专利名称：用于将合成气和其他碳源转化成有用产品的微生物和方法
用于将合成气和其他碳源转化成有用产品的微生物和方法本申请主张2007年12月16日提交的美国临时申请序列号No. 61/138，108的优先权，其全部内容以引用的方式并入本文。
背景技术：
本发明总体上涉及能够将甲醇、合成气体和其他气态碳源转化成较高价值化学品的生物合成方法和有机体。更具体而言，本发明涉及能够生产商用化学品如异丙醇、4-羟基丁酸酯和1，4_ 丁二醇的非天然存在的有机体。增加的廉价灵活性和容易获得原料以及最小化对化学品生产的环境影响对于可持续发展的化学工业是有益的。原料灵活性依赖于可以访问和使用各种材料作为化工生产的主要材料的引入方法。异丙醇(IPA)是一种无色、易燃液体，与大多数溶剂混合完全，包括水。IPA的最大用途是作为溶剂，包括众所周知的但很小使用的“外用酒精”，这是一种IPA和水的混合物。 作为溶剂，IPA在许多日常产品中发现，如涂料、油漆、稀释剂、油墨、粘合剂、通用清洁剂、消毒剂、化妆品、盥洗用品、除冰剂和药品。低级IPA也用于发动机油中。第二个最大作用是作为异丙胺(例如在农产品中)、异丙醚和异丙酯生产的化工中间体。异丙醇经由两种石化路线生产。主要过程需要在有或没有硫酸催化作用下利用丙烯的水合。其次，IPA经由丙酮的氢化生产，这是在苯酚和环氧丙烷生产中形成的副产品。 高价位的丙烯目前在整个化学中正推动成本上升利润下降，因而正需要低成本原料的扩大范围。4-羟基丁酸(4-羟基丁酸酯、4-羟基丁酸酯、4-HB)是4_碳羧酸，已作为各种商品和特种化学品中构建块的工业潜力物。特别地，4-HB有可能作为进入1，4_丁二醇系列化学品的新切入点，其中包括溶剂、树脂、聚合物前体和特种化学品。BDO是一种用于高性能聚合物、溶剂和精细化学品生产的有价值化学品。它是生产其他高价值化学品的基础，如四氢呋喃(THF)和Y-丁内酯(GBL)。BDO的用途包括(1)聚合物，O) THF衍生物，和C3) GBL衍生物。在聚合物的情况下，BDO是一种聚对苯二甲酸乙二醇酯(PBT)生产的共聚单体。PBT是一种由诸如杜邦公司和通用电气公司生产的中性能工程热塑性塑料，其用在汽车、电器、供水系统和小家电中。当转化成THF时，和随后转化成聚四亚甲基醚二醇(PTMEG)时，氨纶和莱卡纤维和服装产业被添加到服务市场。在生产聚酯醚(COPE)时，PTMEG也与BDO相结合。COPES是高模量弹性体，具有优良的机械性能和耐油性/耐环境性，从而允许它们在极端高和低的温度下操作。PTMEG和BDO还可制造经由标准挤出、压延和成型设备加工的热塑性聚氨酯，其特征在于其出色的韧性和耐磨性，从BDO生产的GBL提供制造吡咯烷酮的原料，以及服务于农药市场应用本身。吡咯烷酮用作高性能溶剂，用于增加在电子行业中使用的提取过程以及用在药物生产中。BDO由两种主要石化路线生产，几个路线也投入商业运营中。一条路线涉及乙炔与甲醛的反应，然后氢化。最近，已经提出涉及将丁烷或丁二烯氧化成马来酸酐，然后氢化的 BDO过程。BDO几乎唯一用作合成其他化学品和聚合物的中间体。合成气体(合成气)是主要由吐和CO组成的混合物，可经由气化任何有机原料(例如煤、煤油、天然气、生物质或有机废物)来获得。已经开发出众多气化方法，且大部分设计是基于在高温(500-1500°C )下部分氧化(其中限制氧气含量以避免完全燃烧)有机物质以提供作为例如0.5 1-3 1H2/C0混合物的合成气。有时添加蒸汽以增加氢气含量，这通常伴随着经水煤气变换反应增加(X)2产量。现今，煤是用于工业生产合成气的主要底物，而煤通常用于加热和供能，并且用作甲醇和液态烃的费托合成(Fischer-Tropsch synthesis)的原料。许多大型化学和能源公司大规模地利用煤气化方法，并在工业上应用这种技术。总的来说，在世界上几乎任何地点，从包括煤、生物质、废物、聚合物等在内的众多物质有成本效益地生产合成气的技术当前是存在的。生物质气化技术正在进行商业实践， 尤其是用于热量和能量产生。虽然可以获得利用合成气的有机体，但一般来说，这类有机体的特征不清楚且不是非常适用于商业开发。例如，梭菌和相关细菌是严格厌氧菌，无法耐受高浓度的某些产物(例如丁醇)，因此限制了滴定度和商业化潜力。梭菌还产生很多种产物，这在获得期望产物方面带来了分离问题。最后，用于操作梭菌基因的灵巧基因工具的开发尚处在初期，因此，它们目前不能容易地经受快速基因工程以便改进期望产物的产率或生产特征。因此，需要开发可利用合成气或其他气态碳源来产生期望化学品和燃料的微生物和其使用方法。更具体而言，需要开发用于合成气利用的微生物，其也具有现有的有效基因工具，使其能够经受快速工程改造而以有用的速率和数量产生有价值产物。本发明满足这种需求并且也提供相关优点。
发明内容
在一些方面，本发明提供一种非天然存在的微生物有机体，其具有包含编码异丙醇途径酶的至少一种外源核酸的异丙醇途径，所述外源核酸足量表达以产生异丙醇。异丙醇途径酶包括琥珀酰-CoA: 3-酮酸-CoA转移酶。在其他方面，本发明提供一种非天然存在的微生物有机体，其具有包含编码4-羟基丁酸酯途径酶的至少一种外源核酸的4-羟基丁酸酯途径，所述外源核酸足量表达以产生4-羟基丁酸酯。4-羟基丁酸酯途径酶包括乙酰乙酰-CoA硫解酶、3-羟基丁酰-CoA脱氢酶、巴豆酸酶、巴豆酰-CoA水合酶、4-羟基丁酰-CoA转移酶、磷酸转-4-羟基丁酰酶和 4-羟基丁酸酯激酶。在其他方面，本发明提供一种非天然存在的微生物有机体，其具有包含编码1， 4-丁二醇途径酶的至少一种外源核酸的1，4_ 丁二醇途径，所述外源核酸足量表达以产生 1,4- 丁二醇。1，4- 丁二醇途径酶包括乙酰乙酰-CoA硫解酶、3-羟基丁酰-CoA脱氢酶、巴豆酸酶、巴豆酰-CoA水合酶、4-羟基丁酰-CoA还原酶(醇形成型)、4_羟基丁酰-CoA还原酶(醛形成型)和1，4_ 丁二醇脱氢酶。所述有机体还包含具有编码乙酰-CoA途径酶的至少一种外源核酸的乙酰-CoA途径，所述外源核酸足量表达以产生乙酰-CoA。乙酰-CoA途径酶包括类咕啉蛋白、甲基四氢叶酸类咕啉蛋白甲基转移酶、类咕啉铁硫蛋白、镍蛋白装配蛋白、铁氧还蛋白、乙酰-CoA合成酶、一氧化碳脱氢酶、丙酮酸酯铁氧还蛋白氧化还原酶和氢化酶。在其他方面，本发明提供一种非天然存在的微生物有机体，其具有包含编码1，4-丁二醇途径酶的至少一种外源核酸的1，4_ 丁二醇途径，所述外源核酸足量表达以产生 1,4- 丁二醇。1，4- 丁二醇途径酶包括乙酰乙酰-CoA硫解酶、3-羟基丁酰-CoA脱氢酶、巴豆酸酶、巴豆酰-CoA水合酶、4-羟基丁酰-CoA还原酶(醇形成型)、4_羟基丁酰-CoA还原酶(醛形成型)和1，4_ 丁二醇脱氢酶。所述有机体还包含具有编码乙酰-CoA途径酶的至少一种外源核酸的乙酰-CoA途径，所述外源核酸足量表达以产生乙酰-CoA。乙酰-CoA途径酶包括乙酰-CoA合成酶、甲酸酯脱氢酶、甲酰四氢叶酸合成酶、次甲基四氢叶酸环化水解酶、亚甲基四氢叶酸脱氢酶和亚甲基四氢叶酸还原酶。在其他方面，本发明提供一种非天然存在的微生物有机体，其具有包含编码异丙醇途径酶的至少一种外源核酸的异丙醇途径，所述外源核酸足量表达以产生异丙醇。异丙醇途径酶包括乙酰乙酰-CoA硫解酶、乙酰乙酰-CoA:乙酸酯CoA转移酶、乙酰乙酸酯脱羧酶和异丙醇脱氢酶。所述有机体还包含具有编码乙酰-CoA途径酶的至少一种外源核酸，所述外源核酸足量表达以产生乙酰-CoA。乙酰-CoA途径酶包括甲醇甲基转移酶、类咕啉蛋白、甲基四氢叶酸类咕啉蛋白甲基转移酶、类咕啉铁硫蛋白、镍蛋白装配蛋白、铁氧还蛋白、乙酰-CoA合成酶、一氧化碳脱氢酶、丙酮酸酯铁氧还蛋白氧化还原酶和氢化酶。在其他方面，本发明提供一种产生异丙醇的方法，其包括培养具有异丙醇途径的非天然存在的微生物有机体。所述途径包含编码异丙醇途径酶的至少一种外源核酸，所述外源核酸在用于产生异丙醇的条件和足够时间下足量表达以产生异丙醇。异丙醇途径包括琥珀酰-CoA :3-酮酸-CoA转移酶。 在其他方面，本发明提供一种产生4-羟基丁酸酯的方法，其包括培养具有4-羟基丁酸酯途径的非天然存在的微生物有机体。所述途径包含编码4-羟基丁酸酯途径酶的至少一种外源核酸，所述外源核酸在用于产生4-羟基丁酸酯的条件和足够时间下足量表达以产生4-羟基丁酸酯。4-羟基丁酸酯途径酶包括乙酰乙酰-CoA硫解酶、3-羟基丁酰-CoA 脱氢酶、巴豆酸酶、巴豆酰-CoA水合酶、4-羟基丁酰-CoA转移酶、磷酸转-4-羟基丁酰酶和 4-羟基丁酸酯激酶。在其他方面，本发明提供一种产生1，4- 丁二醇的方法，其包括培养具有1，4- 丁二醇途径的非天然存在的微生物有机体。所述途径包含编码1，4_ 丁二醇途径酶的至少一种外源核酸，所述外源核酸在用于产生1，4_ 丁二醇的条件和足够时间下足量表达以产生1， 4- 丁二醇。1，4- 丁二醇途径包含乙酰乙酰-CoA硫解酶、3-羟基丁酰-CoA脱氢酶、巴豆酸酶、巴豆酰-CoA水合酶、4-羟基丁酰-CoA还原酶(醇形成型)、4_羟基丁酰-CoA还原酶 (醛形成型)和1，4_ 丁二醇脱氢酶。所述有机体还包含具有编码乙酰-CoA途径酶的至少一种外源核酸的乙酰-CoA途径，所述外源核酸足量表达以产生乙酰-CoA。乙酰-CoA途径酶包括类咕啉蛋白、甲基四氢叶酸类咕啉蛋白甲基转移酶、类咕啉铁硫蛋白、镍蛋白装配蛋白、铁氧还蛋白、乙酰-CoA合成酶、一氧化碳脱氢酶、丙酮酸酯铁氧还蛋白氧化还原酶和氢化酶。最后，在一些方面，本发明提供一种产生1，4_ 丁二醇的方法，其包括培养具有1， 4-丁二醇途径的非天然存在的微生物有机体。所述途径包含编码1，4_ 丁二醇途径酶的至少一种外源核酸，所述外源核酸在用于产生1，4_ 丁二醇的条件和足够时间下足量表达以产生1，4_ 丁二醇。1，4_ 丁二醇途径包含乙酰乙酰-CoA硫解酶、3-羟基丁酰-CoA脱氢酶、 巴豆酸酶、巴豆酰-CoA水合酶、4-羟基丁酰-CoA还原酶(醇形成型)、4_羟基丁酰-CoA还原酶(醛形成型)和1，4_ 丁二醇脱氢酶。所述有机体还包含具有编码乙酰-CoA途径酶的至少一种外源核酸的乙酰-CoA途径，所述外源核酸足量表达以产生乙酰_CoA。乙酰-CoA 途径酶包括乙酰-CoA合成酶、甲酸酯脱氢酶、甲酰四氢叶酸合成酶、次甲基四氢叶酸环化水解酶、亚甲基四氢叶酸脱氢酶和亚甲基四氢叶酸还原酶。
