用于生成和培养3D细胞聚集体的方法和装置与流程

相关申请的交叉引用

本申请要求2014年10月29日提交的美国临时专利申请62/072015；2014年10月29日提交的62/072103；2014年10月29日提交的62/072088；2014年12月19日提交的62/094471的优先权，其各自通过引用全文纳入本文。

本申请涉及用于培养细胞的设备、系统和方法。具体地，提供了用于生成和培养3d细胞聚集体的方法和装置。

背景技术：

三维(3d)细胞培养是在人工创造的环境中的细胞生长，允许细胞在全部三维中主要彼此生长和/或相互作用。至少出于3d条件更准确地模拟体内环境的原因，3d细胞培养代表了对以2d模式(例如皮氏培养皿上)生长细胞的方法的改进。

三维模式，如球状体培养的细胞，可以比以单层培养在二维模式中培养的对应物表现出更多的体内相似的功能性。在二维细胞培养系统中，细胞可附着到其上培养它们的基材上。然而，当细胞以三维模式(例如球状体)生长时，细胞彼此相互作用而不是附着于基材。基于球状体的试验的一个问题是试验结果通常随着球状体的大小而变化。例如，不同系统之间的变量变化，如种子密度和生长时间的变化可能会影响系统之间，或在给定系统内的孔之间的试验重复性。因此，在单独的孔中生长的球状体之间保持一致的球状体尺寸可能存在挑战。

随着在细胞培养装置中生长的细胞的密度增加，可能需要较大体积的细胞培养基或更频繁地更换细胞培养基来维持细胞。然而，培养基更换的频率增加可能是不方便的。此外，体积增加的细胞培养基可导致在培养的细胞上方的培养基高度不希望地增加。随着培养基高度的增加，细胞通过培养基的气体交换速率降低。

细胞在编织袋、旋转瓶和摇瓶中已经以高密度生长成球形簇。然而，在这种装置中生长的球状体的尺寸是不一致的，并且这种装置固有的剪切倾向于将球状体打碎成更小的团簇。此外，这些装置可能不能达到足够高的细胞密度以满足当前的需求。

发明概述

本申请涉及用于培养细胞的设备、系统和方法。具体地，提供了用于生成和培养3d细胞聚集体的方法和装置。例如，提供了装置和方法来解决本领域已知或未知的对于细胞的3d培养不利的问题。

三维模式，如球状体培养的细胞，可以比以单层培养在二维模式中培养的对应物表现出更多的体内相似的功能性。在二维细胞培养系统中，细胞可附着到其上培养它们的基材上。然而，当细胞以三维模式(例如球状体)生长时，细胞彼此相互作用而不是附着于基材。在细胞通信和细胞外基质的发展方面，以三维模式培养的细胞更接近体内组织。因此，球状体为细胞迁移、分化、存活和生长提供了优越的模型，因此为研究、诊断和药物疗效、药理学和毒性测试提供了更好的系统。

在一些实施方案中，提供了含有或包含微孔或孔阵列的基材。基材可以形成细胞培养设备或装置的一部分。例如，基材可以形成多孔板、瓶、皿、管、多层细胞培养瓶、生物反应器或用于生长细胞或球状体的任何其他实验室容器的一部分。微孔或孔(术语“微孔”和“孔”在本公开中可互换使用)被构造和设置成提供有利于在培养物中形成球状体的环境。也就是说，在实施方案中，微孔具有引发球形的几何形状。此外，孔被构造和设置成提供液体进出孔的运动，而不会在基材和引入孔的液体或液滴之间滞留空气。也就是说，在实施方案中，微孔具有毛细结构。例如，其中细胞生长的孔可以不与细胞粘附，以使孔中的细胞相互结合并形成球状体。球状体扩大到孔的几何形状所施加的尺寸限制。在一些实施方案中，孔用超低结合性材料包被以使孔不粘附于细胞。

在一些实施方案中，细胞培养装置具有包括装置的迹线的框架，其基材经设置使得在装置中培养的细胞形成球状体。例如，装置中的细胞培养基材不与细胞粘附，导致细胞彼此相互结合而不是与基材结合。细胞培养基材还包括多个微孔(或孔)，其几何形状使孔中生长的细胞能够形成类似大小的细胞聚集体或球状体。球状体扩大到微孔的几何形状所施加的尺寸限制。在一些实施方案中，孔经低结合性处理或用超低结合性材料包被以使孔不粘附于细胞。

非粘附材料的实例包括全氟化聚合物、烯烃或类似聚合物或其混合物。其它实例包括琼脂糖、非离子水凝胶如聚丙烯酰胺、聚醚如聚环氧乙烷和多元醇如聚乙烯醇、或类似物质或其混合物。例如非粘附孔，孔几何形状(例如大小和形状)和/或重力的组合诱导在孔中培养的细胞自组装成球状体。一些球状体保持分化的细胞功能，指示相对于以单层生长的细胞而言更像体内的响应。其他细胞类型，如间充质基质细胞，当作为球状体培养时保留其多能性。

在一些实施方案中，本文的系统、装置和方法包括一个或多个细胞。在一些实施方式中，所述细胞被冷冻保存。在一些实施方案中，细胞处于三维培养物中。在一些这类实施方案中，本文的系统、装置和方法包括一个或多个球状体。在一些实施方案中，一个或多个细胞正在主动分裂。在一些实施方案中，系统、装置和方法包括培养基(例如，包括营养物质(例如蛋白质，肽，氨基酸)，能源(例如碳水化合物)，必需金属和矿物质(例如钙，镁，铁，磷酸盐，硫酸盐)，缓冲剂(例如磷酸盐，乙酸盐)，ph变化的指示剂(例如酚红，溴-甲酚紫)，选择剂(例如化学品，抗微生物剂)等)。在一些实施方案中，系统、装置和方法中包括一种或多种测试化合物(例如药物)。

可以培养各种各样的细胞类型。在一些实施方案中，球状体包含单一细胞类型。在一些实施方案中，球状体包含超过一种细胞类型。在一些实施方案中，其中生长超过一个球状体时，每个球状体具有相同类型，而在其他实施方案中，生长两种或更多种不同类型的球状体。在球状体中生长的细胞可以是天然细胞或改变的细胞(例如，包含一个或多个非天然遗传改变的细胞)。在一些实施方案中，细胞是体细胞。在一些实施方案中，细胞是任何所需分化状态的干细胞或祖细胞(例如，胚胎干细胞，诱导的多能干细胞)(例如多能，专能，命运确定，永生化等)。在一些实施方案中，细胞是疾病细胞或疾病模型细胞。例如，在一些实施方案中，球状体包含一种或多种类型的癌细胞或可诱导为高增殖状态的细胞(例如转化的细胞)。细胞可来自或衍生自任何所需组织或器官类型，包括但不限于肾上腺，膀胱，血管，骨，骨髓，脑，软骨，子宫颈，角膜，子宫内膜，食管，胃肠道，免疫系统(例如，t淋巴细胞，b淋巴细胞，白细胞，巨噬细胞和树突状细胞)，肝，肺，淋巴管，肌肉(例如，心肌)，神经，卵巢，胰腺(例如，胰岛细胞)，垂体，前列腺，肾，唾液，皮肤，肌腱，睾丸和甲状腺。在一些实施方案中，细胞是哺乳动物细胞(例如，人，小鼠，大鼠，兔，狗，猫，牛，猪，鸡，山羊，马等)。

培养的细胞可用于各种研究、诊断、药物筛选和测试、治疗和工业应用。

在一些实施方案中，细胞用于生产蛋白质或病毒。平行培养大量球状体的系统、装置和方法对蛋白质生产特别有效。三维培养允许增加细胞密度，并且每平方厘米细胞生长表面积的蛋白质产量更高。用于疫苗生产的任何所需的蛋白质或病毒可以在细胞中生长，并根据需要用途分离或纯化。在一些实施方案中，蛋白质是细胞的天然蛋白质。在一些实施方案中，蛋白质是非天然的。在一些实施方案中，蛋白质是重组表达的。优选地，蛋白质使用非天然启动子过表达。蛋白质可以表达为融合蛋白。在一些实施方案中，将纯化或检测标签表达为感兴趣的蛋白质的融合伴侣，以促进其纯化和/或检测。在一些实施方案中，融合物以带有可切割接头的方式表达，以允许在纯化后分离融合伴侣。

在一些实施方案中，蛋白质是治疗性蛋白质。这样的蛋白质包括但不限于替代缺乏或异常的蛋白质(例如，胰岛素)，增加现有途径(例如，抑制剂或激动剂)，提供新的功能或活性，干扰分子或生物体，或递送其他化合物或蛋白质(例如，放射性核素，细胞毒性药物，效应蛋白等)的蛋白质和肽。在一些实施方案中，蛋白质是免疫球蛋白，例如，任何类型的抗体(例如，单克隆抗体)(例如人源化，双特异性，多特异性等)。治疗性蛋白质类别包括但不限于基于抗体的药物，fc融合蛋白，抗凝剂，抗原，血液因子，骨形态发生蛋白，工程改造的蛋白质支架，酶，生长因子，激素，干扰素，白细胞介素和血栓溶解剂。治疗性蛋白质可用于预防或治疗癌症，免疫疾病，代谢紊乱，遗传性遗传疾病，感染和其他疾病和病症。

在一些实施方案中，蛋白质是诊断性蛋白质。诊断性蛋白质包括但不限于，抗体，亲和结合伴侣(例如，受体结合配体)，抑制剂，拮抗剂等。在一些实施方案中，诊断性蛋白质与可检测部分一起表达或是可检测部分(例如，荧光部分，发光部分(例如荧光素酶)，比色部分等)。

在一些实施方案中，蛋白质是工业蛋白质。工业蛋白质包括但不限于食品成分，工业酶，农业蛋白质，分析酶等。

在一些实施方案中，细胞用于药物发现、表征、功效测试和毒性测试。这种检测包括但不限于药理作用评估，致癌性评估，医学成像剂特征评估，半衰期评估，辐射安全性评估，遗传毒性试验，免疫毒性试验，生殖发育试验，药物相互作用评估，剂量评估，吸附评估，处置评估，代谢评估，消除研究等。可以将特定细胞类型用于特异性测试(例如，用于肝毒性的肝细胞，用于肾毒性的肾近端小管上皮细胞，用于血管毒性的血管内皮细胞，用于神经毒性的神经元和神经胶质细胞，用于心脏毒性的心肌细胞，用于横纹肌溶解的骨骼肌细胞等)。可以评估治疗细胞的任何数量的期望参数，包括但不限于膜完整性，细胞代谢物含量，线粒体功能，溶酶体功能，凋亡，遗传改变，基因表达差异等。

在一些实施方案中，细胞培养装置是较大系统的组件。在一些实施例中，该系统包括多个这种细胞培养装置(例如，2、3、4、5、...10、...20、...50、...100、...1000个等)。在一些实施方案中，该系统包括用于将培养装置保持在最佳培养条件(例如，温度，大气，湿度等)的培养箱。在一些实施例中，该系统包括用于成像或分析细胞的检测器。这些检测器包括但不限于荧光计，发光计，照相机，显微镜，读板器(例如，perkinelmerenvision酶标仪；perkinelmerviewlux酶标仪)，细胞分析仪(例如，geincellanalyzer2000和2200；thermo/cellomicscellnsight高内容物筛选平台)，和共焦成像系统(例如，perkinelmeroperaphenix高通量内容物筛选系统；geincell6000细胞成像系统)。在一些实施方案中，系统包括用于向培养的细胞提供、再供应和循环培养基或其它组分的灌注系统或其它组件。在一些实施方案中，系统包括用于自动化培养装置的处理、使用和/或分析的机器人组件(例如，移液管、臂、板移动器等)。

在处理具有微孔的微孔格式微孔板或其他容器时，特别是在向微孔中加入液体时，必须注意确保在引入含水液体时从微孔中完全置换空气。在向含有孔的容器中加入液体时，空气可能被滞留在液体下方但在孔(例如，微孔)内，特别是如果孔具有圆形横截面的情况。添加到孔中的水性液体的表面张力强，使得液滴趋于保持球形。球形液滴可以容易地封闭相似尺寸的圆形洞，导致空气滞留在孔内(例如，微孔)。

在一些实施方案中，本文提供了孔几何形状，其降低空气将被滞留在微孔中的可能性同时保持孔的细胞培养特点(例如在3d细胞培养中的实用性)。在一些实施例中，孔几何形状(例如，微孔几何形状)允许在将液体引入孔时有效地置换出空气。在一些实施方式中，孔几何形状提供用于使液体流入孔中的通道，而不阻挡空气从孔中逸出。在一些实施方案中，孔几何形状提供了被滞留的空气逸出的路径。在一些实施方案中，本文提供了各种孔几何形状，其有利于微孔中的空气置换并且允许液体进入微孔，同时保持用于细胞聚集的约束尺寸。

在实施方案中，本公开提供用于培养和测定例如球形细胞块或其他聚集细胞集落的装置(例如，多孔板，培养皿，瓶，多层瓶或hyperstack)。在一些实施例中，装置包括包含开口(例如，口(aperture))，侧壁或多个侧壁，以及具有一个或多个微孔的底表面的至少一个室(例如，孔(例如，大孔)，瓶等)。在一些实施方案中，开口、侧壁和底部的几何形状允许实现：在腔室内对细胞(例如，细胞聚集体，球状体等)进行3d培养，以及以下一种或多种(例如，全部)：(1)在将试剂(例如液体试剂)分配到腔室中(例如，没有空气被滞留在液体下或液体内部)时从腔室中置换出空气，(2)使液体流入微孔的路线，其降低在微孔内的液体表面下滞留空气的可能性，(3)在将液体引入微孔时空气逸出的途径，和/或(4)供于滞留于液面下的空气逸出的途径。

在一些实施方案中，用包括一个或多个孔(例如，微孔)的表面制备器件，其中孔(例如，微孔)和表面不具有任何多边形角(例如，90度角)。

在一些实施方案中，孔(例如，微孔)具有接近正弦波的横截面形状。在这样的实施方案中，孔的底部是圆形的(例如半球形的)，侧壁直径从孔的底部增加到顶部，并且孔之间的边界是圆形的。因此，孔的顶部不以直角终止。在一些实施方案中，孔具有底部和顶部之间的中点处的直径d(也称为d中点)，孔的顶部处的直径d顶部以及从孔底部到顶部的高度h。在这些实施方案中，d顶部大于d。可以针对所需的培养条件选择孔的相对尺寸和绝对尺寸。对于球状体生长，直径d优选是待在孔中培养的3d细胞聚集体的期望直径的1-3倍。高度h为d的0.7-1.3倍。直径d顶部为d的1.5-2.5倍。d优选为100微米(μm)至约2000微米(例如，100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1000、1200、1400、1600、1800或2000微米，包括任何两个上述值之间的范围(例如，200-1000μm、200-750μm、300-750μm、400-600μm等))。然而，可以采用替代的相对或绝对尺寸。例如，d可以是细胞聚集体的期望直径的1至10倍(例如，2、3、4、5、6、7、8、9)或其间的任何值或范围(例如，1、1至1.5、1至2、2、1至2.5、1至3、2至3、1至5、3至5、2至7等)。d可以为100μm至10000μm或其间的任何值(例如，100、200、500、1000、2000、5000)或范围(例如，100-2000、200-1000、300-700、400-600、500等)。h可以为d的0.5至10倍(例如，0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.5、2、2.5、3、4、5、6、7、8、9、10或其间的任何值或范围)。d顶部可以是d的1.1至5倍(例如，1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、3、4、5或其间的任何值或范围)。

