一种利用黄岑根转化合成熊果苷的方法
【专利摘要】本发明公开了一种利用黄岑根转化合成熊果苷的方法，属于熊果苷合成技术领域。本发明通过自制组织培养液培养黄岑根，加入氯化钙和失水山梨醇脂肪酸酯增加黄岑根的细胞通透性，增加对苯二酚通过率，促进黄岑根对熊果苷的合成，再乙醇提取结晶，干燥制得熊果苷。本发明生产周期短，分离纯化容易，选择性好，充分利用培养液中添加氯化钙和表面活性剂提高组织细胞通透率，增加熊果酸的产量，针对性强，所得产物生物利用度高达99.6%以上，产量提高了30.2～32.5%。
【专利说明】
一种利用黄岑根转化合成熊果苷的方法
技术领域
[0001]本发明涉及一种利用黄岑根转化合成熊果苷的方法，属于熊果苷合成技术领域。 【背景技术】
[0002]熊果苷又名熊果素，呈白色针状结晶或粉末。萃取自熊果的叶子，能够通过抑制体内酪氨酸酶的活性，阻止黑色素的生成，从而减少皮肤色素沉积，祛除色斑和雀斑，同时还有杀菌、消炎的作用。主要用于高级化妆品的制备。熊果苷是源于绿色植物的天然活性物质，集“绿色植物、安全可靠”和“高效脱色”三者合谐统一于一体的皮肤脱色组份，它能迅速渗入肌肤，在不影响细胞增殖浓度的同时，能有效地抑制皮肤中的酪氨酸酶的活性，阻断黑色素的形成，通过自身与酪氨酶直接结合，加速黑色素的分解与排泄，从而减少皮肤色素沉积，祛除色斑和雀斑，而且对黑色素细胞不产生毒害性、刺激性、致敏性等副作用，同时还有杀菌、消炎的作用。它是当今流行的最为安全有效的美白原料，也是二十一世纪的理想皮肤美白祛斑活性剂。目前熊果苷合成方法有化学合成法、酶合成法和生物转化法，应用最广泛的是生物转化法，它利用生物体中酶体系将原料高效地转化为目标产物。该法所用原料洁净，转化率高，生产无污染，但生产周期长，分离纯化复杂，可利用酶系有限，选择性差，且所得产物生物利用度低，产量低。
【发明内容】
[0003]本发明所要解决的技术问题:针对生物转化法合成熊果酸生产周期长，分离纯化复杂，可利用酶系有限，选择性差，且所得产物生物利用度低，产量低的弊端，提供了一种通过自制组织培养液培养黄岑根，加入氯化钙和失水山梨醇脂肪酸酯增加黄岑根的细胞通透性，增加对苯二酚通过率，促进黄岑根对熊果苷的合成，再乙醇提取结晶，干燥制得熊果苷的方法。本发明通过向培养液中添加氯化钙和表面活性剂提高组织细胞通透率，提高了黄岑根对对苯二酚的利用度，增加熊果酸的产量，解决了传统生物转化法合成熊果酸生产周期长，分离纯化复杂，可利用酶系有限，且生物利用度低、产量低的问题。
[0004]为解决上述技术问题，本发明采用如下所述的技术方案是:(1)按重量份数计，称取90?95份硝酸钾、8?9份磷酸二氢钾、1?2份乙二胺四乙酸二钠、0.1?0.3份硼酸、0.1?0.2份甘氨酸、0.3?0.5份硫酸锌、10?20份肌醇、40?50份水解乳蛋白、10?15份葡萄糖、50?55份蔗糖及800?900份蒸馏水，搅拌混合均匀，得自制黄岑根组织培养液；(2)量取400?500mL上述自制黄岑组织培养液装入锥形瓶中，再移入无菌箱中，向锥形瓶中接种4?5g鲜嫩的黄岑毛状根，用黑布遮住无菌箱在黑暗环境中于27?29°C下培养18 ?22天；(3)培养结束后分别向锥形瓶中加入10?20mL质量浓度为5%氯化钙溶液和3?5mL失水山梨醇脂肪酸酯，放置在摇床上振荡混合过夜，再向其中加入1?2mL质量浓度为10%对苯二酚溶液，继续保温转化30?35h;(4)取出转化后黄岑毛状根，并用去离子水冲洗20?30min后，放入气流粉碎机中粉碎， 过60目标准筛，得黄岑根碎块，将黄岑根碎块移入超声提取仪中，同时向其中加入黄岑根碎块总体积3?5倍质量浓度为60%乙醇溶液，以300?400W功率超声振荡提取3?5h后，过0.4 ?0.5mi微孔滤膜，得纯化提取液；(5)将上述纯化提取液装入旋转蒸发器中，旋蒸浓缩至其原体积的1/5后，向其加入0.1 ?〇.3g熊果苷晶种，搅拌均匀后放入4?6°C冰水浴中静置结晶过夜，过滤得析出的熊果苷晶体，将其放入真空干燥机中，在0.05?0.07MPa的真空度和60?70°C条件下干燥1?2h，即得熊果苷。
[0005]本发明的应用方法:将本发明制得的熊果苷添加至祛斑霜原料中，添加量为祛斑霜原料总质量3.5?4.0%，制得祛斑霜，该熊果苷生物利用度高达99.6%以上，可有效抑制体内酪氨酸酶的活性，阻止黑色素的生成，与传统的生物转化法相比熊果苷产量提高了30.2 ?32.5%，生产周期缩短了7?9天。
[0006]本发明与其他方法相比，有益技术效果是:(1)本发明生产周期短，分离纯化容易，选择性好；(2)充分利用培养液中添加氯化钙和表面活性剂提高组织细胞通透率，增加熊果酸的产量，针对性强；(3)所得产物生物利用度高达99.6%以上，产量提高了30.2?32.5%。【具体实施方式】
[0007]首先按重量份数计，称取90?95份硝酸钾、8?9份磷酸二氢钾、1?2份乙二胺四乙酸二钠、〇.1?〇.3份硼酸、0.1?0.2份甘氨酸、0.3?0.5份硫酸锌、10?20份肌醇、40?50份水解乳蛋白、10?15份葡萄糖、50?55份蔗糖及800?900份蒸馏水，搅拌混合均匀，得自制黄岑根组织培养液;然后量取400?500mL上述自制黄岑组织培养液装入锥形瓶中，再移入无菌箱中，向锥形瓶中接种4?5g鲜嫩的黄岑毛状根，用黑布遮住无菌箱在黑暗环境中于27 ?29°C下培养18?22天;在培养结束后分别向锥形瓶中加入10?20mL质量浓度为5%氯化钙溶液和3?5mL失水山梨醇脂肪酸酯，放置在摇床上振荡混合过夜，再向其中加入1?2mL质量浓度为10%对苯二酚溶液，继续保温转化30?35h;取出转化后黄岑毛状根，并用去离子水冲洗20?30min后，放入气流粉碎机中粉碎，过60目标准筛，得黄岑根碎块，将黄岑根碎块移入超声提取仪中，同时向其中加入黄岑根碎块总体积3?5倍质量浓度为60%乙醇溶液，以 300?400W功率超声振荡提取3?5h后，过0.4?0.5mi微孔滤膜，得纯化提取液;最后将上述纯化提取液装入旋转蒸发器中，旋蒸浓缩至其原体积的1/5后，向其加入0.1?0.3g熊果苷晶种，搅拌均匀后放入4?6°C冰水浴中静置结晶过夜，过滤得析出的熊果苷晶体，将其放入真空干燥机中，在0.05?0.07MPa的真空度和60?70°C条件下干燥1?2h，即得熊果苷。