图1显示乙酸酯和乙醇的Wood-Ljungdahl途径和形成路径。能够在合成气体上生长的有机体典型地独有的转化有1)C0脱氢酶，幻氢化酶，；3)能量守恒氢化酶(ECH)，和 4)双功能CO脱氢酶/乙酰-CoA合成酶。将氢氧化成2 [H]或用H2O将CO氧化成CO2, 2 [H] 提供将CO2还原成甲酸酯、将次甲基-四氢叶酸(次甲基-THF)还原成亚甲基四氢叶酸(亚甲基-THF)、将亚甲基-THF还原成甲基四氢叶酸(甲基-THF)以及将(X)2还原成CO的还原
=I里。图2A显示完全Wood-Ljungdahl途径，用于将包含C0、0)2和/或H2的气体转化为乙酰-CoA，乙酰-CoA随后被转化为细胞物质和例如乙醇或乙酸酯等产物。图2B显示合成代谢途径，其用于将包含CO、CO2和/或吐的气体和甲醇转化为乙酰-CoA并进一步转化为异丙醇。图2C显示合成代谢途径，其用于将包含CO、CO2和/或吐的气体和甲醇转化为乙酰-CoA并进一步转化为4-羟基丁酸酯。图2D显示合成代谢途径，其用于将包含C0、0)2和 /或吐的气体和甲醇转化为乙酰-CoA并进一步转化为1，4- 丁二醇。在图2A-D中，可经工程改造为生产宿主的特异性酶促转化被编号。缩写IOFTHF 10-甲酰四氢叶酸，5MTHF 5-甲基四氢叶酸，ACTP 乙酰磷酸，CFeSp 类咕啉铁硫蛋白，FOR 甲酸酯，MeOH 甲醇，METHF 亚甲基四氢叶酸，MLTHF 次甲基四氢叶酸，THF 四氢叶酸。图3A显示合成代谢途径，其用于将包含CO、CO2和/或H2的气体和甲醇转化为乙酰-CoA并进一步转化为异丙醇。图:3B显示合成代谢途径，其用于将包含C0、0)2和/或H2 的气体和甲醇转化为乙酰-CoA并进一步转化为4-羟基丁酸酯。图3C显示合成代谢途径， 其用于将包含⑶、CO2和/或吐的气体和甲醇转化为乙酰-CoA并进一步转化为1，4_ 丁二醇。在图3A-C中，可经工程改造为生产宿主的特异性酶促转化被编号。缩写10FTHF :10-甲酰四氢叶酸，5MTHF 5-甲基四氢叶酸，ACTP 乙酰磷酸，CFeSp 类咕啉铁硫蛋白，FOR 甲酸酯，MeOH 甲醇，METHF 亚甲基四氢叶酸，MLTHF 次甲基四氢叶酸，THF 四氢叶酸。图4显示10微克ACS90 (泳道1)、ACS91 (泳道2)、Mta98/99 (泳道3和4)的细胞提取物、大小标准物(泳道5)和热乙酸穆尔氏菌(M. thermoacetica)CODH(Moth_1202/1203) 或 Mtr(Mo th 1197)蛋白的对照(50、150、250、；350、450、500、750、900 和 IOOOng)的 Western 印迹。图5显示甲基紫精分析中使用的试管。空白在右侧，含有还原的甲基紫精的试管在左侧。每个试管上的塞子和真空脂用于保持反应是厌氧性的。图6显示对于将CH3从加入的CH3-THF转移到纯化的热乙酸穆尔氏菌类咕啉蛋白而进行分析的ACS90细胞提取物的谱图。图7显示重组大肠杆菌(E. coli)MG1655在37°C下在N2和CO中36hr的厌氧性生长。从左到右显示空白载体、ACS90和ACS91。
具体实施例方式本发明部分地涉及非天然存在的微生物，其表达编码与MtaABC型甲基转移酶系统一起催化Wood-Ljimgdahl途径的羰基分支的酶的基因。所述有机体能够将甲醇(一种可来源于合成气体的相对廉价的有机原料)和包含C0、0)2和/或H2的气体转化为乙酰-CoA、 细胞物质和产物，如异丙醇(IPA)、4_羟基丁酸酯G-HB)和1，4_ 丁二醇(BDO)。本发明也部分地涉及非天然存在的微生物，其表达编码催化Wood-Ljimgdahl途径的羰基和甲基分支的酶的基因。所述有机体能够将包含CO、CO2和/或吐的气体转化为乙酰-CoA、细胞物质和产物，如IPA、4-HB和BD0。在一个实施方案中，本发明提供能够从甲醇和气态原料如合成气的混合物生产异丙醇、4-羟基丁酸酯或1，4_ 丁二醇的非天然存在的微生物有机体。在其他实施方案中，本发明提供能够从合成气的混合物而无需甲醇生产异丙醇、4-羟基丁酸酯或1，4_ 丁二醇的非天然存在的微生物有机体。在另一个实施方案中，本发明提供通过培养这些非天然存在的微生物有机体生产异丙醇、4-羟基丁酸酯或1，4-丁二醇的方法。利用这些有机体的生物技术过程将会为异丙醇、4-羟基丁酸酯和1，4_ 丁二醇制造商提供操作灵活性，以保证基于多元化原料的最低运营成本和任选地抵消目前原料(如石油和天然气)的市场导向的商品价格波动。此外，这些过程将提供可持续的生产实践，利用再生原料、降低能源强度和降低温室气体的排放。诸如杨氏梭菌(Moorellathermoacelica, C. Iiungdahlii)和嗜羧酸梭菌 (C. carboxidivorans)等产乙酸菌可利用从己糖到一氧化碳的范围内的多种碳源生长。诸如葡萄糖等已糖首先经由Embden-Meyerhof-Parnas (EMP)糖酵解代谢为丙酮酸酯，然后经由丙酮酸酯铁氧还蛋白氧化还原酶(PFOR)转化为乙酰-CoA。乙酰-CoA可用于组建生物质前体或可转化为乙酸酯，其经由乙酸酯激酶和磷酸转乙酰酶产生能量。葡萄糖至乙酸、能量和还原当量的总体转化由方程式1给出C6H1206+4ADP+4Pi — 2CH3C00H+2C02+4ATP+8 [H]方程式 1产乙酸菌甚至从葡萄糖中提取更多的能量供应到乙酸酯转化，同时也通过经由 Wood-Ljungdahl途径将释放的(X)2转化为乙酸酯来维持氧化还原平衡。2C02+8 [H] +η ADP+n Pi — CH3C00H+n ATP 方程式 2以上方程式中的系数η表示这种转化是产生能量的过程，因为许多产乙酸菌可以在(X)2存在下经由Wood-Ljimgdahl途径生长，甚至在没有葡萄糖的情况下也可生长，只要存在氢以便供应必需的还原当量即可。2C02+4H2+n ADP+n Pi — CH3C00H+2H20+n ATP 方程式 3图1所说明的Wood-Ljimgdahl途径与Na+或H+离子梯度的产生相联系，所述离子梯度可分别经由Na+-或H+依赖性ATP合成酶产生ATP (Muller, V. Appl Environ Microbiol 69 :6345-6353(2003)).基于这些已知的转化，产乙酸菌也可具有利用CO作为唯一碳源和能源的能力。具体来说，CO可经氧化以产生还原当量和CO2，或可被直接同化成乙酰-CoA， 其随后转化为生物质或乙酸酯。4C0+2H20 — CH3C00H+2C02 方程式 4然而，当存在足够的氢以满足还原当量的需求时，甚至可获得更高的乙酸酯产率。
2C0+2H2 — CH3COOH 方程式 5根据图1，经由乙酰-CoA产生乙酸酯时会产生一个ATP分子，而从乙酰-CoA产生乙醇时则不会产生ATP分子且需要两个还原当量。因此可以预期，从合成气产生乙醇不会在无乙酸产生的情况下产生足够用于细胞生长的能量。然而，在某些条件下，杨氏梭菌(Clostridium liungdahlii)主要从合成气体产牛乙醇Oilasson等人，Fuel 72: 1673-1678 (199 )，表明以下途径的一些组合实际上不产生足以支持细胞生长的能量。2C02+6H2 — CH3CH20H+3H20 方程式 66C0+3H20 — CH3CH20H+4C02 方程式 72C0+4H2 — -CH3CH20H+H20 方程式 8诸如深红红螺菌(R. rubrum)等产氢细菌也可从CO和水转化为氢气的过程产生能量(参见图 1) (Simoma 等人，Critical Reviews in Biotechnology26 :41-65 (2006)) 一个重要的机制是能量转换氢化酶(ECH)和CO脱氢酶的协同作用。CO脱氢酶从CO供应电子，然后通过ECH用于将质子还原为H2,ECH的活性与产生能量的质子转移相联系。最终结果是经由水煤气变换反应产生能量。本发明的实施方案描述(1)用于将合成气连同和不连同甲醇转化为乙酰-CoA的途径与( 用于将乙酰-CoA转化为异丙醇、4-羟基丁酸酯或1，4_ 丁二醇的途径的组合。 因此，本发明提供生产有机体和转化途径，其与经工程改造以从碳水化合物原料产生异丙醇、4-羟基丁酸酯或1，4_ 丁二醇的有机体相比具有固有的产率优势。例如，使用本文所述的从乙酰-CoA开始进行的代谢途径，从葡萄糖产生异丙醇、4-羟基丁酸酯或1，4_ 丁二醇的最大理论产率是每摩尔葡萄糖得到1摩尔产物。具体而言，经由糖酵解每摩尔葡萄糖可产生2摩尔乙酰-CoA，且每摩尔异丙醇、4-羟基丁酸酯或1，4_ 丁二醇需要2摩尔乙酰-CoA。 通过以下化学计量方程式描述净转化异丙醇C6H1206+L502 — C3H80+3C02+2H204-羟基丁酸酯C6H1206+1. 502 — C4H803+2C02+2H201，4- 丁二醇C6H12O6 — C4H1002+CH202+C02另一方面，葡萄糖气化为其更简单的组分CO和H2,随后使用本文所述的途径转化为异丙醇、4-羟基丁酸酯和1，4_ 丁二醇，这会产生以下最大理论产率异丙醇60)+6 — 1. 333C3H80+2C02+0. 667H204-羟基丁酸酯6C0+6H2 — 1. 333C4H803+0. 667C02+0. 667H201,4- 丁二醇:6C0+6H2 — 1. 091C4H10O2+1. 636C02+0. 545H20应注意葡萄糖的气化最多可提供6摩尔CO和6摩尔H2。从合成气体产生异丙醇、 4-羟基丁酸酯和1，4- 丁二醇的最大理论产率可通过如下文所述添加甲醇而得到进一步提尚异丙醇CH40+6C0+6H2— 1. 667C3H80+2C02+1. 3 3 3H204-羟基丁酸酯CH40+6C0+6H2 — 1. 667C4H803+0. 333C02+1. 3 3 3H201,4- 丁二醇CH40+6C0+64 — 1. 364C4H1002+1. 545C02+1. 182H20异丙醇2CH40+6C0+6H2— 2C3H80+2C02+2H204-羟基丁酸酯2CH40+6C0+6H2 — 2C4Hg03+2H201,4- 丁二醇2CH40+6C0+64 — 1. 636C4H1002+1. 455C02+1. 818H20