相邻孔(例如，微孔)之间的屏障可以具有与相邻孔逆向相同(inverseidentical)的形状，可具有较大或较小直径db，或者其形状可以不同(例如，孔底的形状可以不同于孔/屏障顶部的形状，见例如图2)。为了使给定表面中的孔数最大化，db优选小于d。db可以比d大或小1.1至5倍(例如，1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、3、4、5或其间的任何值或范围)。

在某些实施方案中，本文的细胞培养装置包括多个孔，每个孔被设置成使得在孔中培养的细胞形成指定直径的球状体。细胞培养装置可以包括限定多个孔的结构。在一些实施方案中，多个孔中的每一个限定了顶部口(topaperture)，孔底和从顶部口延伸到孔底的侧壁表面。侧壁表面限定了顶部口和孔底之间的笔尖(pentip)区域。细胞培养体积由底表面、侧壁表面的一部分和笔尖区域限定。在一些实施方案中，笔尖区域由100微米至700微米范围内的直径尺寸(例如，100μm，200μm，300μm，400μm，500μm，600μm，700μm以及其间的任何范围)和50微米至700微米范围内的距离孔底的高度(例如，50μm，75μm，100μm，200μm，300μm，400μm，500μm，600μm，700μm以及其间的任何范围)限定。侧壁表面或细胞培养体积的尺寸被设计成控制在每个孔中生长的球状体的大小。笔尖区域是诱导球状体的几何形状。

实施方案提供了许多特征，包括例如：在细胞接种或培养基交换期间没有气泡滞留，在培养基交换期间高度保留3d细胞聚集体，容易从大面积表面收获球状体，气体可透过性，多个孔上的培养基储器，球形围孔，和/或大量产生均匀尺寸球状体的能力。

在一些实施方案中，本文所述的孔包括从孔的顶部开口延伸的一个或多个毛细结构(例如，脊，裂缝，拐角，锐角，波纹，柱等)，并且其可以从顶部开口延伸到孔底或从顶部开口到嘴底(bottomofmouth)，这为空气在流体流入孔中时逸出提供了途径。在本文描述的实施方案的范围内的合适的孔几何形状包括：(a)具有方形横截面顶部开口，圆形(例如，凹形)孔底，以及从孔顶部的方形横截面转变成孔底的圆形横截面的侧壁的孔；(b)具有从顶部开口(例如，圆形横截面顶部开口)延伸到孔底(例如，圆形(例如，凹形)孔底)的一个或多个突出脊线的孔(参见例如图1b)；(c)具有从顶部开口(例如，圆形横截面顶部开口)延伸到孔底(例如，圆形(例如，凹形)孔底)的一个或多个裂缝的孔(参见例如图2b)；(d)具有由不完全包围孔的第一和第二侧壁限定的上部以及具有圆形底部的孔的下部的孔，并且其中所述侧壁完全限定所述孔(参见例如图27或图28)；(e)其中一个或多个侧壁具有凸形横截面的孔，从而在可由柱形成的两个侧壁之间产生锐角(参见例如图5)。在一些实施方案中，孔包括上述几何形状的变化和/或组合。

在实施方案中，本文提供了制备包含本文所述的孔的细胞培养装置的方法。

在实施方案中，本文提供了使用包含本文所述的孔的细胞培养装置用于例如球形细胞培养或细胞试验中的方法。

在一些实施方案中，本文提供的是包含其中设置有孔的框架的细胞培养装置，所述孔包括：(a)顶部开口；(b)具有圆形横截面几何形状的孔底；(c)从孔底延伸到顶部开口的一个或多个侧壁；(d)任选的嘴；和(e)任选的有助于将液体引入孔中并使空气从孔中排出而不在液体表面下形成持续气穴的毛细结构。

在一些实施方案中，孔底具有圆形横截面几何形状，其中顶部开口具有多边形横截面几何形状，并且其中侧壁从圆形转变成多边形横截面几何形状，由此在侧壁之间形成角，其用作有助于将液体引入孔中并使空气从孔中逸出的毛细结构。在一些实施方案中，侧壁横截面几何形状的转变不会形成流体流入或流出孔的障碍物。在一些实施方案中，顶部开口具有正方形或六边形横截面几何形状。

在一些实施方案中，促进将液体引入孔中以及空气从孔的逸出的结构特征是从侧壁突出并从孔底延伸到顶部开口的脊。在一些实施方案中，孔包括1-20个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20)从侧壁突出并从孔底延伸到顶部开口，或基本上如此的脊。在一些实施方案中，孔底具有圆形横截面几何形状，并且顶部开口具有圆形或多边形横截面几何形状。在一些实施方案中，脊围绕孔的周边对称地间隔开。在一些实施方案中，脊围绕孔的周边不对称地间隔开。在一些实施方案中，脊不跨越从顶部开口到孔底的整个距离。

在一些实施例中，有助于将液体引入孔中并且使空气从孔中逸出的结构特征是侧壁内并且从孔底延伸到顶部开口的裂缝。在一些实施方案中，孔包括1-20个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20)侧壁内并从孔底延伸到顶部开口的裂缝。在一些实施方案中，孔底具有圆形横截面几何形状，并且顶部开口具有圆形或多边形横截面几何形状。在一些实施方案中，裂缝围绕孔的周边对称地间隔开。在一些实施方案中，裂缝围绕孔的周边不对称地间隔开。在一些实施方案中，裂缝不跨越从顶部开口到孔底的整个距离。

在一些实施例中，孔由3个或更多相邻的柱(例如，3、4、5、6、7、8、9、10)限定，每个柱的侧面的一部分形成孔的侧壁；并且其中相邻柱之间限定的空间形成有助于将液体引入孔中并使空气从孔逸出的结构特征。在一些实施方案中，孔底具有圆形横截面几何形状并且在柱下方延伸。

在一些实施方案中，本文提供了包含框架的细胞培养装置，所述框架包括设置在其中的多个孔；其中所述孔布置在至少一排中；其中所述排由两个对齐的波纹侧壁限定，使得所述侧壁之间的间隙随着每个波纹变宽和变窄；其中每个孔的上部由侧壁的两个变窄的间隙之间的加宽间隙限定，使得相邻孔的上部流体连通；并且其中每个孔的下部在波纹侧壁的下面延伸并且形成圆孔底。在一些实施方案中，装置包括多排孔。

在一些实施方案中，侧壁和/或孔底是透气但不可透过液体。也就是说，在一些实施方案中，形成孔的基材是透气但不可透过液体的。

在一些实施方案中，一个或多个侧壁是不透明的，并且孔底是透明的。

在一些实施方案中，孔底包括凹弧形表面。

在一些实施方案中，侧壁和/或孔底包括低粘附或不粘附材料和/或涂覆有低粘附或不粘附材料。

在一些实施方案中，细胞培养装置包含8至约10000个孔(8、16、24、34、48、64、96、128、256、384、500、600、700、800、1000、1536、2000、2400、3200、4000、10000，或其中的任何范围)。

在一些实施方案中，具有微孔图案的表面被纳入到广泛的细胞培养产品中。在一些实施方案中，例如12-，24-和6-孔板中的孔(例如，大孔)的底部用微孔表面图案化。在一些实施方案中，将微孔表面纳入大表面细胞培养容器中，例如t25，t75，t125，t175和t250瓶以及cellstack和hyperstack系列产品。在一些实施方案中，具有多个所述微孔的大表面积容器中的细胞培养产生适用于细胞治疗应用、克隆形成培养、干细胞龛或龛细胞共培养的大量3d细胞聚集体。

在一些实施方案中，本文的细胞培养装置包括限定主表面的底板，从限定储存器的底板延伸的一个或多个侧壁和在主表面中形成的多个孔。每个孔限定了与主表面共平面并且对储器开放的上口，以及位于主表面下方的孔底最低点。与传统的孔板相比，本文所述的板在孔的表面上限定了储器，这允许使用更多体积的细胞培养基，从而提供较低频率的培养基更换。参见，例如图28。

在各种实施方案中，描述了具有一个或多个细胞培养室的细胞培养设备。在一些实施方案中，堆叠细胞培养室。在一些实施方案中，每个细胞培养室包括界定限定多个气体可透过性孔的结构化表面的基材。在一些实施方案中，孔直接通过气体可透过性材料或通过排气孔或气管空间与装置的外部气体连通。在一些实施方案中，描述了至少部分具有由气体可透过性材料制成孔的具有微孔阵列的基材的细胞培养设备。因此，在一些实施方案中，所述设备用于培养孔内的细胞，同时在培养的细胞上方具有一定高度的细胞培养基，其在现有的细胞培养装置过高以无法进行高效代谢气体交换。因为细胞在与设备外部气体连通的气体可透过性孔中培养，所以能够通过孔进行气体交换，以克服由于细胞上方的培养基高度而导致的通过细胞培养基的气体交换的缺陷。

在某些实施方案中，细胞培养设备包括一个或多个细胞培养室。在一些实施方案中，每个细胞培养室具有内部并且包括具有第一主表面和相对的第二主表面的基材；第一主表面限定室内部的结构化表面。在一些实施方案中，结构化表面限定多个透气孔。在一些实施方案中，孔与设备的外部气体连通。

在一些实施方案中，本文提供了培养球状体的方法，其包括：向本文所述的细胞培养装置充装培养基；并向培养基中加入形成球状体的细胞。在一些实施方案中，方法还包括替换/更换培养基(例如，每天，连续等)。

在一些实施方案中，本文提供了本文所述的细胞培养装置用于培养球状体的用途。

在以下的详细描述中提出了本发明主题的其他特征和优点，其中的部分特征和优点对本领域的技术人员而言根据所作描述即容易理解，或者通过实施包括以下详细描述、权利要求书以及附图在内的本文所述的本

技术实现要素：
而被认识。

应理解，前面的一般性描述和以下的详细描述给出了本发明内容的实施方式，用来提供理解要求保护的本发明内容的性质和特性的总体评述或框架。包括的附图提供了对本发明的主题的进一步理解，附图并入本说明书中并构成说明书的一部分。附图例示了本发明的主题的各种实施方式，并与说明书一起对本发明的主题的原理和操作进行阐述。此外，附图和说明书仅仅是示例性的，并不试图以任意方式限制权利要求的范围。

附图简要说明

图1a和b是孔阵列100的示例性实施方式的示意图。图1a是截面图。图1b是在图1a的b-b线获取的孔阵列的示例性实施方式的俯视图。

图2a和b是孔阵列100的另一个示例性实施方式的示意图。图2a是截面图。图2b是在图2a的b-b线获取的孔阵列的示例性实施方式的俯视图。

图3a-d是孔阵列100的另一个示例性实施方式的示意图。图3a是截面图。图3b是在图3a的b-b线获取的孔阵列的示例性实施方式的俯视图。图3c是具有正弦波或抛物线形状的孔阵列的图。图3d是一个实施方案中含球状体的孔阵列的侧视图。

图4a-d是显示含球状体细胞培养室，或孔的阵列的另一个实施方式，一种波纹实施方式的示意图。图4a和4c是具有孔阵列的基材的波纹实施方式的俯视图，并且图4b和4d是同一实施方式的部分剖视图。

图5a-e显示了其他实施方式的示意图，其中由一系列柱限定孔。图5a和5b是俯视图并且图5c-e是示例性实施方式的部分剖视透视图。

图6a-e显示了从侧壁突出的脊的截面几何形状的示例性非限制示例。

图7a-e显示了侧壁内裂纹的截面几何形状的示例性非限制示例。

图8显示了具有用微孔阵列的微图案化的底表面的培养瓶。

图9显示了用微孔阵列微图案化的，形成图9所示瓶的底表面的基材的放大图。

图10a显示了图9所示的图案化的t25球状体形成瓶的微孔内部的ht29细胞球状体。图10b显示了从微图案化的t25球状体形成瓶收获的球状体。

图11a和b显示了nunclonsphera^tm低结合表面上形成的球状体或3d聚集体的显微图，其可获自nunc/thermofisher。图11a显示了人esc细胞并且图11b显示了小鼠esc细胞。

图12是按照实施方式制备具有微孔阵列的基材的方法的示意图。

图13显示了证明在具有基材的6孔板中，在具有不同底部厚度的微孔中细胞生长之后测量的活细胞计数，该基材具有微孔阵列(如实施例1所示)。

图14a和b显示了具有微孔阵列对比具有平坦表面的基材的活细胞计数(图14a)和细胞生产力(图14b)。

图15显示了从在具有微孔阵列对比平坦表面的基材上培养的mh677细胞提取的总蛋白质效价的图。

图16是结构化表面的实施方式的图像。

图17是结构化表面的实施方式的孔中生长的细胞的照片。

图18是显示包含多孔膜支持物的细胞培养设备的实施方式的侧视图。

图19是显示包含多孔膜支持物的细胞培养设备的另一个实施方式的侧视图。

图20是显示包含显示细胞共培养的多孔膜支持物的细胞培养设备的另一个实施方式的侧视图。

图21是细胞培养设备的实施方式的示意性透视图。

图22是细胞培养设备的实施方式的示意性截面图。

图23是细胞培养设备的实施方式的示意性截面图。

图24a是可用于形成图21-23中任一项所示的设备的部分的托盘的实施方式的示意性仰视图。

图24b是图24a中所示的托盘的实施方式的示意性透视图。

图25是细胞培养设备的实施方式的示意性侧视图。

图26是具有孔的细胞培养设备的实施方式的透视图。

图27是多个孔的实施方式的示意性截面图。

图28是多个孔的实施方式的示意性截面图。

图29是多个孔的实施方式的示意性放大截面图。

图30是具有平板和孔的细胞培养设备的实施方式的示意性透视图。

图31是具有平板和孔的细胞培养设备的实施方式的示意性透视图。

图32是细胞培养设备和包括网格的插件的实施方式的示意性透视图。

图33是具有入口和出口的设备的实施方式的示意性透视图。

图34a和b显示了(a)cho5/9α细胞中，和(b)bhk-21pc.dna3-1hc细胞中在96-孔球状体微孔板中每cm²的蛋白质产量的图。

发明详述

下面参考附图对本发明的各种实施方式进行详细描述。参考各种实施方式并不限制本发明的范围。此外，在本说明书中列出的任何实施例都不是限制性的，且仅列出要求保护的本发明的诸多可能的实施方式中的一些实施方式。图中使用的相同附图标记表示相同的部分、步骤等。但应理解，在特定的附图中使用附图标记表示一部分并不会对另一附图中用相同附图标记标出的部分构成限制。另外，使用不同的数字来表示组件并不意味着不同的编号的组件不能与其他编号的组件相同或类似。

除非另外说明，本文中使用的所有科学和技术术语的含义具有本领域通用的含义。本文提供的定义是用来帮助理解本文经常用到的某些术语，不对本发明的范围构成限制。

在某些实施方式中，本文所述设备以及制造和使用这类设备的方法提供了一个或多个优势特征或方面，包括例如，如下文所述。在任何权利要求中列出的特征或方面通常可应用于本发明的所有方面。在任一项权利要求中所述的任何单个或多个特征或方面可以结合任一项或多项其它权利要求中所述的任何其它特征或方面或与任一项或多项其它权利要求中所述的任何其它特征或方面置换。