[0008]实例 1首先按重量份数计，称取90份硝酸钾、8份磷酸二氢钾、1份乙二胺四乙酸二钠、0.1份硼酸、〇.1份甘氨酸、〇.3份硫酸锌、10份肌醇、40份水解乳蛋白、10份葡萄糖、50份蔗糖及800份蒸馏水，搅拌混合均匀，得自制黄岑根组织培养液;然后量取400mL上述自制黄岑组织培养液装入锥形瓶中，再移入无菌箱中，向锥形瓶中接种4g鲜嫩的黄岑毛状根，用黑布遮住无菌箱在黑暗环境中于27°C下培养18天;在培养结束后分别向锥形瓶中加入10mL质量浓度为5%氯化钙溶液和3mL失水山梨醇脂肪酸酯，放置在摇床上振荡混合过夜，再向其中加入lmL质量浓度为10%对苯二酚溶液，继续保温转化30h;取出转化后黄岑毛状根，并用去离子水冲洗 20min后，放入气流粉碎机中粉碎，过60目标准筛，得黄岑根碎块，将黄岑根碎块移入超声提取仪中，同时向其中加入黄岑根碎块总体积3倍质量浓度为60%乙醇溶液，以300W功率超声振荡提取3h后，过0.4wii微孔滤膜，得纯化提取液;最后将上述纯化提取液装入旋转蒸发器中，旋蒸浓缩至其原体积的1/5后，向其加入0.lg熊果苷晶种，搅拌均匀后放入4°C冰水浴中静置结晶过夜，过滤得析出的熊果苷晶体，将其放入真空干燥机中，在〇.〇5MPa的真空度和 60°C条件下干燥lh，即得熊果苷。
[0009]将本发明制得的熊果苷添加至祛斑霜原料中，添加量为祛斑霜原料总质量3.5%， 制得祛斑霜，该熊果苷生物利用度高达99.69%，可有效抑制体内酪氨酸酶的活性，阻止黑色素的生成，与传统的生物转化法相比熊果苷产量提高了 30.2%，生产周期缩短了 7天。
[0010]实例2首先按重量份数计，称取93份硝酸钾、9份磷酸二氢钾、2份乙二胺四乙酸二钠、0.2份硼酸、〇.2份甘氨酸、0.4份硫酸锌、15份肌醇、45份水解乳蛋白、13份葡萄糖、53份蔗糖及850份蒸馏水，搅拌混合均匀，得自制黄岑根组织培养液;然后量取450mL上述自制黄岑组织培养液装入锥形瓶中，再移入无菌箱中，向锥形瓶中接种5g鲜嫩的黄岑毛状根，用黑布遮住无菌箱在黑暗环境中于28°C下培养20天;在培养结束后分别向锥形瓶中加入15mL质量浓度为5% 氯化钙溶液和4mL失水山梨醇脂肪酸酯，放置在摇床上振荡混合过夜，再向其中加入2mL质量浓度为10%对苯二酚溶液，继续保温转化33h;取出转化后黄岑毛状根，并用去离子水冲洗 25min后，放入气流粉碎机中粉碎，过60目标准筛，得黄岑根碎块，将黄岑根碎块移入超声提取仪中，同时向其中加入黄岑根碎块总体积4倍质量浓度为60%乙醇溶液，以350W功率超声振荡提取4h后，过0.5wii微孔滤膜，得纯化提取液;最后将上述纯化提取液装入旋转蒸发器中，旋蒸浓缩至其原体积的1/5后，向其加入0.2g熊果苷晶种，搅拌均匀后放入5°C冰水浴中静置结晶过夜，过滤得析出的熊果苷晶体，将其放入真空干燥机中，在〇.〇6MPa的真空度和 65°C条件下干燥2h，即得熊果苷。
[0011]将本发明制得的熊果苷添加至祛斑霜原料中，添加量为祛斑霜原料总质量3.8%， 制得祛斑霜，该熊果苷生物利用度高达99.81%，可有效抑制体内酪氨酸酶的活性，阻止黑色素的生成，与传统的生物转化法相比熊果苷产量提高了 31.4%，生产周期缩短了 8天。