因此，本文所述的有机体和转化途径显然可提供将碳水化合物转化为异丙醇、 4-羟基丁酸酯或1，4-丁二醇的有效方法。当关于本发明的微生物有机体或微生物使用时，如本文所用的术语“非天然存在” 意指微生物有机体具有在天然存在的所提及物种的菌株(包括所提及物种的野生型菌株) 中通常未发现的至少一处基因变异。基因变异包括例如引入可表达的编码代谢多肽的核酸的修饰、其他核酸添加、核酸缺失和/或微生物遗传物质的其他功能性破坏。所述修饰包括例如所提及物种的异源、同源或异源与同源多肽的编码区和其功能片段。其他修饰包括例如非编码调控区，其中修饰会改变基因或操纵子的表达。示例性代谢多肽包括异丙醇、4-羟基丁酸酯或1，4-丁二醇生物合成途径内的酶或蛋白。代谢修饰是指从天然存在的状态发生改变的生化反应。因此，非天然存在的微生物可具有对编码代谢多肽的核酸或其功能片段的基因修饰。本文公开了示例性代谢修饰。当关于微生物有机体使用时，如本文所用的术语“经分离的”意指有机体基本上不含在自然界中发现所提及的微生物有机体时所伴随的至少一种组分。所述术语包括移除自然环境中所伴随的部分或所有组分的微生物有机体。所述术语还包括移除非天然存在的环境中伴随微生物有机体的部分或所有组分的微生物有机体。因此，经分离的微生物有机体与在自然界中发现时或在非天然存在的环境中生长、储存或生存时与其他物质部分或完全分离。经分离的微生物有机体的具体例子包括部分纯的微生物、基本上纯的微生物和在非天然存在的培养基中培养的微生物。如本文所用的术语“微生物性”、“微生物有机体”或“微生物”意指以古菌域、细菌域或真核域内所包括的显微细胞形式存在的任何有机体。因此，所述术语意图涵盖具有显微尺寸的原核或真核细胞或有机体，且包括所有种类的细菌、古细菌和真细菌，以及真核微生物，例如酵母和真菌。所述术语还包括可经培养以用于产生生化物质的任何种类的细胞培养物。如本文所用的术语"CoA”或“辅酶A”意指有机辅因子或辅基(酶的非蛋白部分)，其存在对于许多酶(脱辅酶)形成活性酶系统的活性是必需的。辅酶A在某些缩合酶中、在乙酰基或其他酰基转移中、在脂肪酸合成和氧化、在丙酮酸酯氧化中和在其他乙酰化作用中发挥功能。当关于培养或生长条件使用时，如本文所用的术语“基本上厌氧的”意指液体培养基中的含氧量小于溶解氧饱和含量的约10%。所述术语还意图包括维持在小于约氧气的气氛下的液体或固体培养基的密封室。如本文所用的“外源”意指所提及的分子或所提及的活性被引入到宿主微生物有机体中。分子可例如通过将编码核酸引入到宿主遗传物质中而引入，例如通过编码核酸整合到宿主染色体中或编码核酸作为非染色体遗传物质(例如质粒)。因此，在关于编码核酸的表达使用时，所述术语是指将编码核酸以可表达形式引入到微生物有机体中。当关于生物合成活性使用时，所述术语是指活性被引入到宿主参考有机体中。来源可为例如同源或异源编码核酸，其在引入到宿主微生物有机体中之后表达所提及的活性。因此，术语“内源”是指所提及的分子或活性是存在于宿主中。类似地，当关于编码核酸的表达使用时，所述术语是指表达微生物有机体内所含的编码核酸。术语“异源”是指分子或活性是来源于除所提及的物种以外的来源，而“同源”是指分子或活性是来源于所述宿主微生物有机体。因此，本发明的编码核酸的外源表达可利用异源编码核酸或同源编码核酸或这两者。本发明的非天然存在的微生物有机体可含有稳定的基因变异，这是指微生物在培养超过5代后仍不会损失所述变异。一般来说，稳定的基因变异包括持续超过10代的修饰， 特别地，稳定的修饰将持续超过约25代，更特别地，稳定的基因修饰将持续超过50代，包括无限持续下去。本领域技术人员将了解，对基因变异(包括本文示例的代谢修饰)的描述是关于合适的宿主有机体(例如大肠杆菌)和其对应的代谢反应，或产生期望遗传物质(例如针对期望代谢途径的基因)的合适来源有机体。然而，鉴于多种有机体的完整基因组测序和基因组学领域中的高度技术水平，本领域技术人员能够容易地将本文提供的教导和指导应用于基本上所有其他有机体。例如，通过并入来自除所提及物种以外的物种的相同或类似的编码核酸，本文示例的大肠杆菌代谢变化可容易地应用于其他物种。所述基因变异一般包括例如种间同源物的基因变异，特别是直系同源物、旁系同源物或非直系同源基因置换。直系同源物是通过垂直家系产生关联且在不同有机体中负责基本上相同或一致的功能的基因。例如，小鼠环氧化物水解酶和人类环氧化物水解酶可被视为环氧化物水解的生物功能的直系同源物。例如，当基因共有足量的序列相似性以指示其是同源的时，所述基因通过垂直家系产生关联，或通过从共同祖先进化而产生关联。如果基因具有足量的三维结构相似性但未必具有足量的序列相似性，从而在无法鉴别到一级序列相似性的范围内表明其是进化自共同祖先，那么所述基因也可被视为直系同源物。直系同源的基因可编码序列相似性为氨基酸序列同一性的约25%到100%的蛋白。如果编码共有氨基酸相似性小于25%的蛋白的基因的三维结构也显示相似性，那么其也被视为是由垂直家系产生的。丝氨酸蛋白酶家族的成员(包括组织纤溶酶原激活物和弹性蛋白酶)被视为是通过垂直家系从共同祖先产生的。直系同源物包括经由例如进化而在结构或总体活性上趋异的基因或其编码的基因产物。例如，在一种物种编码展现两种功能的基因产物的情况下，以及在所述功能分离成第二物种中的不同基因的情况下，这三种基因和其对应产物被视为直系同源物。为了产生生物化学产物，本领域技术人员将了解，可对具有欲引入或破坏的代谢活性的直系同源基因进行选择，以便构建非天然存在的微生物。展现可分离活性的直系同源物的例子是不同活性已在两种或两种以上物种之间或在单一物种内被分离成不同基因产物。具体例子是弹性蛋白酶蛋白水解和纤溶酶原蛋白水解(两种类型的丝氨酸蛋白酶活性)被分离成作为纤溶酶原激活物和弹性蛋白酶的不同分子。另一例子是支原体5' -3'核酸外切酶和果蝇 DNA聚合酶III活性的分离。第一物种的DNA聚合酶可被视为第二物种的核酸外切酶或聚合酶中一者或两者的直系同源物，且反之亦然。相反，旁系同源物是通过例如复制和随后的进化趋异而产生关联且具有相似或共同、但不完全相同的功能的同源物。旁系同源物可来源于或衍生于例如相同物种或不同物种。例如，微粒体环氧化物水解酶(环氧化物水解酶I)和可溶性环氧化物水解酶(环氧化物水解酶II)可被视为旁系同源物，因为其代表两种共同进化自共同祖先的不同酶，催化不同反应且在相同物种中具有不同功能。旁系同源物是来自相同物种的彼此具有显著序列相似性的蛋白，表明其是同源的或通过共同进化自共同祖先而产生关联。旁系同源蛋白家族的分组包括HipA同源物、荧光素酶基因、肽酶等。
非直系同源基因置换是来自一个物种的非直系同源基因，可取代不同物种中的参考基因功能。取代包括例如能够在起源物种中执行与不同物种中的参考功能相比基本上相同或类似的功能。虽然一般来说，非直系同源基因置换可被鉴别为在结构上与编码参考功能的已知基因相关，但是结构相关性较小但功能类似的基因和其对应的基因产物在本文中使用时仍然处于所述术语的含义内。功能相似性需要例如非直系同源基因产物的活性位点或结合区域与编码设法取代的功能的基因相比具有至少一些结构相似性。因此，非直系同源基因包括例如旁系同源物或无关基因。因此，在鉴别和构建具有异丙醇、4-羟基丁酸酯或1，4_ 丁二醇生物合成能力的本发明的非天然存在的微生物有机体的过程中，本领域技术人员将了解，通过对特定物种应用本文提供的教导和指导，代谢修饰的鉴别可包括直系同源物的鉴别和纳入或失活。只要参考微生物中存在旁系同源物和/或非直系同源基因置换以用于编码催化类似或基本上类似的代谢反应的酶，那么本领域技术人员也可利用这些进化上相关的基因。直系同源物、旁系同源物和非直系同源基因置换可通过本领域技术人员熟知的方法来确定。例如，检查两种多肽的核酸或氨基酸序列将会揭示所比较序列之间的序列同一性和相似性。基于所述相似性，如果相似性足够高，那么本领域技术人员可确定蛋白是通过进化自共同祖先而产生关联。本领域技术人员熟知的算法(例如Align、BLAST、ClUStal W) 比较和确定粗略序列相似性或同一性，并且确定序列中可被指派权重或分数的空位的存在或显著性。所述算法在本领域中也是已知的，且类似地可用于确定核苷酸序列相似性或同一性。足以确定关联性的相似性的参数是基于用于计算统计相似性的熟知方法，或在随机多肽中发现类似匹配的概率和所确定匹配的显著性来计算得出。两种或两种以上序列的计算机比较在必要时也可由本领域技术人员目测优化。预期相关的基因产物或蛋白可具有高相似性，例如25%到100%序列同一性。如果扫描足够大小的数据库，那么无关的蛋白可具有与预期偶然发生的概率基本上相同的同一性(约5%)。5%- %之间的序列可能代表或可能不代表足以推断所比较序列是相关序列的同源性。可执行鉴于数据集的大小确定所述匹配的显著性的其他统计分析，以便确定这些序列的相关性。使用BLAST算法确定两种或两种以上序列的关联性的示例性参数例如可说明如下。简言之，氨基酸序列比对可使用2. 0.8版(1999年1月5日)BLASTP和以下参数来进行矩阵0 BL0SUM62 ；空位开放11 ；空位延伸1 ;x_扣分50 ；期望值10. 0 ；字长3 ；过滤器开。核酸序列比对可使用2. 0. 6版(1998年9月16日)BLASTN和以下参数来进行匹配1 ；错配-2 ；空位开放5 ；空位延伸2 ；x_扣分50 ；期望值10. 0 ；字长11 ；过滤器 关。本领域技术人员知悉，例如，为了增加或降低比较严格度并确定两种或两种以上序列的关联性，可对上述参数作哪些修改。大肠杆菌(Escherichia coli)是具有充分研究的一套基因工具的常用有机体。将合成气体转化为乙酰-CoA (重要代谢物，可由其获得细胞物质组分和许多有价值的产物) 的能力可被工程改造入外部宿主，例如大肠杆菌，其随后表达编码Wood-Ljungdahl途径的各种蛋白的外源基因。所述途径在例如热乙酸穆尔氏菌(Moorella thermoacetica)(以前称作热乙酸梭菌(Clostridium thermoaceticum))等产乙酸有机体中高度活跃，热乙酸穆尔氏菌早在1942年被分离出时就作为阐明Wood-Ljungdahl途径的模型有机体(Rmtaine 等人，J Bacteriol. 43 :701-715 (1942))。