在血液中的循环细胞生物标记在检测和诊断疾病中的应用及其分离方法与流程

背景。

发明领域

本发明总体上涉及血液和其它体液中的生物标记的发现和表征，所述生物标记可被用来筛查受试者的实体瘤的存在，帮助选择癌症疗法的疗程，监测癌症治疗的功效，并检测和监测受试者的病毒感染，癌症筛查，癌症复发的早期检测，以及其它重要的目标。本发明的生物标记可单独使用或与循环肿瘤细胞、游离血浆和血清dna癌症标记、癌症-相关蛋白标记和其它生物标记组合使用。

相关领域

当肿瘤细胞从原发性实体瘤脱离时，它们渗透进入血液或淋巴循环，并最终离开血流而进入其它器官或组织形成转移。90%的癌症-相关死亡由转移过程引起。最常见的转移部位是肺、肝、骨和脑。循环中发现的肿瘤细胞被称为循环肿瘤细胞(ctc)。许多研究出版物和临床试验显示ctc具有在以下方面的临床用途：(i)通过在血流中ctc的计数，提供预后生存和癌症复发信息，和(ii)通过检查ctc中的蛋白表达水平，以及基因突变和易位的发生，提供治疗信息。然而，ctc并不与受试者(甚至iv期癌症患者)中癌症的发生和/或存在一直相关。

除了癌症外，还有许多医学病症可通过检测体液中的某些细胞类型来诊断。特别是，指示某些医学病症的或某些医学病症特有的细胞可比在选择的体液中发现的其它细胞具有更多和/或更少的适应性。因此，通过从体液的样品收集这样的更多和/或更少的适应性的细胞，有可能基于收集的细胞诊断医学病症。

可被用来筛查受试者的医学病症的血液和其它体液中的生物标记的鉴定和特征表征将给临床医师提供另外的工具。本发明涉及这个和其它重要的目标。

概述

本发明涉及和公开了一类具有独特特征的细胞，所述细胞在患有实体瘤(包括癌、肉瘤、神经母细胞瘤和黑色素瘤)的癌症患者的血液中发现。细胞，称为“循环癌症相关巨噬细胞-样细胞”(caml)，在本文描述并显示与患者中实体瘤的存在相关。与caml相关的5种形态学已被表征和描述(adams,d.等,作为实体瘤的潜在生物标记的循环巨大巨噬细胞(circulatinggiantmacrophagesasapotentialbiomarkerofsolidtumors)pnas2014,111(9):3514-3519和wo2013/181532)。通过在此提出的数据，caml显示具有临床用途，即它们可用作多种医学应用的生物标记。使用精密微量过滤器，通过微过滤，在患有上皮来源的i期-iv期癌症的受试者的外周血中始终发现有caml。在此提出在癌症患者的血液中发现的另外的caml形态学。

与caml相关的医学应用包括，但不限于，细胞作为生物标记以提供癌症的诊断，特别是在癌症的早期检测，在癌症复发或再发的早期检测，和在癌症突变的测定中的用途。caml也可在确定适宜的疗程中用作生物标记；特别是，所述细胞可用于化疗和放疗治疗反应的效力的快速测定。

caml可独立地用作癌症标记，或与ctc、无细胞的dna、蛋白和其它生物标记组合，以提供对患者疾病的更全面的了解。

更特别地，且在第一个实施方案中，本发明涉及筛查受试者的癌症的方法，其包括在得自受试者的生物样品中检测caml。在特定的方面，当在生物样品中检出caml时，受试者被鉴定为可能具有实体瘤，例如癌、肉瘤、神经母细胞瘤或黑色素瘤，以及其它等。在其它方面，当在生物样品中检出caml时，受试者被鉴定为患有实体瘤，例如癌、肉瘤、神经母细胞瘤或黑色素瘤，以及其它等。特定类型的癌症的鉴定可通过标准方法，例如对癌症标记染色来进行。caml的一个有用的属性是它们可经受猝灭和再染色，因此大量的癌细胞标记可使用相同的细胞样品测定。特定类型的癌症的鉴定因此也可通过对癌症标记染色，然后对另外的标记再染色相同细胞来进行。在某些方面，由该实施方案涵盖的方法也包括检测生物样品中的循环肿瘤细胞(ctc)和/或结合于ctc的白细胞(wbc)。在该实施方案的特定方面，受试者是疑似患有癌症的受试者。在该实施方案的特定方面，治疗决定基于该方法的结果作出。在该实施方案的特定方面，该方法还包括当受试者被鉴定为患有实体瘤时，给予受试者抗癌疗法。

在第二个实施方案中，本发明涉及在受试者中诊断癌症的方法，其包括在得自受试者的生物样品中检测caml，其中当在生物样品中检出caml时，所述受试者被诊断患有癌症。特定类型的癌症的鉴定可通过标准方法，例如对癌症标记染色来进行。特定类型的癌症的鉴定也可通过对癌症标记染色，然后对另外的标记再染色相同细胞来进行。在某些方面，由该实施方案涵盖的方法也包括检测生物样品中的ctc和/或结合于ctc的wbc，其中当在生物样品中检出caml、ctc和结合于ctc的wbc的一种或多种时，所述受试者被诊断患有癌症。在该实施方案的特定方面，治疗决定基于该方法的结果作出。在该实施方案的特定方面，该方法还包括当所述受试者被诊断患有癌症时，给予受试者抗癌疗法。

在第三个实施方案中，本发明涉及检测受试者的癌症复发的方法，其包括在得自先前治疗过癌症的受试者的生物样品中检测caml，其中当在生物样品中检出caml时，则检出癌症复发。特定类型的癌症的鉴定可通过标准方法，例如对癌症标记染色来进行。特定类型的癌症的鉴定也可通过对癌症标记染色，然后对另外的标记再染色相同细胞来进行。在某些方面，由该实施方案涵盖的方法也包括检测生物样品中的ctc和/或结合于ctc的wbc，其中当在生物样品中检出caml、ctc和结合于ctc的wbc的一种或多种时，则检出癌症复发。在该实施方案的特定方面，治疗决定基于该方法的结果作出。在该实施方案的特定方面，该方法还包括当检出癌症复发时，给予受试者抗癌疗法。

在第四个实施方案中，本发明涉及确认受试者的癌症诊断的方法，其包括在得自经诊断患有癌症的受试者的生物样品中检测caml，其中当在生物样品中检出caml时，受试者的癌症诊断被确认。在某些方面，由该实施方案涵盖的方法也包括检测生物样品中的ctc和/或结合于ctc的wbc，其中当在生物样品中检出caml、ctc和结合于ctc的wbc的一种或多种时，受试者的癌症诊断被确认。在特定的方面，初步癌症诊断是通过乳房x线照相术、psa测试、ca125的存在、ct、mri或pet成像进行。在一个特定的方面，受试者被怀疑患有癌症。特定类型的癌症的鉴定可通过标准方法，例如对癌症标记染色来进行。特定类型的癌症的鉴定也可通过对癌症标记染色，然后对另外的标记再染色相同的细胞来进行。在该实施方案的特定方面，治疗决定基于该方法的结果作出。在该实施方案的特定方面，该方法还包括当受试者的癌症诊断被确认时，给予受试者抗癌疗法。

在本发明的第一至第四实施方案中，结合于ctc的wbc的检测是确定结合于ctc的wbc的数目。当ctc渗透进入循环时，免疫细胞(t-细胞，白细胞的一个亚类)可通过结合于ctc识别它们；免疫细胞也可杀死ctc。过滤血液可捕获结合于ctc的白细胞(wbc)。ctc可被降解。生物样品中结合于ctc的wbc的存在和/或数目是实体瘤存在的这样一个指示并且也是机体消除实体瘤的能力。在某些方面，生物样品中的结合于ctc的wbc是t细胞。

在第五个实施方案中，本发明涉及确定受试者的癌症阶段的方法，其包括表征得自患有癌症的受试者的生物样品中的caml，其中选择的caml的特征指示受试者的癌症阶段。特定类型的癌症的鉴定可通过标准方法，例如对癌症标记染色来进行。特定类型的癌症的鉴定也可通过对癌症标记染色，然后对另外的标记再染色相同的细胞来进行。在某些方面，由该实施方案涵盖的方法也包括表征生物样品中的ctc，其中选择的caml和ctc的特征指示受试者的癌症阶段。在某些方面，caml和/或ctc从生物样品收集，然后进行特征鉴定。在该实施方案的特定方面，治疗决定基于该方法的结果作出。在该实施方案的特定方面，该方法还包括在确定受试者的癌症阶段后，给予受试者抗癌疗法。