[0012]实例3首先按重量份数计，称取95份硝酸钾、9份磷酸二氢钾、2份乙二胺四乙酸二钠、0.3份硼酸、0.2份甘氨酸、0.5份硫酸锌、20份肌醇、50份水解乳蛋白、15份葡萄糖、55份蔗糖及900份蒸馏水，搅拌混合均匀，得自制黄岑根组织培养液;然后量取500mL上述自制黄岑组织培养液装入锥形瓶中，再移入无菌箱中，向锥形瓶中接种5g鲜嫩的黄岑毛状根，用黑布遮住无菌箱在黑暗环境中于29 °C下培养22天;在培养结束后分别向锥形瓶中加入20mL质量浓度为5% 氯化钙溶液和5mL失水山梨醇脂肪酸酯，放置在摇床上振荡混合过夜，再向其中加入2mL质量浓度为10%对苯二酚溶液，继续保温转化35h;取出转化后黄岑毛状根，并用去离子水冲洗 30min后，放入气流粉碎机中粉碎，过60目标准筛，得黄岑根碎块，将黄岑根碎块移入超声提取仪中，同时向其中加入黄岑根碎块总体积3?5倍质量浓度为60%乙醇溶液，以400W功率超声振荡提取5h后，过0.5wii微孔滤膜，得纯化提取液;最后将上述纯化提取液装入旋转蒸发器中，旋蒸浓缩至其原体积的1/5后，向其加入0.3g熊果苷晶种，搅拌均匀后放入6°C冰水浴中静置结晶过夜，过滤得析出的熊果苷晶体，将其放入真空干燥机中，在〇.〇7MPa的真空度和70°C条件下干燥2h，即得熊果苷。
[0013]将本发明制得的熊果苷添加至祛斑霜原料中，添加量为祛斑霜原料总质量4.0%， 制得祛斑霜，该熊果苷生物利用度高达99.93%，可有效抑制体内酪氨酸酶的活性，阻止黑色素的生成，与传统的生物转化法相比熊果苷产量提高了 32.5%，生产周期缩短了 9天。
【主权项】
1.一种利用黄岑根转化合成熊果苷的方法，其特征在于具体制备步骤为:(1)按重量份数计，称取90?95份硝酸钾、8?9份磷酸二氢钾、1?2份乙二胺四乙酸二 钠、0.1?0.3份硼酸、0.1?0.2份甘氨酸、0.3?0.5份硫酸锌、10?20份肌醇、40?50份水解 乳蛋白、10?15份葡萄糖、50?55份蔗糖及800?900份蒸馏水，搅拌混合均匀，得自制黄岑 根组织培养液；(2)量取400?500mL上述自制黄岑组织培养液装入锥形瓶中，再移入无菌箱中，向锥形 瓶中接种4?5g鲜嫩的黄岑毛状根，用黑布遮住无菌箱在黑暗环境中于27?29°C下培养18 ?22天；(3)培养结束后分别向锥形瓶中加入10?20mL质量浓度为5%氯化钙溶液和3?5mL失水 山梨醇脂肪酸酯，放置在摇床上振荡混合过夜，再向其中加入1?2mL质量浓度为10%对苯二 酚溶液，继续保温转化30?35h;(4)取出转化后黄岑毛状根，并用去离子水冲洗20?30min后，放入气流粉碎机中粉碎， 过60目标准筛，得黄岑根碎块，将黄岑根碎块移入超声提取仪中，同时向其中加入黄岑根碎 块总体积3?5倍质量浓度为60%乙醇溶液，以300?400W功率超声振荡提取3?5h后，过0.4 ?0.5mi微孔滤膜，得纯化提取液；(5)将上述纯化提取液装入旋转蒸发器中，旋蒸浓缩至其原体积的1/5后，向其加入0.1 ?〇.3g熊果苷晶种，搅拌均匀后放入4?6°C冰水浴中静置结晶过夜，过滤得析出的熊果苷 晶体，将其放入真空干燥机中，在0.05?0.07MPa的真空度和60?70°C条件下干燥1?2h，即得熊果苷。
【文档编号】C07H15/203GK106047789SQ201610469312
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年6月25日
【发明人】仇颖超, 盛海丰, 林茂平
【申请人】仇颖超