Wood-Ljungdahl 途径包含两个分支东部(或甲基)分支，其允许CO2转化为甲基四氢叶酸(Me-THF)；和西部(或羰基)分支，其允许甲基-THF、CO和辅酶A转化为乙酰-CoA (参见图2A)。在一些实施方案中，本发明提供一种非天然存在的微生物，其表达与MtaABC型甲基转移酶系统一起催化Wood-L jungdahl途径的羰基分支的酶的编码基因。所述有机体能将甲醇(一种可来源于合成气体的相对廉价的有机原料)和包含CO、CO2和/或吐的气体转化为乙酰_CoA、细胞物质和产物。在一些实施方案中，本发明的有机体具有图2B所示的以下能力1)功能甲基转移酶系统，能够从甲醇和THF生产5-甲基-四氢叶酸(Me-THF)J)将CO、辅酶A和Me-THF 的甲基组合而形成乙酰-CoA的能力，和3)从乙酰-CoA合成IPA的能力。在其他实施方案中，本发明的有机体具有功能甲基转移酶系统、合成乙酰-CoA的能力以及从乙酰-CoA合成 4-HB的能力，如图2C所示。本发明的其他有机体具有功能甲基转移酶系统、合成乙酰-CoA 的能力以及从乙酰-CoA合成BDO的能力，如图2D所示。在一些实施方案中，本发明的有机体能够‘固定’来自外源CO和/或(X)2和甲醇的碳，以合成乙酰-CoA、细胞物质和产物。合成气体直接转化为乙酸酯是能量中性过程(参见图1和2A)。具体而言，在通过甲酰基-THF合成酶形成甲酰基-THF的过程中消耗1个 ATP分子，而在经由乙酸酯激酶产生乙酸的过程中则产生1个ATP分子。通过确保从甲醇而不是CO2获得甲基分支产物甲基-THF上的甲基避免了 ATP消耗需求。这因此确保了乙酸酯形成具有正ATP产出，从而帮助支持细胞生长和维持。经工程改造而具有这些能力且天然也具有回补能力的宿主有机体(例如，大肠杆菌)可在合适的外部电子受体(例如硝酸盐)存在下，利用甲醇和合成气所产生的乙酰-CoA生长。这种电子受体用于接受来自于经由琥珀酸酯脱氢酶而形成的还原苯醌的电子。添加外部电子受体的一个优点在于可从乙酰-CoA的呼吸作用产生额外的能量用于细胞生长、维持和产物形成。在其他实施方案中， 可以将丙酮酸酯铁氧还蛋白氧化还原酶(PFOR)插到菌株中以允许在不存在外部电子受体的情况下合成生物质前体。本发明的有机体的另一特征是能够从分子氢提取还原当量的能力。这允许高产率的还原产物，例如乙醇、丁醇、异丁醇、异丙醇、1，4_ 丁二醇、琥珀酸、富马酸、苹果酸、4-羟基丁酸、3-羟基丙酸、乳酸、己二酸、3-羟基异丁酸、2-羟基异丁酸、甲基丙烯酸和丙烯酸。本发明的有机体可从以下来源产生乙酰-CoA、细胞物质和目标化学品，更具体而言IPA、4-HB或BDO :1)甲醇和C0，2)甲醇、CO2和H2, 3)甲醇、CO、CO2和H2,4)甲醇和包含 CO和H2的合成气体，和5)甲醇和包含CO、CO2和H2的合成气体。成功地将这种途径工程改造到有机体中会涉及鉴别适当的酶集合，将其对应基因克隆到生产宿主中，优化这些基因的稳定性和表达，优化发酵条件，和分析发酵后的产物形成。下文描述催化合成气体和甲醇转化为乙酰-CoA并进一步转化为异丙醇、4-羟基丁酸酯或1，4_ 丁二醇所必需的途径的每一步骤的多种酶。为了工程改造生产宿主以利用合成气和甲醇，在微生物中表达一种或多种编码酶的外源DNA序列。在一些实施方案中，本发明提供一种非天然存在的微生物有机体，其具有包含编码异丙醇途径酶的至少一种外源核酸的异丙醇途径，所述外源核酸足量表达以产生异丙醇。异丙醇途径酶包括乙酰乙酰-CoA硫解酶、乙酰乙酰-CoA:乙酸酯CoA转移酶、乙酰乙酸酯脱羧酶和异丙醇脱氢酶。本发明的额外异丙醇途径包括琥珀酰-CoA:3-酮酸-CoA转移酶(SCOT)、乙酰乙酸酯脱羧酶和异丙醇脱氢酶。
所述有机体还可包含例如以下的至少一种酶或多肽类咕啉蛋白、甲基四氢叶酸 类咕啉蛋白甲基转移酶、类咕啉铁硫蛋白、镍蛋白装配蛋白、铁氧还蛋白、乙酰-CoA合成酶、一氧化碳脱氢酶、丙酮酸酯铁氧还蛋白氧化还原酶和氢化酶。在一些实施方案中，具有异丙醇途径的有机体可包含甲醇甲基转移酶。在这种实施方案中，所述有机体利用例如以下的原料1)甲醇和C0，2)甲醇、0)2和氏，3)甲醇、CO、 CO2和H2,4)甲醇和包含CO和H2的合成气体，和5)甲醇和包含CO、CO2和H2的合成气体。在其他实施方案中，本发明的有机体具有甲酸酯脱氢酶、甲酰四氢叶酸合成酶、次甲基四氢叶酸环化水解酶、亚甲基四氢叶酸脱氢酶和亚甲基四氢叶酸还原酶。所述有机体利用选自以下的原料1) CO, 2) CO2和H2, 3) CO和CO2,4)包含CO和H2的合成气体，和5)包含CO、CO2和H2的合成气体。本发明还提供一种非天然存在的微生物有机体，其具有包含编码4-羟基丁酸酯途径酶的至少一种外源核酸的4-羟基丁酸酯途径，所述外源核酸足量表达以产生4-羟基丁酸酯。4-羟基丁酸酯途径酶包括乙酰乙酰-CoA硫解酶、3-羟基丁酰-CoA脱氢酶、巴豆酸酶、巴豆酰-CoA水合酶、4-羟基丁酰-CoA转移酶、磷酸转-4-羟基丁酰酶和4-羟基丁酸酯激酶。所述有机体还可包含例如以下的至少一种酶或多肽类咕啉蛋白、甲基四氢叶酸 类咕啉蛋白甲基转移酶、类咕啉铁硫蛋白、镍蛋白装配蛋白、铁氧还蛋白、乙酰-CoA合成酶、一氧化碳脱氢酶、丙酮酸酯铁氧还蛋白氧化还原酶和氢化酶。在一些实施方案中，具有4-羟基丁酸酯途径的有机体可包含甲醇甲基转移酶。所述有机体利用例如以下的原料1)甲醇和C0，2)甲醇、0)2和吐，3)甲醇、0)、0)2和!12，4)甲醇和包含CO和吐的合成气体，和5)甲醇和包含CO、CO2和吐的合成气体。具有4-羟基丁酸酯途径的其他有机体可具有甲酸酯脱氢酶、甲酰四氢叶酸合成酶、次甲基四氢叶酸环化水解酶、亚甲基四氢叶酸脱氢酶和亚甲基四氢叶酸还原酶。所述有机体利用例如以下的原料1) CO, 2) CO2和H2, 3) CO和C02，4)包含CO和H2的合成气体，和5) 包含CO、CO2和H2的合成气体。本发明还提供一种非天然存在的微生物有机体，其具有包含编码1，4_ 丁二醇途径酶的至少一种外源核酸的1，4- 丁二醇途径，所述外源核酸足量表达以产生1，4- 丁二醇。 1,4- 丁二醇途径酶包括例如乙酰乙酰-CoA硫解酶、3-羟基丁酰-CoA脱氢酶、巴豆酸酶、巴豆酰-CoA水合酶、4-羟基丁酰-CoA还原酶(醇形成型)、4_羟基丁酰-CoA还原酶(醛形成型)和1，4_ 丁二醇脱氢酶。所述有机体还可包含例如以下的至少一种酶或多肽类咕啉蛋白、甲基四氢叶酸 类咕啉蛋白甲基转移酶、类咕啉铁硫蛋白、镍蛋白装配蛋白、铁氧还蛋白、乙酰-CoA合成酶、一氧化碳脱氢酶、丙酮酸酯铁氧还蛋白氧化还原酶和氢化酶。在一些实施方案中，具有1，4_ 丁二醇途径的有机体可包含甲醇甲基转移酶。所述有机体利用例如以下的原料1)甲醇和C0，2)甲醇、(X)2和H2, 3)甲醇、CO、CO2和H2,4)甲醇和包含CO和吐的合成气体，和5)甲醇和包含CO、CO2和吐的合成气体。在其他实施方案中，具有1，4_ 丁二醇途径的有机体可包含甲酸酯脱氢酶、甲酰四氢叶酸合成酶、次甲基四氢叶酸环化水解酶、亚甲基四氢叶酸脱氢酶和亚甲基四氢叶酸还原酶。所述有机体利用选自以下的原料1) CO, 2) CO2和H2, 3) CO和CO2,4)包含CO和H2的合成气体，和幻包含CO、CO2和吐的合成气体。本发明还公开一种非天然存在的微生物有机体，其具有包含编码乙酰-CoA途径酶的至少一种外源核酸的乙酰-CoA途径，所述外源核酸足量表达以产生乙酰-CoA。乙酰-CoA途径酶包括甲醇甲基转移酶和乙酰-CoA合成酶。在另一个实施方案中，本发明提供一种非天然存在的微生物有机体，其具有包含编码异丙醇途径酶的至少一种外源核酸的异丙醇途径，所述外源核酸足量表达以产生异丙醇，所述异丙醇途径酶包括甲醇甲基转移酶、类咕啉蛋白、甲基四氢叶酸类咕啉蛋白甲基转移酶、类咕啉铁硫蛋白、镍蛋白装配蛋白、铁氧还蛋白、乙酰-CoA合成酶、一氧化碳脱氢酶、丙酮酸酯铁氧还蛋白氧化还原酶和氢化酶。在一些实施方案中，所述有机体可包含例如以下的外源多肽或酶乙酰乙酰-C0A 硫解酶、乙酰乙酰-CoA:乙酸酯CoA转移酶、乙酰乙酸酯脱羧酶和异丙醇脱氢酶。在其他实施方案中，所述有机体可包含例如以下的外源多肽或酶琥珀酰-CoA:3-酮酸-CoA转移酶(SCOT)、乙酰乙酸酯脱羧酶和异丙醇脱氢酶。经修饰的Wood-Ljungdahl途径在外来宿主中的表达(参见图2B)需要一组甲基转移酶以便利用由甲醇提供的碳和氢以及由CO和/或CO2提供的碳。3种甲基转移酶蛋白(表示为MtaA、MtaB和MtaC)的复合物发挥期望的甲醇甲基转移酶活性(Naidu 和 Ragsdale，T Bacteriol. 183 :3276-3281 (2001) ；Ragsdale, S. W.，Crit Rev. Biochem. Mol. Biol 39 :165-195(2004) Sauer 等人，Eur. T BioChem. 243 :670-677(1997) ；Tallant 和 Krzycki，TBacteriol. 178 :1295-1301(1996) ；Tallant 和 Krzycki，T Bacteriol. 179 6902-6911(1997) :Tallant 等人，J Biol Chem. 276 :4485_4493 (2OOl))。MtaB是一种锌蛋白，催化甲基从甲醇转移到MtaC(类咕啉蛋白)。可在产甲烷古细菌，例如巴氏甲烷八叠球菌(Methanosarcina barkeri) (Maeder等人，.丁 Bacteriol. 188 7922-7931 (2006))和嗜乙酸甲烧八叠球菌(Methanosarcina acetivorans) (Galagan 等人，基因组Res 12 :532-542(2002)),以及产乙酸菌热乙酸穆尔氏菌(Moorella thermoacetica) (Das 等人，Proteins 67 :167-176(2007))中发现编码 MtaB 和 MtaC 的示例性基因。一般来说，MtaB和MtaC基因在染色体上彼此相邻，因为其活性紧密地相互依赖。 巴氏甲烷八叠球菌、嗜乙酸甲烷八叠球菌和热乙酸穆尔氏菌中的各种MtaB和MtaC编码基因的蛋白序列可由以下GenBank登记号标识。表 1.