在第六个实施方案中，本发明涉及监测癌症治疗功效的方法，其包括(a)在得自经受癌症治疗的受试者的生物样品中，测定一个或多个选择的caml的特征，和(b)比较在(a)中测定的一个或多个选择的特征的测定值与在治疗之前、治疗期间或完成治疗之后的一个或多个时间点得自相同受试者的类似生物样品中测定的相同特征的测定值，其中一个或多个测定值的变化指示受试者的癌症治疗的功效。在某些方面，由该实施方案涵盖的方法也包括(a)测定生物样品中ctc的一个或多个选择的特征，和(b)比较在(a)中测定的一个或多个选择的特征的测定值与在治疗之前、治疗期间或完成治疗之后的一个或多个时间点得自相同受试者的类似生物样品中测定的相同的特征的测定值。在某些方面，caml和/或ctc从生物样品收集，然后进行特征鉴定。在该实施方案的特定方面，治疗决定基于该方法的结果作出。

在第五和第六个实施方案中，样品中选择的caml的特征是选自以下的一或多个特征：

(i)caml数；

(ii)caml的平均大小(caml细胞的直径大小范围在从约20微米至约300微米)；

(iii)caml核的平均大小(caml具有直径约14-64µm大小的大的非典型细胞核)；

(iv)caml的形态学形状(caml形状包括纺锤形、蝌蚪形、圆形、椭圆形、两条腿、两条以上的腿、细腿，或无定形)；

(v)cd14阳性表型；

(vi)cd45表达的程度；

(vii)epcam表达的程度；

(viii)波形蛋白表达的程度；

(ix)pd-l1表达的程度；

(x)单核细胞cd11c标记表达的程度；

(xi)内皮cd146标记表达的程度；

(xii)内皮cd202b标记表达的程度；

(xiii)内皮cd31标记表达的程度；

(xiv)标记的位置(位置标记出现在caml，例如，胞浆对比细胞核，可在不同的时间点变化)；

(xv)caml中与癌症相关的一个或多个标记的存在，其中标记是扩散的，或与液泡和/或摄取的材料相关(例如，对于上皮癌，标记是细胞角蛋白8、18和19)；和

(xvi)标记染色的强度。

在第五和第六个实施方案中，样品中选择的ctc的特征是选自以下的一或多个特征：

(i)ctc数；

(ii)结合于ctc的wbc的数量；

(iii)核的状态；

(iv)细胞角蛋白8表达的程度；

(v)细胞角蛋白18表达的程度；

(vi)细胞角蛋白19表达的程度；

(vii)epcam表达的程度；

(viii)波形蛋白表达的程度；

(ix)pd-l1表达的程度；

(x)uroplakin表达的程度；

(xi)细胞角蛋白形态学；

(xii)标记的位置(位置标记出现在ctc，例如，胞浆对比细胞核，可在不同的时间点变化)；和

(xiii)标记染色的强度。

在第五和第六个实施方案中，caml、ctc和/或结合于ctc的wbc的数目使用微量过滤器同时测定。合适的微量过滤器可具有多种孔径和形状。在一个方面，微量过滤器具有大小范围从约5微米至约10微米大小的孔径，并可包括圆形、赛道形、椭圆形、正方形和矩形孔的形状。在一个优选的方面，微量过滤器具有精确的孔隙几何形状和均匀的孔隙分布。

本发明还涉及从生物样品分离caml和/或ctc，并使用相机，例如手机相机，或白光显微镜，或连接于白光显微镜的相机，对分离的细胞计数的方法。因此，并且在第七个实施方案中，本发明涉及检测生物样品中的caml和/或ctc的方法，其包括从受试者获得生物样品，并检测样品中的caml和/或ctc，其中检测是通过相机或白光显微镜，或连接于白光显微镜的相机进行的。在某些方面，相机是手机相机。在某些方面，白光显微镜具有10x或更低的放大倍率。在其它方面，细胞通过低成本的过滤器从生物样品收集和/或生物样品是通过手工抽吸或低成本泵从受试者获得的。在进一步的方面，比色染色被用于显现caml和/或ctc。

本发明还涉及使用caml和/或ctc作为伴侣诊断的方法。伴侣诊断是一种通过评价药物靶标的标记的染色，经fish评价基因扩增或易位，并使用其它针对与药物相关的特异性基因突变的分子分析等，匹配药物与特定治疗的有用工具。所述细胞可起着代替组织活检的作用，以确定某些疗法在治疗患有疾病，例如癌症的受试者中是否可能是有效的。例如，所述细胞可用于筛选免疫疗法，以确定癌症是否表达由给定的免疫疗法(例如，抗体)识别的蛋白。所述细胞也可被分析以确定细胞是否表达某些多核苷酸或选择的突变是否被发现于细胞dna中。如在此所注明的，caml和ctc常常表达或具有与它们所源自的癌症相同的癌症标记。因此，并在第八个实施方案中，本发明涉及在caml和/或ctc中筛查选择的药物靶标记的伴侣诊断方法，其包括从得自受试者的生物样品收集caml和/或ctc并确定caml和/或ctc是否表达或具有选择的药物靶标记。在某些方面，药物靶标记是细胞表面标记，并且测定可以是例如，通过对标记进行染色。作为一个例子，pd-l1可用作免疫疗法的细胞表面标记。在其它方面，药物靶标记是多核苷酸。在进一步的方面，药物靶标记是基因突变、扩增或易位，并且测定可以是例如通过fish进行。

血液中病毒检测的传统方法是基于抗体或病毒-感染的细胞的存在。因为caml是免疫细胞的一种类型，它们也可用于诊断一系列病毒感染的检测，例如人免疫缺陷病毒(hiv)、乙型肝炎病毒(hbv)、厄泼斯坦-巴尔病毒(ebv)，以及更多。事实上，caml已被发现于患有活动期病毒感染的受试者的血液中。caml吞噬病毒碎片、被病毒感染的细胞，或包含病毒的病毒碎片。人们可以对caml中的病毒标记直接染色或进行与病毒相关的caml中的dna或rna的分子分析。因此，caml也可用作生物标记以提供活动期病毒感染的检测和诊断，并确定适宜的疗程。

而且，一些病毒感染如hiv和hbv可导致癌症。在那些患者的血液中发现的caml可由病毒感染或由癌症本身引起。对癌症标记或对病毒标记的染色可被用来提供诊断信息。这可能也是一种早期检测病毒-引起的癌症的有用方法。

因此，并且在第九个实施方案中，本发明涉及诊断受试者的病毒感染的方法，其包括从得自受试者的生物样品收集caml并针对病毒筛查收集的caml。在某些方面，筛查是通过对病毒标记染色caml。也可对另外的病毒标记再染色相同的细胞。在进一步方面，筛查是通过对得自caml的dna或rna进行分子分析。在该实施方案的特定方面，治疗决定基于该方法的结果作出。在该实施方案的特定方面，该方法还包括当病毒感染被诊断时，给予受试者抗-病毒疗法。

在一个另外的实施方案中，本发明包括caml的分子分析的方法，其包括获得单个caml细胞并对单个细胞进行分子分析。对分子分析的具体类型没有限制，分子分析可对单个细胞进行，并且这样的方法包括，但不限于，核酸测序、rna印迹分析和dna印迹分析。

在本发明的相关方面和实施方案中，生物样品是选自外周血、血液、淋巴结、骨髓、脑脊液、组织，和尿的一种或多种。样品可以是新鲜样品或被解冻的冷冻-保存样品。在一个优选的方面，生物样品是外周血。在其它方面，血液是肘前-静脉血液、下腔静脉血液或颈静脉血液。

在本发明的相关方面和实施方案中，癌症是实体瘤、i期癌症、ii期癌症、iii期癌症、iv期癌症、癌、肉瘤、神经母细胞瘤、黑色素瘤、上皮细胞癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、胰腺癌、结肠直肠癌，以及其它实体瘤癌症的一种或多种。

在本发明的相关方面和实施方案中，抗-癌疗法可以是化疗、放疗、免疫疗法、疫苗疗法、靶向疗法，和/或疗法的组合的一种或多种。

在本发明的相关方面和实施方案中，caml使用一种或多种选自以下的方法检测和/或收集：尺寸排阻方法、免疫捕获、红细胞溶胞作用、白细胞耗竭、ficoll、电泳、介电电泳、流式细胞术和微流控芯片，或其组合。在一个特定的方面，尺寸排阻方法包括使用微量过滤器。合适的微量过滤器可具有多种孔径和形状。当caml单独被检测和/或收集时，孔径范围可以是从约15微米至约20微米。当caml和ctc二者被检测和/或收集时，孔径范围可以是从约5微米至约10微米。较大的孔径将消除在过滤器上的大多数wbc污染物。孔可具有圆形、赛道形、椭圆形、正方形和矩形孔的形状。在一个优选的方面，微量过滤器具有精确的孔隙几何形状和均匀的孔隙分布。在一个特定的方面，caml使用基于以下的微流控芯片检测和/或收集：基于物理大小的分选；基于流体动力学大小的分选；根据大小，分组、截留、免疫捕获、浓集大细胞，或消除小细胞。在一个特定的方面，caml使用cellsieve™低压微滤测定法来检测和/或收集。

