM)溶解在含有0～1000mM的NaCl、KCl、MgCl₂或CaCl₂的N,N-二羟乙基甘氨酸缓冲溶液(20mM，pH为8.5)中以外，按照相似的程序制备DM。如上所述进行DM的清洗和分离。

碱性过氧化物降解试验。使用已建立的方案[40]在最小的调整下查明天然和合成黑素的DHI和DHICA含量。简而言之，使0.1mg的黑素悬浮于100μL的H2O中，将其与375μL的1M的K2CO2和25μL的30％的H2O2混合，并在室温下震荡20小时。然后，通过添加50μL的10％的Na2SO3使残留的H2O2分解，并用140μL的6M的HCl酸化该混合物。使用RP-HPLC对80μL的该混合物进行分析，RP-HPLC采用C18柱，移动相为0.1M的磷酸钾缓冲溶液(pH为2.1)/甲醇，比例为98:2(体积/体积)，保持在50℃，流率为0.7毫升/分钟，检测269nm处的吸收。为了进行定量，通过在我们的条件下对各种浓度的PDCA和PTCA标准溶液(发现它们分别在7.7和9.8分钟时洗脱)进行取样来确定标注曲线(图26)。

金属离子的结合。所有的金属结合实验都使用批处理技术来进行。金属离子溶液通过用H2O将10000ppm的库存溶液稀释至2mM(Pb、Cu和Cd)或4mM(Hg)来制备。使用NH4OH和HNO3将pH调整至4.8(Pb、Cu和Cd)或3.6(Hg)。在典型的实验中，在15mL不含金属的离心管中，将5mg的黑素固体与10mL的金属离子溶液混合。然后在室温下，在摇匀机(rocker)上进行4小时的搅动，在15000rcf下使这些试管离心5分钟。然后分离上层清液，并将其稀释至金属含量范围为10～100ppb之间，然后使用电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)进行分析。使用下式通过上层清液金属离子浓度的下降来推测结合的金属的量，其中，qe是每克吸附剂结合的金属的质量，C0和Ce是溶液中金属离子的初始浓度和最终浓度，V是体积，W是吸附剂的质量。

扫描电子显微法。使PDA和DM颗粒悬浮在H2O中，将其吸取到1×1cm的硅晶片上并使其干燥。然后对这些样品涂布5nm的锇并使用日立SU8030扫描电子显微镜在10kV下获取图像。

光学显微法。DM颗粒如上所述由具有各种NaCl浓度的pH为8.5的N,N-二羟乙基甘氨酸缓冲溶液中的5mM的DOPA形成。经过16小时的形成之后，将1mL的各溶液吸取入聚苯乙烯24孔板中，并用明视场光学显微法取得图像。

PDA和DM的合成。N,N-二羟乙基甘氨酸缓冲溶液(20mM，pH为8.5)中的多巴胺溶液的颜色经过一段若干小时的时间因PDA形成且开始沉淀而变深。16小时之后，PDA颗粒可通过4500rcf下的离心而容易地被收集，且不溶于H₂O。而使用该方法由l-DOPA合成的DM保持可溶，并且无法通过离心分离。Chio等人之前观察到了相似的情况，并且注意到DM的沉淀和分离需要酸化至pH＜3或添加诸如氯化钠或硫酸铵这样的盐。[37]然而，在我们的尝试中，当使用本方法形成和分离的DM悬浮在纯H2O中时，它们再次溶解。

为了寻找DM的一种不溶形式，其能够作为用于从水中除去有毒金属的固体载体发挥良好的作用，我们使DOPA在具有不同浓度的NaCl的pH为8.5的缓冲溶液中自氧化16小时。这些悬浊液的颜色随着盐浓度上升而变深，直至NaCl的浓度达到250mM，超过该值的沉淀可利用光学显微法观察到(图20)。在500～1000mM的NaCl的条件下形成的DM固体可通过4500rcf下的离心并在纯H₂O中清洗来分离，而无需酸化，这暗示通过在高浓度NaCl的存在下自氧化而形成的DM与在低盐浓度下形成的DM在生理化学上有所不同。我们推测Na⁺阳离子在形成过程中屏蔽了DHICA的带负电荷的羧基，降低了静电排斥，从而使得形成更大的DM颗粒的聚合增加。对于其它盐的有限调查表明不溶性DM也可在含有KCl(500mM)、MgCl2(125mM)或CaCl2(125mM)的缓冲溶液中形成。扫描电子显微法揭示出PDA和DM颗粒具有可变的尺寸且包含更小的亚微米颗粒的聚集体(图21)。