权利要求
1.一种非天然存在的微生物有机体，其包括具有异丙醇途径的微生物有机体，所述异丙醇途径包含编码异丙醇途径酶的至少一种外源核酸，所述外源核酸足量表达以产生异丙醇，所述异丙醇途径酶包括琥珀酰-CoA: 3-酮酸-CoA转移酶。
2.根据权利要求1所述的有机体，其中所述琥珀酰-CoA:3-酮酸-CoA转移酶由选自以下的一种或多种基因编码HPAG1_0676、HPAG1_0677、ScoA, ScoB, OXCTl 和 0XCT2。
3.根据权利要求1所述的有机体，还包含乙酰乙酰-CoA硫解酶、乙酰乙酸酯脱羧酶和异丙醇脱氢酶。
4.根据权利要求3所述的有机体，其中所述乙酰乙酰-CoA硫解酶由选自以下的基因编码atoB、thlA、thlB 禾口 erg 10。
5.根据权利要求3所述的有机体，其中所述乙酰乙酸酯脱羧酶由基因adc编码。
6.根据权利要求3所述的有机体，其中所述异丙醇脱氢酶由选自以下的基因编码adh 禾口 ipdho
7.根据权利要求1所述的有机体，还包含选自以下的至少一种酶或多肽类咕啉蛋白、 甲基四氢叶酸类咕啉蛋白甲基转移酶、类咕啉铁硫蛋白、镍蛋白装配蛋白、铁氧还蛋白、乙酰-CoA合成酶、一氧化碳脱氢酶、丙酮酸酯铁氧还蛋白氧化还原酶和氢化酶。
8.根据权利要求7所述的有机体，其中所述类咕啉蛋白由选自以下的基因编码mtaC、 mtaCl、mtaC2 禾口 mtaC30
9.根据权利要求7所述的有机体，其中所述甲基四氢叶酸类咕啉蛋白甲基转移酶由选自以下的基因编码mtaA、mtaAl和mtaA2。
10.根据权利要求7所述的有机体，其中所述甲基四氢叶酸类咕啉蛋白甲基转移酶由基因acsE编码。
11.根据权利要求7所述的有机体，其中所述类咕啉铁硫蛋白由基因acsD编码。
12.根据权利要求7所述的有机体，其中所述镍蛋白装配蛋白由选自以下的至少一种基因编码acsF禾口 cooC。
13.根据权利要求7所述的有机体，其中所述铁氧还蛋白由基因orf7编码。
14.根据权利要求7所述的有机体，其中所述乙酰-CoA合成酶由选自以下的至少一种基因编码acsB禾口 acsC。
15.根据权利要求7所述的有机体，其中所述一氧化碳脱氢酶由基因acsA编码。
16.根据权利要求7所述的有机体，其中所述丙酮酸酯铁氧还蛋白氧化还原酶由选自以下的基因编码por和ydbK。
17.根据权利要求7所述的有机体，其中所述氢化酶由选自以下的至少一种基因编码hypA、hypB、hypC、hypD、hypE、hypF、moth_2175、moth_2176、moth_2177、moth_2178、 moth_2179、moth_2180、moth_2181、hycA、hycB、hycC、hycD、hycE、hycF、hycG、hycH、hycl、 hyfA、hyfB、hyfC、hyfD、hyfE、hyfF、hyfG、hyfH、hyfl、hyfj、hyfR、moth_2182、moth_2183、 moth_2184、moth_2185、moth_2186、moth_2187、moth_2188、moth_2189、moth_2190、 moth_2191、moth_2192、moth_0439、moth_0440、moth_0441、moth_0442、moth_0809、 moth_0810、moth_0811、moth_0812、moth_0813、moth_0814、moth_0815、moth_0816、 moth_1193、moth_1194、moth_1195、moth_1196、moth_1717、moth_1718、moth_1719、 moth 1883、moth 1884、moth 1885、moth 1886、moth 1887、moth 1888、moth 1452、moth_1453 禾口 moth_1454。
18.根据权利要求7所述的有机体，还包含由基因acsEps编码的多肽AcsEps。
19.根据权利要求7所述的有机体，还包含由选自以下的基因编码的至少一种酶或多月太codh、codh-I、cooF、hypA、cooH、cooU、cooX、cooL、cooK、cooM、cooT、cooj 禾口 codh-IL·
20.根据权利要求7所述的有机体，还包含甲醇甲基转移酶。
21.根据权利要求20所述的有机体，其中所述甲醇甲基转移酶由选自以下的基因编码mtaB、mtaBl、mtaB2 禾口 mtaB3。
22.根据权利要求20所述的有机体，其中所述有机体利用选自以下的原料1)甲醇和 C0, 2)甲醇、CO2和H2, 3)甲醇、0)、0)2和!12，4)甲醇和包含CO和H2的合成气体，和5)甲醇和包含CO、CO2和吐的合成气体。
23.根据权利要求7所述的有机体，还包含甲酸酯脱氢酶、甲酰四氢叶酸合成酶、次甲基四氢叶酸环化水解酶、亚甲基四氢叶酸脱氢酶和亚甲基四氢叶酸还原酶。
24.根据权利要求23所述的有机体，其中所述甲酸酯脱氢酶由选自以下的基因编码moth_2312、moth_2313、moth_2314、sfum_2703、sfum_2704、sfum_2705、sfi ι m_2706、 chy_073Uchy_0732 和 chy_0733。
25.根据权利要求23所述的有机体，其中所述甲酰四氢叶酸合成酶由选自以下的基因编码moth_0109、chy_2385 禾口 fhs。
26.根据权利要求23所述的有机体，其中所述次甲基四氢叶酸环化水解酶由选自以下的基因编码moth_1516、folD 和 chy_1878。
27.根据权利要求23所述的有机体，其中所述亚甲基四氢叶酸脱氢酶由选自以下的基因编码moth_1516、folD 和 chy_1878。
28.根据权利要求23所述的有机体，其中所述亚甲基四氢叶酸还原酶由选自以下的基因编码moth_l 191、metF 和 chy_1233。
29.根据权利要求23所述的有机体，其中所述有机体利用选自以下的原料1)C0，2) CO2和H2, 3) CO和CO2,4)包含CO和H2的合成气体，和5)包含CO、CO2和H2的合成气体。
30.一种非天然存在的微生物有机体，其包括具有4-羟基丁酸酯途径的微生物有机体，所述4-羟基丁酸酯途径包含编码4-羟基丁酸酯途径酶的至少一种外源核酸，所述外源核酸足量表达以产生4-羟基丁酸酯，所述4-羟基丁酸酯途径酶包括乙酰乙酰-CoA硫解酶、3-羟基丁酰-CoA脱氢酶、巴豆酸酶、巴豆酰-CoA水合酶、4-羟基丁酰-CoA转移酶、磷酸转-4-羟基丁酰酶和4-羟基丁酸酯激酶。
31.根据权利要求30所述的有机体，其中所述乙酰乙酰-CoA硫解酶由选自以下的基因编码atoB、thlA、thlB 禾口 erg 10。
32.根据权利要求30所述的有机体，其中所述3-羟基丁酰-CoA脱氢酶由选自以下的基因编码hbd、msed_1423、msed_0399、msed_0389 禾口 msed_1933。
33.根据权利要求30所述的有机体，其中所述巴豆酸酶由选自以下的基因编码crt、 paaA、paaB、phaA、phaB、maoC、paaF 禾口 paaG。
34.根据权利要求30所述的有机体，其中所述巴豆酰-CoA水合酶由选自以下的基因编码abfD、msed_1321 禾口 msed_1220。
35.根据权利要求30所述的有机体，其中所述4-羟基丁酰-CoA转移酶由选自以下的基因编码cat2、abfT-2、abfT-1 和 abfT。
36.根据权利要求30所述的有机体，其中所述磷酸转-4-羟基丁酰酶由选自以下的基因编码:pta禾口 ptb。
37.根据权利要求30所述的有机体，其中所述4-羟基丁酸酯激酶由选自以下的基因编码ackA、bukl、buk2 禾口 proB。
38.根据权利要求30所述的有机体，还包含选自以下的至少一种酶或多肽类咕啉蛋白、甲基四氢叶酸类咕啉蛋白甲基转移酶、类咕啉铁硫蛋白、镍蛋白装配蛋白、铁氧还蛋白、乙酰-CoA合成酶、一氧化碳脱氢酶、丙酮酸酯铁氧还蛋白氧化还原酶和氢化酶。
39.根据权利要求38所述的有机体，其中所述类咕啉蛋白由选自以下的基因编码 mtaC、mtaCl、mtaC2 禾口 mtaC30
40.根据权利要求38所述的有机体，其中所述甲基四氢叶酸类咕啉蛋白甲基转移酶由选自以下的基因编码mtaA、mtaAl和mtaA2。
41.根据权利要求38所述的有机体，其中所述甲基四氢叶酸类咕啉蛋白甲基转移酶由基因acsE编码。
42.根据权利要求38所述的有机体，其中所述类咕啉铁硫蛋白由基因acsD编码。
43.根据权利要求38所述的有机体，其中所述镍蛋白装配蛋白由选自以下的至少一种基因编码acsF禾口 cooC。
44.根据权利要求38所述的有机体，其中所述铁氧还蛋白由基因orf7编码。
45.根据权利要求38所述的有机体，其中所述乙酰-CoA合成酶由选自以下的至少一种基因编码acsB禾口 acsC。
46.根据权利要求38所述的有机体，其中所述一氧化碳脱氢酶由基因acsA编码。
47.根据权利要求38所述的有机体，其中所述丙酮酸酯铁氧还蛋白氧化还原酶由选自以下的基因编码por和ydbK。
48.根据权利要求38所述的有机体，其中所述氢化酶由选自以下的至少一种基因编码hypA、hypB、hypC、hypD、hypE、hypF、moth_2175、moth_2176、moth_2177、moth_2178、 moth_2179、moth_2180、moth_2181、hycA、hycB、hycC、hycD、hycE、hycF、hycG、hycH、hycl、 hyfa、hyfB、hyfC、hyfD、hyfE、hyfF、hyfG、hyfH、hyfl、hyfj、hyfR、moth_2182、moth_2183、 moth_2184、moth_2185、moth_2186、moth_2187、moth_2188、moth_2189、moth_2190、 moth_2191、moth_2192、moth_0439、moth_0440、moth_0441、moth_0442、moth_0809、 moth_0810、moth_0811、moth_0812、moth_0813、moth_0814、moth_0815、moth_0816、 moth_1193、moth_1194、moth_1195、moth_1196、moth_1717、moth_1718、moth_1719、 moth_1883、moth_1884、moth_1885、moth_1886、moth_1887、moth_1888、moth_1452、 moth_1453 禾口 moth_1454。
49.根据权利要求38所述的有机体，还包含由基因acsEps编码的多肽AcsEps。
50.根据权利要求38所述的有机体，还包含由选自以下的基因编码的至少一种酶或多月太codh、codh-I、cooF、hypA、cooH、cooU、cooX、cooL、cooK、cooM、cooT、cooj 禾口 codh-IL·
51.根据权利要求38所述的有机体，还包含甲醇甲基转移酶。
52.根据权利要求51所述的有机体，其中所述甲醇甲基转移酶由选自以下的基因编码mtaB、mtaBl、mtaB2 禾口 mtaB3。