附图简述

本发明及其许多伴随的优点的更完全的理解将容易地获得，因为当结合附图考虑时，通过参考以下详细描述，将能更好地理解本发明及其许多伴随的优点，其中：

图1a-1i显示在癌症患者的血液中发现的循环癌症相关巨噬细胞-样细胞的组图。合并的彩色图像由dapi(蓝色)、ck8、18和19(绿色)、epcam(红色)和cd45(紫色)生成。

图2a-2f显示在尾部具有吞噬的dna片段的caml。

图3a-3f显示在吞噬dna片段的过程中的caml。

图4a-4f显示在吞噬胞浆片段的过程中的caml。

图5a-5f显示具有4个吞噬的白细胞的caml。

图6a-6f显示具有2个吞噬的白细胞的caml。

图7a-7f显示分裂中的caml。

图8a-8f显示分裂后两个caml。

图9a-9f显示分裂后两个caml。

图10a-10f显示具有两个小臂的caml。

图11a-11f显示具有在同侧的两条腿的caml。

图12a-12f显示具有在同侧的两条腿的caml。

图13a-13f显示具有非常细的腿和相当规则的核的caml。

图14a-14f显示从患有病毒感染的受试者分离的caml。

图15a-15f显示来自乳腺癌患者的结合于ctc的wbc。

图16a-16f显示来自乳腺癌患者的结合于ctc的wbc。

图17a-17f显示来自乳腺癌患者的结合于ctc的wbc。

图18a-18f显示来自乳腺癌患者的结合于ctc的wbc。

图19a-19f显示来自膀胱癌患者的结合于ctc的wbc。

图20a-20f显示来自膀胱癌患者的结合于ctc的wbc。

图21a-21f显示来自膀胱癌患者的结合于ctc的wbc。

图22a-22f显示来自肾癌患者的结合于ctc的wbc。

图23a-23f显示来自肾癌患者的结合于ctc的wbc。

图24a-24f显示来自肾癌患者的结合于ctc的wbc。

图25a-25f显示来自肾癌患者的结合于ctc的wbc。

图26a-26f显示来自肾癌患者的结合于ctc的wbc。

图27a-27f显示来自肾癌患者的结合于ctc的wbc。

图28a-28f显示来自肾癌患者的结合于ctc的wbc。

图29显示在105例乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌和肺癌患者和30个健康对照中ctc和caml的频率。

图30显示在来自105例乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌和肺癌患者的不同阶段的癌症中caml的频率。

图31显示治疗后的caml数。

图32显示术前临床评估的caml数。

图33a-33b显示基于病理学评价的caml数，图33a显示病理确认数和图33b显示4个不同阶段的癌症的细胞大小变化。

图34显示caml的再染色。

图35显示放疗对caml上的癌症标记rad50的效果。

图36显示放疗对ctc上的癌症标记rad50和pd-l1的效果。

图37显示在癌症治疗后，caml数随时间推移的降低。

图38显示caml的大小随时间推移的降低。

图39a-39e显示对pd-l1强染色的caml，其中波形蛋白(最大s-n=880)；pdl1(最大s-n=880)；cd45(最大s-n=850)；长度107µm。

图40a-40e显示对pd-l1弱染色的caml，其中波形蛋白(最大s-n=500)；pdl1(最大s-n=280)；cd45(最大s-n=820)；长度62µm。

图41a-41e显示对pd-l1极弱染色的caml，其中波形蛋白(最大s-n=75)；pdl1(最大s-n=100)；cd45弱(最大s-n=145)。明亮的pdl1斑点是1000；cd45是不光滑的；长度-74µm。

图42a-42d显示caml的比色染色。

详细描述

说明书定义的主题例如详细的结构和要素仅经提供以协助对本发明的全面理解。因此，本领域普通技术人员将认识到，本文描述的实施方案的各种变化和修饰可在不背离本发明的范围或精神的情况下进行。

癌症是世界上最可怕的疾病，影响所有国家的所有人群和种族。仅在美国，就有超过一千二百万例癌症患者，每年有一百七十万例新癌症病例并且几乎六十万例死亡。全世界每年的癌症死亡数估计为约八百万例，其中三百万例发生在患者已得到治疗的发达国家。

理想地，存在这样的生物标记，其可(i)提供所有实体瘤，特别是对于危险人群组(例如对于肺癌的吸烟者)的早期检测，(ii)确认其它癌症迹象，例如对于前列腺癌的高psa，和/或(iii)提供癌症复发的早期检测。

肿瘤学家需要知道如何最好地治疗新诊断的癌症患者。当前的测试标准是组织活检，其被用于测定癌症亚型，因为治疗药物通常仅对特定亚型有效。活检方法根据位置而不同，但是是侵入性的且可能是危险的。

为监测治疗，肿瘤学家需要知道药物对于患者是如何充分发挥作用的，是否应该调整剂量，以及是否疾病正在扩散或对药物有反应。回答这些问题的常用方法是x-射线计算机断层(ct)扫描和磁共振成像(mri)，这两者都是昂贵的。此外，这些方法不能提供必需的信息，直至肿瘤大小已明显地发生变化。

90%的癌症患者死于转移，而非死于原发性肿瘤。转移过程涉及脱离原发性癌(上皮细胞的实体瘤)并进入血流的肿瘤细胞。这些脱离的癌细胞被称为循环肿瘤细胞(ctc)。ctc具有用作确定疗法、监测治疗、测定复发并提供存活的预后信息的工具的潜在性。然而，ctc不能从即使是在iii期和iv癌症的血液中持续收集。

在本公开内容中，提出一种更持续地发现于从i至iv期实体瘤患者的血液中的细胞类型。这些细胞是含有与原发性肿瘤相同的肿瘤标记的巨噬细胞-样细胞，因而它们在此被称为循环癌症相关巨噬细胞-样细胞(caml)。

ctc和caml可通过尺寸排阻方法，例如通过微过滤方法，在相同的时间，从相同患者样品中发现。微量过滤器可由大到足以让所有红细胞和大多数白细胞通过，但保留较大的细胞如ctc和caml的孔形成。尺寸排阻方法也已用微流控芯片实施。

caml当单独使用时具有许多临床用途。而且，caml可与其它标记如ctc、血液中的游离dna和血液中的游离蛋白组合，以进一步改进诊断的灵敏性和特异性。这对于caml和ctc尤其如此，因为它们可在相同的时间被分离和鉴定。

循环肿瘤细胞

许多实体瘤的ctc表达许多细胞角蛋白(ck)。ck8、18和19在诊断中是最常使用的，但考查不必限于这些标记。实体瘤ctc的表面通常表达上皮细胞粘附分子(epcam)。然而，这种表达不是均匀或一致的。ctc不表达任何cd45，因为它是白细胞标记。在鉴定肿瘤相关细胞，例如ctc和caml的分析中，使用针对与实体瘤相关的标记例如ck8、18和19的抗体，或针对cd45或dapi的抗体是足够的。结合形态学染色的存在，可鉴定病理学-可定义的ctc(pdctc)，凋亡的ctc和caml(adams,d.l.等,被微过滤捕获的循环肿瘤细胞的细胞计数特征及其与cellsearch^®ctc测试的相关性(cytometriccharacterizationofcirculatingtumorcellscapturedbymicrofiltrationandtheircorrelationtothecellsearch^®ctctest)。cytometryparta2015；87a:137-144)。

实体瘤的pdctc表达ck8、18和19，并可通过以下特征来鉴定：

•“癌症-样”核用dapi染色。核通常是大的，伴有点状图案。当细胞处于分裂时除外。核也可以是浓缩的。

•ck8、18和19的一种或多种的表达；来自上皮癌的ctc通常表达至少ck8、18和19。细胞角蛋白具有丝状图案。

•cd45表达的缺乏。

得自表达ck8、18和19的癌症的凋亡的ctc通过以下特征来鉴定：

•降解的核。

•ck8、18和19的一种或多种的表达；细胞角蛋白的图案没有丝状物，而是在斑点的形成中出现片段。

•cd45表达的缺乏。

表达细胞角蛋白的实体瘤的本发明的凋亡的ctc因此包括具有1、2或3个以下特征的那些ctc：(a)降解的核；(b)细胞角蛋白8、18和19的一种或多种的表达，且其中细胞角蛋白在斑点的形成中被片段化；和(c)cd45阴性表型。