“包括”、“包含”或类似术语意为包括但不限于，即内含而非排它。

用来描述本发明实施方式的修饰例如组合物中成分的量、浓度、体积、过程温度、过程时间、产量、流速、压力、粘度等数值及它们的范围或者组件尺寸等数值及它们的范围的“大约”是指数量的变化，可发生在例如：制备材料、组合物、复合物、浓缩物、组件零件、制品或应用制剂的典型测定和处理步骤中；这些步骤中的无意误差；制造、来源或用来实施所述方法的原料或成分的纯度方面的差异中；以及类似的考虑因素中。术语“约”还包括由于组合物或制剂的老化而与特定的初始浓度或混合物不同的量，以及由于混合或加工组合物或制剂而与特定的初始浓度或混合物不同的量。

“任选”或“任选地”表示之后描述的步骤、特征、条件、特性或结构出现/存在或者不出现/不存在，同时仍然在所述的范围内。

术语“优选”和“优选地”是指能够在特定条件下产生某些益处的本发明的实施方式。然而，在相同或其他条件下，其它实施方式也可以是优选的。此外，一个或多个优选实施方式的描述并不意味着其他实施方式不是有用的，并且不旨在将其他实施方式排除在本发明技术的范围之外。

本文所述的装置、制造装置的方法、和使用装置的方法可包括本文所述的组件或步骤，加上本文没有描述的组件或步骤。

如本说明书和所附权利要求书所用，“或”字通常在其包括“和/或”的含义上使用，除非文中有明确的相反表示。术语“和/或”表示所列出的要素中的一个或全部或者所列出的要素中的任何两个或多个元素的组合。

在本文中，“具有”、“有”、“含有”、“包括”、“包含”、“含”、“拥有”等在其开放含义上使用，通常表示“包括但不限于”，“包含但不限于”或“含有但不限于”。

本文中，范围可以表示为从“约”一个具体值开始和/或至“约”另一个具体值终止。当表述这种范围时，例子包括自某一具体值始和/或至另一具体值止。类似地，当使用先行词“约”表示数值为近似值时，应理解，具体数值构成另一种实施方式。还应理解的是，每个范围的端点值在与另一个端点值相结合以及独立于另一个端点值的情况下都是有意义的。

除非另有说明，否则，本文所用的不定冠词“一个”或“一种”及其相应的定冠词“该/所述”表示至少一(个/种)，或者一(个/种)或多(个/种)。

可采用本领域普通技术人员熟知的缩写(例如，表示小时的“h”或“hrs”、表示克的“g”或“gm”、表示毫升的“ml”、表示室温的“rt”，表示纳米的“nm”以及类似缩写)。

除非另外说明，在组分、成分、添加剂、尺度、条件和类似方面公开的具体和优选的数值及其范围仅用于说明，它们不排除其他限定数值或限定范围内的其他数值。本发明的装置和方法包括本文所描述的任何数值或数值、具体数值、更具体的数值和优选数值的任何组合，包括显义或隐义的中间值和中间范围。

在本文中，通过端点引用数字范围包括该范围内包含的所有数字(例如，1-5包括1、1.5、2、2.75、3、3.80、4、5等)。当值的范围“大于”、“小于”等特定值时，该值包含在该范围内。

本文所用的任何方向，如“顶部”、“底部”、“左”、“右”、“上”、“下”、“以上”、“以下”和其他方向和取向用于清楚参考附图并且不显示实际装置或系统或该装置或系统的使用。本文所述的许多装置、制品或系统可以多种方向或取向使用。关于细胞培养设备的本文所用的定向描述符通常指当设备出于在设备中培养细胞的目的取向时的方向。

除非另有表述，否则都不旨在将本文所述的任意方法理解为需要使其步骤以具体顺序进行。因此，当方法权利要求实际上没有陈述为其步骤遵循一定的顺序或者其没有在权利要求书或说明书中以任意其他方式具体表示步骤限于具体的顺序，都不旨在暗示该任意特定顺序。在任一项权利要求中所述的任何单个或多个特征或方面可以结合任一项或多项其它权利要求中所述的任何其它特征或方面或与任一项或多项其它权利要求中所述的任何其它特征或方面置换。

还要注意本文中涉及将部件“设置成”或使其“适于”的描述以特定的方式起作用。就这方面而言，使该部件“设置成”或使其“适于”是为了具体表现特定的性质，或者以特定的方式起作用，这样的描述是结构性的描述，而不是对预期应用的描述。更具体而言，本文所述的将部件“设置成”或使其“适于”的方式表示该组分现有的物理条件，因此可以将其看作该组件的结构特征的限定性描述。

虽然会用过渡语“包含”来公开特定实施方式的各种特征、元素或步骤，但是应理解的是，这暗示了包括可采用过渡语“构成”或“基本上由……构成”描述在内的替代实施方式。因此，例如，所指的包含限定多个孔的结构的细胞培养设备的替代性实施方式包括其中细胞培养设备由限定多个孔的结构组成的实施方式和其中细胞培养设备基本由限定多个孔的结构组成的实施方式。

在各种实施例中，本公开描述了诸如细胞培养设备，包括限定孔(例如，微孔)的基材的装置。孔包括侧壁，孔底(或天底)和开口顶部(例如上部口)。在实施方案中，孔构造成含有水性液体组合物，例如用于细胞培养或细胞试验的组合物。例如，水性液体组合物可以包括细胞培养基、缓冲液或细胞试验中使用的其它溶液或混合物。这里描述的实施例可以用于例如包括被配制成容纳液体的小(例如，微尺寸)孔或其它容器或室的任何装置。在具体实施方案中，本文所述的装置的孔可用于细胞培养。更具体地，其中的装置和微孔可用于细胞聚集体或球状体的3d细胞培养。

有一些不同的几何形状已被用于以聚集体培养细胞。在一些实施方案中，细胞聚集体是细胞簇，类胚体或球状体。形成细胞聚集体的常见几何形状是在圆形孔底微孔板上发现的半球。在一些实施方案中，使用非粘附性表面来防止细胞附着在表面上。在制造孔或室(例如，在微板中)之后，可以施加非粘附性材料，或者孔或室材料可具有固有的非附着特性。

图1是孔阵列100的示例性实施例的示意图，显示了单个孔115。在图1所示的实施方案中，孔115具有嘴110。嘴110是孔的顶部，邻近孔115的顶部开口111，其提供更开放的区域，在孔收缩形成孔底之前，其中细胞沉降以形成球状体。在实施方案中，嘴110可以是圆锥形的(嘴的顶部比在嘴的底部更宽)和环形(如图1a和图2a所示，其中孔是圆的)。在其他实施方案中，例如，如图3a所示，其中孔具有圆形开口，但是具有抛物线形状，嘴110可以是抛物线形的，或者如图27和图28所示，嘴可以延伸到每个孔115中。在实施方案中，嘴不存在。嘴结构的存在可以提供两个功能。首先，嘴扩大孔的开口，并允许引入孔的开口的液体向下流到孔的底部。这促进了孔底部处的细胞聚集，并促进了培养物中球状体的形成。此外，嘴在最的环形内表面到孔的内表面之间产生过渡，从而提供可以防止空气在孔中滞留的几何形状特征。在孔的顶部和孔的侧壁之间存在90度的角度可以提供用于形成气泡的位置。该嘴提供在孔的顶部和侧壁之间不是90度角的过渡，由此减少具有嘴结构的孔中的气泡的形成。

用于聚集细胞培养技术的孔尺寸可以在微米到毫米量级之间(例如，100μm至50mm)。许多不同的制造商(例如，corning，nunc，greiner等)出售用于细胞培养的含孔装置。“微孔”是通常具有微米量级(例如，1mm、500μm、400μm、200μm)或几毫米(例如，10mm、5mm、3mm等)的尺寸的孔，并且也用于以聚集体生长细胞。在一些实施方案中，微孔提供用于3d细胞培养的限制。在本文的任何合适的实施方案中，术语“孔”包括使用微孔，除非另有说明或上下文表示(例如，孔描述为具有包含多个微孔的孔底)。意在微孔尺寸之外的孔可以被称为“大孔”或简称为“孔”。在一些实施方案中，孔的高度或深度(例如，从顶部口到孔底)等于顶部口直径的100％或更大(例如，100％，110％，120％，130％，140％，150％，160％，170％，180％，190％，200％，225％，250％，275％，300％，325％，350％，375％，400％，或其间的任何范围。在一些实施方案中，孔深度(例如，从顶部口到孔底)等于顶部口和孔底之间的中点处的孔直径的100％或更大(例如，100％，110％，120％，130％，140％，150％，160％，170％，180％，190％，200％，225％，250％，275％，300％，325％，350％，375％，400％，或其间的任何范围。

最常用的微孔产品之一是可商购的“aggrewell”板(由stemcell技术公司销售)，其提供排列在标准格式微板孔底部的直径为400或800微米的反锥体形状的几何形状。用于生长细胞作为聚集体的另一个几何体是具有“微空间细胞培养物”(kuraray)的“elplasia”微板；这些板具有直径为200微米的方形微孔，排列在允许细胞聚集的标准格式微板孔的底部。本领域了解制造用于以聚集体形式培养细胞的微孔的各种参数、尺寸和方法(美国公开号2004/0125266；美国公开号2012/0064627；美国公开号2014/0227784；wo2008/106771；wo2014/165273；其全部内容通过引用并入本文)。美国专利号6,348,999描述了微型浮雕元件以及它们如何构造，而没有说明除了作为聚合物透镜阵列之外的这些结构的目的。美国专利5,151,366、5,272,084和6,306,646描述了具有各种类型的微浮雕图案的容器，以增加基底上细胞附着的表面积，以及制备培养图案的方法，但是图案本身不利于形成细胞聚集体。本领域已经描述了其它装置、组合物、试剂和方法，例如，美国公开号2014/0322806；美国专利号8,906,685；haycock.methodsmolbiol.2011；695:1-15；美国公开号2014/0221225；wo2014/165273；美国公开号2009/0018033；其全部内容通过引用并入本文。

一些市售的孔几何形状有助于形成细胞聚集体，但不一定有利于“限制(confinement)”。当聚合的细胞不受限制时，它们通常会生长至周围环境所允许的幅度。直径大于150至400微米(取决于细胞类型)的细胞聚集体可能形成坏死核心。坏死发生，例如，是因为细胞质量如此大以至于限制了营养物质扩散到聚集体的中心并且限制了代谢废物离开聚集体。在一些实施方案中，为了产生限制，使用与最大期望细胞聚集体的直径的尺寸相比非常相似(例如，在50％，40％，30％，20％，15％，10％，5％，2％，1％或其中的合适范围内)，但是深度的至少1.5至2倍(例如，1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.6、2.8、3.0、3.5、4.0、或其中的适当范围)的微孔几何形状。在一些实施方案中，约束孔几何形状还允许通过灌注或手动移液来更换液体培养基，而不将细胞球状体从限制孔中提取出来。

现有设备(例如，微孔格式微孔板或具有微孔的其它容器)表现出设计缺陷，其不利地影响用于形成3d细胞聚集体结构的这种装置的使用。虽然处理微孔格式微孔板是非常简单直接的，但在引入液体(例如，培养基)时空气不能从微孔中置换出通常会造成问题。空气滞留是几何尺寸大至384孔，特别是如果孔是圆形时的微孔板孔中常见的问题。含水液体的表面张力强，液滴保持球形。球形液滴能够封闭类似尺寸的圆孔(例如孔截面几何形状)。孔内的空气的存在将不利地影响和/或抑制该孔内的细胞的培养。

在细胞培养容器中在具有非粘附表面的球状体形成孔的阵列的基材上以高密度生长球状体需要平衡许多变量的培养物表面。非常希望可以平衡，例如，最大可实现的球状体密度，在流体交换活动期间保持球状体位置的能力，同时当需要时能够移除它们，并且避免在容器填充时在球状体形成孔中滞留空气的设计以避免使用这种容器中的困难。本文的实施方案通过提供孔几何形状来解决传统孔的空气滞留问题，其将有助于置换微孔中的空气并允许液体进入微孔，同时保持约束尺寸。例如，当加入液体时，具有圆形孔底几何形状的方形顶部口显然不太可能夹带空气，因为空气能够在水滴周围的孔角落上升。在一些实施方案中，包含从孔的开口延伸到孔底的各种结构(例如柱，波纹，拐角，脊，裂隙等)在将液体引入孔中时提供用于空气逸出的途径。在一些实施方案中，除了本文所述的特征之外，还包括在本领域中描述和/或本领域理解的几何形状、材料等。

为了避免在高密度球状体生长基材中空气滞留的问题，通常使用的一个设计特征是避免基材几何形状中的尖角或阶梯变化，特别是与表面上的液体的流动路径正交的基材几何形状。例如，aggrewell板具有以近90度角落垂下的壁。当容器填充时，这促进了液体从表面破裂，留下充满空气的孔。

本文提供了表面几何形状，其解决了在液体引入期间空气滞留，保持促进高密度离散球状体(例如，圆形孔底)的生长和维持的孔特征的问题。

在一些实施方案中，利用孔形状的过渡来减轻在将液体引入孔中时空气逸出的问题。例如，在一些实施方案中，利用圆形截面孔底(或孔的底部)供于球状体形成。然而，圆形截面对于没有袋形成(pocketformation)的空气逸出可能是特别有问题的。为了减轻这个问题，孔形成有圆形孔底截面和非圆形(例如，三角形，正方形，矩形，五边形，六边形等)顶部开口。在这类实施方案中，侧壁从非圆形(例如，多边形)顶部开口过渡为圆形孔底。在一些实施方案中，过渡是渐进的，以便不引入任何干扰、锯齿状或水平呈现的侧壁特征，这可能导致在向孔中引入液体时逸出孔的气泡的“挂起(hangingup)”。在一些实施方案中，由过渡壁和顶部开口的非圆形(例如，多边形)形状产生的侧壁中的角提供液体进入和/或空气逸出的路径。

在一些实施方案中，孔几何形状包括孔壁中的毛细结构(包括例如嘴，嵴裂，圆形或抛物面顶部开口等)，以便于在将液体引入孔中时逸出空气。图1b是图1a的b-b线的俯视图，显示了脊170。如图1b所示，脊是从孔的嘴110或侧壁113的凸起或突起。在实施方案中，脊将微孔的长度从顶部开口111延伸到孔底116。在另外的实施方案中，脊从嘴的顶部111延伸到嘴的底部112。脊170的任意侧面上形成的锐角在水性流体上产生毛细管力，以提供流体进入微孔而无空气滞留。图2b是在图2a中以截面显示的孔100的阵列的俯视图。图2b显示了裂缝270。如图2b所示，裂缝是孔115的侧壁113中的凹陷。形成在裂缝270的任一侧上的锐角产生毛细管力，以允许含水流体流入微孔。

图3a和b是孔阵列100的另一个示例性实施方式的示意图。图3a是截面图。图3b是在图3a的b-b线获取的孔阵列的示例性实施方式的俯视图。图3a和b显示了每个孔115可以具有超过一个脊170或裂缝270，并且脊170或裂缝270可以阵列形式布置在孔115内。如图3a和b所示，在实施方案中，设想了脊和/或裂缝的径向分布。毛细结构的数量不限于每微孔一个。在一些实施方案中，更多数量的毛细管增加流体进入微孔的速率。