53.根据权利要求51所述的有机体，其中所述有机体利用选自以下的原料1)甲醇和 CO, 2)甲醇、CO2和H2, 3)甲醇、0)、0)2和!12，4)甲醇和包含CO和H2的合成气体，和5)甲醇和包含CO、CO2和吐的合成气体。
54.根据权利要求38所述的有机体，还包含甲酸酯脱氢酶、甲酰四氢叶酸合成酶、次甲基四氢叶酸环化水解酶、亚甲基四氢叶酸脱氢酶和亚甲基四氢叶酸还原酶。
55.根据权利要求M所述的有机体，其中所述甲酸酯脱氢酶由选自以下的基因编码moth_2312、moth_2313、moth_2314、sfum_2703、sfum_2704、sfum_2705、sfi ι m_2706、 chy_073U chy_0732 和 chy_0733。
56.根据权利要求M所述的有机体，其中所述甲酰四氢叶酸合成酶由选自以下的基因编码moth_0109、chy_2385 禾口 fhs。
57.根据权利要求M所述的有机体，其中所述次甲基四氢叶酸环化水解酶由选自以下的基因编码moth_1516、folD 和 chy_1878。
58.根据权利要求M所述的有机体，其中所述亚甲基四氢叶酸脱氢酶由选自以下的基因编码moth_1516、folD 和 chy_1878。
59.根据权利要求M所述的有机体，其中所述亚甲基四氢叶酸还原酶由选自以下的基因编码moth_l 191、metF 和 chy_1233。
60.根据权利要求M所述的有机体，其中所述有机体利用选自以下的原料1)C0，2) CO2和H2, 3) CO和CO2,4)包含CO和H2的合成气体，和5)包含CO、CO2和H2的合成气体。
61.一种非天然存在的微生物有机体，其包括具有1，4_ 丁二醇途径的微生物有机体， 所述1，4_ 丁二醇途径包括编码1，4_ 丁二醇途径酶的至少一种外源核酸，所述外源核酸足量表达以产生1，4_ 丁二醇，所述1，4_ 丁二醇途径酶包括乙酰乙酰-CoA硫解酶、3-羟基丁酰-CoA脱氢酶、巴豆酸酶、巴豆酰-CoA水合酶、4-羟基丁酰-CoA还原酶(醇形成型)、 4-羟基丁酰-CoA还原酶(醛形成型)和1，4-丁二醇脱氢酶；所述有机体还包含具有编码乙酰-CoA途径酶的至少一种外源核酸的乙酰-CoA途径，所述外源核酸足量表达以产生乙酰-CoA，所述乙酰-CoA途径酶包括类咕啉蛋白、甲基四氢叶酸类咕啉蛋白甲基转移酶、类咕啉铁硫蛋白、镍蛋白装配蛋白、铁氧还蛋白、乙酰-CoA合成酶、一氧化碳脱氢酶、丙酮酸酯铁氧还蛋白氧化还原酶和氢化酶。
62.根据权利要求61所述的有机体，其中所述乙酰乙酰-CoA硫解酶由选自以下的基因编码atoB、thlA、thlB 禾口 erg 10。
63.根据权利要求61所述的有机体，其中所述3-羟基丁酰-CoA脱氢酶由选自以下的基因编码hbd、msed_1423、msed_0399、msed_0389 禾口 msed_1933。
64.根据权利要求61所述的有机体，其中所述巴豆酸酶由选自以下的基因编码crt、 paaA、paaB、phaA、phaB、maoC、paaF 禾口 paaG。
65.根据权利要求61所述的有机体，其中所述巴豆酰-CoA水合酶由选自以下的基因编码abfD、msed_1321 禾口 msed_1220。
66.根据权利要求61所述的有机体，其中所述4-羟基丁酰-CoA还原酶(醇形成型) 由选自以下的基因编码adhE、adhE2、mcr、rcas_2929、napl_02720 和 mgp2080_005;35。
67.根据权利要求61所述的有机体，其中所述4-羟基丁酰-CoA还原酶(醛形成型) 由选自以下的基因编码acrl、sucD、bphG、msed_0709、mcr、asd-2 禾口 saci_2370。
68.根据权利要求61所述的有机体，其中所述1，4_丁二醇脱氢酶由选自以下的基因编 5 :alrA,adh2,yqhD,bdh I、bdh II 禾口 4hbd。
69.根据权利要求61所述的有机体，其中所述类咕啉蛋白由选自以下的基因编码 mtaC、mtaCl、mtaC2 禾口 mtaC30
70.根据权利要求61所述的有机体，其中所述甲基四氢叶酸类咕啉蛋白甲基转移酶由选自以下的基因编码mtaA、mtaAl和mtaA2。
71.根据权利要求61所述的有机体，其中所述甲基四氢叶酸类咕啉蛋白甲基转移酶由基因acsE编码。
72.根据权利要求61所述的有机体，其中所述类咕啉铁硫蛋白由基因acsD编码。
73.根据权利要求61所述的有机体，其中所述镍蛋白装配蛋白由选自以下的至少一种基因编码acsF禾口 cooC。
74.根据权利要求61所述的有机体，其中所述铁氧还蛋白由基因编码orf7.
75.根据权利要求61所述的有机体，其中所述乙酰-CoA合成酶由选自以下的至少一种基因编码acsB禾口 acsC。
76.根据权利要求61所述的有机体，其中所述一氧化碳脱氢酶由基因acsA编码。
77.根据权利要求61所述的有机体，其中所述丙酮酸酯铁氧还蛋白氧化还原酶由选自以下的基因编码por和ydbK。
78.根据权利要求61所述的有机体，其中所述氢化酶由选自以下的至少一种基因编码hypA、hypB、hypC、hypD、hypE、hypF、moth_2175、moth_2176、moth_2177、moth_2178、 moth_2179、moth_2180、moth_2181、hycA、hycB、hycC、hycD、hycE、hycF、hycG、hycH、hycl、 hyfA、hyfB、hyfC、hyfD、hyfE、hyfF、hyfG、hyfH、hyfl、hyfj、hyfR、moth_2182、moth_2183、 moth_2184、moth_2185、moth_2186、moth_2187、moth_2188、moth_2189、moth_2190、 moth_2191、moth_2192、moth_0439、moth_0440、moth_0441、moth_0442、moth_0809、 moth_0810、moth_0811、moth_0812、moth_0813、moth_0814、moth_0815、moth_0816、 moth_1193、moth_1194、moth_1195、moth_1196、moth_1717、moth_1718、moth_1719、 moth_1883、moth_1884、moth_1885、moth_1886、moth_1887、moth_1888、moth_1452、 moth_1453 禾口 moth_1454。
79.根据权利要求61所述的有机体，还包含由基因acsEps编码的多肽AcsEps。
80.根据权利要求61所述的有机体，还包含由选自以下的基因编码的至少一种酶或多月太codh、codh-I、cooF、hypA、cooH、cooU、cooX、cooL、cooK、cooM、cooT、cooj 禾口 codh-IL·
81.根据权利要求61所述的有机体，还包含甲醇甲基转移酶。
82.根据权利要求81所述的有机体，其中所述甲醇甲基转移酶由选自以下的基因编码mtaB、mtaBl、mtaB2 禾口 mtaB3。
83.根据权利要求81所述的有机体，其中所述有机体利用选自以下的原料1)甲醇和 C0, 2)甲醇、CO2和H2, 3)甲醇、0)、0)2和!12，4)甲醇和包含CO和H2的合成气体，和5)甲醇和包含CO、CO2和吐的合成气体。
84.一种非天然存在的微生物有机体，其包括具有1，4_ 丁二醇途径的微生物有机体， 所述1，4_ 丁二醇途径包括编码1，4_ 丁二醇途径酶的至少一种外源核酸，所述外源核酸足量表达以产生1，4_ 丁二醇，所述1，4_ 丁二醇途径酶包括乙酰乙酰-CoA硫解酶、3-羟基丁酰-CoA脱氢酶、巴豆酸酶、巴豆酰-CoA水合酶、4-羟基丁酰-CoA还原酶(醇形成型)、 4-羟基丁酰-CoA还原酶(醛形成型)和1，4-丁二醇脱氢酶；所述有机体还包含具有编码乙酰-CoA途径酶的至少一种外源核酸的乙酰-CoA途径，所述外源核酸足量表达以产生乙酰-CoA，所述乙酰-CoA途径酶包括乙酰-CoA合成酶、甲酸酯脱氢酶、甲酰四氢叶酸合成酶、 次甲基四氢叶酸环化水解酶、亚甲基四氢叶酸脱氢酶和亚甲基四氢叶酸还原酶。
85.根据权利要求84所述的有机体，其中所述甲酸酯脱氢酶由选自以下的基因编码moth_2312、moth_2313、moth_2314、sfum_2703、sfum_2704、sfum_2705、sfi ι m_2706、 chy_073U chy_0732 和 chy_0733。
86.根据权利要求84所述的有机体，其中所述甲酰四氢叶酸合成酶由选自以下的基因编码moth_0109、chy_2385 禾口 fhs。
87.根据权利要求84所述的有机体，其中所述次甲基四氢叶酸环化水解酶由选自以下的基因编码moth_1516、folD 和 chy_1878。
88.根据权利要求84所述的有机体，其中所述亚甲基四氢叶酸脱氢酶由选自以下的基因编码moth_1516、folD 和 chy_1878。
89.根据权利要求84所述的有机体，其中所述亚甲基四氢叶酸还原酶由选自以下的基因编码moth_l 191、metF 和 chy_1233。
90.根据权利要求84所述的有机体，其中所述有机体利用选自以下的原料1)C0，2) CO2和H2, 3) CO和CO2,4)包含CO和H2的合成气体，和5)包含CO、CO2和H2的合成气体。
91.一种非天然存在的微生物有机体，其包括具有异丙醇途径的微生物有机体，所述异丙醇途径包括编码异丙醇途径酶的至少一种外源核酸，所述外源核酸足量表达以产生异丙醇，所述异丙醇途径酶包括乙酰乙酰-CoA硫解酶、乙酰乙酰-CoA:乙酸酯CoA转移酶、乙酰乙酸酯脱羧酶和异丙醇脱氢酶；所述有机体还包含编码乙酰-CoA酶的至少一种外源核酸，所述外源核酸足量表达以产生乙酰-CoA，所述乙酰-CoA途径酶包括甲醇甲基转移酶、 类咕啉蛋白、甲基四氢叶酸类咕啉蛋白甲基转移酶、类咕啉铁硫蛋白、镍蛋白装配蛋白、 铁氧还蛋白、乙酰-CoA合成酶、一氧化碳脱氢酶、丙酮酸酯铁氧还蛋白氧化还原酶和氢化酶。
92.根据权利要求91所述的有机体，其中所述乙酰乙酰-CoA:乙酸酯CoA转移酶由选自以下的基因编码atoA、atoD、ctfA和ctfB。
93.一种非天然存在的微生物有机体，其包括具有异丙醇途径的微生物有机体，所述异丙醇途径包括编码异丙醇途径酶的至少一种外源核酸，所述外源核酸足量表达以产生异丙醇，所述异丙醇途径酶包括乙酰乙酰-CoA硫解酶、乙酰乙酰-CoA:乙酸酯CoA转移酶、乙酰乙酸酯脱羧酶和异丙醇脱氢酶；所述有机体还包含编码乙酰-CoA酶的至少一种外源核酸，所述外源核酸足量表达以产生乙酰-CoA，所述乙酰-CoA途径酶包括乙酰-CoA合成酶、 甲酸酯脱氢酶、甲酰四氢叶酸合成酶、次甲基四氢叶酸环化水解酶、亚甲基四氢叶酸脱氢酶和亚甲基四氢叶酸还原酶。
94.根据权利要求93所述的有机体，其中所述乙酰乙酰-CoA:乙酸酯CoA转移酶由选自以下的基因编码atoA、atoD、ctfA和ctfB。