许多癌、肉瘤和黑色素瘤的检测可通过鉴定多个其它标记进行。例如，来自肾细胞癌(rcc)和肉瘤的ctc表达波形蛋白。来自膀胱癌的ctc通常表达uroplakin，而ck8、18和19是弱的。有可能对许多不同的感兴趣的标记染色细胞。

本发明的ctc也可基于以下特征的一或多个进行鉴定：(i)ctc数；(ii)结合于ctc的wbc的数量；(iii)核的状态；(iv)细胞角蛋白8表达的程度；(v)细胞角蛋白18表达的程度；(vi)细胞角蛋白19表达的程度；(vii)epcam表达的程度；(viii)波形蛋白表达的程度；(ix)pd-l1表达的程度；(x)uroplakin表达的程度；(xi)细胞角蛋白形态学；(xii)标记的位置(位置标记出现在ctc，例如，胞浆对比细胞核，可在不同的时间点变化)；和(xiii)标记染色的强度。用于本发明的方法的ctc特征数可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或全部13个。

循环癌症相关巨噬细胞-样细胞(caml)

caml的特征鉴定为具有以下一或多个特征：

•caml具有大的非典型核；多个单独的核可发现于caml中，尽管扩大的融合核是常见的。caml核的直径大小范围一般在从约10µm至约70µm，更常见的是直径在从约14µm至约64µm的范围内。

•对于许多癌症，caml表达疾病的癌症标记。例如，与上皮癌相关的caml可表达ck8、18或19、波形蛋白等。标记通常是扩散的，或与液泡和/或摄取的材料相关。任何标记的染色图案几乎均匀地扩散到整个细胞中。对于肉瘤、成神经细胞瘤和黑色素瘤，其它与癌症相关的标记可被用来代替ck8、18、19。

•caml可以是cd45阳性的。

•caml是大的，其直径大小是约20微米-约300微米。

•caml被发现呈许多独特的形态学形状，包括纺锤形、蝌蚪形、圆形、椭圆形、两条腿、两条以上的腿、细腿，或无定形形状。

•caml通常具有扩散的细胞角蛋白。

•如果caml表达epcam，则epcam通常扩散于整个细胞，或与液泡和/或摄取的材料相关，并几乎均匀地分散于整个细胞，但不是所有caml都表达epcam，因为一些肿瘤表达极低的epcam甚或不表达epcam。

•如果caml表达标记，则标记通常扩散于整个细胞，或与液泡和/或摄取的材料相关，并几乎均匀地分散于整个细胞，但不是所有caml以同等的强度表达相同的标记。

•caml表达与肿瘤来源的标记相关的标记；例如，如果肿瘤具有前列腺癌来源并表达psma，则得自该患者的caml也表达psma。另一个例子是，如果原发性肿瘤具有胰腺癌来源并表达pdx-1，则得自该患者的caml也表达pdx-1。如果原发性肿瘤或癌症来源的ctc表达cxcr-4，则得自该患者的caml也表达cxcr-4。

•如果原发性肿瘤或癌症来源的ctc表达药物靶标的生物标记，则caml表达与药物靶标的标记相关的标记。免疫疗法的生物标记的一个例子是pd-l1。

•caml表达单核细胞标记(如cd11c、cd14)和内皮标记(如cd146、cd202b、cd31)。caml还具有结合fc片段的能力。

本发明的caml因此包括具有1、2、3、4或5个以下特征的那些caml：(a)具有约14-64µm大小的大的非典型核；(b)一或多个与肿瘤相关的癌症标记的表达，其中标记是扩散的，或与液泡和/或摄取的材料相关；(c)范围从约20微米至约300微米的细胞大小；(d)选自纺锤形、蝌蚪形、圆形、椭圆形、一或多条腿、细腿和无定形的形态学形状；和(e)cd45阳性表型。本发明的caml还包括具有1、2、3或4个以下的另外特征的那些caml：(f)具有几乎均匀分布的、扩散的epcam或波形蛋白的表达；(g)原发性肿瘤的一或多个标记的表达；(h)髓状cd14标记的表达；(i)单核细胞cd11c标记的表达；和(j)内皮cd146、cd202b，和cd31标记的表达。在一个特定的方面，本发明的caml具有另外的特征(f)-(j)的每一个。

本发明的caml也可基于一或多个以下的特征来表征：(i)caml数；(ii)caml的平均大小(caml细胞的直径大小范围从约20微米至约300微米)；(iii)caml核的平均大小(caml具有直径大小约14-64µm的大的非典型核)；(iv)caml的形态学形状(caml形状包括纺锤形、蝌蚪形、圆形、椭圆形、两条腿、两条以上的腿、细腿，或无定形)；(v)cd14阳性表型；(vi)cd45表达的程度；(vii)epcam表达的程度；(viii)波形蛋白表达的程度；(ix)pd-l1表达的程度；(x)单核细胞cd11c标记表达的程度；(xi)内皮cd146标记表达的程度；(xii)内皮cd202b标记表达的程度；(xiii)内皮cd31标记表达的程度；(xiv)标记的位置(位置标记出现在caml中，例如，胞浆对比细胞核，可在不同的时间点变化)；(xv)caml中与癌症相关的一个或多个标记的存在，其中标记是扩散的，或与液泡和/或摄取的材料相关(例如，对于上皮癌，标记是细胞角蛋白8、18和19)；和(xvi)标记染色的强度。用于本发明方法的caml特征的数目可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或全部16个。

在某些情况下，通过h&e或其它比色染色来染色caml可能是最合适的。

图1包括显示来自独立的前列腺癌、乳腺癌和胰腺癌患者样品的许多不同caml形态学和信号变化的caml的组图(adams,d.等,循环巨大巨噬细胞作为实体瘤的潜在生物标记(circulatinggiantmacrophagesasapotentialbiomarkerofsolidtumors)。pnas2014,111(9):3514-3519)：(图1a)胰腺癌、(图1b)乳腺癌、(图1c)乳腺癌、(图1d)乳腺癌、(图1e)前列腺癌、(图1f)胰腺癌、(图1g)胰腺癌、(图1h)前列腺癌，和(图1i)前列腺癌。形态学变化的实例如下：无定形(图1a)、椭圆形(图1b和1g)、纺锤形(图1c、1f、1i、3、5、6)、圆形(图1d)和蝌蚪形(图1e和1h)。根据与epcam、细胞角蛋白和cd45的抗体反应，颜色差异因不同程度的蛋白表达而发生。

图2-13显示用dapi、cd10、波形蛋白和cd45染色的caml，其中(图2a)画面显示合并的显微镜图像dapi(蓝色)、cd10(绿色)、波形蛋白(红色)和cd45(紫色)，(图2b)画面显示合并的显微镜图像dapi(白色)、cd10(绿色)、波形蛋白(红色)和cd45(紫色)，(图2c)画面显示dapi(白色)，(图2d)画面显示cd10(白色)，(图2e)画面显示波形蛋白(白色)，和(图2f)画面显示cd45(白色)。具有白色核的画面(图2b)对一些细胞提供更好的图像质量。那些细胞具有在以上段落中描述的caml的特性。染色的选择被选中是因为细胞来源是肾癌患者。

图2a-2f显示在上腿末端吞噬的dna材料。图3a-3f显示在吞噬细胞的过程中的caml，其中dna材料已经在caml中和一些分解的细胞胞浆仍部分在caml外面。图4a-4f显示在吞噬分解的细胞材料的过程中的caml。这在波形蛋白通道中是最明显的。图5a-5f显示具有4个吞噬的cd45阳性白细胞的caml。图6a-6f显示具有两个吞噬的cd45阳性白细胞的caml。图7a-7f似乎显示分裂过程中的caml。图8a-8f显示两个类似的并排的caml，提示两个细胞可能来自相同来源。图9a-9f显示两个类似的并排caml的另一个例子。

图10-12显示在图1中未鉴定的caml的另外的形态学。图10a-10f显示在细胞左侧具有两条小腿的caml。图11a-11f显示在同侧具有两条腿的caml。图12a-12f显示在核的右侧具有一条腿和左侧具有两条腿的caml。图13a-13f显示具有非常细的腿和大的单个核的caml。图14a-14f显示发现于患有hsv-2病毒感染的患者中的caml。