图3a-d显示了单孔内多重(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、16、20、24、28、32或其中的任何范围)垂直取向的毛细结构。特征可以是规则间隔的(如图3所示)，不规则间隔，分组/聚束等。在一些实施方案中，毛细结构从孔的顶部开口延伸到孔底。当多个毛细结构存在于单个孔中时，多个特征可以是不同类型(例如，脊线和/或裂缝)，并且可以包括不同的形状(例如，正方形，圆形等)。

图3c显示了孔100的阵列可以具有正弦或抛物线形状。这种形状产生了圆形的顶部边缘或孔边缘，在实施方案中，该边缘或孔口边缘减小了在孔顶处的锐角或90度角处的空气的滞留。该正弦波或抛物线形状或圆顶顶部边缘也是毛细管结构。如图3c所示，孔115具有顶部开口，该顶部开口具有顶部直径d顶部，从孔的底部116到孔的顶部的高度h，以及在孔的顶部和孔的底部116之间的高度中点处的直径d中点。

图3d是孔阵列的示意图，如上面在图1-3和实施方案中所述。图3d显示了布置在基材1114中的阵列中的多个微孔115。图3d中还显示了驻留在多个微孔115中的多个球状体500。

图4a和4b是显示含球状体细胞培养室，或孔的阵列的另一个实施方式的示意图。图4a是孔阵列的波纹实施方案的俯视图，并且图4b是同一实施方案的部分剖视图。在图4a和4b所示的实施方案中，孔不是隔离的，而是允许孔之间的液体流动。如图4a-b所示，显示了其中波纹侧壁403对准以在波纹侧壁403之间的间隙中产生微孔401的示例性实施方案。如图4a和4b所示的波纹状侧壁由框架402包围，具有多个区域，所述区域在形成微孔401的排的周期中远离然后靠近在一起(例如，有或没有接触)。在一些实施方案中，微孔凹陷位于由进一步远离的壁限定的每个区段的基部处(例如，容纳球状体500)。图4c和4d是波纹微孔阵列实施方案的附加示意图。图4c是上图，图4d是实施方案的透视图。如图4d所示，在实施方案中，不存在框架。图4c和4d显示了波形或波浪形侧壁403，其形成适于诱导球状体形成的几何形状的空间401。图4c和4d中还显示了驻留在孔中的球状体500。当液体被引入图4a和b所示的实施方案中时，置换的空气可以通过壁靠近在一起的区域移出局部区域。流体和空气移向或离开较宽的孔区由狭窄的部分促进，以避免空气滞留。这些波纹还通过提供狭窄的生长区域来促进球状体的形成。波纹是毛细结构和诱导球形的几何形状。

图5a和5b显示了孔100阵列的示例性实施例的俯视示意图，其中一系列的柱定义了孔。图5c-5e是微孔阵列的实施方案的透视图，显示了以阵列布置以形成孔515的柱501。在实施方案中，柱501的顶部510可以是平坦的(如图5a所示)。在该实施方案中，柱501产生的凸壁在柱形成侧壁之间的连接处产生非常尖锐的角或不连续性。图5b描绘了由柱子包围以产生适于诱导培养物中球状体500形成的约束几何形状的微孔凹陷。空气逸出和流体进入通过柱501之间的空间505。柱501具有顶部510。在实施方案中，柱顶部510可以是圆形的，如图5b、5d和5e所示，这将导致具有抛物线或正弦形状的孔，如图3a所示。柱还通过提供狭窄的生长区域来促进球状体的形成。柱是毛细结构和诱导球形的几何形状。

这些结构包括例如在顶部口或嘴结构、多个柱、多个不连续壁、多个嘴结构、抛物线或正弦形状的孔形、圆形孔开口或孔的侧壁的平滑内表面的中断结构处的脊、裂缝、凸起、凹陷、开环结构，或这些特征中的任意的组合是毛细结构。毛细结构还为任何可能在加入液体后被滞留的空气提供逸出的途径。在一些实施方案中，使用不连续壁、包含脊或裂缝的壁或中断孔的侧壁的平滑度的其它特征，通过在填充期间在孔内提供排气位置来避免空气截留。

在一些实施方案中，毛细结构沿着孔的壁的垂直长度延伸。在一些实施方案中，毛细结构延伸到孔的顶部开口上或上方。在其他实施方案中，毛细结构在孔的顶部开口附近延伸(例如，离顶部开口<0.1、0.1μm、0.2μm、0.5μm、1μm、2μm、3μm、4μm、5μm、10μm或20μm(或之间的范围))。在一些实施方案中，毛细结构延伸到孔底。在其它实施方案中，毛细结构在孔底附近延伸(例如，距离孔底<0.1、0.1μm、0.2μm、0.5μm、1μm、2μm、3μm、4μm、5μm、10μm或20μm(或之间的范围))。

在一些实施方案中，毛细特征提供了提供用于液体进入孔的路径而不会在孔中滞留空气的益处。在一些实施方案中，毛细结构提供空气响应引导液体进入孔而离开孔的路径。该技术不限于用于防止空气滞留的任何特定的作用机理，并且理解该机理对于实施本发明而言是不必要的。

在快速容器填充事件或其它流体引入事件导致空气滞留的情况下，尽管几何形状被构造成防止这种滞留，毛细特征允许在被滞留的空气下转移液体，从而从孔中释放空气。例如，在图4所示的波纹状实施方案中，液体和空气可以通过开口孔结构从一个孔区域通过阵列的变窄部分流到下一个孔区域。或者，在图5所示的柱实施方案中，液体或滞留的空气可以通过柱之间的空间离开孔。在一些实施方案中，通过毛细结构的液体的向下作用力用于将空气与孔壁分离，用液体包围空气，因此空气袋作为气泡从孔中升出。

各种不同的垂直取向结构可用作毛细特征。例如，在某些实施方案中，特征是凸脊(例如，如图1a和图1b所示)或凹陷的凹槽或裂缝(例如，如图2a和b所示)。在本文的实施方案中使用的脊线和裂缝不限于图中所示的物理几何形状。在一些实施方案中，特征沿孔的侧壁垂直延伸，而不横向移动。在大多数情况下，水平结构特征以与现有孔几何形状中使用的陡角相似的方式促进孔内的空气滞留。脊的合适截面几何形状示于图6并包括：圆形(图6a)，有角的(图6b)，针(图6c)，半六边形(图6d和6e)等。裂缝的合适截面几何形状示于图7并包括：圆形(图7a)，有角的(图7b)，针(图7c)，半六边形(图7d和7e)等。脊和/或裂缝可以是任何合适的截面尺寸(例如，具有0.1-20微米的宽度，长度等(例如，0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、15、20或其间的任何合适的范围))。工程构建和微流体原理可以与本文的实施方案组合使用以优化脊和/或裂缝形状和尺寸，以便于液体的引入和空气的排出，而不会在液体表面下方形成空气袋和/或便于去除被滞留的空气袋。

在一些实施方案中，液体进入孔和空气从孔中排出由不连续的侧壁几何形状介导。不连续的孔几何形状在孔的侧壁中呈不连续的形式。不连续侧壁几何形状的示例如图4的“波浪壁”或“波纹”几何形状以及图5的“针壁(pinwall)”或“柱壁(pillarwall)”几何形状所示。这些几何形状仅仅是示例性的；在侧壁的一部分(例如，上部)中引入间隙或其它不连续性的其它侧壁定向可以在本文的实施方案中使用。在这些几何形状中，壁中的中断允许具有低粘度的空气随着流体进入容器而快速移出孔。在一些实施方案中，不连续几何形状保持避免基材壁特征中的锐角变化(例如，避免产生水平障碍物的特征)。在一些实施方案中，不连续的侧壁几何形状与孔形状的过渡和/或毛细管壁结构联用以在液体引入时帮助气泡释放和/或空气排出。

在一些实施方案中，一个或多个孔具有凹面，例如具有圆形底部的半球形表面或圆锥形表面，以及相似的表面几何形状或其组合。孔和孔底可以最终在圆形或弯曲的表面(例如凹坑或孔)，以及类似的凹形截头圆锥形浮雕表面或其组合中终止、结束或见底。共同转让的美国专利申请号14/087,906中描述了球形导向孔的其他形状和构造，该申请的全部内容以与本公开不冲突的程度通过引用并入本文。在实施方案中，孔底是平坦的或变尖。孔底可具有任何其它合适的形状或尺寸。例如，在实施方案中，孔底具有圆形或弯曲的表面，或孔底可以具有诸如凹坑、凹陷等、凹形截头圆锥形浮雕表面，凹坑或笔尖区域或其组合的结构，其通过提供狭窄的生长区域促进球状体形成。也就是说，圆形或弯曲或凹陷的孔底，或笔尖区域或波纹或柱是诱导球状体的几何形状。

示例性的孔几何形状和尺寸例如在图1和2中所示。在一些实施方案中，本文所述的孔100具有孔底直径130/230，范围为约100微米至约2000微米，例如，100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1000、1200、1400、1600、1800或2000微米，包括任何两个上述值之间的范围(例如，200-1000μm、200-750μm，300-750μm，400-600μm等)。这样的直径尺寸控制在其中生长的球状体的尺寸，使得球状体内部的细胞保持在健康状态。也就是说，这些尺寸还通过提供狭窄的生长区域来促进球状体的形成。也就是说，这些尺寸是诱导球状体的几何形状。

在一些实施方案中，本文所述的孔100/200具有在约100微米至约2000微米范围内的顶部开口截面尺寸120/220(例如，直径或宽度)，例如100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1000、1200、1400、1600、1800或2000微米，包括任何两个上述值之间的范围。在一些实施方案中，孔100在从约500微米到约1500微米的范围内具有从顶部开口到孔底的深度160/260，例如，100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000微米，包括任何两个前述值之间的范围。在一些实施方案中，孔100/200具有上部，其深度为140/240，范围为约50微米至约500微米，例如，50、60、70、80、90、100、200、300、400或500微米，包括任何两个上述值之间的范围。在一些实施方案中，孔100具有在约100微米至约1400微米范围内具有150/250深度的下部，例如，100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1000、1200或1400微米，包括任何两个上述值之间的范围。当然，也可以使用其它合适的尺寸。

在一些实施方案中，除了过渡孔结构和特征之外，还有一个或多个被设置为在将液体引入孔时允许空气逸出的设计元件和/或物理特征，本文所述的装置和孔(例如，微孔)可包括提供专门功能的附加特征，例如，与微孔内的细胞的3d培养有关。以下段落涉及可以与上述实施方案结合使用的这些特征。

在一些实施方案中，孔的全部或一部分侧壁和/或孔底是气体可透过的。在一些实施方案中，气体可透过性允许将氧气和其它气体转移到孔中以溶解到包含在孔内的液体或培养基中。可透过的侧壁、孔底或其部分不允许在孔液中形成空气袋或气泡。

在一些实施方案中，提供具有限定多个气体可透过孔的结构化表面的细胞培养室。在一些实施方案中，孔可包括限定设备的外部表面的外表面。在一些实施方案中，孔可以包括与设备的外部连通的外部或非培养表面。在一些实施方案中，本文提供的是具有多个层叠的细胞培养室的细胞培养设备，每个细胞培养室具有限定多个气体可透过孔的结构化表面。在一些实施方案中，各种实施方式中的孔与装置的外部气体连通，例如，间接地通过排气口或通过气管空间，或直接通过外壁。

在一些实施方案中，设置孔使得在孔中培养的细胞形成球状体。例如，在一些实施方案中，孔与细胞不粘附以使孔中的细胞相互结合(例如形成球状体)。球状体扩大到孔的几何形状所施加的尺寸限制。在一些实施方案中，孔用超低结合材料包被以使孔不粘附于细胞。

与其中细胞在表面上形成单层的二维细胞培养物相反，三维(3d)细胞聚集体如球状体的形成增加了细胞培养设备中生长的细胞的密度，其进而增加在设备中培养的细胞的营养需求。由于代谢气体交换可以通过其中培养细胞的气体可透过孔发生，所以细胞培养设备中的培养基体积可以大于其中代谢气体交换基本上限于通过细胞培养基的扩散的设备可能的体积。因此，本文所述的细胞培养设备可以使用较大的细胞培养基高度，和由此较大的体积。

在一些实施方案中，将细胞在本文所述的设备的孔中培养，其中细胞培养基处于细胞上方2mm或更高的高度。在一些实施方案中，细胞培养基处于细胞上方5mm或更高的高度。当代谢气体交换基本限于通过培养基时，例如当基材或其上或其附近培养细胞的表面不可透过代谢气体或相对不可透过代谢气体(例如，相较于细胞培养基)时，通常将2mm至5mm的最大细胞培养基高度视为培养基高度的上限。

为了高效代谢气体交换的目的，在一些实施方案中，当设备的孔中的细胞培养基处于细胞上方任何高度，如细胞上方2mm或以上，细胞上方5mm或以上，或细胞上方10mm或以上时，将细胞维持在本文所述设备的孔中培养。然而，本领域技术人员将理解，随着设备中细胞培养基的高度在细胞上方增加，施加在细胞上的静水压力增加。因此，细胞上方的细胞培养基的高度可能存在实际的限制。在一些实施方案中，在本文所述制品的孔中培养的细胞上方的细胞培养基的高度在5mm至20mm的范围内，例如5mm至15mm，6mm至15mm，5mm至10mm，或6mm至10mm，例如5、6、7、8、9、10、15或20mm，包括前述任何两个之间的范围。

在某些实施方案中，具有与该设备外部气体连通的非培养物表面的细胞培养基材或层可以适于具有限定如本文所述的透气孔的结构化表面。这样的细胞培养设备的示例包括t型瓶、triple-flask细胞培养容器(纽恩克国际公司(nunc.,intl.))、hyperflask细胞培养容器(康宁公司(corning,inc))、cellstack培养室(康宁公司)，cellcube模块(康宁公司)、cellfactory培养设备(纽恩克国际公司)和细胞培养制品，如wo2007/015770、美国专利申请公开号2014/0315296、美国专利号8,846,399、美国专利号8,178,345、和美国专利7,745,209中所述，其专利和公开的专利申请在此通过引用并入本文作为参考，只要它们与本申请所披露的内容不冲突。

在一些实施方案中，气体可透过/液体不可透过材料用于构建本文的细胞培养装置或其部分(例如，孔、微结构等)。可采用任何合适的气体可透过/液体不可透过型材料，例如聚苯乙烯、聚碳酸酯、乙烯乙酸乙烯酯、聚砜、聚甲基戊烯(pmp)、聚四氟乙烯(ptfe)或相容的含氟聚合物、硅橡胶或共聚物、聚(苯乙烯-丁二烯-苯乙烯)或聚烯烃，例如聚乙烯或聚丙烯，或这些材料的组合。基材可以由在孔的至少一部分上具有合适的气体可透过性的任何合适的材料形成。合适的底物的示例包括聚二甲基硅氧烷(pdms)、(聚)4-甲基戊烯(pmp)、聚乙烯(pe)和聚苯乙烯(ps)。pdms可以具有高度的透气性，并且可以在厚度高达40mm的情况下实现足够的透气性。pmp可以达到足够的气体可透过性，厚度可达约01毫米。在一些实施方案中，pmp的厚度在约0.02至1mm的范围内。pe或ps可以在厚度达0.2mm的情况下实现足够的气体可透过性，尽管较薄的基材可能不具有足够的结构完整性。为了补偿弱结构完整性，可以使用开放框架、支座等来从底部支撑基材。在实施方案中，孔厚度可以是0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20或40mm，包括前述任何两个之间的范围。在实施方案中，孔具有2000cc/m²/天或更大的通过气体可透过性聚合物材料的氧气透过率。在一些实施方案中，孔具有3000cc/m²/天或更大的通过基材的气体可透过性。在一些实施方案中，孔具有5000cc/m²/天或更大的通过基材的气体可透过性。