95.一种产生异丙醇的方法，其包括培养具有异丙醇途径的非天然存在的微生物有机体，所述途径包含编码异丙醇途径酶的至少一种外源核酸，所述外源核酸在用于产生异丙醇的条件和足够时间下足量表达以产生异丙醇，所述异丙醇途径包括琥珀酰-CoA:3-酮酸-CoA转移酶。
96.根据权利要求95所述的方法，其中所述琥珀酰-CoA:3-酮酸-CoA转移酶由选自以下的一种或多种基因编码HPAG1_0676、HPAG1_0677、ScoA, ScoB, OXCTl 和 0XCT2。
97.根据权利要求95所述的方法，还包括乙酰乙酰-CoA硫解酶、乙酰乙酸酯脱羧酶和异丙醇脱氢酶。
98.根据权利要求95所述的方法，其中所述乙酰乙酰-CoA硫解酶由选自以下的基因编码atoB、thlA、thlB 禾口 erg 10。
99.根据权利要求95所述的方法，其中所述乙酰乙酸酯脱羧酶由基因adc编码。
100.根据权利要求95所述的方法，其中所述异丙醇脱氢酶由选自以下的基因编码 adh 禾口 ipdho
101.根据权利要求95所述的方法，其中所述有机体还包含选自以下的至少一种酶或多肽类咕啉蛋白、甲基四氢叶酸类咕啉蛋白甲基转移酶、类咕啉铁硫蛋白、镍蛋白装配蛋白、铁氧还蛋白、乙酰-CoA合成酶、一氧化碳脱氢酶、丙酮酸酯铁氧还蛋白氧化还原酶和氢化酶。
102.根据权利要求101所述的方法，其中所述类咕啉蛋白由选自以下的基因编码 mtaC、mtaCl、mtaC2 禾口 mtaC30
103.根据权利要求101所述的方法，其中所述甲基四氢叶酸类咕啉蛋白甲基转移酶由选自以下的基因编码mtaA、mtaAl和mtaA2。
104.根据权利要求101所述的方法，其中所述甲基四氢叶酸类咕啉蛋白甲基转移酶由基因acsE编码。
105.根据权利要求101所述的方法，其中所述类咕啉铁硫蛋白由基因acsD编码。
106.根据权利要求101所述的方法，其中所述镍蛋白装配蛋白由选自以下的至少一种基因编码acsF禾口 cooC。
107.根据权利要求101所述的方法，其中所述铁氧还蛋白由基因orf7编码。
108.根据权利要求101所述的方法，其中所述乙酰-CoA合成酶由选自以下的至少一种基因编码acsB禾口 acsC。
109.根据权利要求101所述的方法，其中所述一氧化碳脱氢酶由基因acsA编码。
110.根据权利要求101所述的方法，其中所述丙酮酸酯铁氧还蛋白氧化还原酶由选自以下的基因编码por和ydbK。
111.根据权利要求101所述的方法，其中所述氢化酶由选自以下的至少一种基因编码hypA、hypB、hypC、hypD、hypE、hypF、moth_2175、moth_2176、moth_2177、moth_2178、 moth_2179> moth_2180> moth_2181 > hycA、hycB、hycC、hycD、hycE、hycF、hycG、hycH、hycl、 hyfA、hyfB、hyfC、hyfD、hyfE、hyfF、hyfG、hyfH、hyfl、hyfj、hyfR、moth_2182、moth_2183、 moth_2184、moth_2185、moth_2186、moth_2187、moth_2188、moth_2189、moth_2190、 moth_2191、moth_2192、moth_0439、moth_0440、moth_0441、moth_0442、moth_0809、 moth_0810、moth_0811、moth_0812、moth_0813、moth_0814、moth_0815、moth_0816、 moth_1193、moth_1194、moth_1195、moth_1196、moth_1717、moth_1718、moth_1719、 moth 1883、moth 1884、moth 1885、moth 1886、moth 1887、moth 1888、moth 1452、moth_1453 禾口 moth_1454。
112.根据权利要求101所述的方法，还包括由基因acsEps编码的多肽AcsEps。
113.根据权利要求101所述的方法，还包括由选自以下的基因编码的至少一种酶或多月太codh、codh-I、cooF、hypA、cooH、cooU、cooX、cooL、cooK、cooM、cooT、cooj 禾口 codh-IL·
114.根据权利要求101所述的方法，还包括甲醇甲基转移酶。
115.根据权利要求114所述的方法，其中所述甲醇甲基转移酶由选自以下的基因编码mtaB、mtaBl、mtaB2 禾口 mtaB3。
116.根据权利要求114所述的方法，其中所述有机体利用选自以下的原料1)甲醇和 C0, 2)甲醇、CO2和H2, 3)甲醇、0)、0)2和!12，4)甲醇和包含CO和H2的合成气体，和5)甲醇和包含CO、CO2和吐的合成气体。
117.根据权利要求101所述的方法，其中所述有机体还包含甲酸酯脱氢酶、甲酰四氢叶酸合成酶、次甲基四氢叶酸环化水解酶、亚甲基四氢叶酸脱氢酶和亚甲基四氢叶酸还原酶。
118.根据权利要求117所述的方法，其中所述甲酸酯脱氢酶由选自以下的基因编码moth_2312、moth_2313、moth_2314、sfum_2703、sfum_2704、sfum_2705、sfi ι m_2706、 chy_073U chy_0732 和 chy_0733。
119.根据权利要求117所述的方法，其中所述甲酰四氢叶酸合成酶由选自以下的基因编码moth_0109、chy_2385 禾口 fhs。
120.根据权利要求117所述的方法，其中所述次甲基四氢叶酸环化水解酶由选自以下的基因编码moth_1516、folD 和 chy_1878。
121.根据权利要求117所述的方法，其中所述亚甲基四氢叶酸脱氢酶由选自以下的基因编码moth_1516、folD 和 chy_1878。
122.根据权利要求117所述的方法，其中所述亚甲基四氢叶酸还原酶由选自以下的基因编码moth_l 191、metF 和 chy_1233。
123.根据权利要求117所述的方法，其中所述有机体利用选自以下的原料1)C0，2) CO2和H2, 3) CO和CO2,4)包含CO和H2的合成气体，和5)包含CO、CO2和H2的合成气体。
124.—种产生4-羟基丁酸酯的方法，其包括培养具有4-羟基丁酸酯途径的非天然存在的微生物有机体，所述途径包含编码4-羟基丁酸酯途径酶的至少一种外源核酸，所述外源核酸在用于产生4-羟基丁酸酯的条件和足够时间下足量表达以产生4-羟基丁酸酯，所述4-羟基丁酸酯途径包括乙酰乙酰-CoA硫解酶、3-羟基丁酰-CoA脱氢酶、巴豆酸酶、巴豆酰-CoA水合酶、4-羟基丁酰-CoA转移酶、磷酸转-4-羟基丁酰酶和4-羟基丁酸酯激酶。
125.根据权利要求124所述的方法，其中所述乙酰乙酰-CoA硫解酶由选自以下的基因编码atoB、thlA、thlB 禾口 erg 10。
126.根据权利要求IM所述的方法，其中所述3-羟基丁酰-CoA脱氢酶由选自以下的基因编码hbd、msed_1423、msed_0399、msed_0389 禾口 msed_1933。
127.根据权利要求IM所述的方法，其中所述巴豆酸酶由选自以下的基因编码crt、 paaA、paaB、phaA、phaB、maoC、paaF 禾口 paaG。
128.根据权利要求1 所述的方法，其中所述巴豆酰-CoA水合酶由选自以下的基因编码abfD、msed_1321 禾口 msed_1220。
129.根据权利要求IM所述的方法，其中所述4-羟基丁酰-CoA转移酶由选自以下的基因编码cat2、abfT-2、abfT-1 和 abfT。
130.根据权利要求1 所述的方法，其中所述磷酸转-4-羟基丁酰酶由选自以下的基因编码:pta禾口 ptb。
131.根据权利要求IM所述的方法，其中所述4-羟基丁酸酯激酶由选自以下的基因编码ackA、bukl、buk2 禾口 proB。
132.根据权利要求IM所述的方法，其中所述有机体还包含选自以下的至少一种酶或多肽类咕啉蛋白、甲基四氢叶酸类咕啉蛋白甲基转移酶、类咕啉铁硫蛋白、镍蛋白装配蛋白、铁氧还蛋白、乙酰-CoA合成酶、一氧化碳脱氢酶、丙酮酸酯铁氧还蛋白氧化还原酶和氢化酶。
133.根据权利要求132所述的方法，其中所述类咕啉蛋白由选自以下的基因编码 mtaC、mtaCl、mtaC2 禾口 mtaC3 0
134.根据权利要求132所述的方法，其中所述甲基四氢叶酸类咕啉蛋白甲基转移酶由选自以下的基因编码mtaA、mtaAl和mtaA2。
135.根据权利要求132所述的方法，其中所述甲基四氢叶酸类咕啉蛋白甲基转移酶由基因acsE编码。
136.根据权利要求132所述的方法，其中所述类咕啉铁硫蛋白由基因acsD编码。
137.根据权利要求132所述的方法，其中所述镍蛋白装配蛋白由选自以下的至少一种基因编码acsF禾口 cooC。
138.根据权利要求132所述的方法，其中所述铁氧还蛋白由基因orf7编码。
139.根据权利要求132所述的方法，其中所述乙酰-CoA合成酶由选自以下的至少一种基因编码acsB禾口 acsC。
140.根据权利要求132所述的方法，其中所述一氧化碳脱氢酶由基因acsA编码。
141.根据权利要求132所述的方法，其中所述丙酮酸酯铁氧还蛋白氧化还原酶由选自以下的基因编码por和ydbK。
142.根据权利要求132所述的方法，其中所述氢化酶由选自以下的至少一种基因编码hypA、hypB、hypC、hypD、hypE、hypF、moth_2175、moth_2176、moth_2177、moth_2178、 moth_2179> moth_2180> moth_2181 > hycA、hycB、hycC、hycD、hycE、hycF、hycG、hycH、hycl、 hyfA、hyfB、hyfC、hyfD、hyfE、hyfF、hyfG、hyfH、hyfl、hyfj、hyfR、moth_2182、moth_2183、 moth_2184、moth_2185、moth_2186、moth_2187、moth_2188、moth_2189、moth_2190、 moth_2191、moth_2192、moth_0439、moth_0440、moth_0441、moth_0442、moth_0809、 moth_0810、moth_0811、moth_0812、moth_0813、moth_0814、moth_0815、moth_0816、 moth_1193、moth_1194、moth_1195、moth_1196、moth_1717、moth_1718、moth_1719、 moth_1883、moth_1884、moth_1885、moth_1886、moth_1887、moth_1888、moth_1452、 moth_1453 禾口 moth_1454。
143.根据权利要求132所述的方法，还包括由基因acsEps编码的多肽AcsEps。
144.根据权利要求132所述的方法，还包括由选自以下的基因编码的至少一种酶或多月太codh、codh-I、cooF、hypA、cooH、cooU、cooX、cooL、cooK、cooM、cooT、cooj 禾口 codh-IL·