机体对结合于ctc的ctc–t-细胞的免疫反应

当肿瘤细胞进入血流时，ctc将被t-细胞攻击，导致肿瘤细胞的死亡。当这种情况发生时，一个或多个t-细胞将结合于ctc，导致ctc死亡和ctc的最终降解。t-细胞是白细胞的一种亚型。cd45标记染色wbc且对t-细胞不是特异性的。t-细胞可通过核的形态学与粒细胞区分。t-细胞具有大致圆形且小于8微米的单个核。过滤血液可捕获结合于ctc的白细胞(wbc)。结合于ctc的wbc在血液中的存在既是存在实体瘤的指示，也是机体消除实体瘤的能力的指示。确定结合于ctc的t-细胞数目可因而用于诊断。

肿瘤细胞和t-细胞在它们接触时，在这两种细胞中的标记可以交换。图15-18显示在乳腺癌患者的血液中发现的结合于ctc的wbc。用于乳腺癌患者的标记是dapi、ck8、18和19、epcam和cd45。图15-16显示ctc是凋亡的，伴有降解至斑点的ck8、18和19。图18显示无胞浆的、失去ck和epcam两种标记的、更多降解的ctc。常常观察到wbc和ctc的核如图16中所示相互吸引。

图19-21显示在膀胱癌患者的血液中发现的结合于ctc的wbc。用于膀胱癌患者的标记是dapi、ck8、18和19、epcam和cd45。在图19e中，epcam被降解成斑点。wbc的胞浆(在图19a中标出)和ctc存在于与wbc周围的epcam合并的过程中。wbc还表达cd45。图20a-20f显示结合于wbc的仍相对完整的ctc。图21a-21f显示无胞浆的裸ctc核和wbc(在图21a中标出)，其仍表达cd45，但比不结合于ctc的wbc(未在图21a中标出)弱得多。

图22-28显示在肾癌患者的血液中发现的结合于ctc的wbc。用于这些患者样品的标记是dapi、cd10、波形蛋白和cd45。图22a-22f显示得自具有高表达的波形蛋白的间充质肾癌的ctc。其紧密地结合于wbc。图23-28显示在非-间充质肾癌患者的血液中发现的结合于ctc的wbc，非-间充质肾癌患者表达比图22中所示的更低水平的波形蛋白。wbc和ctc的核和胞浆彼此吸引。cd10、波形蛋白和cd45标记在wbc结合于ctc后，全部变得非常弱。胞浆的量降低且最终可全部失去。

ctc和caml在癌症患者的血液中的频率

pdctc在早期癌症中极少发现。即使pdctc更频繁地发现于iii和iv期乳腺癌和前列腺癌患者中，但它们可以低频率见于大多数其它实体瘤中。作为例子，分析了105例癌症患者(乳腺癌(n=34)、前列腺癌(n=25)、胰腺癌(n=39)和肺癌(n=7))和30个健康对照者。图29显示pdctc和caml未能在健康对照者的血液中发现。相反，caml在105例癌症患者的98例中发现。具有pdctc和caml的患者的百分比分别为53%和93%。105例癌症患者的癌症分期如下：i期(n=46)、ii期(n=18)、iii期(n=11)和iv期(n=30)。图30显示，具有caml的i、ii、iii和iv期患者的百分比分别为87%、100%、91%和97%。发现caml比pdctc更常见。分析得自12种不同的实体瘤的患者样品：乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、肺癌、结肠直肠癌、子宫癌、神经母细胞瘤、食道癌、肾癌、膀胱癌、肉瘤和卵巢癌。caml被发现于所有那些类型的癌症中(数据未显示)。

caml数基于疗法而变化

以上提及的105例患者中，44例患者未接受治疗，12例接受靶疗法和49例接受化疗。进行随访筛查以在完成治疗后检测患者的caml。caml数似乎取决于治疗类型，如图31中所示。接受化疗的患者中的caml数比未接受治疗或靶向疗法的患者的caml数高得多。

caml数与分期和疾病进展的关系

在经受化疗的患者中的caml数与治疗前临床评估时的癌症阶段仅为弱相关，图32，而与病理学证实后的阶段高度相关，图33a。对于经受化疗的患者，caml数与以下最终的病理学证实呈指数相关：i期(3.2)、ii期(7.1)、iii期(14.6)、iv期(35.1)；r²=0.99。

图33b分析了基于不同阶段的大小的caml数。较后阶段的caml具有更多的具有较大尺寸的caml。

乳腺癌筛查

由于可在实体瘤的所有阶段发现高百分比的caml，caml作为癌症筛查标记被用于评价乳腺癌。双盲前瞻性研究在其中乳房x线照相术判断是不正常的41例受试者中进行。双盲测试如下进行：(i)采集7.5ml外周血液样品以测试caml和(ii)用芯针刺活组织检查进行组织诊断。虽然乳房x线照相术不能辨别该组的亚群，但caml存在的确区分良性和恶性乳腺疾病，其灵敏性为90%和特异性为72%(数据未显示)。

分离的细胞的抗体染色和再染色

典型的荧光显微镜通常使用4个或5个荧光通道，以以最大限度地减少流血通过荧光发射进入非预期的荧光通道。一个通道被dapi采用以成像核。常常有评价超过3个标记的需要。鉴于这些缺点，允许分析相同细胞上的最多约12个不同标记的方法被开发，其可与本公开内容中公开的每一种方法组合使用。用第一组标记在过滤器上过滤和染色细胞的过程后，鉴定感兴趣的细胞并成像。为评价相同细胞上的更多标记，开发了猝灭/剥离步骤及随后的再染色技术。这需要细胞处于相同的位置以允许相同细胞的再成像。这可重复多次。图34的顶排显示具有以下标准ctc染色的camla：dapi、ck8、18、19、epcam和cd45。第二排显示在猝灭和对感兴趣的标记(pd-l1、ccr和pd-1)再-染色后的相同细胞的再染色。图34的第三排显示具有标准ctc染色的camlb。第四排显示在猝灭后对于感兴趣的标记pd-l1、ccr和pd-1，相同的camlb的再染色。这种再染色方法特别适合于在微量过滤器上固定的细胞。它们的位置被固定，这样它们可被再次成像以评价不同的标记。过滤器上的ctc和其它细胞也可使用这种技术再-染色。这种再染色方法对分析癌症类型、伴侣诊断、疗法反应、癌症筛查，以及多种研究应用是非常有用的。

使用caml和ctc的单个细胞分子分析

caml和ctc的分子分析可通过各种pcr分析、微阵列、fish分析和测序，潜在地用于对于基因突变、易位和扩增，确定癌症分型。单个细胞分子分析正变得越来越普通，且caml的单个细胞分析是特别重要的。一些分析需要超过一个核和/或细胞以减少误差。本发明因此包括单个caml细胞的分子分析的方法，其中单个caml细胞被获得，且分子分析在单个细胞上进行。对可在单个细胞上进行的分子分析的特定类型没有限制，这样的方法包括，但不限于，核酸测序、rna印迹分析和dna印迹分析。

使用微过滤装置收集ctc和caml的方法被描述。为了这样的应用，需要将细胞从过滤器容易地移开，而为了再染色的目的，则相反地需要细胞留在过滤器上。允许细胞移去的重要步骤是涂布过滤器，以防止细胞粘附，例如使用胎牛血清(fbs)或牛血清白蛋白(bsa)涂布。防止细胞粘附的其它涂层也可应用。样品流过过滤器以收集大于孔的细胞。有两种收集感兴趣的细胞的方法。方法1：从过滤器夹移去过滤器并置于其上有细胞的皿或载玻片中，并用适宜的液体，例如pbs覆盖；细胞可使用微操纵器直接从过滤器取走细胞。方法2：将一个填充有pbs的注射器附接至过滤器上有细胞的夹子的底部并从过滤器回洗脱细胞。细胞可通过离心浓缩并除去上清液。细胞需要被染色以便能够在显微镜下观察。染色的一个非限制性选择是荧光嵌入染料。另一个例子是用于细胞表面标记如epcam、cd45和/或其它标记的染色。有多种方法例如用微操纵器，或器械例如cellcolector和其它器械从皿中取出感兴趣的细胞。

伴侣诊断

caml可用作伴侣诊断的组织来源以确定对患者开具的特定药物。目前伴侣诊断利用组织活检以对药物靶标的标记染色，进行fish分析，并进行其它分子分析以通过pcr、微阵列、测序等查找基因突变、扩增或易位。利用组织活检的常规伴侣诊断的例子是针对her2扩增的fish，针对alk易位的fish，组织中的pd-l1，组织中的ar和er等。有时没有足够的组织，或根本没有组织以评价广泛种类的药物。可重复收获ctc和caml并用于代替组织活检。相同的样品也可重复再-染色以评价多个药物的功效。