这种材料允许在外部和内部隔室之间有效的气体交换，以允许氧气和其它气体进入，同时防止液体或污染物的通过。

在一些实施方案中，调整孔基材的厚度以允许优化的气体交换。在一些实施方案中，厚度为10-100μm(例如10μm，15μm，20μm，25μm，30μm，35μm，40μm，45μm，50μm，60μm，70μm，80μm，90μm，100μm，和之间的任何范围)。在本文的实施方案的开发过程中进行的实验表明用较薄的孔厚度(例如，17μm>30μm>57μm)产生的较高数量的活细胞。

图8是包括作为细胞培养装置的表面的具有微孔阵列的基材的实施方式的图示。在图8中，细胞培养装置是瓶800。然而，应当理解，在实施方案中，基材可以形成任何种类的细胞培养装置的一部分，包括但不限于多孔板、瓶、皿、管、多层细胞培养瓶、生物反应器或用于生长细胞或球状体的任何其他实验室容器。具有微孔阵列的基材可以是透气材料。图9显示了形成了图8所示的瓶的底表面，用微孔阵列微图形化的基材的放大视图，如图9所示。

参考图8和图9所示的实施方案，所示的装置是包括细胞培养室850的瓶或壳体。壳体包括具有微孔阵列(图9所示)的基材。壳体还具有顶表面815，从结构化表面110延伸到顶表面815的一个或多个侧壁820。在一些实施方案中，壳体850包括单个封闭侧壁，例如圆柱形壁等。这样的设备的其他示例在例如共同转让的美国临时专利申请序列号62/072,015中描述，该临时专利申请的全部内容以与本公开不冲突的程度通过引用并入本文。

壳体包括端口860。图8中显示了具有螺纹顶部861的开口。然而，在实施方案中，壳体可具有允许液体和细胞进入和离开壳体的任何类型的端口。端口860可以在侧壁、顶表面815或细胞培养表面110中。端口860可以连接到管或其它连接，以将细胞和细胞培养基引入或移出到细胞培养室850中。

虽然图8中所示的壳体显示了固定侧壁820，但是在实施方案中，侧壁可以是柔性的或可延伸的和可塌陷的，以允许可变体积的细胞培养基进入细胞培养室850。随着其他细胞培养基被通过端口860引入细胞培养室850，柔性侧壁820可以延伸，并且随着细胞培养基通过端口860从细胞培养室850中移出，柔性侧壁820可能会塌陷。在一些实施方案中，侧壁820和顶部815由袋形成。此外，细胞培养室850可以填充任何体积的细胞培养基直到壳体的固定体积。在一些实施方案(未显示)中，整个或几乎整个内部体积充满细胞培养基。

在图8所示的实施方案中，细胞培养室850中的细胞培养基的体积以细胞上方的培养基的高度hm处存在。如上所述，如果孔不透气的话，可高于如上所述的壳体中的培养基的高度hm培养的细胞将是可能的。在一些实施方案中，将细胞培养室850填充至其容量以便在该设备内培养细胞。

图10a显示了图9所示的微图案化的t25球状体形成瓶的微孔110内部的ht29细胞球状体500。图10b显示了根据下述实施例2的来自微图案化t25球状体形成性瓶的收获的球状体500。图11a和b是显示在购自纽恩克公司的nunclonsphera^tm低结合表面上形成的3d聚集体(图11a中的人esc细胞和图11b中的小鼠esc)的宽范围尺寸分布的显微照片。nunclonsphera^tm低粘合表面具有低细胞结合表面处理，但缺乏本文公开的几何形状，以形成均匀的球状体。

图12是根据实施方案，和如下文实施例1所述制备多孔阵列基材的方法的图示。尽管图12显示了热压花/热成型方法，也考虑到根据实施方案制造微孔阵列的其它方法，包括压印，注塑，压花和本领域已知的其它方法。

图13、图14a和b以及图15是比较具有微孔阵列与平坦表面的基材的活细胞计数(图13和图14a)和细胞生产率(图14b和图15)的图。孔的气体可透过性可部分取决于基材的材料和基材沿孔的厚度。在实施方案中，具有孔的微阵列的基材中的孔的侧壁和底部的厚度可以是恒定的并且可以相对较薄。或者在实施方案中，微孔的阵列中的孔的壁可以在通入所述孔的开口附近处相对较厚，并且在所述孔的底部处相对较薄。或者在实施方案中，微孔阵列中的孔的壁可以在通入所述孔的开口附近处相对较薄，并且在所述孔的底部处相对较厚。根据所使用的材料和使用的厚度，具有微孔阵列的基材可以是出于本发明目的的气体可透过的。

图15显示了从在具有微孔对比平坦表面的基材上培养的mh677细胞提取的总蛋白质效价的图。下面在实施例2中讨论这些数据。

虽然图8所示的装置可以是硬侧瓶或软侧细胞培养瓶，但是应当理解，任何其它细胞培养装置，其包括结构化微孔阵列，其具有界定细胞培养设备的外部表面或与设备的外部气体连通的表面，可以具有如本文所述的由气体可透过性材料形成的微孔阵列的基材。

具有如本文所述的微孔阵列的细胞培养设备的结构化表面可以限定任何合适数量的可具有任何合适尺寸或形状的孔。孔根据其大小和形状限定一个体积。在许多实施方案中，一个或多个或所有孔围绕纵轴对称和/或旋转对称。在一些实施方案中，一个或多个或所有孔的纵轴彼此平行。孔可以是均匀或不均匀间隔的。在一些实施例中，孔被均匀间隔开。一个或多个或所有孔可以具有相同的尺寸和形状或可以具有不同的尺寸和形状。

在一些实施方案中，围绕孔的基材的厚度和形状被设置为对于过内表面并离开外表面的光的折射进行校正。在一些实施方案中，通过调整形成孔的基材材料的厚度来实现校正。在一些实施方案中，靠近孔底(或最低点)的基底材料的厚度大于侧壁中和/或靠近顶部口的基材材料的厚度。在一些实施方案中，基材材料的厚度从孔底的最低点处的最大值逐渐减小至顶部口处的最小值。例如，形状和厚度可以如共同转让的美国临时专利申请号62/072,019所述，该临时专利申请的全部内容通过引用并入本文，只要其与本公开不冲突。

例如非粘附孔，诱导球状体的孔几何形状和重力的组合可以限定限制体积，其中在孔中培养的细胞的生长受到限制，这导致具有由限制体积限定的尺寸的球状体的形成。

在一些实施方案中，孔2115的内表面与细胞非粘附。孔可以由非粘附材料形成，或者可以用非粘附材料涂覆以形成非粘附的孔。非粘附材料的实例包括全氟化聚合物、烯烃或类似聚合物或其混合物。其它实例包括琼脂糖、非离子水凝胶如聚丙烯酰胺、聚醚如聚环氧乙烷和多元醇如聚乙烯醇、或类似物质或其混合物。例如，非粘附孔，孔几何形状，和重力的组合可诱导在孔中培养的细胞自组装成球状体。一些球状体可保持分化的细胞功能，指示相对于在单层中生长的细胞更像体内。

在一些实施方案中，一个或多个孔具有凹面，例如具有圆形底部的半球形表面或圆锥形表面，以及相似的表面几何形状或其组合。孔和孔底可以最终在有利于球状体的圆形或弯曲的表面，如凹坑、或凹陷，以及类似的凹形截头圆锥形浮雕表面或其组合中终止、结束或见底。共同转让的美国专利申请号14/087,906中描述了有利于气体可透过的有利于球状体的孔的其他形状和构造，该申请的全部内容以与本公开不冲突的程度通过引用并入本文。

在一些实施方案中，孔底是平坦的或变尖。孔底可具有任何其它合适的形状或尺寸。

在一些实施方案中，本文所述的孔115具有在约200微米至约500微米范围内的直径尺寸w，例如，200、250、300、350、400、450或500微米，包括任意两个上述值之间的范围。这样的直径尺寸可控制在其中生长的球状体的尺寸，使得球状体内部的细胞保持在健康状态。在一些实施方案中，本文所述的孔115具有在约100微米至约500微米范围内的高度h，例如，100、150、200、250、300、350、400、450或500微米，包括任意两个上述值之间的范围。当然，也可以使用其它合适的尺寸。

在一些实施方案中，限定孔的结构化表面包括六边形紧密堆积孔结构的阵列。图16中显示了具有六边形微孔阵列100的这种基材的实施方案的图像，显示具有六边形孔1601阵列的基材。图17是显示在具有具有六方密堆积孔结构的微孔阵列100的基材的实施方案的孔1601中生长的细胞(球状体)500的示意图。在一些实施方案中，每个孔1601内的细胞形成单个球状体500，如图所示。

图18是显示包含多孔膜支持物的细胞培养设备的实施方式的侧视图。图18-20中显示了纳入多孔膜支持物2500的细胞培养设备2100的各种实施方式。多孔膜支持物2500跨过壳体设置到设备(例如，联接到一个或多个侧壁2120)，以将壳体的内部区分成单独的培养室2152和2154。第一培养室2152包括形成限定与设备外部气体连通的气体可透过孔2200的结构化表面。室2152的顶部由多孔膜2500限定。第二培养室2154的底部由多孔膜2500限定。因此，可以在由基材2110形成的结构化表面的孔2115中的第一室2152中培养第一细胞群2200，并且可以在多孔膜2500上的第二腔室2154中培养第二细胞群2202。

图18-20所示的设备包括与第一室2152连通的第一端口2162和与第二室2154连通的第二端口2164。在其他实施方案中，第一室2152或第二室2154可任选地具有其他端口(未显示的出口)以允许液体流过室。端口2162、2644可以是类似于下面关于例如图21-23描述的并且所讨论的端口(例如，端口2160)的端口。端口2162、2644可以在设备2100的同一侧上，如图所示，可以在相对侧上，或者可以以任何其它合适的方式取向，以提供对腔室的单独进入或流过腔室2152、2154。

在图18中，该设备以无顶部空间操作(用细胞培养基填充容量)形式描述。在图19-20中，该设备以有顶部空间操作(不用培养基填充容量)形式描述。由于支持物2500的多孔性质，腔室2152保持充满培养基，而腔室2154可在有或没有顶部空间的情况下操作。由于孔2115的气体可透过性质，细胞2200上方的培养基的高度可能不是重大的问题，例如，如上所述。然而，如果壳体不是可透气的，可能需要限制在多孔膜支持物2500上培养的细胞上方的培养基的高度。如图20所示，多孔膜支持物2500可以形成具有微孔阵列的基材，例如，如上所述。

根据图18-20所示的实施方案，考虑超过一个细胞群的共培养。例如，第一细胞群可以驻留在第一室2152中，而第二细胞群可以驻留在第二室2154中。这些细胞群可以由可透过性膜2500分离。这允许第一个细胞群和第二细胞群之间的化学连通。在实施方案中，这些细胞群中的一个或两个可以是球状体。例如，如图20所示，第一球状体细胞群2200可以在第一室2152中生长，由于细胞培养基质的诱导球状体的几何形状而形成球状体，而也由于存在于第二细胞培养室中的细胞培养基质的诱导球状体的几何形状形成球状体的第二球状体细胞群2202可在第二室2154中生长。通过多孔膜2500，第二球状体细胞群2202与第一球状体细胞群2200处于化学连通中。以这种方式，可以共同培养两个单独的球状体细胞群，同时允许两个分离的球状体细胞群彼此化学连通。或者，在实施方案中，如图18所示，第一细胞群可以是在第一细胞培养室2152中生长的球状体细胞并且不是球状体细胞的第二细胞群(因为第二细胞培养室不具有诱导球状体的几何形状)可以在第二细胞培养室2154中生长，而多孔膜2500的存在允许第一和第二细胞群彼此化学连通。如图19所示，第二细胞群可以在存在顶部空间的情况下生长，或者如图18所示，第二细胞群可以在不存在顶部空间的情况下生长。类似地，第一细胞培养室中可以存在或不存在顶部空间。或者，在第一细胞培养室中可能存在或不存在诱导球状体的几何形状。本领域普通技术人员将认识到，根据用户的细胞培养要求，这些特征的许多组合是可取的。

在一些实施方案中，设备的壳体是透气的。作为示例，透气膜或袋可以形成壳体的至少一部分。

在一些实施方案中，至少部分基于它们限定的尺寸和形状来设置一个或多个孔，以生长具有限定的尺寸的单个球状体。球状体可能扩大到由培养其的孔的几何形状施加的尺寸限制。例如，每个孔可以包括允许球状体生长到一定直径的微孔或细胞培养体积。换句话说，微孔或细胞培养体积的几何尺寸可以约束球状体生长，使得球状体直径达到最大值并保持在该最大值。一致大小的球状体的生产可能导致组织样的，不膨胀的球状体，这可能是提高测定结果的再现性的理想选择。一致的球状体的生产可以是由一个或多个孔的内部限定的各种形状和尺寸的体积(例如，微孔或细胞培养物体积)的结果。例如，微孔或细胞培养体积可以具有在约100微米至约700微米范围内的直径尺寸，例如约200微米至500微米，或在上述值内的任何范围(例如，100微米至200微米，100微米至500微米，或200微米至700微米)。微孔或细胞培养体积可以具有在约50微米至约700微米范围内的深度，例如约100微米至500微米，或在上述值内的任何范围。

图19是显示包含多孔膜支持物的细胞培养设备的另一个实施方式的侧视图。

图20是显示包含显示细胞共培养的多孔膜支持物的细胞培养设备的另一个实施方式的侧视图。

参照图21，显示了具有多个层叠的细胞培养室1410a，1410b，1410c的细胞培养装置1400的实施方式。每个细胞培养隔室可以包括具有如本文所述的微孔阵列的基材。设备1400包括具有开口1435的填充歧管1430，通过该开口可以引入或移除细胞培养基。填充歧管1430包括多个口(未显示)。每个细胞培养隔室1410a，1410b，1410c具有与歧管1430的孔流体连通的至少一个口(未显示)，使得通过开口1435引入的细胞培养基可以流入细胞培养室1410a，1410b，1410c。当设备1400定位在细胞培养位置时，开口1435可以被盖(未显示)等覆盖。设备1400还任选地包括限定开口1425的排气歧管1420，空气、代谢气体等可流动通过该开口。排气歧管1420包括多个口(未显示)。每个细胞培养隔室1410a，1410b，1410c具有与歧管1420的孔气体连通的至少一个口(未显示)，使得细胞培养代谢气体可通过开口1425在细胞培养室的内部和设备1400的外部之间交换。当设备1400被定位在细胞培养位置时，开口1425可以覆盖有排气盖(未显示)，过滤器(未显示)等。