145.根据权利要求132所述的方法，还包括甲醇甲基转移酶。
146.根据权利要求145所述的方法，其中所述甲醇甲基转移酶由选自以下的基因编码mtaB、mtaBl、mtaB2 禾口 mtaB3。
147.根据权利要求145所述的方法，其中所述有机体利用选自以下的原料1)甲醇和 CO, 2)甲醇、CO2和H2, 3)甲醇、0)、0)2和!12，4)甲醇和包含CO和H2的合成气体，和5)甲醇和包含CO、CO2和吐的合成气体。
148.根据权利要求132所述的方法，其中所述有机体还包含甲酸酯脱氢酶、甲酰四氢叶酸合成酶、次甲基四氢叶酸环化水解酶、亚甲基四氢叶酸脱氢酶和亚甲基四氢叶酸还原酶。
149.根据权利要求148所述的方法，其中所述甲酸酯脱氢酶由选自以下的基因编码moth_2312、moth_2313、moth_2314、sfum_2703、sfum_2704、sfum_2705、sfi ι m_2706、 chy_073U chy_0732 和 chy_0733。
150.根据权利要求148所述的方法，其中所述甲酰四氢叶酸合成酶由选自以下的基因编码moth_0109、chy_2385 禾口 fhs。
151.根据权利要求148所述的方法，其中所述次甲基四氢叶酸环化水解酶由选自以下的基因编码moth_1516、folD 和 chy_1878。
152.根据权利要求148所述的方法，其中所述亚甲基四氢叶酸脱氢酶由选自以下的基因编码moth_1516、folD 和 chy_1878。
153.根据权利要求148所述的方法，其中所述亚甲基四氢叶酸还原酶由选自以下的基因编码moth_l 191、metF 和 chy_1233。
154.根据权利要求148所述的方法，其中所述有机体利用选自以下的原料1)C0，2) CO2和H2, 3) CO和CO2,4)包含CO和H2的合成气体，和5)包含CO、CO2和H2的合成气体。
155.—种产生1，4_ 丁二醇的方法，其包括培养具有1，4_ 丁二醇途径的非天然存在的微生物有机体，所述途径包含编码1，4_ 丁二醇途径酶的至少一种外源核酸，所述外源核酸在用于产生1，4-丁二醇的条件和足够时间下足量表达以产生1，4-丁二醇，所述1，4-丁二醇途径包括乙酰乙酰-CoA硫解酶、3-羟基丁酰-CoA脱氢酶、巴豆酸酶、巴豆酰-CoA水合酶、4-羟基丁酰-CoA还原酶(醇形成型)、4-羟基丁酰-CoA还原酶(醛形成型)、1，4- 丁二醇脱氢酶；所述有机体还包含具有编码乙酰-CoA途径酶的至少一种外源核酸的乙酰-CoA 途径，所述外源核酸足量表达以产生乙酰-CoA，所述乙酰-CoA途径酶包括类咕啉蛋白、甲基四氢叶酸类咕啉蛋白甲基转移酶、类咕啉铁硫蛋白、镍蛋白装配蛋白、铁氧还蛋白、乙酰-CoA合成酶、一氧化碳脱氢酶、丙酮酸酯铁氧还蛋白氧化还原酶和氢化酶。
156.根据权利要求155所述的方法，其中所述乙酰乙酰-CoA硫解酶由选自以下的基因编码atoB、thlA、thlB 禾口 erg 10。
157.根据权利要求155所述的方法，其中所述3-羟基丁酰-CoA脱氢酶由选自以下的基因编码hbd、msed_1423、msed_0399、msed_0389 禾口 msed_1933。
158.根据权利要求155所述的方法，其中所述巴豆酸酶由选自以下的基因编码crt、 paaA、paaB、phaA、phaB、maoC、paaF 禾口 paaG。
159.根据权利要求155所述的方法，其中所述巴豆酰-CoA水合酶由选自以下的基因编码abfD、msed_1321 禾口 msed_1220。
160.根据权利要求155所述的方法，其中所述4-羟基丁酰-CoA还原酶(醇形成型)由选自以下的基因编码adhE、adhE2、mcr、rcas_2929、napl_02720 和 mgp2080_005;35。
161.根据权利要求155所述的方法，其中所述4-羟基丁酰-CoA还原酶(醛形成型) 由选自以下的基因编码acrl、sucD、bphG、msed_0709、mcr、asd-2 禾口 saci_2370。
162.根据权利要求155所述的方法，其中所述1，4-丁二醇脱氢酶由选自以下的基因编 5 :alrA,adh2,yqhD,bdh I、bdh II 禾口 4hbd。
163.根据权利要求155所述的方法，其中所述类咕啉蛋白由选自以下的基因编码 mtaC、mtaCl、mtaC2 禾口 mtaC3 0
164.根据权利要求155所述的方法，其中所述甲基四氢叶酸类咕啉蛋白甲基转移酶由选自以下的基因编码mtaA、mtaAl和mtaA2。
165.根据权利要求155所述的方法，其中所述甲基四氢叶酸类咕啉蛋白甲基转移酶由基因acsE编码。
166.根据权利要求155所述的方法，其中所述类咕啉铁硫蛋白由基因acsD编码。
167.根据权利要求155所述的方法，其中所述镍蛋白装配蛋白由选自以下的至少一种基因编码acsF禾口 cooC。
168.根据权利要求155所述的方法，其中所述铁氧还蛋白由基因orf7编码。
169.根据权利要求155所述的方法，其中所述乙酰-CoA合成酶由选自以下的至少一种基因编码acsB禾口 acsC。
170.根据权利要求155所述的方法，其中所述一氧化碳脱氢酶由基因acsA编码。
171.根据权利要求155所述的方法，其中所述丙酮酸酯铁氧还蛋白氧化还原酶由选自以下的基因编码por和ydbK。
172.根据权利要求155所述的方法，其中所述氢化酶由选自以下的至少一种基因编码hypA、hypB、hypC、hypD、hypE、hypF、moth_2175、moth_2176、moth_2177、moth_2178、 moth_2179、moth_2180、moth_2181、hycA、hycB、hycC、hycD、hycE、hycF、hycG、hycH、hycl、 hyfA、hyfB、hyfC、hyfD、hyfE、hyfF、hyfG、hyfH、hyfl、hyfj、hyfR、moth_2182、moth_2183、 moth_2184、moth_2185、moth_2186、moth_2187、moth_2188、moth_2189、moth_2190、 moth_2191、moth_2192、moth_0439、moth_0440、moth_0441、moth_0442、moth_0809、 moth_0810、moth_0811、moth_0812、moth_0813、moth_0814、moth_0815、moth_0816、 moth_1193、moth_1194、moth_1195、moth_1196、moth_1717、moth_1718、moth_1719、 moth_1883、moth_1884、moth_1885、moth_1886、moth_1887、moth_1888、moth_1452、 moth_1453 禾口 moth_1454。
173.根据权利要求155所述的方法，其中所述有机体还包含由基因acsEps编码的多肽 AcsEps0
174.根据权利要求155所述的方法，还包括由选自以下的基因编码的至少一种酶或多月太codh、codh-I、cooF、hypA、cooH、cooU、cooX、cooL、cooK、cooM、cooT、cooj 禾口 codh-IL·
175.根据权利要求155所述的方法，还包括甲醇甲基转移酶。
176.根据权利要求175所述的方法，其中所述甲醇甲基转移酶由选自以下的基因编码mtaB、mtaBl、mtaB2 禾口 mtaB3。
177.根据权利要求175所述的方法，其中所述有机体利用选自以下的原料1)甲醇和 C0, 2)甲醇、CO2和H2, 3)甲醇、0)、0)2和!12，4)甲醇和包含CO和H2的合成气体，和5)甲醇和包含CO、CO2和吐的合成气体。
178.—种产生1，4_ 丁二醇的方法，其包括培养具有1，4_ 丁二醇途径的非天然存在的微生物有机体，所述途径包含编码1，4_ 丁二醇途径酶的至少一种外源核酸，所述外源核酸在用于产生1，4-丁二醇的条件和足够时间下足量表达以产生1，4-丁二醇，所述1，4-丁二醇途径包括乙酰乙酰-CoA硫解酶、3-羟基丁酰-CoA脱氢酶、巴豆酸酶、巴豆酰-CoA水合酶、4-羟基丁酰-CoA还原酶(醇形成型)、4-羟基丁酰-CoA还原酶(醛形成型)、1，4- 丁二醇脱氢酶；所述有机体还包含具有编码乙酰-CoA途径酶的至少一种外源核酸的乙酰-CoA 途径，所述外源核酸足量表达以产生乙酰-CoA，所述乙酰-CoA途径酶包括乙酰-CoA合成酶、甲酸酯脱氢酶、甲酰四氢叶酸合成酶、次甲基四氢叶酸环化水解酶、亚甲基四氢叶酸脱氢酶和亚甲基四氢叶酸还原酶。
179.根据权利要求178所述的方法，其中所述甲酸酯脱氢酶由选自以下的基因编码moth_2312、moth_2313、moth_2314、sfum_2703、sfum_2704、sfum_2705、sfi ι m_2706、 chy_073Uchy_0732 和 chy_0733。
180.根据权利要求178所述的方法，其中所述甲酰四氢叶酸合成酶由选自以下的基因编码moth_0109、chy_2385 禾口 fhs。
181.根据权利要求178所述的方法，其中所述次甲基四氢叶酸环化水解酶由选自以下的基因编码moth_1516、folD 和 chy_1878。
182.根据权利要求178所述的方法，其中所述亚甲基四氢叶酸脱氢酶由选自以下的基因编码moth_1516、folD 和 chy_1878。
183.根据权利要求178所述的方法，其中所述亚甲基四氢叶酸还原酶由选自以下的基因编码moth_l 191、metF 和 chy_1233。
184.根据权利要求178所述的方法，其中所述有机体利用选自以下的原料1)C0，2) CO2和H2, 3) CO和CO2,4)包含CO和H2的合成气体，和5)包含CO、CO2和H2的合成气体。
全文摘要
一种示例性非天然存在的微生物有机体，其具有包含编码异丙醇途径酶的至少一种外源核酸的异丙醇途径，所述外源核酸足量表达以产生异丙醇，异丙醇途径酶包括琥珀酰-CoAL3-酮酸-CoA转移酶。另一种有机体具有包含至少一种外源核酸的4-羟基丁酸酯途径，包含乙酰乙酰-CoA硫解酶、3-羟基丁酰-CoA脱氢酶、巴豆酸酶、巴豆酰-CoA水合酶、4-羟基丁酰-CoA转移酶、磷酸转-4-羟基丁酰酶和4-羟基丁酸酯激酶。一种具有1，4-丁二醇途径的示例性有机体包括乙酰乙酰-CoA硫解酶、3-羟基丁酰-CoA脱氢酶、巴豆酸酶、巴豆酰-CoA水合酶、4-羟基丁酰-CoA还原酶(醇形成型)、4-羟基丁酰-CoA还原酶(醛形成型)和1，4-丁二醇脱氢酶。所述有机体还包括乙酰-CoA途径。上述有机体中的任一种被培养以产生异丙醇、4-羟基丁酸酯或1，4-丁二醇。
文档编号C12N1/21GK102307986SQ200980156147
公开日2012年1月4日 申请日期2009年7月15日 优先权日2008年12月16日
发明者A·P·博加德, M·J·伯克, 约翰·D·特拉威克 申请人:基因组股份公司