监测治疗反应

液体细胞活检提供一种微创方法来监测患者的治疗反应。可以采用以下方法监测癌症治疗的功效，包括：

(a)在治疗后的不同时间点监测得自相同受试者的caml和ctc的数目的变化；

(b)在不同的时间点监测caml和ctc大小的变化；

(c)在不同的时间点监测caml和ctc中标记的强度变化；和

(d)在不同的时间点监测caml和ctc中标记(胞浆对比细胞核)的位置的变化。

作为一个与化疗相关的例子，图31显示化疗反应者似乎在化疗治疗后不久显示出caml的增加。相比之下，来自靶疗法的caml数未显示出高于未治疗对照的增加。

在放疗的第二个例子中，图35的顶排显示在放疗前得自肺癌患者的对dapi、pd-l1、rad50和pd-1染色的caml。底部两排显示放疗后也对dapi、pd-l1、rad50和pd-1染色的两个不同的caml。迁移到dna损伤位点的rad50在核中。

rad50的这种改变也见于ctc。第三个例子结合再染色以检查放疗的有效性。图36的顶排显示得自用放疗治疗后肺癌患者的、使用标准ctc染料(dapi、ck8、18、19、epcam和cd45)的ctc簇。底排显示猝灭和对与放疗和免疫反应相关的标记：pd-l1、rad50和pd-1再染色后的相同的ctc簇。

第四个例子与免疫疗法相关。能使机体杀死肿瘤的免疫疗法已显示出对许多类型的癌症的令人惊讶的结果。免疫疗法药物的例子是针对肿瘤细胞表面上的pd-l1的抗体；而免疫疗法药物的另一个样品是针对杀伤t-细胞表面上的pd-1的抗体。两种类型的免疫疗法药物能使杀伤t-细胞杀死一些患者的肿瘤细胞。图37显示在延长约2-3周的4个时间间隔收集的caml数的例子。pd-1的治疗是在提供血液样品用于液体细胞活检后的日期t1和t3。治疗后caml数的减少可能是患者对治疗无反应的指示。图38显示当caml的大小也降低时，caml的大小的相应的范围。这种信息提示在血液中肿瘤碎片可由于治疗而减少，提示患者可能对治疗无反应。图39是显示非常明亮的pd-l1的t1之前的caml。在背景噪音上的pd-l1的信号是背景噪音的约8倍。图40是紧接在治疗前，在t1收集的caml。现在pd-l1信号是弱的。在背景噪音上的pd-l1的信号是少于背景噪音的2倍，指示潜在的不良应。图41是在t3的caml。pd-l1信号现在是非常弱的。在背景噪音上的pd-l1的信号是少于背景噪音的1倍；这是药物靶标，例如pd-l1缺失的指示。

第五个例子与监测手术成功有关。在adams等论文(循环巨大巨噬细胞作为潜在的实体瘤的生物标记(circulatinggiantmacrophagesasapotentialbiomarkerofsolidtumors).pnas2014,111(9):3514-3519)的图s5显示手术减少caml数。caml在患者血液中的继续存在可指示癌症可能没有被完全根除。

caml和ctc的捕获

比体液中存在的其它细胞更大和/或更少合适性的细胞可通过过滤体液收集。例如，指示病症的靶细胞，例如，caml和ctc，可通过使体液通过具有太小的开口以致不能通过靶细胞，但大到足以使其它细胞通过的过滤器收集。一旦收集到，任意数量的靶细胞的分析可以进行。这样的分析可包括，例如，标记的鉴定、计数、特征表达，获得分子分析，和/或培养收集的细胞。

caml，病理学上-可定义的ctc，和凋亡的ctc大于红细胞和大多数白细胞。使用具有精确的孔径和空隙分布的精密微量过滤器已显示提供高捕获效率和对这些细胞的低标准的偏离。cellsieve^tm微量过滤器(creatvmicrotech)是精密微量过滤器的一个例子。cellsieve^tm微量过滤器是透明的和非荧光的，使得它们对于显微镜成像分析是理想的。7-8微米的孔径消除所有的红细胞和99.99%的白细胞。制作产生均匀的孔径和分布的微量过滤器的方法描述于wo2011/139445和pct/us12/66390中，这二者通过引用以其全文结合到本文中。用跟踪蚀刻方法制得的微量过滤器具有可重叠的随机定位的孔，其有效产生大孔。它们可能失去一些caml和ctc。

除了微过滤外，存在许多捕获ctc的其它方法，并且一些也可被采用以捕获caml。它们一般被分成以下类别：

•由于caml比大多数血细胞大，许多基于大小的方法适合于捕获caml。具有7-8微米孔的微量过滤器对于同时捕获caml和ctc是理想的。如果只有caml具有意义，而并非ctc，则孔径可扩大至约15-20微米。较大的孔径将消除在过滤器上的大多数wbc污染物。

•免疫捕获使用铁磁流体、磁珠、微流控芯片等，用抗体涂布以供选择caml，或排除其它细胞。

•红细胞溶胞作用也可被用来收集caml。得到的样品体积需要放置在多个载玻片上。

•白细胞耗竭。

•ficoll。

•电泳。

•介电电泳。

•流式细胞术。

•按大小分选、选择、分组、截留、浓缩大细胞或消除小细胞，利用多种生物和物理原理的微流控芯片技术也是合适的。

过滤是鉴定结合于ctc的wbc的最佳方法。由于wbc和ctc二者失去它们的标记和失去胞浆，免疫捕获和流式细胞术是分离它们的不太合适的方法。

在本发明的相关方面和实施方案中，ctc和结合于ctc的wbc可被单独检测或与检测caml组合。这样的检测可以是同时或顺序的检测，并可利用相同的或不同的方法。例如，可使用利用微量过滤器的同时检测，所述微量过滤器具有选择用于两种细胞类型的孔径。合适的微量过滤器可具有多种孔径和形状。具有大小约7-8微米的孔的微量过滤器是可接受的，并包括圆形、矩形和赛道形孔形状。当使用聚合物微量过滤器时，具有大小约7-8微米的圆形孔的微量过滤器尤其是最佳的。在一个优选的方面，微量过滤器具有精确的孔隙几何形状和均匀的孔隙分布。

用于经济节约的caml分离和鉴定

从生物样品分离caml和/或ctc和使用相机，例如手机相机计数分离的细胞的方法是本发明的实施方案。利用相机，例如在手机上的那些相机的方法可用于其中通过标记染色和可视化详细分析caml和/或ctc所需的设备和试剂不是可获得的那些情况。基于比色染色计数caml和/或ctc的能力对于某些应用可能是足够的。当在一个社区缺乏资源时，癌症往往是在晚期才被诊断，这体现为有限的治疗选项和悲观的后果。提供基于样品中caml和/或ctc的计数的低成本诊断的方法可采取一或多个以下的概念。

(i)利用具有孔径~15-20微米的低成本过滤器。

(ii)通过手工抽吸或低成本泵过滤血液样品。

(iii)使用比色染色以显现caml和/或ctc。

(iv)使用带有/不带便携式小镜头的手机相机，或各种具有10x或更低放大倍率的白光显微镜使细胞成像。

过滤器的大孔径将减少wbc污染物。手工抽吸将降低成本。比色染色是低成本的。由于细胞的大尺寸，手机相机可观察到caml。

本发明的实施方案

如上所提出的，本文描述的caml和ctc的独特特征使得它们完全适合用于临床方法，包括筛查和诊断疾病例如癌症、监测治疗、监测疾病进展和复发的方法。

本发明因此在第一个实施方案中涉及筛查受试者癌症的方法，其包括在得自受试者的生物样品中检测caml。在特定的方面，当在生物样品中检出caml时，受试者被鉴定为潜在地患有癌、肉瘤、神经母细胞瘤、黑色素瘤或其它实体瘤。在其它方面，当在生物样品中检出caml时，受试者被鉴定为患有癌、肉瘤、神经母细胞瘤、黑色素瘤或其它实体瘤。在某些方面，由该实施方案涵盖的方法也包括检测生物样品中的循环肿瘤细胞(ctc)和结合于肿瘤细胞的t-细胞。在这样的第一个实施方案的特定方面，受试者是疑似患有癌症的受试者。

在发现caml、ctc或结合于肿瘤细胞的t-细胞后，有可能通过染色鉴定肿瘤的类型，并在一些情况下，用与肿瘤类型相关的标记再染色这些细胞。nationalcancerinstitutetumormarkerfactsheet列出了许多癌症标记(见具有以“cancer.gov/cancertopics/factsheet/detection/tumor-markers”和“cancer.gov/about-cancer/diagnosis-staging/diagnosis/tumor-markers-fact-sheet#q5”结尾的url的nci网站)。癌症标记不限于这个列表。下面所列标记的几个例子可被用来染色caml和ctc，以提供癌症类型的初步指示：