现在参考图22，显示了可以是图21所示的设备类型的细胞培养装置1400的截面图。设备1400具有多个堆叠的细胞培养室1410a，1410b，1410c，每个细胞培养室具有限定如上所述的具有气体可透过孔阵列的结构化表面的基材1110。在图22所示的实施方案中，每个隔室(例如，1410b，1410c)，除了堆叠中的最顶层隔室1410a之外，具有顶表面1450，该顶表面1450由相邻隔室的基材1110的结构化的第二主表面限定。例如，隔室1410b的基材1110的第二主表面用作隔室1410c的顶部内表面。因此，相邻隔室的内部通过形成底部结构化表面/顶部表面的共同基材1110彼此气体连通。最顶层的隔室1410具有由顶部1450形成的顶部内表面，其可以是板。

隔室(例如，隔室1410a，1410b，1410c)的内部由具有微孔阵列(例如，图9所示的阵列100)，在上面的隔室的基材的外部第二主表面限定的顶表面，以及一个或多个侧壁1440的基材限定。一个或多个侧壁1440具有排气口1442，该排气口1442与由歧管1420限定的排气柱1429连通，歧管1420经由一个或多个由歧管1420限定的开口1425，426与设备的外部连通。排气口1442限定当该设备是细胞培养取向时(例如，如图22所示)可存在于细胞培养室内部的细胞培养基1300的最大体积。隔室中的细胞培养基的体积可以小于最大值。排气口1442还限定了细胞培养隔室内部的最小顶部空间体积。隔室内部的顶部空间体积可以大于最小顶部空间体积(如果细胞培养基体积小于最大培养基体积)。

因此，在相邻室(例如，室1410c)上方的室(例如，室1410b)的基材1110限定的结构化表面的孔中培养的细胞与相邻室(例如，室1410c)的顶部空间1441通过透气孔连通。顶部空间1441处于由歧管限定的连通柱1429中，歧管通过一个或多个开口1425、1426与设备的外部连通。

可选的过滤器1427可以并入开口1425，开口1425或盖1422中以排出代谢气体。在一些实施方案中，在设备的底部具有排气口是有利的。例如，代谢废气二氧化碳比大气空气密度更大，并且倾向于在没有底部排气口的培养设备中形成底部浓度最高的梯度。因此，在设备底部(例如，由排气柱1429和开口1426形成)上存在排气口可以有助于将废二氧化碳转移出设备。

现在参考图23，显示了细胞培养设备1400的截面图，其可以是图21所示的设备类型，并且可以是图22所示设备的一部分。在没有明确讨论图23中的每个附图标记的程度上，参考上面关于图22描述的相同编号的部件的讨论。在所示实施方案中，隔室(例如，隔室1410a，1410b，1410c)由基材1110的内部结构化表面，由上面隔室的基材的外表面限定的顶表面，以及一个或多个侧壁1440限定。一个或多个侧壁1440具有与由填充歧管1430限定的柱1439连通的口1443，其通过由歧管1430限定的开口1435与设备的外部连通，当设备处于细胞培养方向时，歧管1430可被盖1432盖上。可以将细胞培养基1300引入细胞培养隔室(例如隔室1410a，1410b，1410c)中，或者通过操作该隔室通过柱1439和开口1435从细胞培养隔室中取出。

现在参见图24a和24b，显示了托盘1415的示意性仰视图(24a)和示意性透视图(24b)，托盘1415可用于形成细胞培养隔室(例如，如图21-23所示的隔室1410a，1410b，1410c)当多个这样的托盘堆叠在彼此的顶部时。托盘1415包括从限定具有微孔阵列的基材的基板1110延伸的侧壁1440a，1440b，1440c，1440d。在一些实施方案中，托盘包括单个封闭侧壁(未显示)。部分高度的壁1472连接到侧壁1440a和侧壁1440d。部分高度的壁1472和侧壁1440a，1440d围绕并限定排气口1442。当细胞培养设备由堆叠的托盘组装时，由托盘1415形成的室内部的代谢气体可以在部分壁1472上流过口1442。排气口1442，部分壁1472和堆叠托盘1415的相关侧壁可以形成排气柱的至少一部分(例如，图22所示的排气柱1429)。

托盘1415还包括耦合到侧壁1440a和侧壁1440b的部分高度壁1473。部分高度的壁1473和侧壁1440a，1440b围绕并限定填充口1443。当细胞培养设备从堆叠的托盘组装时，培养基可以被引导到由托盘1415在部分壁1473上形成的室的内部或从其中移出，并通过组装的设备的操纵通过填充口1443。填充口1443，部分壁1473和堆叠托盘1415的相关侧壁可以形成填充柱的至少一部分(例如，图23所示的填充柱1439)。

部分壁1473的高度限定了可以容纳在由托盘1415形成的细胞培养隔室内的细胞培养基的最大高度和体积。部分壁1473的顶部可以距形成结构化表面的基材1110任何合适的距离。在一些实施方案中，距离为5mm或更大，例如6、7、8、9、10、12、15或20mm，包括前述任何两个之间的范围。由于由这种托盘组装的细胞培养设备的结构化表面的透气孔与设备的外部连通，细胞上方的细胞培养基的高度可以大于常规细胞培养设备可行的高度，其中气体交换主要通过细胞培养基发生。

从部分壁1472的顶部到基材1110的距离可以与从部分壁1473的顶部到基材1110的距离相同或更大。因此，如果隔室用培养基过度填充，则过量的培养基将通过填充口1443而不是排气口1442排出。在使用排气柱中的底部过滤器(例如图22中的过滤器1427)的实施方案中，底部过滤器不会被培养基污染。当然，组装的设备的正确操作也应防止底部过滤器被培养基污染。

现在参考图25，显示了具有多个层叠的细胞培养隔室1410a，1410b，1410c的细胞培养设备1400的实施方案的示意性侧视图。每个隔室可以包括限定如上所述的结构化表面的基材1110。设备1400包括邻近基材1110放置的间隔物1500，其形成结构化表面，并且在室外部提供空气流动的通道，该通道在本文中被称为“气管空间(trachealspace)”(例如，气管空间1460a，1460b，1460c)。因为结构化表面限定了可以培养细胞的气体可透过的孔，所以代谢气体可以通过孔交换到由间隔物1500限定的气管空间1460a，1460b，1460c到设备1400的外部。设备1400还包括限定开口的填充歧管1430，通过该开口可以引入或移除细胞培养基。歧管1430包括多个口(未显示)。每个细胞培养室1410a，1410b，1410c具有与歧管1430的孔流体连通的至少一个口(未显示)，使得通过歧管1430引入的细胞培养基可以流入细胞培养室1410a，1410b，1410c。

图25中的细胞培养设备1400的底部包括其上设置有间隔物1500的板1510。在实施方案中，板1510和间隔物1500是单个部件，例如模制部件。这种板可形成其他细胞培养隔室的顶表面(例如，隔室1410a，1410b，1410c)。对于每个隔室，一个或多个侧壁1440从限定结构化表面的基材1100延伸到顶表面，顶表面可以由具有间隔物的板形成。与端口1430的口(未显示)连通的口(未显示)可以由侧壁限定。

堆叠的细胞培养托盘或室可以任何合适的方式组装。例如，可以使用焊接技术(例如，热，激光，长波ir或超声波焊接等)，粘合，溶剂粘合等来接合这些组件。

在一些实施方案中，结构化表面耦合到袋。适于细胞培养的袋可以通过热封，激光焊接，施用粘合剂或者可膨胀制袋技术中已知的任何其它方法形成。袋的壁或其部分可具有允许气体高效传递通过壁的厚度。应当理解，期望的厚度可以根据形成壁的材料而变化。作为示例，壁或形成壁的膜可以是约0.02毫米至0.8毫米厚。袋可以由任何适于培养细胞的材料制成。在各种实施方案中，袋由光学透明材料形成，以允许目视检查袋中培养的细胞。可用于形成袋的透光透气材料的示例包括聚苯乙烯，聚碳酸酯，聚乙烯乙酸乙烯酯，聚砜，聚甲基戊烯，聚四氟乙烯(ptfe)或相容的含氟聚合物，硅橡胶或共聚物，聚(苯乙烯-丁二烯-苯乙烯)或聚烯烃，例如聚乙烯或聚丙烯，或这些材料的组合。

本文所述的细胞培养设备可用于在结构化表面的孔内培养细胞。如上所述，设备中的细胞培养基可以是细胞上方的任何合适的高度。在一些实施方案中，设备中细胞上方的细胞培养基的高度(例如，在孔的顶部或最低点上方)为约5mm或更大。在一些实施方案中，设备中细胞上方的细胞培养基的高度(例如，孔的顶部或最低点上方)为约6mm或更大，约7mm或更大，约8mm或更大，约9mm或更大或约10mm或更大。

由于孔的气体透过性，细胞培养基的这种高度可用于将细胞维持在健康状态。因此，在本文所述的设备中培养的细胞可以用这种细胞培养基高度培养较长时间。例如，可以用这种培养基高度连续培养细胞24小时或更久，48小时或更久，72小时或更久，96小时或更久，或直至培养基更换。

在孔不附着于细胞的实施方案中，可以通过翻转设备以允许通过重力从孔中移置细胞来收获细胞。

在一些实施方案中，将多孔膜设置在如本文所述的细胞培养设备中，以支持在相同设备内的第二细胞类型生长，但与在与设备的外部气体连通的结构化表面上培养的第一细胞类型分离(或支持相同类型的其他细胞的生长)。在一些实施方案中，将干细胞在具有与设备外部连通的气体可透过孔的结构表面上培养，并且在多孔膜上培养饲养细胞。当然，可以使用这种设备来使用任何其它所需的细胞组合和分隔。

多孔膜可以设置在细胞培养设备的壳体内，以将壳体分隔成两个生长室。优选地，可透过性膜限制细胞移动通过膜，但允许生物分子通过。可用于形成多孔膜的材料的示例包括轨道蚀刻膜或织造或非织造多孔材料。多孔膜的材料可以经处理或涂覆以使其更粘附或更不粘附于细胞。可以通过本领域已知的任何数量的方法来实现处理，这些方法包括等离子体放电，电晕放电，气体等离子体放电，离子轰击，电离辐射和高强度uv光。可以通过本领域已知的任何合适的方法引入涂层，包括印刷，喷涂，冷凝，辐射能，电离技术或浸渍。然后涂层可以提供共价或非共价附着位点。这些位点可以用于附着部分，例如细胞培养组分(例如，促进生长或粘附的蛋白质)。此外，涂层也可用于增强细胞(例如，聚赖氨酸)的附着。或者，如上所述的细胞非粘附涂层可用于预防或抑制细胞结合。在一些实施方案中，多孔膜可以被制造成具有多个孔的结构化表面，如上文关于形成限定多个气体可透过性孔的结构化表面的基材所述。然而，在这种情况下，形成多孔膜材料具有结构化表面。

结构化表面的气体可透过性孔(例如，如上所述)允许通过调节放置该设备以允许细胞生长的培养箱中的气体浓度来控制氧气张力。可透过性膜支持物提供了在允许生物活性成分转移的同时物理分离不同细胞群的方法。

多孔膜可以以任何合适的方式附着到设备的壳体(例如，侧壁等)上。例如，如上所述，多孔膜可以与纳入形成限定具有多个气体可透过性孔的结构化表面的基材的基材类似的方式纳入装置中。

在图26所示的实施方案中，细胞培养装置3100是一个96孔多孔板，具有在板3111中由框架3113包围的孔3115。然而，如上所述，细胞培养设备可以具有任何合适数量的孔(例如，可以提供3、6、12、96或任何其它数量的孔)。在所描绘的实施方案中，多个孔3115中的每一个的至少一部分包含具有微孔阵列的基材，并提供形成球状体的位置，如上所述。几乎任何类型的具有用于培养细胞的孔的细胞培养设备可以通过采用具有微孔阵列的基材来设计，其在一些实施方式中，可以形成孔的整个体积，或者在一些实施方案中，可以形成孔的细胞培养子体积。在一些实施方案中，可以实现微孔设计的细胞培养设备可以是多孔板，例如，96孔多孔板，384孔多孔板，1536孔多孔板等。在一些实施例中，多孔板的至少一个表面是透气的。

多个孔允许细胞以球状体形成的方式聚集的能力，以及使得多个孔中的每一个中形成的球状体在多个孔中保持一致尺寸的能力可以任何合适的方式实现。例如，多个孔3115可以包括像如图1-5或16所示的微孔结构化和布置的微孔的阵列，其中细胞生长为球状体500。

在一些实施方案中，至少部分基于它们限定的尺寸和形状来设置一个或多个孔，以生长具有限定的尺寸的单个球状体。球状体可能扩大到由培养其的孔的几何形状施加的尺寸限制。例如，每个孔可以包括允许球状体生长到一定直径的微孔或细胞培养体积。换句话说，微孔或细胞培养体积的几何尺寸可以约束球状体生长，使得球状体直径达到最大值并保持在该最大值。一致大小的球状体的生产可能导致组织样的，不膨胀的球状体，这可能是提高测定结果的再现性的理想选择。一致的球状体的生产可以是由一个或多个孔的内部限定的各种形状和尺寸的体积(例如，微孔或细胞培养物体积)的结果。例如，微孔或细胞培养体积可以具有在约100微米至约700微米范围内的直径尺寸，例如约200微米至500微米，或在上述值内的任何范围(例如，100微米至200微米，100微米至500微米，或200微米至700微米)。微孔或细胞培养体积可以具有在约50微米至约700微米范围内的深度，例如约100微米至500微米，或在上述值内的任何范围。

本文所述的多个孔中的每一个可以帮助沉积在其中的细胞形成球状体。多个孔中的每一个还可以将每个球状体的直径限制或约束为约，例如，小于或等于500微米，小于或等于400微米，小于或等于300微米，小于或等于250微米，小于或等于150微米等，或在上述值内的任何范围(例如，150至250、150至300、150至400、150至500、250至300、250至400等)的值。在一些实施方案中，多个孔中的每一个形成由直径限定的球状体，该直径与在多个孔中生长的所有球状体的平均直径相差，例如，小于或等于20％，小于或等于15％，小于或等于10％，小于或等于5％，小于或等于2％等，或在上述值内的任何范围。

在图27-29所示的实施方案中，微孔阵列3115形成在基材3110中。多个孔3115中的每一个可具有顶部口3118、底表面3112和从顶部口3118延伸到底表面3112的侧壁表面3120。另外，侧壁表面3120可以在顶部口3118和底表面3112之间限定笔尖区域3116(参见图29)，由于孔的底部的收缩区域看起来像笔尖而得名。笔尖区域是诱导球状体的几何形状。

多个孔3115中的每一个的顶部口3118可以用作开口，通过该开口将细胞接种到多个孔3115中的每一个中。顶部口3118可具有各种不同的形状和尺寸。例如，顶部口3118可以由圆形，椭圆形，正方形，矩形，六边形，四边形等形状限定。顶部口3118还可以由直径尺寸(例如，直径、宽度等定义，取决于形状)。顶部口3118的直径尺寸可以被定义为在最宽点处穿过顶部口的距离。顶部口3118的直径尺寸可以是约，例如，大于或等于300微米，大于或等于500微米，大于或等于800微米，大于或等于1000微米，大于或等于1500微米，大于或等于2000微米等，或，小于或等于7000微米，小于或等于6000微米，小于或等于4000微米，小于或等于2500微米，小于或等于1700微米，小于或等于1200微米等，或在上述值内的任何范围。