DM的合成条件对PTCA/PDCA比的影响。为了确定黑素固体的DHI和DHICA含量，进行了碱性过氧化物试验，其中，使黑素的DHICA和DHI亚单位分别降解成吡咯-2,3,5-三羧酸(PTCA)和吡咯-2,3-二羧酸(PDCA)。因此，PTCA/PDCA比被认为是DHICA/DHI比的代表。[41]为了进行比较，我们还对PDA和通过酪氨酸的过氧化物氧化制得的合成黑素(SM)以及从乌贼上分离得到的乌贼黑素(CM)进行了该试验。该试验显示SM和CM具有0.63±0.1和26.4±1.3的PTCA/PDCA比(表7)，这与文献所述相一致。[42]天然黑素的高得多的DHICA含量是由于会使多巴色素重排成DHICA的多巴色素互变异构酶的酶促作用所致，而在没有酶的条件下形成的合成黑素由于多巴色素的自发性脱羧而含有更低的DHICA含量。[36]

表7.PDA和DM形成的收率，由1克多巴胺.HCl或L-DOPA起始。

PDA的PTCA/PDCA比最低，为0.48±0.03，预计是因为多巴胺前体缺乏羧酸所致。然而，在PDA中测得了少量但可检测水平的PTCA，这很可能是由于通过2号位共轭的DHI亚单位所致。[35]有趣的是，在500mM的NaCl缓冲溶液中合成DM这种简单的调整使PTCA/PDCA比上升至1.80±0.02，这比PDA和SM的PTCA/PDCA比(p＜0.001)要高得多。该结果与我们之前的发现相符，即利用FTIR确定在高离子强度下形成的DM涂层含有羧酸。[39]DM的高PTCA/PDCA比表明使DM在碱性的缓冲生理盐水中自氧化的方法导致相比于用于形成市售SM的酪氨酸的过氧化物氧化这种方法更高的DHICA含量。

我们还探索了一价盐(NaCl、KCl)和二价盐(MgCl2、CaCl2)的不同浓度对PTCA/PDCA比、进而对Pb结合的影响。在存在125、250、500和1000mM的上述每一种盐的条件下形成DM，以确定对PTCA/PDCA比的影响。对于每一种盐，我们发现一个明显的趋势(p＜0.01)，即PTCA/PDCA比随盐浓度的上升而增大(图22A)。NaCl的PTCA/PDCA比与KCl的相似，数值在1.6～2.1之间。在DM的形成过程中使用二价盐比使用一价盐导致了高得多的PTCA/PDCA比。除了二价阳离子提供的更高的离子强度以外，该结果还可能与儿茶酚盐氧化增多有关，儿茶酚盐氧化增多是因为儿茶酚在与碱土金属阳离子络合过程中发生额外的去质子化。[43]使用1000mM的MgCl2形成的DM的PTCA/PDCA比最高，为20.3，这几乎与天然CM(26.4)相当。这些数据表明DM形成过程中的缓冲溶液中所使用的盐的浓度和电荷都会强烈影响DHICA/DHI含量。

Pb(II)结合。为了确定DM合成过程中的盐对其金属结合性质的影响，将黑素粉末与1mM的Pb(II)溶液混合3小时，离心，并且使用ICP-MS分析上层清液以确定残余的Pb(II)浓度。如图22B所示，我们发现使用MgCl2形成的DM结合了最多的Pb(II)，排第二的是CaCl2。使用NaCl和KCl形成的DM结合了最少的Pb(II)。对于每一种盐，结合的Pb(II)的量也在DM的形成过程中随盐浓度的上升而增多。该趋势与DM的PTCA/PDCA比(Mg＞Ca＞Na～K)相关，并且暗示盐的种类及其浓度都能够通过在形成过程中增加DHICA含量而间接地增加DM结合Pb(II)的量。