•braf突变v600e：癌症类型：皮肤黑色素瘤和结肠直肠癌

•ca15-3/ca27.29：癌症类型：乳腺癌

•ca19-9：癌症类型：胰腺癌、胆囊癌、胆管癌和胃癌

•ca-125：癌症类型：卵巢癌

•癌胚抗原(cea)：癌症类型：结肠直肠癌和乳腺癌

•细胞角蛋白片段21-1：肺癌

•雌激素受体(er)/孕激素受体(pr)：癌症类型：乳腺癌

•he4：癌症类型：卵巢癌

•her2/neu：癌症类型：乳腺癌、胃癌和食管癌

•kit：癌症类型：胃肠道间质瘤和粘膜黑色素瘤

•前列腺-特异性抗原(psa)和psma：癌症类型：前列腺癌

•甲状腺球蛋白：癌症类型：甲状腺癌

•5-蛋白标记(ova1)：癌症类型：卵巢癌

标记的选择不限于这个列表。

为鉴定一种类型的癌症，对于某些类型的癌症而言，一个标记可能是足够的。为在相同的血液样品中筛查超过一种类型的癌症，例如男性前列腺癌、直肠结肠癌和肺癌，在鉴定感兴趣的caml和ctc后，用对那些类型的癌症是特异性的癌症标记再染色caml和ctc是需要的。以下是使用微过滤方法，分析caml和ctc，以癌症筛查最多4种类型的上皮癌的说明：

•收集血液。

•分离微量过滤器上的ctc和caml。

•用dapi、ck8、18、19、cd14/cd45，及用于一种类型的癌症的一个标记染色细胞。

•使用荧光显微镜成像细胞并鉴定caml和ctc。

•猝灭caml和ctc中的荧光染料。

•用dapi和3种另外的感兴趣的标记再-染色细胞。

•在先前成像的相同ctc和caml中再-成像新的标记。

•基于标记确定癌症类型。

对肺的ct扫描可显示小至4mm尺寸的不寻常的发现。现在，它是推荐的用于肺癌的筛查方法。为验证初步结果是肺癌，需要组织活检。对于肺的组织活检查是极具挑战性的且其与造成不良影响的较高风险相关。具有相关的肺癌标记如细胞角蛋白片段21-1，及其它标记的caml的存在可被用来提供一个确定肺癌的非侵入性步骤。

对于携带brac1和brac2突变的人群，它们具有罹患乳腺癌和/或卵巢癌的高概率。可进行对于caml的血液测试，包括对于卵巢癌的ca125、ova1，以及对于乳腺癌的cea、ca15-3/ca27.29、er、pr和her2的标记。

为筛查人类的前4个类型的癌症，对于标记的一组可能的选择可以是对于前列腺癌的psma、对于结肠直肠癌的cea、对于肺癌的细胞角蛋白片段21-1和对于胰腺癌的pdx-1。

程序和标记可取决于caml和ctc分离方法、显微镜、感兴趣的癌症类型等而变化。总之，有可能筛查一种特定的癌症、几种癌症，或癌、肉瘤、成神经细胞瘤和黑色素瘤种类中的任何实体瘤。标记不必限于在此描述的标记。

在第二个实施方案中，本发明涉及在受试者中诊断癌症的方法，其包括在得自受试者的生物样品中检测caml，其中当在生物样品中检出caml时，则受试者被诊断患有癌症。特定类型的癌症的鉴定可通过标准方法，例如对癌症标记染色来进行。特定类型的癌症的鉴定也可通过对癌症标记染色，然后对另外的标记再染色相同细胞来进行。在某些方面，由该实施方案涵盖的方法也包括检测生物样品中的ctc，其中当caml和ctc在生物样品中检出时，受试者被诊断患有癌症。在某些方面，由该实施方案涵盖的方法也包括检测生物样品中结合于wbc的ctc和/或检测结合于wbc的凋亡的ctc，其中当在生物样品中检出结合于wbc的ctc和/或结合于wbc的凋亡的ctc时，受试者被诊断患有癌症。

在第三个实施方案中，本发明涉及检测受试者的癌症复发的方法，其包括在得自先前治疗过癌症的受试者的生物样品中检测caml，其中当在生物样品中检出caml时，检出癌症复发。特定类型的癌症的鉴定可通过标准方法，例如对癌症标记染色来进行。特定类型的癌症的鉴定也可通过对癌症标记染色，然后对另外的标记再染色相同细胞来进行。在某些方面，由该实施方案涵盖的方法也包括检测生物样品中的ctc和/或结合于ctc的wbc，其中当在生物样品中检出caml、ctc和结合于ctc的wbc时，检出癌症复发。为鉴定特异性癌症的复发，染色应该特别地包括与缓解癌症相关的标记。

在第四个实施方案中，本发明涉及在受试者中确认癌症诊断的方法，其包括在得自经诊断患有癌症的受试者的生物样品中检测caml，其中当在生物样品中检出caml时，受试者的癌症诊断被确认。大多数患者可以避免由组织活检所致的侵入性确证；只有当caml存在时，组织活检才是必需的。在某些方面，由该实施方案涵盖的方法也包括检测生物样品中的ctc和/或结合于ctc的wbc，其中当在生物样品中检出caml、ctc和结合于ctc的wbc的一种或多种时，受试者的癌症诊断被确认。在特定的方面，初步癌症诊断是通过乳房x线照相术、psa测试、ca125的存在、ct、mri或pet成像进行。在一个特定的方面，受试者被怀疑患有癌症。特定类型的癌症的鉴定可通过标准方法，例如对癌症标记染色来进行。特定类型的癌症的鉴定也可通过对癌症标记染色，然后对另外的标记再染色相同细胞来进行。

在第五个实施方案中，本发明涉及确定受试者的癌症阶段的方法，其包括表征得自患有癌症的受试者的生物样品中的caml，其中选择的caml的特征指示受试者的癌症阶段。特定类型的癌症的鉴定可通过标准方法，例如对癌症标记染色来进行。特定类型的癌症的鉴定也可通过对癌症标记染色，然后对另外的标记再染色相同细胞来进行。在某些方面，由该实施方案涵盖的方法也包括表征生物样品中的ctc，其中选择的caml和ctc的特征指示受试者的癌症阶段。在某些方面，在特征鉴定之前，从生物样品收集caml和/或ctc。在iii和iv期癌症中的caml数在7.5ml体积的外周血液样品中通常为5个或更多。直径大小大于40微米的caml的百分比对于iii期患者为约70%和对于iv期患者为约80%。

在第六个实施方案中，本发明涉及监测癌症治疗功效的方法，其包括(a)在得自经受癌症治疗的受试者的生物样品中，测定一个或多个选择的caml的特征，和(b)比较在(a)中测定的一个或多个选择的特征的测定值与在治疗之前、治疗期间或完成治疗之后的一个或多个时间点得自相同受试者的类似生物样品中测定的相同的特征的测定值，其中一个或多个测定值的变化指示受试者的癌症治疗的功效。在某些方面，由该实施方案涵盖的方法也包括(a)测定生物样品中的ctc的一个或多个选择的特征，和(b)比较在(a)中测定的一个或多个选择的特征的测定值与在治疗之前、治疗期间或完成治疗之后的一个或多个时间点得自相同受试者的类似生物样品中测定的相同的特征的测定值。在某些方面，在特征鉴定之前，从生物样品收集caml和/或ctc。

在某些方面，选择的caml的特征是以下的一个或多个：(i)得自在治疗后的不同时间点的相同受试者的caml数的变化；(ii)在不同的时间点的caml平均大小的变化；(iii)在不同的时间点的caml中的标记强度的变化；和(iv)在caml中从核到胞浆或反过来从胞浆到核的标记位置的变化。

在某些方面，选择的ctc的特征是以下的一个或多个：(i)在治疗后的不同时间点生物样品中的ctc数的变化；(ii)在不同的时间点的ctc中标记强度的变化；(iii)从核到胞浆或反过来从胞浆到核的标记位置的变化；(iv)在生物样品中的结合于ctc的wbc的数目的变化；和(v)在治疗后的不同时间点，在生物样品中结合于ctc的wbc的数目的变化。

技术人员将理解，caml和/或ctc和/或结合于ctc的wbc的数目的变化将是治疗效果的指示，其中caml和/或ctc和/或结合于ctc的wbc的数目的变化可以增加或减少。关于caml、ctc和结合于wbc的ctc的汇总信息可以彼此独立地使用。关于caml、ctc和结合于wbc的ctc的汇总信息也可一起使用。

技术人员将理解，caml和/或ctc大小的变化可以是治疗效果的指示，其中大小的变化可以是caml和/或ctc和/或结合于ctc的wbc的大小的增加或减少。关于caml和ctc的汇总的信息可以独立地使用或一起使用。