多个孔3115中的每一个的底表面3112可有助于使细胞在其上或其上方培养。底表面3112可具有各种不同的形状和尺寸。例如，底表面3112可以是圆形，半球状，扁平状，圆锥形等。作为另一示例，底面3112也可以由圆形，椭圆形，正方形，矩形，六边形，四边形等限定。如图27-29所示，底表面3112是平坦的并且由直径尺寸限定底表面的直径尺寸可以是约，例如，大于或等于0微米，大于或等于50微米，大于或等于75微米，大于或等于100微米，大于或等于200微米，大于或等于275微米等，或，小于或等于700微米，小于或等于500微米，小于或等于400微米，小于或等于300微米，等于250微米，小于或等于150微米等，或在上述值内的任何范围。对于具有圆形底部或相似表面(例如，半球形，圆锥形等)的底表面3112，其中最低点处的最低点，底表面112的直径尺寸被认为是零。在一些实施方案中，顶部口3118的直径尺寸大于底表面3112的直径尺寸。在其他实施方案中，顶部口3118的直径尺寸等于底表面3112的直径尺寸。

在一些实施方案中，多个孔3115中的每一个的底表面3112可以均匀地由具有孔的微阵列的基材构成(也参见图29)。在其它实施方案中，底表面3112可以由与用于形成基材3110的材料不同的材料制成。下面将进一步描述制造多个孔的各种方法。底表面3112或侧壁表面3120可以是透气的，以帮助向孔3115内培养的细胞或球状体3130提供氧气。在一些实施方案中，限定底表面3112的基材3150可以是透气基材。在一些实施方案中，基材3150可以包括透气膜。底表面3112对外部的气体可透过性将部分取决于底表面3112的材料和底表面3112的厚度。例如，孔的气体可透过性可以如2014年10月29日提交的标题为“透气性培养瓶(gaspermeablecultureflask)”的美国临时专利申请号62/072,088所述，该临时专利申请的全部内容通过引用并入本文，只要其与本公开不冲突。

笔尖区域3116(参见图29)可以由顶部口3118和底表面3112之间的侧壁表面3120限定。笔尖区域3116的位置可以由孔的其它组件限定。例如，笔尖区域3116可以由通过侧壁表面3120的直径尺寸3144限定。笔尖区域3116的直径尺寸3144可以被定义为在笔尖区域3116处穿过侧壁表面3120的距离。笔尖区域3116可以由约例如，大于或等于50微米，大于或等于100微米，大于或等于200微米，大于或等于300微米，大于或等于400微米，大于或等于550微米等，或，小于或等于800微米，小于或等于700微米，小于或等于600微米，小于或等于500微米，小于或等于450微米，小于或等于350微米等，或在上述值内的任何范围的直径尺寸3144限定。笔尖区域3116还可以由约，例如，大于或等于50微米，大于或等于100微米，大于或等于150微米，大于或等于250微米，大于或等于350微米，大于或等于450微米等，或，小于或等于800微米，小于或等于700微米，小于或等于600微米，更小小于或等于500微米，小于或等于400微米，小于或等于300微米等，或在上述值内的任何范围的距底表面3112的高度3142限定。高度3142可以从底表面3112的最低点测量。在这样的实施方案中，孔3115的整个体积是细胞培养体积3140。

顶部口3118的直径尺寸可以大于或等于笔尖区域3116的直径尺寸3144。笔尖区域3116的直径尺寸3144可以大于或等于底表面3112的直径尺寸。还可以描述底表面3112的直径尺寸小于或等于笔尖区域3116的直径尺寸3144，或者笔尖区域3116的直径尺寸3144可以小于或等于顶部口3118的直径尺寸。在一些实施方案中，顶部口3118可以是笔尖区域3116。

多个孔3120中的每一个的侧壁表面3120从顶部口3118延伸到底表面3112。侧壁表面3120可以包括上侧壁表面3124和下侧壁表面3122.上侧壁表面3124可以被限定在顶部口3118和笔尖区域3116之间。下侧壁表面3122可以限定在笔尖区域3116和底表面3112之间。在一些实施方案中，多个孔3115中的每一个的侧壁表面3120可以限定细胞非粘附表面。如前所述，细胞非粘附表面促进细胞在细胞培养体积3140中生长成球状体3130。细胞非粘附的上侧壁表面3124可以有助于将接种的细胞沉降到细胞培养体积3140中。不管上侧壁表面3124是否是细胞非粘附的，在一些实施方案中，上侧壁表面3124被设置成导致接种在孔中的细胞由于重力沉淀到笔尖区域3116中，以形成细胞培养体积3140。

在一些实施方案中，上侧壁表面3124和下侧壁表面3122可以由例如抛物面，锥形，阶梯状，各种角度，弯曲等的形状限定。上侧壁表面3124和下侧壁3122可具有相同或不同的形状。在一些实施方案中，侧壁表面3120可以在上侧和下侧壁表面3124，3122相交的位置(例如，如图29所示)处具有拐点121。在其他实施方案中，侧壁表面3120可以在拐点3121处具有连续的斜面，其中上侧壁3124和下侧壁3122表面相交。

在一些实施方案中，与底表面112邻接的侧壁3120的一部分可以垂直于底表面3112或与底表面3112成一定角度。邻接底表面3112的侧壁3120的部分可以被描述为下侧壁表面3112。侧壁3120的一部分与底表面3112相交的角度可以相对于底表面3112限定，例如大于或等于90度，大于或等于92度，大于或等于95度，大于或等于100度等，或，小于或等于110度，小于或等于105度，小于或等于102度，小于或等于97度等，或上述值内的任何范围。在一些实施方案中，跨侧壁表面3120的直径尺寸可以被描述为从底表面3112向顶部口3118增加。侧壁几何形状可以是充分允许细胞沉降到多个孔3115中的每一个中的任何几何形状。

对于不具有平坦表面的底面3112，侧壁3120的角度被认为是相对于与底面3112的最低点相切的假想平面。在其他实施方案中，假想平面也可被定义为与顶部口3118共面，而不管假想平面是否与最低点相切。

底表面3112，笔尖区域3116和侧壁表面3120的一部分的组合可以限定细胞培养体积3140。限定细胞培养体积3140的侧壁表面3120的部分也可以被描述为较低的侧壁表面3122。细胞不限于仅在细胞培养物体积3140中培养。然而，沉积在多个孔3115的每一个内的细胞可以聚集在细胞培养物体积3140中以形成和生长球状体3130。而且，球状体3130的尺寸可以是细胞培养体积3140的形状和尺寸的结果。例如，多个孔3115中的每一个的细胞培养体积3140设置成使球状体3130生长至约，例如，小于或等于500微米，小于或等于400微米，小于或等于300微米，小于或等于250微米，小于或等于150微米等，或者上述值内的任何范围的直径。在一些实施方案中，多个孔3115中的每一个的细胞培养物体积3140形成球状体3130，该球状体3130由与多个孔3115中生长的所有球状体3130的平均直径相差，例如，小于或等于20％，小于或等于15％，小于或等于10％，小于或等于5％，小于或等于2％等，或上述值内的任何范围的直径限定。

顶部口3118，笔尖区域3116和侧壁表面3120的一部分的组合可以限定第二体积3145。限定第二体积3145的侧壁表面3120的部分也可以被描述为上侧壁表面3124。第二体积3145可大于细胞培养体积3140。例如，第二体积3145可以是大约，大于或等于100％，大于或等于200％，大于或等于500％，大于或等于1,000％，大于或等于10,000％，大于或等于100,000％，大于或等于200,000％等的细胞培养物体积3140，或上述值内的任何范围。举例来说，96孔板可以具有由0.1微升的体积限定的细胞培养体积和由200微升的体积限定的第二体积，导致体积上比细胞培养体积大2,000倍的第二体积。

细胞培养设备3100的一个实施方案在图27中显示。如图27所示，多个孔3115中的每一个的侧壁表面3120从顶部口3118到底表面3112逐渐变细。具体地，侧壁表面3120从顶部口3118以几乎垂直于顶部口3118的方向延伸，但是稍带角度，使得当侧壁表面3120向底表面3112延伸时，穿过侧壁表面3120的直径尺寸减小。在点3123处沿着顶部口3118和笔尖区域3116之间的侧壁表面3120，当侧壁表面3120向底表面3112延伸时，侧壁表面3120的角度改变以进一步减小穿过侧壁表面3120的直径尺寸。在笔尖区域3116处，侧壁表面3120的角度再次改变并且向底表面3112延伸。侧壁表面3120的最后部分有时被描述为下侧壁表面3122。如图27所示，在实施方案中，下侧壁表面3122可以与垂直于底表面3112稍带角度，并且穿过侧壁表面3120的直径尺寸将随着侧壁表面3120向底表面3112延伸而减小。球状体3130被显示为定位在下侧壁表面3122内并抵靠底表面3112(即，在笔尖区域3116中)。下侧壁表面3122可以局限或限制球状体3130可以生长的尺寸。

细胞培养设备3100的一个实施方案在图28中显示。如图28所示，多个孔3115中的每一个的侧壁表面3120从顶部口3118到底表面3112逐渐变细。具体地，侧壁表面3120最初从顶部口3118以与顶部口3118垂直的角度延伸，然后沿着抛物线路径向笔尖区域3116延伸。在笔尖区域3116处，侧壁表面3120的角度改变并向底表面3112延伸。侧壁表面3120的最后部分有时被描述为下侧壁表面3122。如图29所示，下侧壁表面3122稍带角度垂直于底表面3112，并且跨越侧壁表面3120的直径尺寸随着侧壁表面3120向底表面3112延伸而减小。球状体3130被描绘为位于下侧壁表面3122内并且在笔尖区域3116中抵靠底面3112。下侧壁表面3122可以局限或限制球状体3130可以生长的尺寸。笔尖区域是诱导球状体的几何形状。

现在参考图30，在一些实施方案中，细胞培养设备3650可以包括底板3610和一个或多个侧壁3620，如图30所示。底板3610可以限定主表面3611并且一个或多个侧壁3620可以从底板3610延伸。底板3610可以全部或部分地由具有微孔阵列3615的基材形成。图30显示了底板可以具有微孔阵列3615。也就是说，被识别为图30所示的微孔阵列3615的每个区域可以包含小得多的微孔阵列。在实施方案中，细胞培养设备3650还可以包括在底板3610的主表面3611中形成的多个孔3615。多个微孔阵列3615的每个孔可以限定微孔或细胞培养体积，如前所述，促进或诱导球状体的生长。底板3610的主表面3611和一个或多个侧壁3620限定储器体积。本文所述的储器板允许加入超过通常用于填充微孔板的各个浅孔的培养基，并允许在不同孔中培养的细胞流体连通。

在一些实施方案中，一个或多个侧壁3620可以比一些当前可用的细胞培养设备从底板3610延伸得更远(例如，侧壁高度)，从而允许储器容纳大于正常体积的培养基。储器的较大容量机会可以允许将过量的培养基添加到储器中，使得球状体可能不需要仅依赖于每个单个孔中的培养基的量。换句话说，球状体可能不需要像在标准微孔板中生长的球状体那样频繁地馈进细胞培养基。如图30所示，营养物和代谢物可以在整个细胞培养基中进行交换，因为储器中的细胞培养基与贮存器中的所有孔连通。

在一些实施方案中，细胞培养组件3600可以包括细胞培养装置3650和流体可透过性网3670。在细胞已经接种到孔中之后，可将流体可透过性网格3670置于孔3615的顶部。在多个孔3615之间共同连通的细胞培养基可以在手动批量进料过程中分离和更换，而不会干扰孔中的细胞。因为在一些实施方案中，细胞可以不粘附到孔的表面，所以可能难以在不干扰或失去球状体的情况下更换细胞培养基。然而，如上所述使用网格3670可以减轻这样的困难。例如，细胞培养设备和流体可透过性网格的组合可以如2014年10月29日提交的题为“储球板(reservoirspheroidplate)”的美国临时专利申请号62/072,103所述，该临时专利申请的全部内容通过引用并入本文，其与本公开不冲突的程度。

应当理解，本文所述的细胞培养设备3650的孔3615可以是任何尺寸、形状或构型。在一些实施方案中，孔由如图17所示的六边形紧密堆积孔结构形成。具有紧密堆积的小体积孔的结构化表面的储器板设备可能是特别有利的，因为在没有添加储器体积的情况下，孔的小体积需要频繁更换细胞培养基。

本文所述的储器板，例如，允许加入超过通常用于填充微孔板的各个浅孔的培养基，并允许在不同孔中培养的细胞流体连通。

如图31所示，细胞培养设备4100可包括底板4110和一个或多个侧壁4120。底板可以限定主表面，并且一个或多个侧壁4120可以从底板延伸。底板和一个或多个侧壁的组合可以限定储器。细胞培养设备还可以全部或部分地包括具有在底板的主表面中形成的微孔阵列4115的基材。微孔阵列中的多个孔的每个孔可以限定上口和最低点。上口可以与主表面共平面，并且最低点可以位于主表面下方，即，最低点可以位于与一个或多个侧壁从底板延伸的方向相反的方向。当孵育细胞时，可在储器上方按需设置顶板(未显示)。

在一些实施方案中，一个或多个侧壁可以比典型的更远离底板延伸，因此允许储存器保持大于正常体积的介质。储器的较大容量机会可以允许将过量的培养基添加到储器中，使得球状体可能不需要仅依赖于每个单个孔中的培养基的量。换句话说，球状体可能不需要像在标准微孔板中生长的球状体那样频繁地馈进细胞培养基。如图31所示，营养物和代谢物可以在整个细胞培养基中进行交换，因为储器中的细胞培养基与贮存器中的所有孔连通。

在一些实施方案中，本文描述了细胞培养组件4200。该组件可以包括设备4100(例如，如关于图31所示和讨论的)和流体可透过性网格4570。在细胞已经接种到孔中之后，可将流体可透过性网格4570放置在孔4115的顶部。可以在手动批量进料过程中分离和替换共同连通的细胞培养基，而不会干扰孔中的细胞。

在一些实施方案中(例如，如图32所示)，可将框架4560耦合到网格4570，如图所示。框架4560可以被设置为将网格4570保持在第一孔4515上的适当位置。在一些实施方案中，网格4570被设置为设置在设备4100的侧壁4120的上边缘之上。框架4560可以通过过盈配合、卡扣配合或用于将网格保持在板4110的主表面上的任何其它合适的机构接合一个或多个侧壁4120。在一些实施方案中，用户可以手动地将框架4560保持在适当位置，使得网格在孔4115上保持在板4110的主表面上。

流体透过性网格4570可以由任何合适的材料形成。在一些实施方案中，流体可透过性网格限定孔。孔可以是任何合适的尺寸。在一些实施方案中，孔限定在10微米至100微米范围内的平均孔径。在一些实施方案中，孔定义小于或等于40微米的平均孔径。优选地，网格的孔具有足够小的尺寸以防止球状体通过网格。