随后，我们对在500mM的NaCl或500mM的MgCl2的存在下形成的DM(下文中分别称为DM(Na)和DM(Mg))、活性炭(AC)、PDA、SM和CM的Pb(II)结合性质进行了比较。在0.2mM～2mM的Pb(II)中对这些固体进行4小时的培养，并利用ICP-MS测定未结合的Pb(II)。使用朗缪尔吸附等式来拟合这些数据，虽然我们注意到金属离子对黑素的结合可能在多于一种类型的结合位点上发生。然而，现有文献使用了朗缪尔吸附模型来描述金属离子对黑素的聚集结合容量和亲和性[44,45]，因此我们为了进行对比也采用相同的方法。

如表7和图23所示，发现PDA具有89.2mg/g的最大Pb(II)结合容量，大约是最大Pb(II)结合容量为18.2mg/g的AC的5倍。所有含DHICA的黑素都具有比PDA高得多的最大Pb(II)结合容量，排序为PDA＜SM＜DM(Na)＜CM＜DM(Mg)。与图22中所见的趋势相似，黑素的Pb(II)结合容量遵循与它们的PTCA/PDCA比的排序相同的排序，只有DM(Mg)例外，它具有比CM更高的容量，尽管其具有比CM更低的PTCA/PDCA比。引人注目的是，DM(Mg)具有494.1mg/g的最大Pb(II)容量和170.5mM^-1的结合亲和性。该结合容量高于许多其它种类的吸附剂(例如沸石、黏土和壳聚糖)的结合容量[11]，甚至高于市售可得的磺化离子交换树脂的结合容量，Demirbas等人测定这种市售可得的磺化离子交换树脂具有84mg/g的Pb(II)结合容量和12.3mM^-1的结合亲和性。[46]

在最近的研究成果中，Sono等人测定通过DOPA的酪氨酸酶氧化而涂布在PVDF上的合成黑素具有92mg/g的最大Pb(II)结合容量和17.4mM^-1的结合亲和性。[44]我们的DM颗粒的更高的结合容量和亲和性可归因于其更高的DHICA含量，所述更高的DHICA含量是在高离子强度溶液中进行制备的结果，虽然我们提醒这两种研究之间存在方法上的差异。

Pb(II)结合对接触时间的依赖性通过在黑素粉末中对2mM的Pb(II)进行一段8小时的培养来确定。如图24所示，我们发现DM(Mg)、DM(Na)和CM在所研究的第一时间点(15分钟)内就达到了它们的最大吸收，该时间点为我们的第一时间点。对于SM和PDA，结合增加直至约60分钟。DM颗粒对Pb(II)的快速结合可使得它们适合作为用于在线水净化的吸附剂。

对其它重金属的结合容量。使用相似的方法，确定AC和各种黑素对Cu(II)、Cd(II)和Hg(II)的结合容量。如图25A所示，Cu(II)结合能力的排序为AC＜PDA＜SM＜DM(Na)＜CM＜DM(Mg)。该排序与Pb(II)结合的排序相似，且匹配它们各自的PTCA/PDCA比的排序，只有DM(Mg)例外，它具有148.4mg/g的更高的Cu(II)结合容量，尽管其具有更低的PTCA/PDCA比。我们发现CM结合了117.2mg/g的Cu(II)。相比之下，Hong等人发现新鲜的乌贼墨黑素结合了不超过70mg/g的Cu(II)。该差异可能是由于Hong等人在测量金属离子浓度之前用0.1mM的HCl清洗了Cu(II)饱和的CM颗粒所致，这么做可能导致已结合的Cu(II)部分脱附。[47]

在同一研究中，提出了黑素中的Cu(II)结合位点是儿茶酚基团而非羧基。然而，Froncisz和Sarna早先使用电子顺磁共振谱法提出当pH小于6时，Cu(II)结合至黑素的羧基。[48,49]Hong和Simon之后总结道，Cu(II)首先结合至儿茶酚位点，然后在更高的Cu(II)浓度下结合至羧基。[50]由于Pb(II)与Cu(II)具有定性上相似的结合趋势(图25B)，我们推测Pb(II)类似地先结合至黑素的儿茶酚，然后在更高的浓度下结合至羧基。