跟踪caml的能力提供一种常规监测坏死和化疗或放疗反应的新的机会。如果化疗不能奏效，caml数目将不增加。这可与ctc检测平行使用。如果治疗奏效，病理学上-可定义的ctc数目将减少，而凋亡的ctc数目将增加。然而，ctc不能总是被检测到。如果ctc在与caml相同的时间被检测，则可改进灵敏性和特异性。对于许多癌症，有大量的化疗剂。如果患者对一种类型的化疗没有反应，则该患者可快速地转换到另一个。

本发明也涉及从生物样品分离caml和/或ctc，以及使用相机，例如手机相机，或白光显微镜，或连接于白光显微镜的相机，计数分离的细胞的方法。因此，在第七个实施方案中，本发明涉及检测生物样品的caml和/或ctc的方法，其包括从受试者获得生物样品，并检测样品中的caml和/或ctc，其中检测是通过相机，白光显微镜或连接于白光显微镜的相机进行。在某些方面，相机是手机相机。在某些方面，白光显微镜具有10x或更低的放大倍率。在其它方面，细胞通过低成本过滤器从生物样品收集和/或生物样品通过手工抽吸或低成本泵从受试者获得。在进一步的方面，比色染色被用于显现caml和/或ctc。

在第八个实施方案中，本发明涉及在caml和/或ctc中筛查选择的药物靶标记的伴侣诊断方法，其包括从得自受试者的生物样品收集caml和/或ctc并确定caml和/或ctc是否表达或具有选择的药物靶标记。在某些方面，药物靶标记是细胞表面标记，并且所述测定可以是例如通过对标记进行染色。作为例子，pd-l1可用作免疫疗法的细胞表面标记。在其它方面，药物靶标记是多核苷酸。在进一步方面，药物靶标记是基因突变、扩增或易位，且测定可以是例如通过fish进行。

在第九个实施方案中，本发明涉及诊断受试者的病毒感染的方法，其包括从得自受试者的生物样品收集caml并针对病毒筛查收集的caml。在某些方面，筛查是通过对病毒标记染色caml来进行。在进一步方面，筛查是通过分子分析来自caml的dna或rna。

病毒检测的传统方法是基于血液中抗体或病毒颗粒的存在。由于caml吞噬病毒碎片、被病毒感染的细胞，和包含病毒的细胞碎片，以这样的方法使用caml可提供检测和诊断病毒感染的有用的工具。可使用这些方法诊断的病毒感染源不受限制并包括，例如人免疫缺陷病毒(hiv)、乙型肝炎病毒(hbv)、厄泼斯坦-巴尔病毒(ebv)等。

一些病毒感染，例如hiv和hbv，可导致癌症。在患有此类感染的受试者血液中发现的caml可由病毒感染或者由癌症本身引起。对癌症标记或对病毒标记染色可用来提供诊断信息。这可以是早期检测病毒-引起的癌症的有用方法。

在本发明的相关方面和实施方案中，疗法包括疫苗、化疗、放疗、免疫疗法、靶向疗法，及其组合。

在本发明的相关方面和实施方案中，生物样品可以是疑似含有ctc、结合于ctc的wbc，和/或caml的任何样品。在某些方面，生物样品是选自外周血、血液、淋巴结、骨髓、脑脊液、组织，和尿的一种或多种。样品可以是新鲜样品或被解冻的冷冻-保存的样品。在一个优选的方面，生物样品是外周血。在其它方面，血液是肘前-静脉血、下腔静脉血或颈静脉血。

循环单核细胞具有进入机体的任何组织隔室，包括淋巴结、骨髓、大多数器官，并甚至越过血脑屏障的能力。因此，caml的检测并不限于血液，并且细胞也可发现于淋巴结、骨髓、脑脊液、大多数器官，和尿中。

在本发明的相关方面和实施方案中，癌症是实体瘤、i期癌症、ii期癌症、iii期癌症、iv期癌症、癌、肉瘤、神经母细胞瘤、黑色素瘤、上皮细胞癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、胰腺癌、结肠直肠癌，及其它实体瘤癌症的一种或多种。技术人员将意识到，本发明的方法并不限于特定形式或类型的癌症，且它们可与广泛种类的癌症结合实施。

由于caml可发现于i和ii期癌症中，caml可被用作早期检测癌、肉瘤、成神经细胞瘤和黑色素瘤的筛查。癌是上皮来源的癌症，特别是对于乳腺癌、前列腺癌、肺癌、胰腺癌、结肠直肠癌和其它癌症的高危患者。癌症类型的特异性可通过对在微量过滤器上捕获的相同细胞上的各种癌症部位特异性标记再染色来测定。一些例子是(i)使用针对psma的抗体以特异性鉴定前列腺癌，(ii)使用针对pdx-1的抗体以特异性鉴定肺癌，(iii)针对ca125的抗体用于卵巢癌，以及(iv)clorotoxin以鉴定神经胶质瘤。

类似地，当癌症处于消退时，caml可被用来确定癌症的早期复发。目前，ct、mri和pet成像被用来监测患者的肿瘤，要求肿瘤大小显著地变化以注意到差别。当只有细微的大小变化发生时，患者可因此失去开始治疗的宝贵时间。caml，单独或与ctc组合，可提供癌症复发的早期检测。caml和ctc的非-侵入性血液测试的成本比ct、mri和pet成像低得多。

caml也可潜在地用于确定癌症分型或基因突变、易位或扩增。在每个caml中有很多癌细胞核。因此，对于核的基因突变、基因缺陷，和基因易位的分子分析可提供确定治疗的信息。有特异性地靶向某些基因突变、易位或扩增的药物。caml可单独或与ctc平行使用以供分子分析。

在本发明的相关方面和实施方案中，生物样品的体积将基于样品的来源和/或身份而变化。然而，在外周血液的情况下，血液的体积的范围可以是从约0.5ml至约50ml，约1ml至约40ml，约2ml至约30ml，约3ml至约25ml，约4ml至约20ml，约5ml至约15ml，约6ml至约10ml，或约7ml至约8ml。合适的体积也包括约1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10ml。通常用来检测ctc的血液体积是7.5ml。较大体积的血液将提供更大的灵敏性和一致性，但较小的体积例如3.5ml可能是足够的。为了各种理由，对于许多ctc检测方法，较大体积的血液是不实用的。然而，血液的微过滤以捕获ctc和/或caml允许更大的合适性来增加样本大小。使用具有160,000个孔的cellsieve^tm微量过滤器，已显示成功地筛查了50ml的血液体积。捕获caml的合适的血液体积将是7.5ml。

在本发明的相关方面和实施方案中，抗-癌症治疗可以化疗、放疗、免疫疗法、疫苗疗法、靶向疗法，和/或疗法的组合的一种或多种。

在本发明的相关方面和实施方案中，caml使用一种或多种选自以下的方法检测和/或收集：尺寸排阻方法、免疫捕获、红细胞溶胞作用、白细胞耗竭、ficoll、电泳、介电电泳、流式细胞术和微流控芯片，或其组合。在一个特定的方面，尺寸排阻方法包括使用微量过滤器。合适的微量过滤器可具有多种孔径和形状。当caml单独被检测和/或收集时，孔径范围可以是从约15微米至约20微米。当caml和ctc二者被检测和/或收集时，孔径范围可以是从约5微米至约10微米，优选7-8微米。较大的孔径将消除在过滤器上的大多数wbc污染物。孔可具有圆形、赛道形、椭圆形、正方形和矩形孔的形状。在一个优选的方面，微量过滤器具有精确的孔隙几何形状和均匀的孔隙分布。在一个特定的方面，caml使用基于以下的微流控芯片检测和/或收集：基于物理大小的分选；基于流体动力学大小的分选；根据大小分组、截留、免疫捕获、浓集大细胞，或消除小细胞。在一个特定的方面，caml使用cellsieve™低压微滤测定法检测和/或收集。

本文报告的结果支持caml提供癌症存在的可靠指示的理念。caml使用的灵敏性和特异性可与同时检测ctc和结合于wbc的ctc组合进一步改进。癌症筛查是用于人群以鉴定个体的无体征或症状的未认知疾病，以及症状发生前的或未认知的有症状的疾病的策略。同样，筛查试验的一些独特之处在于它们在显然健康良好的人群中执行。筛查试验不是诊断试验。诊断试验是在疑似患有该疾病的个体中为证实，或确定疾病存在所进行的程序。caml可用作癌症诊断，以提供确认其它筛查技术，例如乳房x线照相术、psa测试、ca125存在、ct、mri或pet成像的另外的非-侵入性诊断。