在一些实施方案中，网格可以如在例如共同转让的美国临时专利申请系列号62/072094，其临时专利申请通过引用整体并入本文，其程度与本公开不冲突。

在一些实施方案中，作为手动替替换胞培养基的替代，可以将如本文所述的储器板制造为灌注装置，其中细胞培养基可以流过孔的主表面上方的储器。

例如参考图33，可以适应如图314100所述和讨论的细胞培养设备，使得一个或多个侧壁形成入口4140并且一个或多个侧壁形成出口4145。细胞培养液可以从入口到出口在储器上灌注。图33所示设备的形状因子可以是敞开的顶部形状因子，或可以是封闭的顶部。如果形状因子是开放顶部，则如关于图2所讨论的，包括框架和网格的插入物可以用于在孔4115内保留细胞，如果可能从孔中移除诸如球状体的细胞的高灌注速率。

本文所述的细胞培养设备可以任何合适的方式制造。在各种实施方案中，制造细胞设备的方法包括模制聚合物材料或本文所述的任何其它合适的材料以形成细胞培养设备。聚合物材料可以限定细胞培养设备的多个孔。多个孔中的每一个可以限定从顶部口延伸到底表面的顶部口、底表面和侧壁表面。侧壁表面还可以限定顶部口和底表面之间的笔尖区域。可以将聚合物材料倒入具有钉(pin)的模具中，使得钉周围模制的聚合物材料具有如本文所述的多个孔的特征。

在一些实施方案中，将聚合物材料包覆模制到基材上以形成细胞培养装置。基材限定了底部表面，并且聚合材料和基材的组合限定了多个孔。可以将聚合物材料倒入具有钉的模具中，使得钉周围模制的聚合物材料具有如本文所述的多个孔的特征。

在一些实施方案中，无论如何制造本文所述的细胞培养设备，多个孔中的每一个的侧壁表面可以涂覆有如本文进一步描述的细胞非粘附材料。

在一些实施例中，孔包括作为侧壁的一部分或附属于其的各种特征。这样的基材特征可以直接注射成型，或者它们可以压花到形成的基材上。特征的材料可以是任何聚合物，聚合物共混物，共聚物，玻璃，金属或本文所述或在本领域中理解的任何其它材料。

本文所述的装置，孔，侧壁，孔底和其它特征由任何合适的材料形成。优选地，用于接触细胞或培养基的材料与细胞和培养基相容。通常，细胞培养组分由聚合物材料形成。合适的聚合物材料的实例包括聚苯乙烯，聚甲基丙烯酸甲酯，聚氯乙烯，聚碳酸酯，聚砜，聚苯乙烯共聚物，含氟聚合物，聚酯，聚酰胺，聚苯乙烯丁二烯共聚物，完全氢化的苯乙烯聚合物，聚碳酸酯pdms共聚物和聚烯烃如聚乙烯，聚丙烯，聚甲基戊烯，聚丙烯共聚物和环烯烃共聚物等。

在实施方案中，孔的内表面不与细胞粘附。孔可以由非粘附材料形成，或者可以用非粘附材料涂覆以形成非粘附表面。示例性非粘附材料包括全氟化聚合物，烯烃或类似聚合物或其混合物。其它实例包括琼脂糖、非离子水凝胶如聚丙烯酰胺、聚醚如聚环氧乙烷和多元醇如聚乙烯醇、或类似物质或其混合物。在一些实施方案中，例如两个或多个非粘附孔，孔几何形状和/或重力的组合诱导在孔中培养的细胞自组装成球状体。一些球状体保持分化的细胞功能，指示相对于在单层中生长的细胞更像体内。在孔不附着于细胞的实施方案中，可以通过翻转设备以允许重力从孔中置换细胞来收获细胞。

在一些实施方案中，材料的表面修饰用于实现期望的性能。这些包括表面化学和机械性能修饰的修饰可以利用生物涂层(例如matrigel^tm，胶原，层粘连蛋白等)和合成涂层(例如硅胶水凝胶等)。对材料(例如，孔或微结构)的其它表面修饰在本文的范围内。

具有如本文所述的结构化表面的基材可以任何合适的方式组装成细胞培养室或托盘。例如，细胞培养室或托盘的结构化表面和一个或多个其它组分可以模制成单个部分。在一些实施方案中，结构化表面或其部分包覆模制以形成底部和一个或多个组件，结构化表面被焊接(例如，热，激光，长波ir或超声波焊接等)，粘附，溶剂键合至细胞培养设备的一种或多种其它组分等。

在各种实施方案中，细胞培养系统可以包括上文描述的超过一种细胞培养设备组件。作为示例，可以将设备组件堆叠以形成细胞培养系统。可以结合本文所述的细胞培养设备组件的堆叠细胞培养系统的实例包括例如(i)2014年10月29日提交的题为“多层培养容器(multilayerculturevessel)”的美国临时专利申请号号62/072,015；(ii)2014年10月29日提交的题为“灌注生物反应器平台(perfusionbioreactorplatform)”的美国临时专利申请号62/072,039，各临时专利申请的各自的全部内容通过引用并入本文，只要它们与本公开不冲突。

本文所述的细胞培养设备可用于以任何合适的方式在设备的孔内培养细胞。例如，培养细胞的方法包括将细胞和细胞培养基引入如本文所述的细胞培养设备的多个孔中的一个或多个孔中。细胞培养基可以仅包含于细胞培养体积或包含细胞培养体积和第二体积的多个孔中的每一个的全部。该方法还涉及在多个孔中的一个或多个中的培养基中培养细胞。培养多个孔中的一个或多个孔中的细胞可以包括在一个或多个孔内形成球状体。在一个或多个孔内培养的球状体可以由约，例如，小于或等于500微米，小于或等于400微米，小于或等于300微米，小于或等于250微米，小于或等于150微米等，或上述值内的任何范围的直径限定微米。一个球状体的直径可以与在多个孔中生长的所有球状体的平均直径相差约，例如，小于或等于20％，小于或等于15％，小于或等于10％，小于或等于5％，小于或等于2％等，或上述值内的任何范围。

在一些实施方案中，孔底包括凹弧形表面或“杯”几何形状，例如半球形表面，具有圆形底部的锥形表面，和类似的表面几何形状，或其组合。孔(例如微孔)和孔底最终在球状体“友好的”圆形或弯曲表面(例如凹坑，凹形截头圆锥形表面或其组合)中终止，结束或见底。

在某些实施方案中，侧壁和/或孔底的部分对可见光和/或uv光谱内的波长具有不同程度的不透明度/透明度。例如，不透明侧壁可以与透明微孔底组合。从不透明部分到透明部分的过渡可以是渐进的或瞬变(immediate)的。

在一些实施方案中，孔(例如，微孔)在孔的一部分上，例如在至少一个凹弧形表面上包括低粘附性，无粘附性或高粘附性涂层。

在一些实施方案中，该装置还包括，例如，孔附件，孔扩展区域，或辅助侧室，用于接收用于抽吸的移液管尖端。在一些实施方案中，孔附件或孔延伸部(例如，侧袋)是例如与孔(例如，微孔)相邻并与其流体连通的整体表面。在一些实施方案中，孔附件具有与孔的气体可透过性的透明底部间隔开的底部。孔附件和室孔的第二底部，例如与透气的透明底部间隔开，例如在更高的高度或相对高度处。在一些实施方案中，孔附件的第二底部使从移液管分配的流体偏离透明底部，以避免破坏或扰乱球状体。

在某些实施方案中，该装置还包括位于孔的一部分内的多孔膜，例如衬里或膜插入件，位于孔附件的一部分，或孔和孔附件部分内。多孔膜可以提供分离或分离位于孔的上部的第二细胞材料，例如不同的细胞类型或不同的细胞状态，在由多孔膜形成的孔的上部，或两个孔，来自位于底部附近的一个或两个孔的下部的第一细胞材料。

装置和孔几何形状通过本领域已知的任何合适技术制造。在一些实施方案中，热压花，热变形和/或注射成型方法用于在细胞培养相容性塑料中生产微图案化表面。图12显示了本文使用的热压花/热成型制造工艺的示意图。在一些实施方案中，将具有特定厚度的聚苯乙烯膜(或另一合适的聚合物膜)置于加热的电阻硅树脂支持物上。然后将模具放置在薄膜上，将微孔面朝下。整个组件在预热到130℃持续10分钟的板之间在5n负载下压制。10分钟后，将板冷却至低于100℃，并将微图案压花/热成型膜从组件中移出并作为3d聚集体促进表面并入常规细胞培养容器中。其他温度，时间，压力和材料可在本文的范围内。

为了防止细胞附着，在一些实施方案中，微图案化的表面用抑制细胞附着的聚合物如聚-hema、普流罗尼克或专门的ula处理来处理。根据初始聚合物膜厚度和工艺参数，产生具有不同底部厚度的微孔的表面。在一些实施方案中，微孔底部的聚合物厚度对透氧性具有直接影响。更薄的微孔底部允许更好的氧气供应到位于微孔内的细胞。上述制造方法提供具有高氧可透过性微孔的表面。

在一些实施方案中，本文中的装置和系统包括用于在这种装置中使流体(例如，培养基)和细胞(例如，球状体)移动进入和离开各个隔室、孔等的微流体元件。微流体元件可以包括通道，储器，阀，泵等。

体外3d肿瘤细胞培养比简单二维细胞单层更准确地反映复杂的体内微环境。在一些实施方案中，如本文所述的具有微孔图案化表面的细胞培养物形式提供大量产生与常规高通量药物开发和临床前研究相容的均匀尺寸的3d培养物(例如，肿瘤球状体)。

在一些实施方案中，本文所述的培养容器用于从诱导的多能干细胞(ips)细胞和胚胎干细胞(esc)形成胚状体(eb)，允许大规模地均匀且容易地形成聚集体。在一些实施方案中，改变培养基使得eb连续生长数周。在一些实施方案中，控制每个聚集体的大小，因为大小取决于接种的细胞数量和培养时间。在一些实施方案中，聚集体被转移到传统的孔板，允许更大体积的培养基或球状体的分析。在一些实施方案中，大量形成的eb从单个板中转染的靶标或小分子的高通量分析提供统计上重要的数据。支持在一个培养容器中形成大量3d细胞聚集体的能力使得这些容器，例如修饰的培养皿适用于选择用于细胞重编程的eb形成克隆。在一些实施方案中，本文所述的容器还支持在与毒理学相关的多种细胞类型(例如肝细胞和胚胎干细胞)中形成3d细胞聚集体。在一些实施方案中，微孔表面容器用于3d聚集细胞培养，其目的是，例如，在生物处理领域中的蛋白质生产。在一些实施方案中，如本文所述的具有微孔图案化表面的细胞培养形式提供了使干细胞环境共培养，特别是克隆形成培养物，单干细胞和环境共培养的手段。结合针对干细胞表面标记或干细胞分化标记建立的染色方案并且可以进行成像、单一干细胞的计算机鉴定和环境共培养。

微图案化的容器也用于细胞库存目的，以保存3d格式的细胞。在一些实施方案中，一旦球状体生长到规定的尺寸(通常处于稳定状态之前的过渡状态)，则它们从微孔中移出，并且收集的球状体被冷冻保存并库存以供以后使用。过渡球状体意味着球状体的尺寸可以持续增长，而稳定球状体意味着球状体在达到其固有尺寸极限后会停止生长。各种低温保存方法在本文的范围内，包括但不限于二甲基亚砜(dmso)，胎牛血清(fbs)等。

实施例

实施例1：基材制备

根据实施方案的基材使用压花方法制造，如图12所示。图12显示了聚合物膜中微孔形成的热压花/热成型方法。提供热板1。将热板预热至130℃。提供压花模具2，反映所需的孔型。提供一层聚合物薄膜3，并在聚合物薄膜之后提供硅酮垫4。将热板加热，并压靠聚合物膜，由硅酮层支撑。当移去热板时，提供具有其中压花的所需孔型的微孔阵列的聚合物膜。

实施例2：细胞培养

在本文描述的实施方案的开发过程中进行的实验表明，例如，形成具有均匀直径的3d细胞培养聚集体，并在各自具有半球状圆底和圆顶的单个空间分离的微孔阵列中培养，其直径(d)是3d细胞聚集体的所需直径的约1至3倍。微孔高度(h)等于圆底部直径的约0.7至1.3倍，微孔的上开口直径(d顶部)等于圆底直径的约1.5至2.5倍。

进行实验，其中制造具有微孔图案化表面的t25细胞培养瓶原型并在细胞培养应用中进行测试，以验证所提出的设计的球状体形成和保留/收获益处的均一性。图8包含具有圆底几何形状的t25原型微孔交叉切割的反向复制图像。在原型t25瓶中由ht29细胞形成的球状体的图像显示在图10a中。图10b描述了从瓶中收获的球状体，其可以与使用可从纽恩克公司(nuncnunc)/赛默飞世尔科学公司(thermofisher)获得的市售nunclonsphera^tm低结合表面瓶(图11中所示)生长的那些相比，所述孔具有的优异性能通过与市售对照相比的实施方案中产生的球状体的均一性显而易见，市售对照具有低结合表面但没有孔来限定和控制球状体产生。圆底几何形状是诱导球状体的几何形状。在本文的实施方案的开发过程中进行实验以证明微孔的氧气可透过性对细胞培养性能的影响。如实施例1中所述制造具有不同厚度的微孔的6和12孔板。图13显示了证明在具有基材的6孔板中，在具有不同底部厚度的微孔中细胞生长之后测量的活细胞计数，该基材具有微孔阵列(如实施例1所示)。如图13所示，a的厚度为70μm，b为120μm，并且c为320μm。对照是tct处理的1mm厚的平板聚苯乙烯。从图13的结果可以看出，在实施方案中，更薄的材料(其表现出更多的气体可透过性)支持更强的细胞生长。

图13显示了证明在具有基材的6孔板中，在具有不同底部厚度的微孔中细胞生长之后测量的活细胞计数，该基材具有微孔阵列(如实施例1所示)。图14a和b显示了具有微孔阵列对比具有平坦表面的基材的活细胞计数和细胞生产力。图15显示了从在具有微孔对比平坦表面的基材上培养的mh677细胞提取的总蛋白质效价的图。

采用每2天进行培养基更换持续7天或9天进行mh677细胞培养。图13中显示的结果证明总活细胞计数对微孔底部厚度的依赖性。在透氧微孔(a柱，70μm厚的底部)中培养的细胞与较低透氧柱c，320μm厚的底部相比，产生82％更高的活细胞计数。总体而言，与普通的平坦非粘附表面相比，在微孔图案化表面上的培养物产生更高的活细胞计数(图14a)和更高的每细胞生产率(图14b)(图14)。这产生了85％更高的蛋白质产量(图15)。

在本文的实施方案的开发期间进行实验以证明使用本文所述的细胞培养装置和孔的3d培养中的细胞对比2d培养物的有利生长。在cho5/9α细胞(图34a)和bhk-21细胞(图34b)中，当与2d相比时，在3d培养物中每cm²产生了明显更多的蛋白质(图34a中的hm-csf；图34b中的epo)。

本申请中提及和/或以下所列的所有出版物和专利通过引用纳入本文。所述的特征和实施方式的各种修饰、重组和变化将对于本领域技术人员而言是显而易见的，而不偏离本发明的范围和精神。虽然已经描述的特定实施方式，应理解本发明不应过度限于这类特定实施方式。实际上，对相关领域技术人员显而易见的所述方式和实施方案的各种改进都落在以下权利要求的范围内。

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