对于Cd(II)，我们发现富含DHICA-DM(Na)、DM(Mg)和CM的黑素结合的Cd(II)是PDA结合的9.6倍～13.2倍(图25C)。该反差比Pb(II)和Cu(II)的情况大得多，后两者分别为4.3倍～6.2倍和6.2倍～8.8倍。这可能暗示Cd(II)主要结合在DHICA的羧基上而非结合在儿茶酚上。Chen等人的研究发现相比于Pb(II)，结合至乌贼黑素的Cd(II)因与盐竞争而减少得更多，这支持了对羧基的静电吸引对Cd(II)结合具有更重要的作用这一观点。[21]

对于Hg(II)，DM(Na)、DM(Mg)和CM出人意料地结合了1128～1244mg/g的Hg(II)(图25D)。相比于结合了622mg/g的Hg(II)的PDA，富含DHICA的黑素的结合量是其两倍。考虑到已知神经黑素具有对Hg(II)离子的高亲和性，该结果可能并不令人吃惊。[22]对于黑素中的Hg(II)结合，儿茶酚结合位点可能至少与羧酸位点一样重要。另外，可通过利用儿茶酚的氧化还原反应将Hg(II)还原为Hg(0)。

对于所有四种重金属离子，我们观察到，DM(Mg)比CM结合得更多，尽管其具有更低的PTCA/PDCA比。这可归因于多种因素的组合。首先，所使用的CM是包含约5～7％的基质蛋白的黑素颗粒，该基质蛋白不被期望展现出对金属离子具有明显结合作用。[51]第二个因素可能是CM已经含有少量在海水中发现的内源性金属离子，这减少了表观的结合容量。[20]

表面积。使用布朗诺尔-埃米特-泰勒(BET)表面分析来确定我们的吸附剂的表面积(表7)。发现AC具有792.2m2/g的表面积，而发现我们研究中的所有黑素具有小于8m2/g的表面积，可被认为是无孔的。DM(Na)和DM(Mg)都具有比其它黑素小得多的表面积，这可能与其是在高离子强度下形成的有关。利用BET表面积分析和巴雷特-乔伊纳-哈兰达(BJH)孔容分析，Liu和Simon还确定了CM是一种无孔材料[52]，这与我们的发现相一致。AC吸附重金属的能力归因于其高表面积。然而，考虑到DM和CM的高结合容量和低表面积，金属结合很可能不仅发生在黑素颗粒的表面上，还通过金属离子的内扩散而在整个材料中发生。该假说也受到Liu等人的支持，他们根据乌贼墨黑素对Fe(III)的高结合容量提出乌贼墨黑素中存在离子扩散通道。[20]

总之，我们通过高离子强度的碱性缓冲溶液中的自氧化合成出了不溶性的DM颗粒。使用二价盐和高盐浓度导致DM中的更高的DHICA含量。具体而言，在MgCl2中形成的DM具有最高的DHICA含量，几乎与天然黑素的相媲美。DM中DHICA含量的增加与Pb(II)结合的增加相关联。横向比较了AC、PDA、SM、DM(Na)、DM(Mg)和CM的对Pb(II)的朗缪尔最大结合容量和结合亲和性，发现DM(Mg)具有最高的容量和亲和性。还测量了对Cd(II)、Cu(II)和Hg(II)的结合容量，相似地，发现DM(Mg)具有比AC、PDA、SM、DM(Na)和CM高得多的结合容量。综上所述，本研究证明了富含DHICA的合成黑素能够在高离子强度下轻易制得并发挥能够将重金属从水溶液中隔离的优异的吸附剂的作用。在高离子强度下形成的合成DM还可能作为真黑素的合成模型引起研究者的兴趣，因为它们的DHICA含量非常接近天然真黑素的DHICA含量。

应当注意的是，上述说明书、附图以及它们的描述旨在进行说明，而非限制本发明。受到本文的启发，本发明技术人员可对本发明提出许多改动和变化。所有这些改动和变化都在本发明的构思之内。例如，虽然结合上述各示例性实施方式描述了本发明，但已知的或可能目前无法预料的各替代方案、调整、变化、改进和/或实质性等同方案对于至少具有本领域普通技术的人员而言是显而易见的。可在不偏离本发明的精神和范围的前提下做出各种改变。因此，本发明旨在包括这些示例性实施方式的所有已知或之后开发的替代方案、调整、改变、改善和/或实质性等同方案。